Экстрасинаптическая секреция нейротрансмиттеров
реклама
На правах рукописи Чистопольский Илья Александрович ЭКСТРАСИНАПТИЧЕСКАЯ СЕКРЕЦИЯ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ: ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ИЗОЛИРОВАННОГО НЕЙРОНА КАК БИОЛОГИЧЕСКОГО СЕНСОРА 03.03.01. - физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научный руководитель: Официальные оппоненты: доктор биологических наук Сахаров Дмитрий Антонович, ИБР РАН доктор биологических наук, профессор Гомазков Олег Александрович, РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН кандидат медицинских наук Шевелкин Алексей Валерьевич, РАМН НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра высшей нервной деятельности. Защита диссертации состоится « 01 » 02 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru. С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Автореферат разослан «___»______________20__ года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ele0806@yandex.ru 2 Абрамова Е.Б. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Согласно логике классической синаптической парадигмы, для работы нервной системы не требуется нескольких, даже двух медиаторов. В реальной же нервной системе множество медиаторов работают совместно. В попытке логически разрешить «противоречие» между разнообразием эргичности нейронов и представлением о достаточности одного химического посредника для работы нервной системы, были высказаны соображения о том, каким образом это разнообразие участвует в работе нервной сети (Сахаров, 1985, 1990). Кодирование передающих сигналов в такой сети предполагается не посредством синаптических связей нейронов между собой, а наличием рецепторного поля к тому или иному химическому агенту, выделяемому нейроном-передатчиком. Такая передача не требует обязательной локализации всего процесса внутри синапса, т.к. адресация в ней производится не локализацией места передачи, а типом рецепторов к медиатору, расположенных на мембранах нейронов как вблизи, так и в удалении от зоны медиаторного выброса. Известные на сегодня описания элементов такой «несинаптической» передачи в нейрональных сетях конкретных животных пытаются объединить в одной группе феноменов. С другой стороны, синаптической доктрине противоречат феномены, которые относят к экстрасинаптической секреции («объемной передаче», volume transmission, VT) (Zoli,1999; Agnati,2010; Sykova, 2008). Вместе с тем, функции и механизмы экстрасинаптической секреции остаются в целом неясными, методы ее исследования разработаны недостаточно и требуют новых подходов. Необходимо изучение того, как экстрасинаптическая секреция проявляет себя в работе нервных систем реальных животных. Цель и задачи исследования. Цель работы – выявление механизмов химических несинаптических взаимодействий в работе простой центральной нервной системы (ЦНС). В работе предстояло решить следующие задачи: 1. Разработать методику с использованием биосенсора для регистрации нейроактивных веществ, выделяемых нейронами в нейропиль ганглиев ЦНС моллюска. 2. Выявить участие нейроактивных веществ, действующих по механизму безадресного межнейронального взаимодействия, в работе простой ЦНС моллюска Lymnaea stagnalis. 3. Оценить функциональную значимость и эффективность таких нейроактивных веществ в работе нейронов ЦНС, участвующих в реализации локомоторного поведения моллюска. 4. Выяснить, проявляют ли себя феномены экстрасинаптического межнейронального взаимодействия при генерации нейронами ЦНС моллюска программы фиктивного пищевого поведения. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые системно и в разных модификациях зарегистрированы в режиме реального времени экстраклеточные химические процессы, которые относят к 3 несинаптическим взаимодействиям. С этой целью была применена собственная методическая разработка – биосенсор на основе изолированного нейрона. Применение нового метода впервые дало возможность визуализировать регистрацию и позволило исследовать несинаптические взаимодействия в интактной, фиктивно работающей нервной системе. Метод позволяет тестировать химическую обстановку вблизи поверхности ганглиев моллюска и отслеживать ее изменения, наблюдать в режиме реального времени работу нейроактивных факторов, выделяемых в объем ганглия. Разработанные методические приёмы, продлевающие на многие часы рабочее состояние изолированного нейрона, впервые позволили регистрировать химические изменения межнейронального пространства простой нервной системы, связанные со спонтанным переключением ее функциональных состояний. Результаты экспериментов говорят о важности феномена экстрасинаптической секреции в работе нервной системы исследованного объекта, моллюска Lymnaea stagnalis. Они позволяют выявить специфику объемной межнейрональной передачи, а также очертить круг функций, с которыми может быть связан феномен экстрасинаптической секреции. Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи были решены с применением современных методов электрофизиологии. Кроме того, была отработана не применявшаяся ранее методика для многочасовой детекции нейроактивных веществ истекающих из нейропиля ЦНС. Выводы сформулированы четко и соответствуют заявленным целям и использованным методам. Написание и оформление диссертации осуществлено в соответствии с предъявляемыми требованиями. Научные положения и выводы, изложенные в работе, обоснованы и опираются на квалифицированный анализ собственных исследований и данных литературы. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: Simpler nervous systems. VI East European conference of the ISIN, September 22-24, Moscow-Pushchino, 2000.; VIII Всероссийская конференция, посвященная 100-летию со дня рождения Х.С. Коштоянца, октябрь 25-27, 2000.; Simpler nervous systems. VII East European conference of the ISIN, September 12-16, Kaliningrad-Svetlogorsk-Otradnoe, 2003.; Конференция «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты», 14-16 марта, Москва, 2005.; 35th annual meeting of the Society for Neuroscience, 13-16 November, Washington, USA, 2005.; Simpler nervous systems. VIII East European conference of the ISIN, September 13-17, Kazan, Russia, 2006.; 11th Symposium on invertebrate neurobiology, August 25-29, Tihany, Hungary, 2007.; Конференция «Механизмы нервных и эндокринных регуляций, ноябрь 24-26, Москва, 2008.; Simpler nervous systems. IX East European conference of the ISIN, September 9-13, S-Peterburg, Russia, 2009.; 9th International congress of neuroethology, August 2-7, Salamanka, Spain, 2010.; 40th annual meeting of the Society for Neuroscience, 13-17 4 November, San Diego, California, USA, 2010.; 9th Gagra Talks. International conference on fundamental questions of neuroscience, October 13-16, Tbilisi, Georgia, 2010. Публикации. По результатам диссертации опубликовано 24 печатных работы, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 6, в других журналах и научных сборниках – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 15. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 75 страницах, содержит 18 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы, включающий 82 цитируемых источника. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования были выбраны выращенные в аквариальной культуре взрослые особи большого прудовика Lymnaea stagnalis (Mollusca Gastropoda Pulmonata). Все эксперименты проводили с использованием препарата изолированной ЦНС улитки (рис. 1). Регистрацию электрической активности нейронов, а также их стимуляцию, осуществляли стандартными методами клеточной электрофизиологии. Отводились микроэлектродами как от нейронов, лежащих внутри ЦНС, так и от изолированных нейронов. Биосенсор. С помощью изолированного нейрона-биосенсора тестировалось присутствие нейроактивных веществ в выбранной точке пространства рабочей камеры. Такой биосенсор, имея необходимую рецепцию, реагировал на окружающие его химические вещества изменением мембранного потенциала. Биосенсоры изолировали из педальных, церебральных, буккальных и плевральных ганглиев. Для изоляции биосенсора нервную систему прудовика обрабатывали проназой Е (Sigma), 4 мг/мл, 5-7 минут, с последующей отмывкой физиологическим раствором. Изоляцию осуществляли с помощью микроэлектрода (Т.Л. Дьяконова, 1985). В сому клетки вводили стеклянный микроэлектрод, который медленно сдвигали в сторону до полного отрыва ветвей нейрита от нейропиля. Этот же микроэлектрод использовали как для дальнейших перемещений биосенсора, так и для регистрации его электрической активности. В опытах с тестированием экстранейрональной среды биосенсор попеременно сближали с поверхностями одного или нескольких ганглиев. Его перемещали в течение 20-60 секунд из отдалённой точки, находящейся на расстоянии около 0,5 мм от тестируемых ганглиев, к выбранному участку поверхности. Через 60-120 секунд биосенсор возвращали в исходную отдалённую точку. При непрерывном мониторинге среды у поверхности ганглия использовали несколько биосенсоров. «Полуизолированные» нейроны. В некоторых опытах использовали не до конца изолированные нейроны. Получены они были сходно с тем, как описано для биосенсора, т.