исследовательская работа Саломаткин Н.М

Обсемененность денежных знаков, находящихся в обороте г. Тара и
Тарского района, анаэробной и аэробной микрофлорой
Саломаткин Никита Максимович
БПОУ «ТИПК»
Обухова Л.Г, преподаватель
ВВЕДЕНИЕ
Благодаря исключительному разнообразию усвоения питательных
веществ, малым размерам и легкой приспособленности к различным внешним
условиям бактерии могут быть обнаружены там, где отсутствуют другие
формы жизни, к примеру, на денежных купюрах и монетах. [4]
Актуальность проблемы и темы исследования заключается в
очередном напоминание обществу о том, что в любой ситуации необходимо
помнить о правилах личной гигиены, о том, что патогенные микроорганизмы
окружают нас везде, в том числе и на денежных знаках.
Практическая значимость исследовательской работы заключается в
применении материала на лекционных, лабораторно - практических и
семинарских
занятиях
по
предмету
«Экология»,
«Биология»,
«Естествознание».
Гипотеза исследования: денежные знаки, находящиеся в обороте
города Тары и Тарского района являются носителями анаэробной и аэробной
микрофлоры.
Объект: денежные знаки, находящиеся в обороте города Тары и
Тарского района.
Предмет исследования: анаэробные и аэробные микроорганизмы,
смытые с денежных знаков, находящиеся в обороте города Тары и Тарского
района.
Цель: исследовать денежные знаки, находящиеся в обороте города
Тары и Тарского района, на обсемененность микроорганизмами.
Для реализации цели исследования и выдвинутой гипотезы поставлены
следующие задачи:
1)
Проанализировать нужное количество литературы по предмету
микробиология и нумизматика (состав и производство денежных знаков).
2) Выбрать
методику
для
проведения
необходимых
микробиологических анализов.
3) Произвести все необходимые анализы.
4) Выявить на денежных знаках анаэробную и аэробную микрофлору.
5) Определить патогенность выделенных культур.
Исследование проводилось в филиале ФБУЗ «Центр гигиены и
эпидемиологии в Омской в Тарском районе». Работа содержала 8 этапов.
Сроки проведения исследования с 11.01.2016 по 22.01.2016 года.
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕНЕЖНЫХ ЗНАКОВ НА
ОБСЕМЕНЕННОСТЬ АЭРОБНОЙ И АНАЭРОБНОЙ МИКРОФЛОРОЙ
Первый этап: смыв микрофлоры с денежных знаков на жидкую
питательную среду.
Перед выполнением работы был проведен инструктаж по технике
безопасности.
В нашей исследовательской работе мы использовали следующие
жидкие среды: среда Кесслер, среда Кода и 1% пептонно - солевой раствор.
Признаком роста микрофлоры на среде Кесслер является наличие газа. Среда
Кода - признаком роста бактерий является изменение цвета среды с темнозеленого до ярко-желтого; 1% пептонно - солевой раствор - признаком роста
микроорганизмов является помутнение раствора. [1]
Перед началом исследования все пробирки были подписаны и
пронумерованы соответственно количеству денежных купюр и монет.
В
день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливали (в условиях
бокса над горелкой) по 2,5-3 мл стерильной питательной среды, чтобы
ватный тампон не касался жидкости. (Прил. 1, рис.1) Непосредственно перед
взятием смыва тампон увлажняют средой. Все манипуляции производят над
пламенем горелки. Тампоном, который держали в руке между указательным,
средним и большим пальцами (подобно карандашу или ручке), захватывали
небольшое количество питательной среды, и производили
со всей
поверхности денежного знака смыв. В открытую и наклоненную пробирку
вводили тампон с посевным материалом, слегка погружая тампон в среду.
(Прил. 1, рис.2) [3]
После того как был сделан смыв со всех денежных знаков, пробирки
помещали в термостат на 1-2 суток, при температуре 37 °С. (Прил.1,рис.3)
Второй этап: Пересев на пластинчатую питательную среду.
