ПЦР

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР
В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ
ДИАГНОСТИКЕ
Цаур Г.А
Центр детской онкологии и гематологии
Областная детская клиническая больница № 1
Екатеринбург
Молекулярно-генетические
методы
• Полимеразная цепная реакция (PCR)
• Методика разветвленных зондов (branched DNA)
• Транскрипционно-опосредованная амплификация
• Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
• Амплификация с вытеснением цепи (SDA)
• Гибридный захват (HC)
• Лигазная цепная реакция (LCR)
Другие...
QB репликаза, Биочипы
Молекулярно-генетические методы
Ломают границы между традиционными
лабораторными технологиями
Клиническая химия
Гематология
Микробиология
Вирусология
Генетика
Kary B. Mullis
1985
1993
Saiki R, Scharf S., Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of
sickle cell anemia.
Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.
Схема ПЦР
ПЦР в реальном времени
метка
праймер
гаситель
флуоресценция
полимераза
полимераза
полимераза
матрица
А.В.Мисюрин
ПЦР в реальном времени
Пороговый цикл
Пороговое значение
105
копий
106
копий
107
копий
Сравнение результатов ПЦР
и ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени HCV
70000
65236
60000
Количество геномных эквивалентов / мл
50000
40000
30000
20000
12476
9451
10000
1450
510
0
0
3 months
6 months
9 months
12 months
+
+
+
+
+
Качественное определение HCV
Преимущества
ПЦР в реальном времени
1. Повышение специфичности метода
за счет наличия зонда;
2. Возможность количественного определения;
3. Автоматизация;
4. Снижение риска контаминации
за счет отсутствия электрофореза;
5. Снижение времени проведения реакции;
6. Уменьшение площади, занимаемой ПЦРлабораторией
Зачем использовать ПЦР?
Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и
микробиологическими методами
Эффективны для мониторинга эффективности лечения
Относительно просты в исполнении
Высокая чувствительность
Не существует альтернативных
методов диагностики
Оборотная сторона
Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и
микробиологическими методами
но часто необходимы дополнительные методы верификации
Эффективны для мониторинга эффективности лечения
Относительно просты в исполнении
требует высокой квалификации персонала
Высокая чувствительность
существует потенциальная опасность ложно+
результатов (контаминации)
Не существует альтернативных методов
диагностики
Направления применения ПЦР
• Инфекционная микробиология / Санитарная
эпидемиология
• Диагностика и мониторинг терапии онкологических и
онкогематологических заболеваний
• Наследственные заболевания
• Тестирование на наличие генетическимодифицированных компонентов в продуктах питания
• Фармакогеномика
•
HLA-типирование
Революция в диагностике
инфекционных заболевания
• Быстрое и точное определение возбудителей
бактериальных и вирусных инфекций, в
т.ч.некультивируемых и медленно растущих
• Терапевтический мониторинг эффективности лечения
при вирусных заболеваниях
• Определение устойчивости к антибиотикам
• Открытие и идентификация новых вирусов
• Эпидемиологические исследования (особенно для
социально значимых инфекций)
• Выработка стратегии по контролю инфекционных
заболеваний
Молекулярная микробиология















HIV-1 & 2
HCV
HBV
EBV
CMV
HSV 1, 2, 6 типов
VZV
HPV
JC & BK вирусы
Энтеровирусы
Риновирус
Аденовирус
РС-вирус
Метапневмовирус
Вирус Лихорадки Западного Нила















Вирус гриппа
Вирусы парагриппа
SARS
Парвовирус B19
HAV
Toxoplasma
Legionella
Chlamydia
N. Gonorrhoeae
Mycobacterium spp.
