Сельскохозяйственные науки Оценка цитотоксического действия митостатиков

Сельскохозяйственные науки
УДК [631.11+634.721] :576.355 :581.132.08
Оценка цитотоксического действия митостатиков
по состоянию фотосинтезирующей ткани листа яблони и смородины
Папихин Роман Валериевич,
заведующий лаборатории селекции клоновых подвоев яблони, кандидат
сельскохозяйственных наук,
ФГБОУ ВПО Мичуринский государственный аграрный университет,
393760, Тамбовская область, г.Мичуринск, ул. Интернациональная, 101
parom10@mail.ru
HTU
UTH
Дубровский Максим Леонидович,
младший научный сотрудник, лаборатория цитогенетики и гаметной
селекции,
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и
селекции плодовых растений имени И.В.Мичурина Россельхозакадемии,
тел. 8 (47545) 5-78-87,
393770, Тамбовская область, г. Мичуринск, ул. ЦГЛ
element68@mail.ru
HTU
UTH
Брюхина Светлана Александровна,
Директор центра экологического просвещения и образования, кандидат
сельскохозяйственных наук,
ФГБОУ ВПО Тамбовский государственный университет
имени Г.Р.Державина,
392000, Тамбовская область, г. Тамбов, ул. Интернациональная, д. 33
sv_mich@mail.ru
Аннотация. Методом PAM проведена оценка цитотоксического
действия митостатиков на фотосинтезирующий аппарат листа яблони и
смородины. В сравнении с контролем отмечено ингибирование процесса
фотосинтеза и цитотоксический эффект растворов клопиралида,
парадихлорбензола и хлоралгидрата, причем с увеличением времени
обработки и концентрации растворов возрастает ингибирующий эффект
изучаемых химических соединений, вплоть до некротизации фрагментов
тканей листа.
Ключевые слова: хлорофиллфлуоресценция, метод PAM, удельная
фотосинтетическая
активность, индуцированная
полиплоидизация,
митостатики, клопиралид, парадихлорбензол, хлоралгидрат.
Используемые для индукции полиплоидизации химические соединения
обладают выраженными токсическими свойствами. Один из наиболее
эффективных полиплоидизирующих агентов – колхицин – является сильным
1
ядом, поэтому для получения полиплоидных клеток и тканей у растений
перспективным направлением исследований служит поиск новых менее
токсичных соединений со сходным механизмом блокирования веретена
деления.
Химическими
агентами
с митостатическим действием, помимо
колхицина и его производных, являются аценафтен, хлоралгидрат, парадихлорбензол, аппиоль и ряд других соединений (Бреславец, 1963). Отмечено
также полиплоидизирующее действие на растительные клетки ряда
ядохимикатов,
в
частности
фосфоротиоамидных
из
гербицидов
–
класса
динитроанилиновых
трифлуралина,
оризалина
и
и
др.
эффекта применяемых
для
(Зильберварг, 2001; Mitrofanova et al., 2003).
Одним
из
следствий
токсического
обработки химических соединений на клетки растений является нарушение
нормального хода физиологических процессов в них – от ингибирования до
полной некротизации групп клеток. Так, при изучении действия ряда
токсических веществ на растения разных видов и жизненных форм, отмечено
снижение удельной фотосинтетической активности листьев, фиксируемое с
помощью хлорофиллфлуориметра (Рубин, 2000). Разные варианты метода
оценки функционального состояния растений по изменению флуоресценции
хлорофилла
часто
используют
в
качестве диагностического, изучая
негативное действие на растительный организм природно-климатических
условий или химических соединений (Krause, Weis, 1991; Алексеев, Осипов,
2006; Будаговская и др., 2010).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Целью исследований являлось изучение цитотоксического действия
митостатиков по состоянию фотосинтезирующей ткани листа яблони и
смородины. В качестве биологического материала для исследований
использовали круглые высечки листовых пластинок клонового подвоя
яблони 54-118 и смородины красной сорта Голландская красная. Высечки
2
инкубировали при рассеянном свете в закрытых чашках Петри в водных
растворах действующих веществ по вариантам: 0,5% и 1,0%-ные растворы
пара-дихлорбензола; 1,0% и 2,0 %-ные растворы хлоралгидрата; 0,3·10 – 6 %,
P
P
1,5·10 – 6 %, 3,0·10 – 6 %-ные растворы клопиралида; в контроле использовали
P
P
P
P
дистиллированную воду.
Хлоралгидрат
и
пара-дихлорбезол
широко
применяются
в
цитологических методах исследования процессов деления и хромосом.
Клопиралид является современным аналогом растительного гормона роста,
проникая в ткани растения, способствует блокированию меристематически
активных участков и ингибированию процессов деления и роста клеток,
поэтому широко применяется как действующее вещество в составе
современных гербицидов (препараты «Галера», «Лонтрел», «Лорнет»,
«Меридиан» и др.).
Диагностику
проводили
хлорофиллфлуориметре
неразрушающим
(Германия,
PAM-Junior
способом
Heinz
Walz
на
GmbH).
Измеряли удельную фотосинтетическую активность хлорофиллсодержащих
тканей инкубируемых высечек листа через заданные промежутки времени – 0
(исходное состояние), 24, 48, 72 и 200 часов с начала эксперимента. Перед
измерением проводили темновую адаптацию высечек в течение 30 мин.
После проведения каждой серии измерений высечки вновь помещали в
соответствующий раствор.
Полученные данные статистически обрабатывали в программной среде
Microsoft Office Excel 2003 и представляли в форме линейных диаграмм,
отражающих зависимость удельной фотосинтетической активности от
времени инкубирования (экспозиции) высечек в растворах.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведенные
исследования
показали,
что
водные
растворы
клопиралида, парадихлорбензола и хлоралгидрата обладают выраженным
цитотоксическим эффектом. При длительном инкубировании высечек в
3
растворах токсикантов (5-8 суток) отмечено появление некрозов тканей,
преимущественно в периферической зоне, непосредственно контактирующей
в зоне среза с действующим раствором. К окончанию эксперимента в
вариантах опыта область некроза тканей на высечках увеличивалась,
расширяясь от периферии к центру, при этом в контроле возникновение
некрозов не отмечено в течение всего времени опыта.
Методом
флуоресценции
PAM
путем
хлорофилла
измерения
отмечено
быстрой
снижение
фазы
величины
индукции
удельной
фотосинтетической активности хлорофиллсодержащих тканей листа у обоих
видов – как яблони, так и смородины (см. рис. 1-3).
а
б
Рис.1. Влияние раствора пара-дихлорбензола на состояние фотосинтезирующей ткани
4
листа: а – подвоя яблони 54-118; б – смородины красной сорта Голландская красная.
а
б
Рис.2. Влияние раствора хлоралгидрата на состояние фотосинтезирующей ткани листа: а –
подвоя яблони 54-118; б – смородины красной сорта Голландская красная.
5
а
б
Рис.3. Влияние раствора раствора клопиралида на состояние фотосинтезирующей ткани
листа: а – подвоя яблони 54-118; б – смородины красной сорта Голландская красная.
Для всех изучаемых химических соединений выявлена прямая
зависимость между концентрацией раствора, и величиной удельной
фотосинтетической
активности
инкубируемых
высечек
листьев.
С
увеличением времени инкубирования (экспозиции) листовых дисков в
растворах токсикантов и с возрастанием их концентрации активность
функционирования
фотосинтетической
ткани
снижается,
достигая
необратимых изменений к окончанию эксперимента.
Как правило, при кратковременном инкубировании тканей листа (24 ч)
различия вариантов опыта недостоверны в сравнении с контролем, величина
6
удельной фотосинтетической активности снижается до 0,6–0,7 единиц,
происходит
лишь слабое ингибирование
функциональных
процессов
хлорофиллсодержащих тканей. Однако при наиболее длительной экспозиции
(200 ч) отмечено существенное необратимое снижение величины удельной
фотосинтетической активности высечек листа до 0,05-0,2 единиц в растворах
больших концентраций и в отдельных вариантах до 0,4-0,5 в растворах
меньшей концентрации при норме в контроле порядка 0,8-0,85. При этом в
контроле в течение всего эксперимента не отмечено снижения активности
функционирования хлорофиллсодержащих тканей.
Полученные результаты позволяют сделать предположение, что при
использовании растворов клопиралида, парадихлорбензола и хлоралгидрата в
качестве полиплоидизирующих агентов предпочтительны малые экспозиции
– не более 48 ч. Следует учитывать, что в данном эксперименте оценивалось
непрерывное
длительное
действие
данных
соединений
на
фотосинтезирующую ткань зрелых, сформированных листьев, в то время как
при
индукции
митотической
меристематической
ткани
в
полиплоидизации
точках
роста,
проводят
которая
обработку
является
более
чувствительной к негативному действию комплекса факторов внешней
среды. Следовательно, можно предположить, что цитотоксический эффект
данных соединений на меристематическую ткань будет выражен еще
сильнее.
Данные
экспериментальных
гипотезы
будут
исследованиях
при
проверены
в
непосредственной
дальнейших
индукции
полиплоидизации в точках роста с использованием растворов изученных
химических соединений.
ВЫВОДЫ
1. Водные растворы клопиралида, парадихлорбензола, хлоралгидрата
обладают выраженным цитотоксическим эффектом, проявляющимся в
уменьшении интенсивности хлорофиллфлуоресценции фотосинтезирующей
ткани листа и образовании некрозов инкубируемых листьев.
7
2. Для всех изучаемых растворов химических агентов отмечена прямая
зависимость
между
концентрацией
и
величиной
удельной
фотосинтетической активности обрабатываемых листьев. С увеличением
времени инкубирования высечек листа (экспозиции) в растворах токсикантов
и
с
возрастанием
их
концентрации
активность
функционирования
фотосинтетической ткани снижается, а степень некротизации растительных
тканей увеличивается. Данная тенденция отмечена как у листьев яблони, так
и смородины.
8
Литература
1. Алексеев, А.А. Метод определения функционального состояния растений
по флуоресценции хлорофилла: Учебное пособие / А.А. Алексеев, В.А.
Осипов, Д.Н. Маторин. – Якутск: Изд-во ЯГУ, 2006. – 54 с.
2. Бреславец, Л.П. Полиплоидия в природе и опыте / Л.П. Бреславец. – М.:
Изд-во АН СССР, 1963. – 364 с.
3. Будаговская,
О.Н.
Лазерная
диагностика
растений:
Методические
рекомендации / О.Н. Будаговская, А.В. Будаговский, И.А. Будаговский. –
Мичуринск, 2010. – 60 с.
4. Дубровский, М.Л. Цитологические особенности формирования мужского
гаметофита у отдаленных гибридов pyrus malus и ribes grossularia / М.Л.
Дубровский,
Р.В.
Папихин,
С.А.Брюхина
//
Вестник
Тамбовского
университета. Серия: Естественные и технические науки. 2011. Т. 16. №2. С.
633-637.
5. Зильберварг,
И.Р.
Динитроанилиновые
гербициды:
преимущества
использования для полиплоидизации Nepeta transcaucasica Grossh. по
сравнению с колхицином / И.Р. Зильберварг, И.В. Митрофанова, А.И.
Емец, О.В. Митрофанова, В.Д. Работягов, Я.Б. Блюм // Докл. НАН
Украины. – 2001. – № 11. – C. 145-149.
6. Рубин, А.Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге / А.Б.
Рубин // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т.6, №4. – С. 7-13.
7. Krause, G.H. Chlorophill Fluorescence and Fotosynthesis: The Basis / G.H.
Krause, E. Weis // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. – 1991. – V.42. –
P.313-349.
8. Mitrofanova, I.V. The effect of dinitroaniline and phosphorothiamidate herbicides on polyploidization in vitro of Nepeta plants / I.V. Mitrofanova, I.R. Zilbervarg, A.I. Yemets, O.V. Mitrofanova, Ya.B. Blume // Cell Biology International. – 2003. – Vol. 27. – P. 229-231.
9