среды

http://www.coolreferat.com/%D0%9F%D0%B8%D1%82%D0%B0%D1%82%D0%B5%D0%BB%D1%8C%D0%
BD%D1%8B%D0%B5_%D1%81%D1%80%D0%B5%D0%B4%D1%8B_%D0%B8_%D0%B8%D1%85_%D0%BA%D0%BB
%D0%B0%D1%81%D1%81%D0%B8%D1%84%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F
Микробы, как любые другие живые организмы свое развитие и рост, обновление
строительного материала, обеспечение энергетических процессов осуществляют за счёт
постоянного обмена веществ с окружающей его внешней средой, т.е. путём питания и
дыхания. В зависимости от типа питания микробы подразделяют на аутотрофы (способные
усваивать углерод из СО2, а также молекулярный азот из воздуха, а минеральные вещества
путём хемо- или фотосинтеза) и гетеротрофы (способны усваивать углерод и другие
вещества только из готовых органических соединений). К аутотрофам относятся в основном
многие почвенные бактерии, к гетеротрофам (параторофам) – микробы инфекционных
болезней животных и растений.
Типы питания, дыхания (аэробы и анаэробы), индукцию и активность ферментов, токсинов,
пигментов, рост и размножение являются основными физиологическими параметрами,
которые учитывают при разработке составов питательных сред и условий
культивирования микробов in vitro.
2. Культивирование микроорганизмов.
Культивировать микроорганизмы – это значит искусственно создавать условия для их
роста и размножения in vitro, взаимосвязанных, но не обязательно сопряжённых процесса.
Рост и размножение –циклический 4-х фазный процесс (латентная, логарифмического
роста, стационарная, гибель). Период между образованием новых клеток и их делением
называется периодом генерации, на длительность которого, кроме особенностей микроба,
влияет состав питательной среды. Формы колоний разных микробов на питательной среде
одного и того же состава отличаются, что учитывают при их дифференциации.
Для культивирования in vitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы могут
использовать в качестве питательных веществ для своего роста и размножения. Такие
питательные субстраты – плотные или жидкие – называют культуральными или
питательным средами. В большинстве случаев в микробиологических лабораториях
микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных колбах, пробирках и других
сосудах.
К любой питательной среде предъявляют ряд основных требований:
1). Стерильность и по возможности прозрачность.
2). При составлении питательных сред учитывают потребность микроорганизмов в
элементах питания (необходимые для жизнедеятельности клеток биохимические факторы –
источники энергии, С, N, S, а также неорганические ионы – доступные для усвоения
микроорганизмами).
3). Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных
ионов (pH), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (aw),
осмотического давления.
3. Классификация питательных сред и способы их получения.
В зависимости от видовой принадлежности микробов и целей культивирования
консистенция и составы культуральных сред бывают разными и варьируют в широких
пределах. Среда, отвечающая биологическим особенностям микроба и обеспечивающая его
рост и размножение, называется полноценной, не имеющая какого- либо компонента,
необходимого для его жизнедеятельности – дефицитной.
Питательные среды классифицируют в зависимости от:
v
Ø
·
химического состава и исходных компонентов;
консистенции;
целевого назначения.
В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие
типы питательных сред:
- среды неопределенного химического состава (естественные или натуральные среды) – это
среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения,
имеющие сложный неопределенный химических состав:
1)
молоко и т.д.)
среды животного происхождения (исходные продукты – мясо, рыба, яйца,
2)
среды растительного происхождения (исходные продукты – соя, горох,
картофель, морковь и т.д.)
На естественных средах хорошо развиваются микроорганизмы, однако эти среды
малопригодны для контролируемого изучения физиологии обмена веществ
микроорганизмов и диагностических исследований, поскольку они не позволяют учитывать
потребности ряда компонентов среды, а с другой стороны определять вещества,
образующие микроорганизмами. Естественные среды используют главным образом для
поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.
«Полусинтетические» среды (гидролизатные), относящиеся к средам с неопределенным
составом. В них, наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества
неопределенного состава. Их используют в микробиологической практике для получения
витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности
микроорганизмов (продукты гидролиза мяса, молока, дрожжей, крови и др. белковых
веществ).
Среды известного химического состава (синтетические) – в их состав включают известные
химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т.д.) в оптимальном
количественном соотношении. Синтетические среды по составу бывают простыми или
имеют относительно большой набор компонентов. Их используют, когда выращиваемую
клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических
соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических
аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или
ином конкретном химическом соединение. Кроме того, исследователи стремятся определить
для каждого микроорганизма минимальные потребности в питательных веществах и,
исходя из этого, создать минимальную среду, содержащую лишь необходимы для его
размножения химические соединения.
По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.
Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы
исходных продуктов.
Полужидкие и плотные питательные среды. Используют для учёта количества бактерий,
выделения их в виде «чистой» культуры и других целей. Необходимую консистенцию среде
придают добавлением различных уплотнителей - агар-агар или желатину.
Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских
водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным количеством
азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,52%,полужидких –0,3-0,7%.
Желатина – кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и
хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют
протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для
применения.
По целевому назначению различают:
А).Общеупотребительные (основные) среды.
Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.
Мясная вода: Получение – мясной фарш заливают водопроводной водой 1:2, кипятят 1ч.,
затем фильтруют, доливают водой до первоначального объема, разливают по емкостям,
плотно закрывают и стерилизуют автоклавированием при 120ОС 20 мин.
Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир,
фасции, сухожилия нарезают, заливают кипящей водой 1:2, кипятят, охлаждают до 45 ОС,
добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия, встряхивают,
добавляют хлороформ, закрывают и выдерживают в теплом месте 10 дней.
Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления используют мясной бульон. К 1 л
мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка с высокой
молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г NaCI для создания
осмотической активности. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию
среды. Кипятят. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и
стерилизуют автоклавированием при 1200С 20 мин.
Мясо–пептонный агар (МПА): к 1 л МПБ добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара.
Среду нагревают до растворения агара, устанавливают слабощелочную реакцию среды
20%-ным раствором Na2CO3, фильтруют и через воронки разливают в пробирки,
стерилизуют автоклавированием при1200 20 мин.
Мясо-пептонная желатина (МПЖ). К 1 литру МПБ добавляют желатин до конечной
концентрации 10-20%, нагревают, устанавливают слабо-щелочную pH, кипятят,
фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром 3
дня или однократно автоклавированием при 1200С при 1 атм. течение 20 мин.
Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара,
кипятят до его расплавления, устанавливают требуемую pH, фильтруют в горячем виде и
стерилизуют автоклавированием.
Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водой 1:5 (1:8), добавляют 0,5%
NaСI, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают pH, кипятят 150-20 мин, фильтруют,
разливают по емкостям и стерилизуют автоклавированием при 1200 20 мин.
Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2% агар-агара.
Питательный бульон содержит: триптический гидролизат кильки –10,05, NaCI- 4,95. 15 г
порошка этого бульона растворяют а 1 л дист. Воды, кипятят 2 мин, фильтруют, разливают
по емкостям и стерилизуют а автоклаве при 1200С 20 мин (Ph 7,3).
Питательный агар содержит: ферментативный гидролизат кормовых дрожжей – 12 г, агар12,5 г; NaCI –5,5 г. Навеску 36 г полученного порошка растворяют в 1 л дист. Н2О, кипятят 3
мин, фильтруют, стерилизуют автоклавированием при1200С 20 мин (pН 7,3).
Б).Обогащенные среды.
Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на обще-употребительных средах,
поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие среды
получили название обогащенных.
Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному стерильному
питательному агару добавляют дефибринированной крови или сыворотки крови (лошади,
КРС, кролика). Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и
оставляют до застывания.
Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогично.
Растворы углеводов стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в
количестве 0,5- 1% к пит. среде.
В).Специальные среды.
Среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий.
Среда Мак-Коя: куриные яйца обрабатывают спиртом, проводят через пламя горелки.
Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 ч
физиологического раствора. Компоненты перемешивают и разливают в пробирки и
помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют.
Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсена и кроличьей сыворотки.
Смесь Зеренсена: раствор А: гидрофосфат натрия, вода дист.; раствор Б: дигидрофосфат
калия, вода дист. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем до 1000
мл, разливают по пробиркам, стерилизуют, а затем добавляют 6-8 капель стерильной
инактивированной сыворотки кролика.
Г). Элективные (избирательные) среды
Предназначены для культивирования определенных групп микроорганизмов,
обеспечивающие преимущественное развитие одного вида или группы родственных
микроорганизмов и менее пригодные или совсем не пригодные для развития других. Их
применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного
обитания и получения накопительных культур. Элективные среды чрезвычайно
разнообразны по своему составу. По консистенции среды данного типа могут быть
плотными и жидкими. Жидкие среды называются средами обогащения или накопления, их
применяют, когда ставят цель увеличить количество искомого микроорганизма смешанной
популяции. Среды стерилизуют автоклавированием текучим паром или в автоклаве под
давлением при 1 атм 12-30 мин.
Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков.
Среда Шустовой предназначена для выделения сальмонелл
Среды Раппопорта и Мюллера предназначены для культивирования сальмонелл.
Среда Кауфмана – это среда обогащения для сальмонелл
Казеиново - угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования
бордетелл.
Д). Дифференциально - диагностические среды.
Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. В состав этих сред входит
основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат
для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге pH
среды в результате расщепления субстрата.
Среды Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур
микроорганизмов. К 100мл дист. Воды добавляют 1% пептона, 0,5 г NaCI. Компоненты
растворяют, фильтруют, устанавливают pH,добавляют один из углеводов субстратов, агарагар, а затем индикатора Андрэдэ. Готовую среду разливают по 3мл в пробирки,
стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.
Среда Энда содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференцировки
бактерий, различающихся по способности расщеплять глюкозу.
Среда Левина, по целевому назначению аналогична среде Эндо, но содержит другой
индикатор.
Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве
субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры.
4. Культивирование грибов.
Лучший рост грибов отмечен на средах с содержанием углеводов 1…4%. При первичной
изоляции для подавления роста различных сопутствующих бактерий в питательные среды
часто добавляют различные антибиотики.