Выставляли на рабочий стол посевы первого этапа, изучали, делали
выводы. (Приложение 2, рис.1)
Пересев - это перенос выращенных микроорганизмов в свежую
стерильную питательную среду. Во втором этапе нашей работы мы
использовали 2 вида пластинчатых сред: среда эндо и желточно-молочносолевой агар. Эндо среда (S. Endo) - готовая среда прозрачна и имеет бледнорозовый цвет. Желточно-молочно-солевой агар - готовая среда имеет бледно
- желтую окраску. [2]
При посеве на твердую среду пользовались одной чашкой Петри,
разделив ее на несколько секторов, одну чашку не засевали, она была
контрольной средой для анализа. (Прил.2 рис.1)
На среду Эндо мы пересевали посевы из пробирок «Кесслер» и «Кода».
На ЖМС агар – из пробирок с «1% пептонно - солевой раствор».
Брали в левую руку чашку Петри со средой, приготовленной заранее, а
в правую – металлическую петлю. Над пламенем горелки петлю держали
вертикально, чтобы проволока на всем протяжении была одновременно
накалена докрасна, т. е простерилизована. Посев на пластинчатую среду
производили мягкими движениями, проводя штрихи, при этом за границу
сектора старались не заводить, что бы после инкубирования колонии четко
отличались друг от друга. (Прил.2, рис.2, 3) [5]
По окончанию работы
все чашки
перемещали в термостат для
культивирования в течение суток при температуре 37°С.
Третий
этап:
изучение
роста
микробов
на
плотной
питательной среде и подсчет количества колоний.
Микробной колонией называют популяцию, т.е. потомство микробов
одного и того же вида, возникшие в результате размножения одной
микробной клетки. [8]
На рабочий стол выставляли чашки с посевом. (Прил.3рис.1).
Выращенные культуры просматривали сначала с помощью лупы, а затем
помещали их на столбик микроскопа вверх дном, просматривали колонии в
проходящем свете с объективом малого увеличения.
В чашке Петри: «2 р.» количество микробных клеток составило 44
-«5 р.» - 52
- «10 р. б» -66
- « 50 р.»- 82
- «100 р.»- 98
Пересевы с остальных денежных купюр и монет («1р.», «10 р. м»., «500
р.», «1000р»., «5000 р.» не подтвердили наличие микрофлоры, в дальнейшем
исследовании они не участвовали.
В ходе изучения культур в чашках Петри «2 р.», «5 р.», «10 р. б», « 50
р.», «100 р.» с помощью микроскопа были обнаружены различные по цвету,
форме колонии.
Четвертый этап: Приготовление мазков с выращенных культур,
микроскопирование.
На
фиксированный
мазок
ложили
фильтровальную
бумажку,
обработанную по Синеву. (Прил. 4 рис.1) На ее поверхность наносили
несколько капель (3 - 4) дистиллированной воды и выдерживали в течение
двух минут. Бумажку снимали пинцетом, оставшуюся жидкость сливали и
промывали водой. Затем наливали раствор Люголя на 2 мин. (Прил. 4 рис.2)
После слива раствора мазок обесцвечивали 96%-ным спиртом путем
нанесения его на 20 - 30 сек. Мазок промывали водой. На 1 - 2 мин наливаем
фуксин
Пфейффера,
затем
краску
смывали,
препарат
высушивали
фильтровальной бумагой. (Прил.3 рис 3) [5]
Результаты окраски под микроскопом: Грамположительные микробы
окрашивались
основными
грамотрицательные
красителями
бактерии,
в
воспринимая
темно-фиолетовый
дополнительную
цвет
окраску,
приобретали ярко- малиновый цвет. (Прил.4рис. 4, 5)
A) Чашки Петри «2 р.», «5р.». Колонии, представляющие собой
скопление микробных клеток белого цвета, а также золотистые клетки
круглой формы окрашивались в темно - фиолетовый цвет.
