ОДНОЭТАПНЫЕ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ

Классификация Kawamura и соавт. (1995) подразделяет эту довольно
гетерогенную группу каталазонегативных грамположительных кокков на 6 групп:

Pyogenic

Mitis

Salivarius

Anginosus

Mutans

Bovis
Агалактийному стрептококку отведено место в группе пиогенных (син.:
Гноеродных) стрептоккоков.
По типу гемолиза его относят к β-гемолитическим.
В реакции преципитации Str. agalactiae подразделяют по капсульному антигену
на 10 сероваров (Ia, Ib и II–IX). 4-7% изолятов не удается идентифицировать этим
методом.
Str. agalactiae широко распространен среди людей и животных
(крупного рогатого скота, собак и др.).
Бактерию обнаруживают во влагалище в среднем каждой третьей
беременной женщины.
Колонизирует пищеварительный тракт и носоглотку, реже кожу,
центральную нервную систему, сердце, легкие, реже другие
органы и ткани.
Наиболее опасны для детей серотип III и Ia.
В последние годы регистрируют интенсивное распространение
серотипов V, VI и VII.
У взрослых людей
Бессимптомное течение инфекции (в большинстве случаев).
Часто вызывает пневмонию на фоне вирусных инфекций.
У лиц пожилого возраста, пациентов, страдающих диабетом и
заболеваниями периферических кровеносных сосудов, печени
и злокачественными новообразованиями, нередко вызывает
бактериемию.
Ответственен за послеродовые инфекции эндометрия,
мочевыводящих путей, головного мозга, а также сепсис и
осложнения кесарева сечения (их инцидентность составляет 12 %) .
В последние годы чаще стали регистрировать случаи
инвазивной инвазии агалактийного стрептококка , приводящии к
кистозному фиброзу легких.
У детей
1. Ранняя форма (проявляющейся в первую неделю жизни и
ассоциированная с заражением вертикальным путем)
в 30 % случаев в первый день жизни возникает сепсис, в 32-35 % —
пневмония, а у остальных пораженных детей — менингит.
- смертность 37 %
2. Отсроченная форма (проявляющейся у детей 1-12-недельного
возраста после неонатального заражения горизонтальным путем).
- превалируют бактериемия и менингит,
- реже развиваются остемиелит и/или септический артрит (в 10-20%
они имеют летальный исход, а у половины выживших детей остаются
осложнения перенесенной инфекции.
- Спорадически возникают некротизирующий фасциит и токсический
шок
Исход заражения детей во время родов зависит от серовара
возбудителя и пути заражения.
Новорожденные дети проявляют повышенную восприимчивость к
инфекции вследствие отсутствия у них гуморального иммунитета.
Основной метод – обработка антибиотиками беременных женщин
перед родами:
Пенициллин G (антибиотик выбора) = в/в в ударной дозе, затем
каждые 4 ч вплоть до рождения ребенка в меньших дозах. Вызывает
анафилактические реакции у 4 из 10-100 тыс. человек, а также другие
аллергические реакции приблизительно у 10 % пациентов

При повышенной чувствительности к пенициллину применяют
ампициллин, реже цефазолин, эритромицин, клиндамицин и
ванкомицин.

Ванкомицин держат в резерве для пациентов, проявляющих
повышенную чувствительность к β-лактамным антибиотикам и
инфицированных резистентными к эритромицину и клиндамицину
штаммами возбудителя.