е. микроэлектрод вводили в сому и затем 5 микроманипулятором отодвигали ее от ганглия, стараясь вытащить проксимальный и медиальный сегменты отростка из нейропиля. Тестируемые ганглии нервной системы улитки. Тестируемые ганглии обрабатывали проназой Е (Sigma), 4 мг/мл, 2-6 минут, с последующей отмывкой физиологическим раствором. В4-кл В2 В2 В1 ЛБГ ПБГ В1 В4 А-кл ПCGC ЛCGC ЛПедГ ЛЦГ ЛПлГ ППедГ ПЦГ ППлГ ВГ ЛПарГ ППарГ Рис. 1. Схема ЦНС моллюска Lymnaea stagnalis (предоставлена В.Цыгановым). Дорсальная сторона ЦНС. Перерезана церебральная комиссура, церебральные ганглии развернуты вентральной стороной. Отмечены идентифицированные нейроны, используемые в экспериментах. ЛБГ и ПБГ– левый и правый буккальные ганглии; ЛЦГ и ПЦГ– левый и правый церебральные ганглии; ЛПлГ и ППлГ– левый и правый плевральные ганглии; ЛПарГ и ППарГ– левый и правый париетальные ганглии; ЛПедГ и ПедГ– левый и правый педальные ганглии; ВГ – висцеральный ганглий; В4 – идентифицированные нейроны буккальных ганглиев; В4-кл – район кластера, состоящего из В4Сl нейронов; А-кл – район А-кластера; ПCGC и ЛCGC - гигантские нейроны правого и левого церебральных ганглиев. 6 Условия экспериментов. Основной физиологический раствор имел состав:(в мМ): NaCl – 50; KCl – 1,6; CaCl2 – 4; MgCl2 – 4; Tris – 10 (pH 7,5); с добавлением D-глюкозы 0,05%. Эмпирически подобранный состав раствора, оптимальный для регистрации биосенсорами ритмов в буккальных ганглиях, был изменен, концентрация MgCl2 составляла в нем 1 мМ. Препарат ЦНС помещали в проточную камеру объёмом 1,5 мл. В ней поддерживали проток скоростью 0,5-1 мл/мин на всём протяжении эксперимента. Используемые экзогенные химические вещества вносили в проток рабочей камеры или апплицировали в камеру микропипеткой. Использовали вещества: хинин (Calbiochem), серотонин (5-гидрокси-L-триптамин, 5-НТ, Sigma), предшественник серотонина (5-гидрокси-L-триптофан, 5-НТР, Sigma). Для ингибирования триптофандекарбоксилазы, фермента, превращающего 5-НТР в 5-НТ, применяли м-гидроксибензилгидразин (мГБ, Sigma). В части опытов нейрон подводили также к кончику капилляра с диаметром кончика несколько микрометров, который содержал 10 -3 М 5-НТ. Мембранные потенциалы отводили от нейронов с помощью стеклянных микроэлектродов (KCl, 3М, R= 20 – 50 МОм), на усилители постоянного тока фирмы Микромед. Далее сигналы подавали на аналого-цифровой преобразователь (АЦП, интервал между двумя последовательными опросами по одному каналу составлял 0,2 миллисекунды), встроенный в персональный компьютер IBM PC. После дополнительной обработки данных и расчета средних значений параметров, достоверность полученных результатов оценивали по непараметрическому критерию Уилкоксона и критерию знака, в части случаев пользовались F-критерием. РЕЗУЛЬТАТЫ 1.Медиаторная обстановка вблизи серотонинергических нейронов Акластера педальных ганглиев. 1.1. Предварительное исследование механизма действия 5-НТР на нейроны А-кластера педальных ганглиев. Зная, что у моллюска можно активизировать локомоторное поведение при помощи 5-НТР, данного экзогенно в его гемолимфу, на изолированной центральной нервной системе (ЦНС) моллюска было изучено, сводится ли действие 5-НТР к повышению синтеза 5-НТ в серотонинэргических нейронах. В них был заблокирован синтез 5-НТ из 5-НТР с помощью мГБ (см. методы) в концентрации 25 мкМ. В этих опытах электрическую активность отводили от «полуизолированного» нейрона Акластера педальных ганглиев (см. методы). После начала поступления раствора с мГБ в рабочую камеру, регистрировали фоновую активность нейрона в течение 30 минут (пять или шесть записей, каждая длительностью 1 минута). Затем в проток мГБ на 6 минут добавляли 5-HTP в концентрации 100 мкМ и регистрировали сходным образом активность нейрона в интервале с 4-ой до 14ой минуты от начала поступления 5-HTP в рабочую камеру. Разность двух средних частот по модулю, до и после воздействия 5-НТР, выражала его 7 влияние на клетку. Результаты опытов с мГБ (n=7) даны в Таблице 1. Результаты контрольных экспериментов (n=12) с действием 5-НТР без мГБ, даны в Таблице 2. Таблица 1. номер нейрона исходная частота (спайк/мин) частота после мГБ (спайк/мин) частота после мГБ + 5-HTP (спайк/мин) 1 2 3 4 5 6 7 14,5 16,0 16,0 11,5 24,5 21,5 51,2 14,6 14,0 18,5 9,3 28,3 17,6 53,4 13,3 14,1 15,0 10,5 27,1 16,5 53,3 Таблица 2. номер нейрона исходная частота (спайк/мин) частота после 5-HTP (спайк/мин) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 10,8 5,8 9,3 33,2 9,2 8,6 8,4 6,8 4,4 9,4 10,2 17,0 20,3 15,8 27,0 36,6 15,3 14,5 15,4 13,9 9,1 13,2 11,1 19,1 Опыты показали, что мГБ достоверно снимает эффект 5-НТР (уровень значимости 0.01, критерий Уилкоксона), и что его возбуждающее действие становится возможным лишь после его превращения в 5-HT. Т.