Б) В результате окраски колоний взятых из чашки Петри «10р. б. », под
микроскопом мы наблюдали бактерии, окрашенные в различные цвета, что
говорило нам о неоднородности данной культуры, в которой имелись как
грамположительные, так и грамотрицательные микробные клетки. Колония,
состоящая из клеток круглой формы с правильными краями кремового цвета,
окрашивалась в темно - фиолетовый цвет. Три колонии серовато - голубого
цвета палочковидной формы окрашивались ярко - малиновым цветом. Одна
колония,
имеющая
вид
стелющегося
мутно
-
белого
налёта,
с
многочисленными скоплениями вокруг, окрашивалась грамотрицательно.
B)
В результате окраски колонии, взятой из чашки Петри «50р.»,
состоящей из клеток круглой формы с правильными краями золотистого
цвета, окрашивалась в темно - фиолетовый цвет. Одна колония, имеющая вид
стелющегося мутно - белого налёта, с многочисленными скоплениями вокруг
и две колонии серовато - голубого цвета окрашивалась грамотрицательно.
В) В результате окраски колоний взятых из чашки Петри «100р.» под
микроскопом мы наблюдали две колонии, имеющие вид стелющегося мутнобелого налёта, с многочисленными скоплениями вокруг, а также три колонии
серовато - голубого цвета палочковидной формы, окрашивались в ярко малиновый цвет.
Пятый этап: выделения чистых культур и определение рода и
вида микроорганизмов.
Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов,
принадлежащих к одному виду. [6]
В
нашей
применялся
исследовательской
метод
рассеивания
работе,
по
после
способу
микрокопирования,
Дригальского
на
соответствующую среду, т.е. грамположительные кокки на МПА, а
грамотрицательные палочки на среду Эндо. [2]
На рабочий стол выставляли все чашки Петри «2р.», «5р.», «10р.б»,
«50р.», «100р.». Пересев производили также как и во втором этапе.
А) Из чашки Петри «2р.» «5р.» рассеивали культуру на две чашки
Петри со средой МПА. (Прил. 5 рис.1)
Б) Из чашки Петри «10р.б» производили рассеивание двух видов
колоний (различных по ряду признаков) на среды Эндо, так как они в
предыдущем анализе окрашивались в ярко - малиновый цвет (один вид
состоял из 1 колонии, а другой - из трех колоний). А колонию, которая
окрашивалась грамположительно, пересеивали на среду с МПА. (Прил. 5
рис.2)
В) Из чашки Петри «50 р.», в которой выделили 3 грамотрицательные
колонии, материал рассеивали на чашки со средой Эндо (три колонии - на
три чашки). А одну колонию пересеивали на среду с МПА, так как она
состояла из грамположительных микроорганизмов. (Прил. 5 рис.3)
Г)
Из
чашки
Петри
«100р.»,
в
которой
выделили
только
грамотрицательные колонии (пять колоний), рассеивали на чашки Петри со
средой Эндо( пять колоний на среду Эндо).
Закончив пересев подвели итог: чашек Петри с МПА, на которые мы
рассевали материал, оказалось в итоге 6 штук, а чашек со средой Эндо - 10.
Все подписанные чашки Петри с пересееным материалом переносили в
термостат, устанавливали температуру 37°С, оставляли для прорастания на
24 часа.
Приготовление и окрашивание мазков по Граму, их фиксацию
осуществляли также как и при окрашивании, данным методом первичных
посевов.
A) Чашки Петри «2.1р.», «2.2р.», «5.1р.», «5.2р.», «10.1р.», «50.1р.»
содержали колонии, которые окрашивались в темно - фиолетовый цвет,
следовательно, микроорганизмы этих колонии грамположительные кокки.
Г) В
чашках Петри «10.2р.», «10.3р.», «50.2р.», «50.3р.», «50.4р.»
«100.1р.», «100.2р.», «100.3р.», «1000.4р.», «100.5р.»
микробные клетки
окрашивались в ярко - малиновый цвет, что свидетельствовало о том, что это
грамотрицательные палочки.
