ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Принцип контактного взаимодействия Эндотелиальный покров сосудов – гладкая текучая поверхность. Целостность эндотелия – основное условие несвертывания крови в сосудистом русле Субэндотелий организован полимерными белками: коллагеном, эластином, имеющими свойство твердого тела. Субэндотелий обладает выраженным тромбогенным эффектом Принцип избыточности В норме скорость коагуляции практически не определяется концентрацией факторов, так как они присутствуют в избытке и процесс идет в состоянии насыщения. Принцип активации Путем ограниченного протеолиза из неактивного предшественника образуются активный (диагностически значимый) пептид и активированный фермент Принцип сборки комплексов На поверхность твердой фазы (адгезированные тромбоциты, поврежденные клетки, бактерии и др.) прикрепляется (интернализуется крупный кофакторный белок), который организует место контакта факторов свертывания. Факторы действуют друг с другом по принципу комплементарности Принцип каскадного усиления сигнала Каждый предыдущий компонент системы свертывания активирует несколько последующих. Принцип обратной связи Принцип обратной связи на примере активации тромбином V и VIII факторов и инактивации Vа и VIIIа факторов гемостаза Принцип конечного звена Цикл компонентов гемостаза. Тромбоциты образуются в процессе тромбоцитопоэза в костном мозге, освобождаются в систему циркуляции, где потребляются или удаляются Принцип защитного ингибирования Транспортный С4b-связывающий белок (С4ВР) доставляет протеин S (РS), участвующий как ко-фактор в формировании комплексов на фосфолипидной мембране. Высвобождение РS сопровождается быстрым его потреблением Плазменный гемостаз Плазменный гемостаз – многоэтапный ферментативный процесс, в котором участвуют белки плазмы и тканей, надмолекулярные образования и ионизированный кальций. 1) белки, обладающие свойствами протеолитических ферментов 2)лишенные ферментных свойств белки – акцелераторы процесса гемокоагуляции 3) фибриноген, являющийся конечным субстратом процесса свертывания. Различают: Внешние путь свертывания(основной) Внутренний путь(добавочный) Плазменные факторы свертывания крови Симво л факто ра I Название Время полужиз ни (час) Фибриноген 64-96 II Протромбин 48 III Тканевой тромбопласт ин (тканевой фактор, ТФ) IV Ион Са V Проакцелери н Концентра ция в плазме (нМ) 8800 (2-4 г/л) Гемостат ический минимум Зависимост ь от витамина К 0,5-1,0 г/л - 1400 (100г/л) 40% + В норме в плазме отсутствуе т - 1,15-1,27 ммоль/л 12 20 (10 мг/л) - 10-15% - Символ фактор а Название VII Проконвертин VIII Антигемофильный глобулин А IX Время полужизни (час) Концентрация в плазме (нМ) 4-6 Гемостат ический минимум Зависимо сть от витамина К 5-10% + 15-20 10 (0,1 мг/л) 0,7 30-35% - 24 90 (5 мг/л) 20-30% + X Антигемофильный фактор В Фактор Стюарта 32 10-20% + XI Антигемофильный 60-80 170 (8 мг/л) 30 (5 мг/л) 10-20% - 400 (30 мг/л) 50 (10 мг/л) <1% - 2-3% - 50 мг/л <1% - 60 мг/л <1% - глобулин С, XII Фактор Хагемана 50-70 XIII трансглютаминаза 40-50 ПК Прекаллекреин (фактор Флетчера) Высокомолекулярный кининоген (фактор Фитцжеральда) ВМК СХЕМА СТРОЕНИЯ И УЧАСТКОВ ПРОТЕОЛИЗА ПЛАЗМЕННЫХ ФАКТОРОВ Агрегация тромбоцитов, повреждение сосудистой стенки Тканевой тромбопластин XII VIII VII XI IX V X Xa Протромбин Тромбин Фибриноген Фибрин Сборка комплексов плазменных факторов на VIIIa и Va факторах, интернализованных в фосфолипидную мембрану Каскад активации плазменного гемостаза Контактная фаза активации плазменных факторов. Внутренний каскад активации плазменного гемостаза. Внешний путь образования протромбиназы Тканевой фактор (ТФ) – трансмембранный белок у которого внеклеточная часть гомологична цитокиновым рецепторам. Его практически нет на поверхности эндотелиальных клеток, лейкоцитов или эритроцитов. Субэндотелий богат тканевым фактором. ТФ присутствует практически во всех тканях, кроме сухожилий. Определение экспрессии ТФ на моноцитах проводят методом проточной цитометрии. М.