к. все это наблюдалось в условиях «полуизоляции», можно было предполагать, что действие 5-НТР осуществляется на уровне одного нейрона. В дальнейшем это подтвердилось опытами на полностью изолированных нейронах. Т.е. после дачи предшественника вновь синтезированный 5-НТ нейрона действует на этот же нейрон, возбуждая его, и, тем самым, осуществляет положительную обратную связь на уровне одной клетки. 1.2. 5-НТ в межклеточном пространстве педальных ганглиев. В предположении, что 5-НТ действует в районе А-кластера при усилении локомоции моллюска по механизму экстрасинаптической секреции, была исследована химическая обстановка с помощью биосенсора, в качестве которого выступал нейрон А-кластера. В подавляющем большинстве случаев (36 из 42 клеток на 31 препарате ЦНС) частота спайков изолированного нейрона, придвинутого сомой к поверхности ганглия в зоне А-кластера, возрастала и составляла 112-1000% (в среднем 280%). Однако были исключения, когда частота значимо не менялась (3 случая) или даже уменьшалась (3 случая). Если биосенсор сближали с кончиком 5-НТ капилляра (см. методы), частота спайков возрастала. Исследование биосенсором всей поверхности педальных ганглиев позволило получить более детальную 8 информацию о химической обстановке внутри них (см. рис. 2). То, что наиболее сильное возбуждающее действие достигается в области А-кластера, уже более определенно указывает на эти нейроны, как на источник сильного медиаторного влияния. Рис. 2. Изменения активности биосенсора в зависимости от его позиции относительно педального ганглия. ЛПД – левый педальный ганглий; ППД – правый педальный ганглий; А – педальный Акластер. На ЛПД дана карта активности биосенсора у разных участков дорзальной поверхности (среднее из 7 экспериментов, в процентах от измеренной частоты спайков у латерального края ганглия). На ППД показаны результаты эксперимента, в котором биосенсор перемещали вдоль протока. Для каждой точки указано число спайков за 2 мин регистрации. Стрелкой указано направление протока физиологического раствора. Далее была проведена серия опытов с подведениями биосенсора к педальным ганглиям на фоне экзогенного 5-НТ. Периодическое сближение биосенсора с педальными ганглиями на фоне постепенно увеличивающейся концентрации 5-НТ в протоке (2 случая) показало, что после достижения экзогенным 5-НТ некоторого порогового значения частота спайков нейрона переставала увеличиваться и могла даже уменьшаться при подведениях к педальным ганглиям. Экзогенный 5-НТ, действуя сонаправленно с фактором, выделяющимся из ганглия, при 10-7М полностью маскировал действие этого эндогенного фактора на биосенсор. При 5*10-5М 5-НТ подведение биосенсора к А-кластеру во всех случаях не вызывало усиления электрической активности. Напротив, в этих условиях отмечалось уменьшение частоты спайков (в 6 случаях из 10). Все это указывало на 5-НТ, как на один наиболее значимых химических факторов, который выделяется в исследуемой области ганглиев и влияет на биосенсор. 9 В следующей схеме эксперимента использовали усиливающее действие 5-НТР. При поступлении с протоком в концентрации 1-2*10-4М (или при аппликации его в камеру) (рис. 3) (n=6), 5-НТР вызывал как усиление активности самого биосенсора, так и увеличение прироста частоты, вызванного его сближением с педальными ганглиями. Абсолютный прирост частоты, вызываемый сближением с педальными ганглиями, продолжал увеличиваться, в то время как фоновая частота спайков самого биосенсора уже прошла максимум увеличения, вызванного 5-НТР. Т.е. возбуждающее влияние педальных ганглиев на биосенсор усиливается в присутствии 5-НТР, который, не обладая прямым действием на нейроны А-кластера, действует на них только после превращения в 5-НТ. 14 F, спайк/мин 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 Т, мин Рис. 3. Реакция биосенсора на подведение к А-кластеру усиливается на фоне 2*10-4М 5НТР в протоке. Биосенсор подводили через каждые 5 минут, начиная с 0 минуты, время перемещения нейрона при подведении (отведении) - 0,5 минуты, время у поверхности ганглия после подведения до начала отведения – 1,5 минуты. Черный прямоугольник на горизонтальной оси – начало поступления в камеру 5-НТР. Светлый прямоугольник – начало отмывки. 1.3. Медиаторный «бульон» педальных ганглиев. Помимо ожидаемого 5-НТ, в системе педальных ганглиев предполагались и другие факторы, которые, подобно 5-НТ, действовали на биосенсор. На это указывали единичные случаи гиперполяризации биосенсоров в отсутствие внешних химических воздействий на педальные ганглии. Применение хинина в концентрации 10 мкМ выявило отличный от 5-НТ деполяризующий фактор. На фоне хинина спайк биосенсора, подведенного к педальным ганглиям, сужается под влиянием деполяризующего фактора, который не является 5-НТ, т.к. последний всегда действует на биосенсоры (изолированные из А-кластера), расширяя их спайк (пример см. рис. 4). 10 Для обнаружения тормозящего фактора препарат подвергали действию 0,5 мкМ 5-НТ, что вызывало возбуждение нейронов А-кластера, в том числе биосенсора. Если на первых минутах действия 5-НТ сблизить биосенсор с Акластером педальных ганглиев ЦНС, то в первые секунды сближения частота спайков уменьшается (рис. 5) (n=6). 10 мВ 5 мс Рис. 4. Изменения длительности спайков биосенсора на фоне 10 мкМ хинина в ходе тестирования эталонного источника медиатора, 5-НТ капилляра, и ганглиев ЦНС. тонкая сплошная линия – в отсутствие воздействий; толстая сплошная линия – при сближении с 5-НТ капилляром; тонкая пунктирная линия – при сближении с А -кластером. Действие кончика 5-НТ капилляра было равносильно действию 10-8-10-7М 5-НТ. 30спайк в 30 сек f, 25 20 5-HT 15 10 A A A A A A A A 5 0 10 20 30 мин 40 Рис. 5. Изменение средней частоты спайков биосенсора при сближении его с А-кластером педальных ганглиев в отсутствие и на фоне 0,5 мкМ 5-НТ. Момент появления 5-НТ в растворе обозначен стрелкой. Толстые А-линии – нейрон находится вблизи А-кластера. Каждая точка графика – средняя частота спайков на интервале 30 секунд. 11 2. Медиаторная обстановка вблизи буккальных ганглиев. Опыты показали, что медиаторный фон имеется у многих ганглиев моллюска (у педальных, церебральных, париетальных, буккальных и висцерального ганглиев). Мембранный потенциал биосенсора при подведении его к поверхности выбранного ганглия обратимо сдвигался до нескольких мВ. При повторных подведениях того же биосенсора к той же точке характер ответа не менялся. Знак ответа при тестировании примерно одной и той же области в разных опытах мог быть разным даже при использовании в качестве биосенсора одноименных нейронов. В большинстве экспериментов было видно, что у поверхности ЦНС присутствуют нейроактивные факторы в концентрации, способной оказать значимое влияние на мембранный потенциал изолированного нейрона. Для дальнейших исследований были выбраны буккальные ганглии, которые ответственны за формирование пищевого паттерна. 2.1. Работа генератора пищевого ритма. Основная задача нейронов этих ганглиев – задание ритмических движений мышц буккальной массы, организация циклических движений скребущего ротового аппарата. Стандартный моторный цикл, с периодом порядка 10 сек, состоящий из трех фаз, обеспечивается поочередной активностью нейронов центрального генератора. В ходе многочасовых экспериментов на препаратах изолированной ЦНС прудовика отслеживали изменения состава среды вблизи буккальных ганглиев, отражающие изменения в характере генерации фиктивного моторного ритма. Использовали биосенсоры, представляющие собой изолированные буккальные нейроны В4 или B4Cl (это идентифицированные нейроны 4-го кластера буккальных ганглиев). Эти нейроны – моторные нейроны третьей фазы. В поведении моллюска эта фаза соответствует заглатыванию пищи. Биосенсоры выделяли из ЦНС другого животного и располагали вблизи выбранного участка поверхности одного из буккальных ганглиев. Одновременно отслеживали работу буккального генератора, регистрируя in situ электрическую активность нейрона В4, входящего в состав тестируемого ганглия. Примеры электрофизиологических данных, полученных в такой схеме, даны на рис. 6, 7, 8, 9. На рис. 6 видно, как запуск генерации внутри буккального ганглия, отслеживаемый по нейрону В4 in situ, приводит к изменению активности биосенсоров. В активности нейрона in situ, помимо собственно моторного ритма периодом около 7-10 сек, нами зарегистрированы медленные ритмы с периодами порядка 50 сек (см. рис. 7 и 9) и 500 сек (см. рис. 9). Эксперименты показали, что электрическая активность биосенсора коррелирует с активностью нейрона in situ на обоих медленных ритмах. Значимой корреляции с 10 секундным моторным ритмом обнаружить не удалось. Результаты, сходные с показанными на рис. 6, 7, 8 ,9 были получены на 13 биосенсорах в 8 опытах. Достоверность наблюдаемых корреляций 12 оценивали после обработки максимальных частотных или амплитудных значений активности биосенсоров, сравнивая полученные данные с усредненной ритмической активностью нейронов в ганглии (см. методы). Наличие корреляции оценивали отдельно в каждом опыте, используя для анализа F-критерий. б1и б2 меняются местами б1 В4 в ЦНС б2 Рамка увеличения 50мВ 300 сек Рис. 6. Электрическая активность биосенсоров, расположенных вблизи поверхности буккальных ганглиев ЦНС. б1 и б2 – биосенсоры, изолированные В4 нейроны, стрелка указывает перемену мест биосенсоров в пространстве (их механическое перемещение электродами); В4 в ЦНС – нейрон В4 in situ одного из буккальных ганглиев; Рамка увеличения – выделенный фрагмент, данный в развернутом виде на рис. 7. б1 В4 в ЦНС б2 50мВ 10 сек Рис. 7. Увеличенный фрагмент электрической активности нейронов, приведенной на рис. 6, обозначения см. там же. 13 б1 б1и б2 меняются местами 5мВ В4 в ЦНС 50мВ б2 50мВ Рамка увеличения 300 сек Рис. 8. Электрическая активность биосенсоров, расположенных вблизи поверхности буккальных ганглиев ЦНС. б1 – биосенсор, изолированный В4Cl нейрон, б2 – биосенсор, изолированный В4 нейрон, стрелка указывает перемену мест биосенсоров в пространстве (их механическое перемещение электродами); В4 в ЦНС – нейрон В4 in situ одного из буккальных ганглиев; Рамка увеличения – выделенный фрагмент, данный в развернутом виде на рис. 9. б1 5мВ B4 in CNS 50мВ б2 50мВ 60 сек Рис. 9. Увеличенный фрагмент электрической активности нейронов, приведенной на рис. 8, обозначения см. там же. 14 2.2. Активация церебральных гигантских клеток (CGC), управляющих генератором пищевого ритма. Генератор пищевого цикла, описанный выше, управляется несколькими нейронами. Эти нейроны, непосредственно влияющие на параметры пищевой генерации, группируются в церебральных ганглиях и дают проекции в церебро-буккальные коннективы. В частности, пара CGC управляет генератором, воздействуя на свойства как интернейронов, так и мотонейронов генератора. Эта пара нейронов имеет электрическую связь в комиссуре, которая соединяет буккальные ганглии. Для исследования работы CGC с помощью биосенсоров использовали препарат с частично изолированными ганглиями. Оставили только пару церебральных и пару буккальных ганглиев, сохранили связывающие их коннективы (т.е. сохранили паттернобразующие нейроны и управление ими со стороны CGC). В качестве биосенсоров использовали изолированные нейроны А-кластера предварительно отрезанных педальных ганглиев той же ЦНС. В опытах, проведенных по этой схеме (n=6), меняли только количество и места расположения биосенсоров у поверхности буккальных ганглиев. Во всех опытах наблюдали сходные результаты, пример см. на рис. 10. В этом опыте CGC, изначально гиперполяризованные, деполяризовали до различного уровня как совместно, так и раздельно. Видно, что усиление степени деполяризации приводит к усилению активности биосенсоров, что отражает усиление выброса медиаторного агента из буккальных ганглиев. IЛCGC IПCGC -1.5 нA 0 нA -1.5 нA -0.9 нA 0 нA -0.9 нA +1.5нA +1.5 нA -1.5 нA +0.9 нA -0.9 нA -1.5 нA +0.9 нA -0.9 нA 0.1В ЛCGC ПCGC 0.1В б1 50мВ б2 50мВ б3 50мВ 60сек Рис. 10. Электрическая активность биосенсоров, расположенных вблизи поверхности буккальных ганглиев ЦНС, при деполяризации управляющих пищевым ритмом нейронов (CGC). ЛCGC и ПCGC – мембранные потенциалы левой и правой CGC соответственно; IЛCGC и IПCGC – токи, подаваемые в левую и правую CGC соответственно. Значения подаваемых токов указаны над соответствующими пунктирными линиями; б1,б2 и б3 – биосенсоры, расположенные у буккальных ганглиев. 15 ОБСУЖДЕНИЕ 1. Экстраклеточная секреция в педальных ганглиях моллюска. Как известно из более ранних исследований, при усилении локомоторной активности, что моделируется инъекцией в полость тела моллюска 5-НТР, активируются серотонинергические нейроны А-кластера. Известно, что активируется вся цепь синтеза, что приводит к видимому многократному приросту содержания 5-НТ в телах нейронов А-кластера, а сами эти нейроны деполяризуются под действием 5-НТ. Основное действие этих нейронов – выделение медиатора в подошве ноги улитки, активация и модуляция эффекторов локомоции, в случаях, когда прудовик нуждается в более эффективном передвижении по субстрату. Согласно результатам нашей работы, совместная секреция нейронов Акластера поддерживает у его поверхности концентрацию 5-НТ на уровне 10-810-7М. Этого достаточно для вовлечения серотонинергических нейронов в процесс самоусиливающегося возбуждения и для эффективного серотонинергического контроля других нейронов, расположенных на этом участке клеточной коры педальных ганглиев, даже без учета того, что концентрация в межсоматическом пространстве ганглиев, безусловно, выше той, которая фиксировалась вблизи их поверхности. Из анализа медиаторной обстановки вблизи медиальной области педальных ганглиев ЦНС улитки можно заключить, что там присутствуют несколько нейроактивных факторов, один из которых 5-НТ. Расширение спайка экзогенно данным хинином помогло выявить присутствие нейроактивного агента с менее сильным, при сравнении с 5-НТ, эффектом воздействия на данный тип клеток. Можно полагать, что этот выявленный, сужающий спайки, агент выполняет, сходную с 5-НТ, функцию воздействия на группу нейронов одновременно. Вместе с тем, источник этого агента неизвестен, а действие его на нейроны А-кластера in situ маскируются 5НТ-ом. Таким образом, в настоящее время сложно делать какие-либо заключения о его функции. То же самое можно сказать и о выявленном гиперполяризующем факторе, добавив, что на временные ограничения его действия в реализуемых им функциональных процессах указывает «привыкание» нейронов А-кластера к этому веществу. 2. Медиаторная обстановка в буккальных ганглиях моллюска. В представленных опытах биосенсор регистрирует медиаторные изменения у буккальных ганглиев во время работы генератора пищевой моторики. Это указывает на возможное участие медиаторов, работающих по механизму экстраклеточной секреции, не только в медленном процессе стабилизации поведенческих программ, примером которого служит работа 5-НТ в педальных ганглиях. Об эргичности нейронов, составляющих буккальный генератор Большого прудовика, известно немного. С уверенностью можно сказать только 16 о том, что в нем работают нейроны разной эргичности и что нейроны одной эргичности включены в состав одной и той же фазы (ацетилхолин – для первой фазы, глутамат – для второй). Это наводит на мысль, что одна и та же эргичность нейронов может быть не только признаком их принадлежности одной фазе, но и иметь функциональный смысл. Вместе с тем, генерация в буккальных ганглиях имеет сложный характер и состоит из многих мод, которые на порядок отличны друг от друга по частоте. Биосенсоры в наших опытах регистрируют более медленные моды паттерна, которые по отношению к основному пищевому паттерну по характеристикам частоты являются модулирующими. Следовательно, наблюдаемые феномены нельзя просто привязать к фазам «стандартного» ритма. Наблюдаемая генерация, имеющая период около 50 сек, может представлять собой заторможенный «стандартный» пищевой паттерн, имеющий период у интактного животного около 10 сек. Такое увеличение периода может определяться состоянием генератора. Периодичный 500секундный сигнал может являться составным, т.к. источник 50-секундного сигнала может выбрасывать медиатор и за краями своего периода. Кроме того, диффузионное рассеяние также будет вносить вклад в сглаживание колебаний концентраций медиатора, как в начале, так и в конце пачки. Несмотря на то, что наблюдаются периодические, значимые по амплитуде флуктуации нейроактивного вещества (или веществ) во всем объеме ганглия, функция этих процессов подлежит уточнению. Гомологи нейронов, называемые CGC, присутствуют, практически во всех хорошо изученных ЦНС гастропод. У Большого прудовика известны как множество мишеней этих церебральных клеток в буккальных ганглиях, так и множественные эффекты 5-НТ на свойства мишеней. 5-НТ меняет систему в сторону большей генерации, облегчается межфазовое взаимодействие, клетки, связанные со «стандартным» пищевым паттерном, деполяризуются, становятся более активны. Традиционно считается, что CGC управляет нейронным ансамблем буккальных ганглиев через синаптические связи с каждым нейроном. На сегодня известно множество нейронов буккального ганглия, которые имеют рецепцию к 5-НТ. В рамках традиционной схемы адресного действия и т.к. CGC является основным источником 5-НТ в буккальных ганглиях и именно через эти нейроны осуществляется основная модуляция буккальной генерации, предполагается, что все буккальные 5-НТ чувствительные нейроны являются мишенями CGC. Коммуникация же CGC с ее мишенями происходит в переплетениях нейропиля. Для проверки адекватности изложенной схемы работы CGC, были поставлены эксперименты, в которых регистрировали фон медиатора у поверхности буккальных ганглиев при деполяризации CGC. В этих условиях был обнаружен выброс нейроактивного агента. Сам по себе этот факт говорит о том, что CGC может не только воздействовать на активность и свойства 17 определенных клеток, но и задавать состояние всей системы буккальных ганглиев, задавая некоторый средний фон медиатора в ганглиях. Именно на этом может быть основан механизм плавной регулировки паттерна, в случаях, когда 5-НТ-фон плавно меняет характеристики частоты основного генератора посредством воздействия на свойства мембран клеток (на пейсмекерные свойства, ребаунд и т.п.). Несколько опытов с биосенсорами, в качестве которых выступали изолированные В2 нейроны, показали, что ситуация неоднозначна. В2 нейроны отвечают на 5-НТ гиперполяризацией. В наших же экспериментах при стимуляции CGC такие биосенсоры деполяризовались, подобно нейронам-биосенсорам из А-кластера. Т.е. или медиатор, выбрасываемый у буккальных ганглиев при стимуляции CGC, не является 5НТ-ом, или это смесь 5-НТ и др. агента (агентов), которые в смеси действуют на В2 так, что деполяризуют ее. Вопрос о природе этого (этих) отличного от 5НТ агента остается открытым. ВЫВОДЫ 1) Разработана методика с использованием биосенсора для регистрации нейроактивных веществ, вытекающих из ганглиев ЦНС моллюска. Это позволило наблюдать в реальном времени процессы экстрасинаптической секреции в фиктивно работающей ЦНС. 2) Зарегистрировано присутствие нескольких нейроактивных агентов, действующих по механизму безадресного межнейронального взаимодействия (по типу volume transmission), в работе простой ЦНС моллюска Lymnaea stagnalis. Обнаружено их непосредственное действие на нейроны в двух функционально различных нейронных ансамблях. 3) Описан механизм работы одного из идентифицированных нейроактивных агентов - серотонина, участвующего в экстрасинаптическом взаимодействии. Исследована роль этого медиатора в функциональной системе, обеспечивающей усиление локомоторной активности моллюска. 4) Выявлены нейроактивные вещества, участвующие в работе нейронной сети, которая генерирует программы пищевого поведения моллюска. Полученные результаты, касающиеся медиаторных изменений в межклеточном пространстве ганглиев, не укладываются в классические описания работы нейронных сетей в рамках синаптической парадигмы. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ: 96-04-49181-а, 99-04-48411-а, 02-04-48091-а, 05-04-49812-а, 08-04-00120-а, 11-04-00674-а. 18 Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК: 1. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Активация серотонинергических нейронов метаболическим предшественником серотонина: увеличение частоты и длительности потенциалов действия. // Доклады РАН. 1998. Т. 362(4). С. 561563. 2. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Активация серотонинергических нейронов метаболическим предшественником серотонина: эффект ингибитора триптофандекарбоксилазы. // Доклады РАН. 2000. Т. 372(1). С. 129-131. 3. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Несинаптическая интеграция клеточных тел нейронов в ЦНС улитки. // Росс. физиол. журн. 2001. Т. 87(11). С. 15401547. 4. Чистопольский И.А. Взаимодействия нейронов на уровне клеточных тел в ЦНС улитки: Гетерогенность нейроактивной среды. Росс. физиол. журн. 2004. Т. 90(3). С. 345-350. 5. Чистопольский И.А. Использование изолированного нейрона для мониторинга нейроактивных факторов среды, окружающей генератор моторного поведения. // Онтогенез. 2005. Т. 36(3). С. 240. 6. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Изолированный нейрон как биосенсор, реагирующий на высвобождение нейроактивных веществ. // Рос. физиол. журн. 2007. Т. 93(10). С. 1210-1213. Другие издания: 7. Chistopolsky I.A., Vorontsov D.D., Sakharov D.A. Monitoring of neuroactive factors released from a pattern-generating network. // Acta Biologica Hungarica. 2008. V. 59. P. 29-31. 8. Dyakonova V.E., Chistopolsky I.A., Dyakonova T.L., Vorontsov D.D., Sakharov D.A. Direct and decarboxylation-dependent effects of neurotransmitter precursors on firing of isolated monoaminergic neurons. // J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 2009. V. 195(6). P. 515-527. 9. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Мониторинг volume transmission мультирецепторным биосенсором. в сб.: Актуальные вопросы нейробиологии, нейроинформатики и когнитивных исследований. 2010; М., НИЯУ МИФИ. C. 91-100. 19