ОСНОВНЫЕ НЕДОСТАТКИ АНТИБИОТИКОТЕРАПИИ БЕРЕМЕННЫХ
ЖЕНЩИН
- Применение пенициллина сопряжено с риском анафилактического шока,
аллергические реакции регистрируют и на другие антибиотики, применяемые
для борьбы со СГБ
- Охват профилактической обработкой ими почти всех будущих матерей
требует определенных экономических затрат.
- Длительное время считали, что несмотря на широкое применение беталактамовых антибиотиков резистентности к ним у СГБ (в отличие от
макролидов, фторхинолонов и эритромицина) не вырабатывается. Однако, в
1984 г. в Японии изолировали 16 штаммов Str/agalactiae, устойчивых к
пенициллину и ампициллину.
- Такой подход неизбежно повышает риск появления резистентных к
антибиотикам других бактерий.
- Кратковременное (а порой однократное) применение антибиотиков не
гарантирует полной элиминации возбудителя: у 38-53 % женщин,
обработанных антимикробными препаратами, во время новой
беременности вновь выявляют колонизацию влагалища агалактийным
стрептококком.
Цель: максимально снизить применение антибиотиков, исключив их
необоснованное применение
Практика 1992-….. 2002 гг. : Бактериологическое обследование
женщин на 26-28 нед. беременности с последующим обработкой
антибиотиками инфицированных СГБ.
Недостатки:
1. Возможность повторного заражения СГБ после применения
антибиотиков.
2. Колонизация СГБ половых органов женщин на ранней стадии
беременности не всегда сохраняется до родов.
Антибиотиками обрабатывают во время родов женщин, у которых:
- во время беременности в моче обнаружили Str. agalactiae;
- получен положительный результат бактериологического
исследования на эту инфекцию при исследовании смывов из
влагалища и/или прямой кишки на 35-37 нед. беременности;
- роды начались ранее 37 нед. плодоношения
- отхождение плодных вод произошло за 18 ч и более до поступления
в клинику
-- возникла лихорадка, а бактериологический анализ не проведен
Женщинам, у которых в течение 5 нед, предшествующих родам,
подтверждено отсутствие Str. agalactiae, антибиотики не применяют
(даже при преждевременных родах, раннем разрыве плодных
оболочек и повышенной температуре, а также наличии инфекции во
время предшествующей беременности), если нет других показаний
для антимикробной терапии.
Детей, рожденных матерями, которым вводили антибиотики,
обследуют на наличие Str. agalactiae (исследуют смывы из
наружного слухового канала, подмышечной впадины, со
слизистой зева, пупочной культи, паховых складок, а также
меконий) независимо от их общего клинического состояния при
рождении). Однако выделить возбудителя удается не всегда
(например, в 15 % случаев стрептококкового менингита при
изоляции Str. agalactiae из крови новорожденных получают
отрицательный результат).
За данной группой детей следует наблюдать не менее 3 мес,
проводя двукратное бактериологическое исследование. В
случае обнаружения агалактийного стрептококка проводят
антибиотикотерапию. Запрещено применять антибиотики всем
детям, рожденным матерями, которые были инфицированы СГБ
во время беременности.
Переход в США на такую схему, по данным CDC, привел к
снижению инцидентности перинатального )заражения
Str. agalactiae на 33 % (в период с 2002—2006 гг. по сравнению с
2000—2001 гг.
1.
Часто невозможно своевременно провести бактериологическое
исследование проб, взятых у рожениц
2.
Запоздалое получение положительных результатов
бактериологического анализа влечет за собой применение
антибиотиков кормящим женщинам , что сопряжено с
нежелательными побочными реакциями на химиотерапию у грудных
детей.
3.
Дополнительные затраты средств на проведение
бактериологического обследования в неонатальный период.
Чтобы понять, как можно улучшить данную систему профилактики СГБ
кратко проанализируем средства и методы, которыми мы
диагностируем эту инфекцию
Анализ анамнестических данных, клинических проявлений болезни
(при наличии симптоматики) и результатов бактериологического
исследования
Установление этиологии
Изоляция возбудителя посевом на питательных средах из смывов
влагалища и прямой кишки беременных женщин (35-37-й дни
плодоношения) с последующей идентификацией

Экспресс-методы обнаружения агалактийного стрептококка (ИХТ)
или его генома (ПЦР) в клиническом материале.

Обнаружения в клиническом материале генома бактерии с
помощью ПЦР.

При подозрении на инфекцию СГБ доставлять клинический
материал в лабораторию лучше в транспортной среде (Эймса и
др.)
А. НЕСЕЛЕКТИВНЫЕ
Кровяной агар: в суточной культуре прозрачные или мутноватые ,
выпуклые, диаметром 0,5-1 мм, окруженные зоной гемолиза. До 15%
штаммов не проявляют выраженных гемолитических свойств.
Колумбийский CNA агар: аналогично.
Сывороточный бульон: гранулярный или хлопьевидный придонный рост.
Кровяной бульон: аналогично + гемолиз.
Бульон Тодд-Хевитта (бульон LIM = аналог + колистин + налидиксовая
кислота)
Лакмусовое молоко: закисляет и свертывает при 37°С в течение 48 ч, а
при 10°С не вызывает видимых изменений в течение 5 дн.
Среды с крахмалом (агар Гранала, анар Гренада с метатрексатом и
др.): образуют красные колонии за счет образования гемолитического
пигмента гранадаена.
Б. СЕЛЕКТИВНЫЕ
Среды с сульфаметоксазол-триметопримовой добавкой
Агар Сланетца-Бартлея
Агар GBS
Агар NNA (неомицин + налидиксовая кислота)
Канамицин-эскулин азидный агар
Стрептококковый агар Novamed
Световая микроскопия окрашенных мазков изолятов получают
первичное подтверждение принадлеждности изолята к стрептоккоккам
(грамположительные кокки, располагающиеся длинными цепочками)

Оценка чувствительности к антибиотикам:
Пенициллин
+
Бацитрацин (0,04 ЕД)
—

CAMP-тест (тест Кристена, Аткинса и Мюнч-Петерсена): при
одновременном посеве на плотную среду с S. aureus (интенсивные зоны
гемолиза в местах пересечения штриховых посевов обоих бактерий.
Применяют разные модификации теста, в т.ч. основанные на внесении в
питательную среду стафилоккового токсина, применении
сенсибилизированных стафилокковым токсином эритроцитов.