Шестой этап: изучение биохимические свойства микроорганизмов.
Из изучаемых колоний делали отсевы в бульон и инкубировали при
37°С 18 - 24 ч. Далее из нее готовили взвеси в бульоне или физиологическом
растворе.
Для
исследования
ферментативных
свойств
выращенных
нами
культур, применяли заранее приготовленный в лаборатории «пестрый» ряд
следующего состава: глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит, уреаза.
Каждый ряд - для каждой чашки Петри (16 «цветной» ряд - для 16 чашки с
посевами). (Прил. 6 рис. 1)
Учет результатов проводили через 18 - 24 ч инкубации при 37°С. Все
полученные результаты, фиксировали в заранее приготовленной таблице.
Ферментацию углевода отмечали знаком (+); цвет среды не изменен - ( - ),
газообразование - наличие газа в газовках или его пузырьков в полужидкой
среде обозначали буквой «Г». Все полученные результаты, фиксировали в
заранее приготовленной таблице.
Анализ таблицы (Прил. 6 табл.1)
A) В чашках Петри «2.1р.», «5.1р.», «10.1р.», «50.1р.», были
выращены культуры, микроорганизмы которых разлагают с образованием
газа
лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, но не разлагают уреазу.
Б) В чашках Петри «10.3 р.», «50.3 р.», «50.4 р.», « 100.3 р», «100.4 р.»,
«100.5 р.» микроорганизмы в пробирках с лактозой, глюкозой, маннитом,
мальтозой изменяли цвет с соломенно - желтого на ярко – малиновый, а в
пробирках с сахарозой и уреазой после инкубации, не произошло ни каких
изменений.
B) В чашках Петри «2.2р.», «5.2р» выросли культуры, которые
разлагали
лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу. Не разлагали уреазу и маннит.
Г) В чашках Петри «10.2 р.», «50.2 р.», «100.1р.», «100.2р.» мы
наблюдали разложение глюкозы, сахарозы, мальтозы. В пробирках с
маннитом, и лактозой мы не наблюдали ни каких изменений.
Седьмой этап: установка вида микроорганизмов по определителям
микробов Н.А. Красильникова.
В чашках Петри «2.1 р.», «5.1р.», «2.2р.», «5.2р.», «50.1 р.», «10.1р.»
выращенные культуры по большинству признаков идентичны. Все колонии,
выросшие в перечисленных чашках Петри, являются представителями рода
Staphylococcus: шаровидная форма, расположение колоний в виде грозди
винограда, грамположительное окрашивание по Граму, грубозернистая
структура, плотный центр, отсутствие прозрачности, ферментация глюкозы,
лактозы, сахарозы, отсутствие разложение уреазы. [5]
А) В чашках Петри «2.2р.», «5.2р.», была выращена культура
Staphylococcus, но главный отличительный признак - золотистый цвет,
отсутствие реакции в пробирки с маннитом указывала на принадлежность
данного вида микробов к типу «золотистый» стафилококк» (Staphylococcus
aureus).
Б) В результате проведения исследования в чашках Петри «2.1р.»,
«5.1р.», было установлено, что в данных чашках выращена культура, которая
по всем полученным признакам схожа с признаками, характеризующими
форфорно - белый стафилококк (Staphylococcus haemolyticus), и обладает
главными отличительными признаками - белый цвет колоний.
В) В чашке Петри «10.1р.» выросла культура, которая относится к роду
Staphylococcus.
Но
данные
колонии
обладали
и
индивидуальными
признаками: кремовый цвет, разложение мальтозы, а также отсутствие
разложения маннитата - это признаки вида стафилококк кремовый
(Staphylococcus hominis).