Mycoplasma & Ureaplasma
Bordetella
Helicobacter pylori
MRSA
Candida
И другие
Острый лимфобластный лейкоз
СОЗРЕВАНИЕ B-клеток
T-ALL
Pro-B
Del 1p32
t(4;11)
SIL / TAL MLL / AF4
Pre-B /
common
Pre-B
B-ALL
t(9;22)
BCR / ABL
t(11;19)
MLL / ENL
t(8;14)
MYC / IgH
t(12;21)
TEL / AML1
t(1;19)
E2A / PBX
Острый миелобластный лейкоз
ОМЛ М2
ОМЛ M3
ОМЛ М4
t(8;21)
AML /
ETO
t(15;17)
PML /
RARa
inv16
CBFb /
MYH11
ОМЛ M5
t(9;11)
MLL / AF9
WT-1, NPM1, FLT3
ОМЛ М7
t(1;22)
Солидные опухоли
Ген
Заболевание
RB1
Ретинобластома
MYCN
Нейробластома
CDKN2A
Меланома
ATM
Атаксия-телеангиэктазия
BRCA
Наследственные форма рака молочной
железы
APC
Наследственный полипоз кишечника
Факторы прогноза
Ген
Заболевание
BCR / ABL
ОЛЛ
TEL / AML
ОЛЛ
PML / RARa
ОМЛ М3
MYCN
Нейробластома
SPARC
Менингиома
Прогноз
Оценка эффективности терапии(МРБ)
Ген
IgH
TCR
Ген тирозингидролазы
СК19
СК20
Ген кодирующий PSA
FLI1 / EWS
Заболевание
ОЛЛ
ОЛЛ
Нейробластома
Рак молочной железы
Рак желудка
Рак простаты
Саркома Юинга
Мониторинг количества
химерного гена MLL-AF4 (МРБ)
5,00
4,96
5,0
4,77
Пациент A.K., КМ
4,0
log10 NCN MLL-AF4
Log 10 NCN MLL-AF4
Пациент А.Г, КМ
4,00
3,32
3,00
2,49
2,00
1,72
1,05
1,00
0,71
3,0
2,33
2,36
1,95
2,0
1,0
0,39
0,00
0
0,0
1
15
36
HR 1(I)
Therapeutic dates
HR 2(II)
HR 3(III)
Динамика снижения MLL - AF4 в
костном мозге и периферической крови
1
15
36
Log 10 NCN MLL-AF4
4,00
4,96
4,30
3,32
3,00
2,49
2,83
2,00
1,72
1,73
1,00
1,61
1,05
0,71
0,58
0,00
1
15
36
HR 1(I)
Therapeutic dates
HR 2(II)
HR 3(III)
HR3 (III)
Protocol II
Стандартная кривая для
плазмиды MLL - AF 4
6,00
5,00
43
Therapeutic dates
Slope -3.573
Y-Intercept 39.025
Клонирование генов — создание
трансгенных животных, генетически
модифицированных растений
(1) ДНК организма А, упакованная в хромосомы. (2) ПЦР. (3)
Множество копий 1 гена из организма A. (4) Вставка гена в
плазмиду. (5) Плазмида со встроенным геном из организма А.
(6) Вставка плазмиды в организм B. (7) Увеличение числа
копий гена организма А в организме B.
Тестирование на наличие генетическимодифицированных ингредиентов
• Соя
линия 40-3-2
• Кукуруза
линия GA-21 (терминатор Nos)
линия MON 810
Наследственные заболевания
• Муковисцидоз - 7 мажорных мутаций гена
CFTR (F508, G17173A, G542X, R553X, 3905 insertion T,
W1282X, N1303K)
• Миодистрофия Дюшенна
• Гемофилия А и В - более 100 мутаций
• Болезнь Вильсона-Коновалова - 70 мутаций в гене
БВК, наиболее часто His1069Gln
• Гемохроматоз (C282Y, H63D)
Направления применения ПЦР
•
•
Идентификация личности (+отцовство)
«геномная дактилоскопия»
Исследование эволюционной теории
Электрофорез амплифицированных
в ходе ПЦР фрагментов ДНК
(1) Отец. (2) Ребенок. (3) Мать.