Биохимическая идентификация: ферментация глюкозы, трегалозы,
лактозы, сахарозы, мальтозы, салицина (непостоянно); отсутствие
ферментации инулина, маннита, сорбита, раффинозы; не гидролизует
эскулин и желатину, но разлагает гиппурат натрия; 90% штаммов обладают
гиалуронидазой.

Идентификация изолятов иммунологическими тестами (ИФА, РЛА,
реакции коагглютинации, ИХТ)

Хроматографический анализ - очень точный аналитический
метод , основанный на разделении компонентов смесей.
Нуждается в специальных оборудовании и реактивах,
требует значительных затрат времени и труда
высококвалифицированных специалистов.
Иммунологические методы основаны на взаимоденйствии
антигенов (Аг) со специфическими антителами (Ат).
Чувствительность и специфичность разных
иммунологических тестов при разных инфекциях
неодинаковы.
Комбинация пористо-мембранной хроматографии с
иммунологическими реакциями получила название
ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ .
На нитроцеллюлозной мембране
зафиксирован конъюгат
моноклональных антител к
вирусному или бактериальному
антигену с коллоидными частицами
золота.
В результате взаимодействия
антигена с конъюгатом формируется
комплекс антиген-антитело, который
мигрирует по мембране, образуя в
тестовой зоне при наличии в пробе
ротавирусного антигена окрашенную
полоску.
Контрольная
полоска
Тестовая
полоска
Непрореагировавший конъюгат
мигрирует к контрольной зоне, где
захватывается фиксированными
поликлональными антителами,
формируя окрашенную полоску, (по
цвету отличается от тестовой), что
подтверждает корректность
результатов теста.
В настоящее время разработаны разнообразные ИХТ, позволяющие
решать разнообразные задачи – от качественной индикации
специфических компонентов (в т.ч. Аг и Ат) до количественной
оценки их содержания в субстратах.
Эти простые тесты стали незаменимыми средствами диагностики
беременности, инфаркта миокарда, онкологических ,
инфекционных и инвазионных болезней. Наши зарубежные коллеги,
которые ими широко пользуются на протяжении последних 10 лет
окрестили их «point-of-careу», т.е. средствами диагностики, которыми
пользуются у «постели больного».
Простота – не показатель низкого качества!
Бесприборные одноэтапные ИХТ - высокочувствительные и
специфичные методы выявления специфических Аг и Ат
Материал для анализа
- вагинальные мазки
- выросшие на питательных средах колонии бактерий
Комплектация набора






25 тест-полосок
25 пластиковых одноразовых пробирок, установленныхв пластиковый штатив;
1 бутылочка Реагента для экстракции 1 (5мл);
1 бутылочка Реагента для экстракции 2 (5мл);
25 стерильных тампонов для сбора материала;
1 пластиковая подставка с крышкой для исполнения анализа;
Проведение анализа
1. Вносят в пробирку несколько капель каждого
экстрагирующего реагента.
2. Погружают в смесь тампон на 2-5 мин.
3. Выжимают из тампона в пробирку жидкость.
4. Погружают в нее иммунохроматографическую
полоску на 5-10 мин.
5. Учитывают результаты через по появлению цветных
полос на тест-полоске (контрольной и тестовой).
Результат анализа учитывают через 5-10 мин после извлечения
тест-полоски из пробирки с разведенной пробой.
ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ
Проявляется розово-сиреневой полоской в контрольной зоне К и
отсутствием розово-сиреневой полоски в тестовой зоне T.


T К
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ
Проявляется розово-сиреневой полоской в контрольной зоне C и
аналогичной розово-сиреневой полоской в тестовой зоне T

TК
СОМНИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ
При отсутствии видимой розово-сиреневой полоски в контрольной
зоне C и результаты анализа оценивают как сомнительные. Тест
проводят повторно.



TК
Стреп-В-Стик
Mетод бактериологического
выделения
Положительные Oтрицательные
ВСЕГО
Положительные
46
6
52
Oтрицательные
8
372
380
54
378
432
ВСЕГО
Перекрестных реакций со стрептококками других групп не зарегистрировано в
течение 8 лет применения теста.
Применение ИХТ позволяет в течение 5-10 мин
определить наличие инфекции у пациента.
Специфичность показания теста 97,9%,
чувствительность - 88,4%.
СтрепВСтик выявляет группоспецифический антиген
Str. agalactiae. Поэтому детектирует инфекцию всех серотипов возбудителя.
Перекрестных реакций со стрептококками других групп не зарегистрировано в течение 8 лет
применения теста.
Таким образом, ИХТ способен обеспечить скрининг на инфекцию СГБ. В случаях, когда имеется
подозрение на инфицированность беременной женщины агалактийным стрептокком (данные
анамнеза, результаты ранее проводившегося бактериологического анализа, наличие
клинических проявлений инфекции) прибегают к посеву материала на питательные среды и
идентификации возбудителя по традиционной схеме.
Применение ИХТ облегчает осуществление системы профилактики заражения новорожденных
детей СГБ и делает ее более надежной.