Г) Используя определитель микробов Н.А. Красильникова, в чашках
Петри «10.2 р.», «50.2 р.», «100.1р.», «100.2» мы обнаружили еще один род
микроорганизмов
протей
-
обыкновенный
(Proteus
vulgaris)
–
микроорганизмы палочковидной формы, на мясо - пептоном агаре растут в
виде плоского, мутного стелющегося налета, в окрашенных мазках можно
наблюдать ярко - малиновые клетки, разлагали глюкозу, сахарозу, мальтозу,
не реагировали с маннитом и лактозой. [2]
Д) В чашках Петри «10.3 р.», «50.3 р.», «50.4 р.», «100.3р.», «100.4р.»,
«100.5р.» были выращены микроорганизмы, которые обладали идентичными
признаками
рода
кишечной
палочки
(Escherichia
coli).
Колонии
представлены микроорганизмами палочковидной (правильно круглой)
формы, в окрашенных мазках из культуры можно наблюдать ярко малиновые клетки. На чашках со средой МПА они имеют круглую форму,
ровный четко очерченный край, серо – голубой цвет колоний. Ферментирует
с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, не
реагирует с сахарозой и уреазой . [1]
Восьмой этап: тесты дифференциации патогенных и непатогенных
микроорганизмов.
С каждой чашки
Петри,
на
которых
были
обнаружены
и
выявлены колонии стафилококков «2.1 р.», «5.1р.», «2.2р.», «5.2р.», «50.1 р.»,
«10.1р.» производили пересев , идентично первичному посеву на чашки
Петри со средой Эндо. Далее чашки Петри (с посевом и контрольную)
помещали в термостат. Инкубация посевов при температуре 37 °С длилась
18-24 часа.
А) После инкубации чашек Петри «50.1 к.», «10.1р.» (колонии
золотистого стафилококка) по сравнению с контрольной чашкой Петри, были
обнаружены четкие зоны гемолиза (агар становится совершенно прозрачным,
бесцветным), что говорит о том, что колонии состоят из микроорганизмов
гемолитически активных - безусловно патогенных. [3]
Б) После инкубации в чашке Петри «2.1 р.», «5.1р.», «2.2р.», «5.2р.» не
был обнаружен
гемолиз, цвет агара
не изменился, следовательно,
стафилококк кремовый(Staphylococcus hominis) и фосфорно - белый
(Staphylococcus haemolyticus) не являлись патогенными.
Далее исследовали на патогенность энтеробактерии: кишечную
палочку (Escherichia coli) и протея обыкновенного (Proteus vulgaris),
выращенных соответственно в чашках Петри «10.3 р.», «50.3 р.», «50.4 р.»,
«100.3р.», «100.4р.», «100.5р.», «10.2 р.», «50.2 р.», «100.1р.», «100.2р.»
С материалом каждой чашки Петри отдельно ставили реакцию
агглютинации на предметном стекле с неразведенной агглютинирующей
комплексной ОВ - сывороткой, представляющая собой смесь типовых ОВсывороток к наиболее распространенным типам энтеропатогенных палочек.
[5]
А) Образование хлопьев в сыворотке, по сравнению с контрольным
стеклом, колоний взятых с чашек Петри «10.3 р.», «50.3 р.», «50.4 р.»,
«100.3р.», «100.4р.», «100.5р.». Положительная реакция агглютинации
свидетельствует о патогенности кишечной палочки.
Б) Чашки Петри «10.2 р.», «50.2 р.», «100.1р.» по внешним признакам
после инкубации не чем не отличались от контрольной чашки Петри.
Следовательно в этих чашках не произошло ни каких реакций и
отрицательный результат доказал нам, что колонии протея обыкновенного
выявленного нами, не патогенны.
Выводы
В начале для достижения цели исследовательской работы были
поставлены определенные задачи, которые в период проведения работы
были полностью выполнены.
Обсемененность аэробной и анаэробной микрофлорой
выбранных
нами денежных знаков г. Тары составляет следующее:
На монетах достоинством 1 рубль и 10 рублей и бумажных купюрах
номиналом -500, 1000, 5000 рублей микроорганизмов обнаружено не было.
