vorobeva

Определение активности
лекарственных препаратов
биологическими методами
Воробьева М.О.
Овсянникова Е.А.
Фармацевтический факультет 102 гр.
Научный руководитель: доц. Шапиро Л.А.
Актуальность
Методы дисперсионного анализа и тесно
связанного с ним планирования
эксперимента в настоящее время широко
применяются для решения прикладных
медико-биологических и фармакологических
задач
Цель исследования
Изучить методы определения
биологической активности
лекарственного препарата
окситоцина
Задачи исследования:
• Изучить методы планирования
экспериментов по схеме латинских
квадратов;
• Разработать алгоритм статистической
обработки результатов определения
биологической активности лекарственного
препарата окситоцина;
• Провести сравнительный анализ результатов
экспериментов по биологическому действию
окситоцина на рог матки крысы.
Введение
При проведении опытов используются
методы рационального планирования по
схеме латинских, греко-латинских или гипергреко-латинских квадратов, которые
позволяют спланировать сочетание
различных факторов так, чтобы при
минимальном числе опытов наиболее
равномерно охватить всю область
возможных сочетаний влияющих факторов.
Латинский квадрат n-го порядка таблица L=(lij) размеров n × n, заполненная n
элементами множества M таким образом, что в каждой
строке и в каждом столбце таблицы каждый элемент из
M встречается в точности один раз. Пример латинского
квадрата 3-го порядка:
В настоящее время в качестве множества M обычно
берётся множество натуральных чисел {1,2,…,n},
однако Леонард Эйлер использовал буквы латинского
алфавита, откуда латинские квадраты и получили своё
название.
Окно в университете Кембриджа с латинским
квадратом 7-го порядка, посвященный Р.Фишеру.
Греко-латинские квадраты
два
латинских
квадрата
4х4
можно
преобразовать в греко-латинский квадрат
Можно оценить главные эффекты 4-х уровневых факторов
(фактора строк, фактора столбцов, латинских букв и
греческих букв) , проведя только 16 опытов.
Гипер-греко-латинский квадрат
• Получится, если наложить друг на друга три
различных варианта латинских квадратов.
С его помощью можно оценить главные
эффекты пяти факторов (фактора строк,
столбцов и трех расположений квадратов).
• В частности, для пяти трехуровневых
факторов потребуется провести только 9
опытов вместо 243 опытов при переборе
всех возможных сочетаний факторов.
Ограниченность метода:
Планирование по методу латинского
квадрата применяется когда
необходимо получить оценки влияний
главных факторов, при этом влиянием
взаимодействий факторов можно
пренебречь.
Материал и методы
• Для исследования использовался
раствор окситоцина для
внутривенного и внутримышечного
введения (5МЕ/мл).
•Производитель - ООО медицинский
центр «Эллара»
•Проявляет биологическую
активность:
 Вызывает сокращение рога
матки крысы;
 Снижает кровяное давление у
петушков.
Материал и методы
Количественное определение окситоцина
проводилось по одному из биологических опытов,
где в качестве тест- объекта использовался
изолированный рог матки крысы, который
сокращался под действием этого препарата. (В
сравнении с Государственным стандартным
образцом (ГСО) окситоцина синтетического для
биологических испытаний (ФС 42-0021-00)).
Материал и методы
• В сосуд поочередно вводят подобранные дозы стандартного и
испытуемого препаратов в следующей последовательности:
Кислород (для const pH=7,4)
S1 S2 T1 T2
S2 T1 T2 S1
T1 T2 S1 S2
T2 S1 S2 T1
Окситоцин
Водяная баня
T=32oC
Рог матки крысы
Регистрация
на
самописце
Время наблюдения за действием вводимой дозы - не менее 3 минут.
• Число реакций на каждую дозу - не менее четырех.
• Ответ – величина изотонического сокращения рога матки крысы в ответ
на введение двух доз стандартного образца окситоцина и двух доз
испытуемого препарата. Регистрируют их в виде амплитуды
перемещения писчика механического рычага или пера электронного
самописца (см или мм).
…
Материал и методы
Относительную активность испытуемого
Абсолютную активность испытуемого
препарата определяли по формуле:
препарата определяли по формуле:

T T  S
R  anti lg
T  T  S
1
2
2
1
 S2 
 0,301
 S1 
2
1
где S1 и S2 - величина
средних ответных реакций на
соответствующие дозы
стандартного образца в мм
где T1 и T2 - величина
средних ответных реакций на
меньшую и большую дозы
испытуемого препарата в мм
0,301 – логарифм 2
(отношение между большей и
меньшей дозой, равное 2)
R K c
A
Ku
Относительная активность (R)
умножается
на отношение активности рабочего
раствора
стандартного образца (Кс) и степени
разведения
испытуемого препарата (Кu).
Результаты исследования
Результаты исследования
Опыт 1
Число
степеней Fнабл Fкрит
свободы
Показатель
Регрессия
Параллель
ность
Строки
Столбцы
1
1
3
3
Р
Выполнен
ие
условий
стандарта
16,69
13,75
<0,01
да
15,54
5,99
<0,05
нет
0,58
0,94
9,78
9,78
>0,01
>0,01
да
да
Результаты исследования
Опыт 2
Число
степеней Fнабл Fкрит
свободы
Показатель
Регрессия
Параллель
ность
Строки
Столбцы
1
1
3
3
Р
Выполнен
ие
условий
стандарта
101,82
13,75
<0,01
да
40,72
5,99
<0,05
нет
0,58
0,94
9,78
9,78
>0,01
>0,01
да
да
Результаты исследования
Опыт 3
Показател
ь
Регрессия
Параллель
ность
Строки
Столбцы
Число
степеней Fнабл
свободы
Fкрит
Р
Выполнен
ие
условий
стандарта
1
150,11
13,75
<0,01
да
1
64,24
5,99
<0,05
нет
3
3
0,58
0,94
9,78
9,78
>0,01
>0,01
да
да
Результаты обработки методом 2-х
дозового латинского квадрата
Активность,
МЕ/мл
Погрешность
измерения
1 животное
5,07
0,28
2 животное
5,71
0,38
3 животное
5,39
0,33
Среднее
5,39
0,33
Выводы:
•
Полученное значение активности препарата: 5,39
МЕ/мл соответствует стандарту (4,25-6,00 МЕ/мл или
85%-120% от значения, указанного на этикетке).
•
Погрешность измерений составила 0,33 МЕ/мл
(стандарт – до 0,45).
•
Дисперсионный анализ показал правильность
результатов опыта: статистическую значимость
дозозависимости («Регрессия») и отсутствие
статистически значимых различий между строками и
столбцами. Результаты расчетов не удовлетворяют
требованиям метода латинских квадратов по
показателю параллельности линий регрессии.
Параллельность
см
см
см
Возможные причины
• Соотношение меньшей и большей дозы
должно быть 1:2.
• S1=0,03 МЕ/мл S2=0,06 МЕ/мл
1:2
• T1=0,01 МЕ/мл T2=0,06 МЕ/мл
1:6
• S1=0,0066 МЕ/мл S2=0,06 МЕ/мл 1:9
• T1=0,017 МЕ/мл T2=0,06 МЕ/мл 1:3
Спасибо за внимание!