У ребенка есть часть генов от каждого
из родителей. И это дает новую
уникальную комбинацию
Геномная дактилоскопия
Фармакогеномика
Субстраты для CYP2D6 и CYP2C19
Фармакогеномика для
индивидуализирования терапии
Предположи
тельно, не
ответят на
терапию
Высокий
риск
токсических
эффектов
Лечение альтернативными
дозами препаратов
Предположительно,
ответят на терапию
Лечение обычными
дозами препаратов
HLA-типирование
HLA-антиген I класса
HLA-антиген II класса
Human Leukocyte Antigens
1.Подбор пары донор-реципиент при трансплантации
2.Определение предрасположенности к заболеваниям:
-Сахарный диабет I типа
-Целиакия
-Анкилозирующий спондилоартрит
-Ревматоидный артрит
http://www.genomediagnostics.com
HLA-типирование
• ПЦР-SSP
• ПЦР-SSO
• Секвенирующее типирование
HLA-типирование. ПЦР-SSP
Совместимость по системе
HLA для ТГСК
Локус
Рекомендации
HLA-A
Да
HLA-B
Да
HLA-C
Да
HLA-DRB1
Да
DRB3, 4 и 5
Не известно
HLA-DQA1 и B1
Не ясно
HLA-DPA1 и B1
Не ясно
National Marrow Donor Program, NMDP USA (2004)
Принцип подбора доноров:
отличия HLA-типирования «низкого» и
«высокого» разрешения
J.M. Tiercy, Prague, 2007
Контроль качества
Преаналитический этап
Процедура
Условия
Взятие образца
В закрытые системы, свободные от ДНКаз, РНКаз
Транспортировка
Максимально быстро. Оптимально при +4С
Хранение
Для исследования РНК – 20-70С. Не допускать
повторное замораживание не допустимо
В.В. Меньшиков Клиническая лабораторная диагностика, 2006, №3
Оценка качества РНК
Свежий материал RIN 8.3
Хранение 1 день, комнатная температура
Транспортировка 2 дня, комнатная температура
Транспортировка 4 дня, комнатная температура
Чувствительность метода
• Теоретическая
10-6
• Реальная (на примере MLL-AF4 протокол EAC)
Костный мозг 5*10-4 – 6*10-5
Кровь
1*10-4 – 7*10-4
Различия в стандартах
Плазмиды b2m
Ipsogen
Slope -3.450
Y-Intercept 38.718
1 430 000 копий
Плазмиды b2m
другой производитель
Slope -4.385
Y-Intercept 50.128
27 890 000 копий
Программа контроля качества
EQUAL
• Одинаковые праймеры и зонды
• Одинаковые разведения стандартной кДНК
• Одинаковые образцы крови с неизвестной
концентрацией
• Разная химия (полимераза, обратная
транскрипция для неизвестных образцов)
• Разные приборы для ПЦР в реальном
времени
кДНК 5,526 *101 копий гена ABL
min 2,569*101
max 541,170*101
103
102
101
Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006
Образец крови с неизвестным
количеством копий гена ABL
106
105
104
Min 0,180*104
mean 5,632*104
max 21,284*104
Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006
Программа контроля качества
GLEEM
К562 – клеточная линия, несущая химерный ген BCR / ABL, характерный для ХМЛ
T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007
Обязательно типировать образцы в
повторах (в идеале в триплетах),
особенно при низкой концентрации
исследуемого гена-мишени
T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007
Воспроизводимость по гену b2m.
Образцы от пациентов с
неизвестной концентрацией
Число
копий
Образцы пациентов,
протестированные в 5 разных постановках в триплетах
№1
№2
№3
№4
Mean
35,7*105
14,2*105
8,3*105
0,8*105
SD
7,1*105
1,1*105
1,4*105
0,3*105
CV, %
20,00
7,41
17,02
40,53
Воспроизводимость Ct b2m
Концентрация плазмид
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
Mean
14,15
17,48
20,73
SD
0,51
0,67
0,62
CV, %
2,51
3,47
1,75
Ct
Различия в приборном парке
Амплификация
Различия в приборном парке
M Silvy et al Leukemia (2005) 19, 305–307
Благодарю за внимание!