б. для оценки гиперкоагуляции в будущем его определение заменит коагуляционные методы Внешний каскад свертывания крови Внешний каскад свертывания крови •Активация только внешнего пути достаточна для формирования протромбиназы и образования тромбина, но тромбина образуется мало и его хватает только для активации внутреннего пути, но не для превращения фибриногена в фибрин в количестве достаточном для образования сгустка. Поэтому больные гемофилией страдают кровотечениями. •Физиологическая активация свертывания крови происходит в большинстве случаев через тканевой фактор. Активность внешнего пути поддерживается за счет механизма положительной обратной связи Для поддержания активности внешнего пути наиболее важна, обратная связь с активацией фактора V тромбином. Протромбиназный комплекс значительно эффективнее активирует тромбин, нежели один фактор Ха Агрегация тромбоцитов, повреждение сосудистой стенки Тканевой тромбопластин XII VIII VII XI IX V X Xa Протромбин Тромбин Фибриноген Фибрин Последовательные и взаимовлияющие реакции, определяющие на суммарную активность протромбинового теста Международное Нормализованное Отношение Международным Комитетом по тромбозам и гемостазу рекомендован тест протромбиновое время (ПВ) с оценкой результатов по МНО ПВ больного МНО ПВ донорской пул плазмы МИЧ При определении ПВ больного и стандартной плазмы с любым тромбопластином, учитывая международный индекс чувствительности (МИЧ или ISI в английской аббревиатуре) используемого тромбопластина, получают относительное значение, как будто был использован в качестве тромбопластина Международный стандарт ВОЗ, МИЧ которого принят за 1,0. Эту величину и принято называть Международным Нормализованным Отношением – МНО ( INR - английская аббревиатура). МИЧ для различных тромбопластинов варьирует от 0,9 до 2,8. Чем выше значение МИЧ, тем менее чувствителен к изменению содержания компонентов протромбинового комплекса тромбопластин и, следовательно, тем больше может быть ошибка в определении ПВ. Использование тромбопластинов с МИЧ 1,4 - 1,5 обеспечивает хорошее совпадение результатов даже при низких дозах непрямых антикоагулянтов. Основная цель, которую преследовало введение МНО, состояла в обеспечении оптимизации терапии оральными антикоагулянтами, а для лаборатории это еще освобождение от необходимости построения калибровочного графика для каждой серии тромбопластинов. Рекомендуемый диапазон МНО при терапии непрямыми антикоагулянтами Показатели Профилактика системных тромбоэмболий Послеоперационная профилактика венозного тромбоза Лечение флеботромбоза и легочной тромбоэмболии Преходящие нарушения мозгового кровообращения Постинфарктная профилактика венозного тромбоза Мерцание предсердий Нестабильная стенокардия Пороки клапанов сердца Биологические протезы сердечных клапанов Рецидивирующий тромбоз глубоких вен Инфаркт миокарда Механические протезы сердечных клапанов Рецидивирующие системные тромбоэмболии МНО 2,0 - 3,0 3,0 - 4,5 Фибриноген Формирование фибрина Формирование фибрин мономеров из фибриногена Последовательные стадии образования нерастворимого фибрина Фибринолиз Основные звенья фибринолиза ФИБРИНОЛИЗ ПРОАКТИВАТОРЫ АКТИВАТОРЫ ИНГИБИТОРЫ АКТИВАТОРОВ АНТИПЛАЗМИН ПЛАЗМИНОГЕН ПЛАЗМИН 2- МАКРОГЛОБУЛИН 1- АНТИТРИПСИН ФИБРИН ПДФ Активациия плазминогена Ингибиторы фибринолиза Образование фибрина из фибриногена и D-димеров при деградации фибрина плазмином Образование ПДФ при деградации фибриногена плазмином Антикоагулянты Агрегация тромбоцитов, повреждение сосудистой стенки Тканевой тромбопластин XII VIII XI V Протеин С VII IX X Xa Протромбин Антитромбин III Тромбин Фибриноген Фибрин Ингибиторы протеаз Ингибирование активных сериновых протаз серпинами за счет образования стабильного неактивного ферментсубстратного комплекса Ингибирование активных протаз за счет погружения фермента внутрь макромолекулы 2макроглобулина Эффект нефракционированого гепарина •Терапевтическое антикоагулянтное действие гепарина связано со способностью вызывать конформационные изменения АТ. •Функция гепарина каталитическая. После образования эквимолярного 1:1 комплекса тромбин-антитромбин (ТАТ) гепарин может освобождаться для других комплексов. Снижение уровня АТ в плазме в период активного лечения нефракционированным гепарином Активация тромбоцитов гепарином за счет образования комплекса между гепаринзависимыми IgG антителами и тромбоцитарным фактором 4. Терапевтический диапазон Анти-Ха при терапии фракционированным гепарином Мониторинг антикоагулянтной терапии при лечении фракционированным гепарином основывается на тесте анти-Ха (единица измерения - анти-Ха МЕ/мл), предваряющим очередное введение препарата, так как значения АЧТВ остаются в пределах нормы или удлиняются незначительно. Тест анти-Ха заключается в измерении оставшегося Ха с использованием специфического хромогенного субстрата. Препарат Фрагмин, фраксипарин ловенокс, клексан Показания Профилактика венозного тромбоза - умеренный риск Профилактика венозного тромбоза - высокий риск Дальтепарин, Интенсивная терапия при инфаркте ревипарин, миокарда, венозных и эноксипарин артериальных тромбоэмболиях Дозировка 2000 - 2500 МЕ п/к 1 раз в день 4000 - 5000 МЕ п/к 1-2 раза в день 100-120 МЕ/кг веса п/к 2 раза в сутки Экстракорпоральное Болюс 3000 кровообращение, гемодиализ < 4 6000 МЕ часов Экстракорпоральное Болюс 2000 кровообращение, гемодиализ > 4 3000 МЕ + 1000часов 1500 МЕ/ч Анти-Ха (МЕ/мл) Мониторинг не требуется 0,2 - 0,4 0,3 МЕ/мл до инъекции, через 3-4 ч после инъекции <1,5 МЕ/мл 1,0 1,2 Прокоагулянный и антикоагулянтный эффекты тромбина Система протеина С Система протеина С Нарушения в системе протеина С, способствующие развитию тромбофилий: 1 – дефицит протеина С, 2 - дефицит тромбомодулина, 3 - дефицит протеина S, 4 резистентность к активированному протеину С Резистентность к активированному протеину С (АПС) при мутации в гене, контролирующем синтез V фактора и приводящей к образованию фактора V Лейден Принцип работы механического коагулометра Принцип регистрации выпадающего фибрина оптико-механическим коагулометром Принцип регистрации момента образования сгустка турбидиметрическим коагулометром. Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов Принцип определения активности протеолитического фермента (протеазы) с использованием хромогенного субстрата Принцип определения содержания фактора VIII Определение фактора VIII основано на том, что количество образующегося фактора Ха в реакциях активации плазменного гемостаза прямо пропорционально содержанию VIII фактора в пробе Иммунохимические методы Принцип латексагглютинации Принцип ELISA. На плашке, покрытой антителами против фактора гемостаза, связывается антиген Принцип метода радиальной иммунодиффузии, используемый для полуколичественной оценки некоторых факторов гемостаза Линейка коагулометров фирмы Sysmex Коагулометр Автоматический Автоматический СА-7000 СА-50, 4коагулометр СА- коагулометр СА1500 Выполняет канальный, 500 Делает До 500 клоттинговые, выполняются клоттинговые тестов/час хромогенные и тесты: ПВ, тесты , по 20 АЧПВ, ТВ, хромогенные турбидиметричес выбранным МНО, AT, тесты и др. До 33 кие тесты До 80 параметрам тестов/час фибриноген тестов в час