В результате всех проведенных опытов с остальными объектами
исследования
было выделено 14 культур: 6 культур кишечной палочки
(Escherichia coli), 2 культуры - золотистого стафилококка (Staphylococcus
aureus), 4 - обыкновенного протея (Proteus vulgaris), 1 - форфорово - белый
стафилококк
(Staphylococcus
haemolyticus),
l
стафилококк
-кремовый
(Staphylococcus hominis).
Безусловно,
патогенными
колониями
оказались
-
золотистый
стафилококк (Staphylococcus aureus) и кишечная палочка (Escherichia coli).
Колонии
кремового
и фосфорно - белого
стафилококка, а также
обыкновенного протея оказались непатогенными.
Источниками
кишечных
инфекций
являются
патогенные
микроорганизмы, которые находятся на денежных знаках г. Тары - что было
подтверждено в процессе исследовательской работы. Патогенными оказались
споры микроорганизмов золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus), a
также кишечной палочки (Escherichia coli).
Следовательно,
гипотеза
«Денежные
носителями анаэробной и аэробной
знаки
микрофлоры»,
г.
Тары
являются
после подведения
итогов исследовательской работы, полностью подтверждена.
Использованная литература
1. Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии.- М.- 1997.
2. Бухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных
экосистемах. - Екатеринбург, 2007
3. Васильев Д.А.,С.Н. Золотухин, Е.А. Корнеев «Руководство к
практическим занятиям по микробиологии (малый практикум) М.,- 2003
4. Венедиктов Н. Как делать деньги?/ Николай Венедиктов// Техника молодежь № 2 - М. -1996г С. 44 - 45.
5. Плешакова В.И Методические указания к лабораторным занятиям
по дисциплине « Микробиология и иммунология» Раздел: «Методы
выделения чистых культур аэробов и анаэробов». Омск 2004.
6. http://supotnitskiy.webspecialist.ru/bookybookl-1 -3.htm
7. http://www.money-world.ru/money_2.php
8. http://www.o-dengah.ru/1 http://nature.web.ru
Приложение
Приложение 1. Первый этап: смыв микрофлоры с денежных знаков на
жидкую питательную среду.
Рис.1 Подготовка к экспертизе
денежных знаков.
Рис.2 Смыв на жидкие питательные среды.
Рис.3 Перенос смывов в термостат.
Приложение
2.
Второй
этап:
Пересев
на
пластинчатую
питательную среду.
Рис. 1 Первичный анализ смывов с денежных знаков.
Рис.2 Пересев на пластинчатую среду МПА
Рис.3 Пересев на пластинчатую среду ЖМС.
Приложение 3 . Третий этап: изучение роста микробов на плотной
питательной среде и подсчет количества колоний.
Рис. 1 Анализ выращенных культур.
Приложение 4. Четвертый этап: Приготовление мазков с выращенных
культур, микроскопирование.
Рис.1 Приготовление мазков.
Рис.2 Окрашивание мазков методом Грама.
Рис. 3 Фиксация мазков.
Рис.4 Микроскопирование окрашенных мазков.
Приложение 5. Пятый
этап: выделения чистых культур и
определение рода и вида микроорганизмов.
Рис.1 Определение рода и вида выращенных культур на денежном
знаке «5 р.»
Рис.2 Определение рода и вида выращенных культур на денежном
знаке «10 р.»
Рис.3 Определение рода и вида выращенных культур на денежном
знаке «50 р.,» «100р.»
Приложение 6. Шестой этап: изучение биохимические свойства
микроорганизмов
Рис.1 Пестрый
ряд Гисса.
Таблица 1 Исследование биохимических свойств выращенных
культур.
Чашки Петри
«2.1р.»
«2.2р.»
«5.1 р.»
«5.2 р.»
«10.1р.б»
«10.2р.б»
«10.3р.б.»
ррр.б»р.б»
«50.1 р.»
«50.2 р.»
«50.3 р.»
«50.4 р.»
«100.1»
«100.2»
«100.3»
«100.4»
«100.5»
лактоза
Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
глюкоза
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
маннит
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
сахароза
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
-
мальтоза
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
+Г
уреаза
+Г
+Г
+Г
+Г
-