Агар Сабуро применяют для культивирования возбудителей дерматомикозов и
кандидамикоза.
Агар Чапека используют для культивирования грибов многих видов.
Сусло-агар предназначен для культивирования возбудителей дерматомикозов и
кандидомикоза.
Агар Литмана пригоден для культивирования дерматофитов.
Среда Ван-Итерсона предназначена для авыделения из кормов токсичных грибов,
вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохитоксикоз и др.
Среда Билай предназначена для получения макроконидий грибов.
Культивирование на волосах по Ванбрейзегему применяют при выделении дерматофитов.
Здоровые стерильные волосы прикрепляют коллодием к стеклянной трубочке. На середину
волос наносят культуру гриба. Трубочку помещают в цилиндр, на дно которого для
влажности наливают небольшое количество воды. Культивируют при 250С 5-10 дней и
более.
Для выделения возбудителей гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита применяют
кровяной агар.
5. Вывод.
Микроорганизмы культивируют на питательных средах. К универсальным средствам
относят мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон. Первая характеристика изучаемого
микроорганизма определяется способностью его роста на универсальных средах. На
плотных питательных средах многие микроорганизмы образуют колонии. Для
микроорганизмов, не растущих на обычных средах, используют специальные среды. Для
выделения каких-либо определенных видов, отличающихся особенностями роста,
применяют элективные среды.
Правильный подбор и использование питательных сред обеспечивает успешное
культивирование микробов для накопления биомассы и её биотехнологическое
использование для производства диагностических и вакцинных препаратов, определения и
идентификации микробов в диагностической лаборатории и научных исследованиях.
http://ru.wikipedia.org/wiki/%CF%E8%F2%E0%F2%E5%EB%FC%ED%E0%FF_%F1
%F0%E5%E4%E0
Требования, предъявляемые к средам
 быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для
удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в
среды вносят факторы роста - витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может
синтезировать.
 иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - pH, т.к. только при оптимальной реакции
среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.
Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2-7,4). Исключение
составляют холерный вибрион - его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5-9,0) и возбудитель
туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2-6,8).
Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не
изменили pH, среды́ должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты
обмена.
 быть изотоничными для микробной клетки; т.е. осмотическое давление в среде должно быть
таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая
0,5% раствору натрия хлорида.
 быть стерильными, т.к. посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба,
определению его свойств и изменяют свойства среды.
 плотные среды́ должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов
консистенцию.
 обладать определённым окислительно - восстановительным потенциалом, т.е. соотношением
веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Например, анаэробы
размножаются при RH2, не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10.
 быть по возможности унифицированным, т.е. содержать постоянное количество отдельных
ингредиентов.
Желательно, чтобы среды́ были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче
заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.
Классификация
 По исходным компонентам:
o натуральные среды - готовят из продуктов животного и растительного происхождения(мясо,
костная и рыбная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)
o синтетические среды - готовят из определённых химически чистых органических и неорганических
соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.
 По консистенции( степени плотности):
o жидкие
o полужидкие
o плотные
Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым прибавляют агар-агар или
желатин. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свёрнутую сыворотку крови, свёрнутые
яйца, картофель, среды с селикагелем.Некоторые микроорганизмы используют желатин как
питательное вещество - при их росте среда разжижается.

o
o

o
По составу:
простые: мясопептонный бульон(МПБ), мясопептонный агар(МПА), , питательный желатин,
сложные - готовят прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества.
По назначению:
основные - служат для культивирования большинства патогенных микробов. МПБ, МПА, бульон и
агар Хоттингера, пептонная вода.
o специальные - служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых
средах.
o элективные( избирательные) - служат для выделения определённого вида микробов, росту
которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов.Среды
становятся элективными при добавлении к ним определённых антибиотиков, солей, изменения pH.Жидкие
элективные среды называют средами накопления.
o дифференциально-диагностические - позволяют отличить один вид микробов от другого по
ферментативной активности.
o консервирующие - предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого
материала.
Приготовление сред
Посуда для приготовления сред
Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например
щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в
среду при варке её в ржавых кастрюлях. Лучше пользоваться стеклянной, эмалированной или
алюминиевой посудой. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть,
прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятат 30 минут 1-2%
растворе хлороводородной кислоты, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.
Сырьё
Исходным сырьём для приготовления большинства сред служат продукты животного и
растительного происхождения, а также готовые полуфабрикаты.
Этапы приготовления
1. варка: среды варят на открытом огне, водяной бане,автоклаве или варочных котлах.
2. установление pH: ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного
определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2,
поэтому сначала готовят более щелочной раствор.
3. осветление производят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок
куриного яйца или сыворотку крови.
4. фильтрация жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный
или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена - они быстро застывают. Обычно их
фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
5. разливают среды не более чем на ¾ емкости, т.к. при стерилизации могут намокнуть пробки и
среды утратят стерильность.
6. стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте.
7. контроль
 для контроля стерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают.
 химический контроль окончательно устанавливает pH, содержание общего и амминого азота,
пептона, хлоридов.
 для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными
культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды.