Автореферат - Научно-исследовательский институт общей

На правах рукописи
Лямина Светлана Владимировна
ФОРМИРОВАНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО КОМПОНЕНТА
В БРОНХО-ЛЕГОЧНОЙ СИСТЕМЕ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЛЕГКИХ
И ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОЙ РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНИ: РОЛЬ
СУРФАКТАНТНОГО БЕЛКА D И РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ
14.03.03 – патологическая физиология
14.01.04 - внутренние болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва - 2013
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический
университет имени
А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения
Российской
Федерации
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор
Малышев Игорь Юрьевич
доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН
Маев Игорь Вениаминович
Официальные оппоненты:
Решетняк Виталий Кузьмич
доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН;
федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт
общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук,
отдел клинической патофизиологии, заведующий отделом
Балякин Юрий Викторович
доктор медицинских наук, профессор;
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального
образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет
имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
кафедра общей патологии медико-биологического факультета, заведующий кафедрой
Трухманов Александр Сергеевич
доктор медицинских наук;
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального
образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.
Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
кафедра пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета, профессор кафедры
Ведущая организация:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
профессионального образования «Российский университет дружбы народов»
Защита состоится «___»__________ 2013 года в ____ часов на заседании Диссертационного
совета Д 001.003.01 при федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской Академии
Медицинских Наук, по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИОПП» РАМН
Автореферат разослан «____»___________
2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук
Скуратовская Лариса Николаевна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Продолжающийся рост заболеваемости населения болезнями органов дыхания,
увеличение инвалидизации и преждевременной смертности у данной категории
больных (Министерство здравоохранения и социального развития России, 2009), попрежнему, определяет важность проблем патогенеза заболеваний легких и поиска
новых подходов в их лечении. Наиболее распространенными среди заболеваний
легких в настоящее время являются хроническая обструктивная болезнь легких
(ХОБЛ), бронхиальная астма (БА), а также отмечается неуклонный рост
заболеваемости
саркоидозом
органов
дыхания
(СОД)
(Министерство
здравоохранения и социального развития России, 2009).
Нередкой клинической ситуацией в последние годы является сочетание
бронхиальной астмы (БА) и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ)
(Корабельников Д.И., Чучалин А.Г., 2002; Маев И.В. и соавт., 2006), что определяет
высокую распространенность симптомов ГЭРБ среди больных БА, взаимное влияние
этих патологических состояний друг на друга (Корабельников Д.И., Чучалин А.Г.,
2002) и рост числа их тяжелых форм. Известно, что ГЭРБ может проявляться не
только симптомами поражения пищевода, но также служить причиной различных
внепищеводных проявлений (Маев И.В. и соавт., 2006). БА и ГЭРБ имеют разную
этиологию, однако формирование воспаления в бронхо-легочной системе при
данных состояниях (Чучалин А.Г., 2005; Хаитов Р.М,, 2006) обусловлено общим
патогенетическим компонентом – нарушением иммунного ответа в форме дисбаланса
между клеточным Th1 и гуморальным Th2 звеньями иммунитета (P. Kidd, 2003).
Поэтому дальнейшее изучение клеточных патогенетических механизмов развития
данных заболеваний имеет высокую научную и практическую значимость.
Исключительно важную роль в патогенезе заболеваний с воспалительным
компонентом в бронхо-легочной системе играют альвеолярные макрофаги М1 и М2
фенотипов, а одним из ключевых регуляторов функций альвеолярных макрофагов
является сурфактантный белок D (SP-D) (Gardai S.J., 2003; Gow A.J., 2011).
Макрофаги М1 и М2 фенотипов в зависимости от факторов микроокружения
способны изменять свой фенотип (Martinez F.O., 2008), т.е. обладают фенотипической
пластичностью. Мультифункциональная структура белка позволяет SP-D выступать
в качестве бивалентного фактора контроля фенотипа макрофагов и определять
двойственность иммунного ответа, обеспечивая возможность активации иммунного
ответа провоспалительной или противовоспалительной направленности. Уровень SPD и его олигомерный состав изменяются при различных заболеваниях легких, в связи
с чем белок может быть использован не только как маркер повреждения легких, но и
как агент воздействия на патогенетические звенья воспалительной реакции.
Несмотря на существующие методы терапии заболеваний бронхо-легочной
системы, не всегда достигается необходимый эффект от проводимой терапии и
улучшение прогноза
пациентов, страдающих заболеваниями с воспалительным
компонентом, хотя методы терапии и основываются на общепринятых принципах
комплексности и
преемственности лечения больных. В настоящее время
3
чрезвычайно актуальным и приоритетным направлением представляется проблема по
разработке и внедрению новых персонализированных подходов терапии с учетом
фенотипической пластичности макрофагов, позволяющих достичь определенного
баланса М1/М2 фенотипов макрофагов через факторы микроокружения и, прежде
всего, SP-D, воздействующие на патогенетические звенья воспалительной реакции
уже на начальных этапах формирования воспалительной реакции.
Цель исследования
Оценка фенотипа альвеолярных макрофагов и изменений их фенотипической
пластичности, анализ роли SP-D при формировании воспалительного компонента в
бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и гастроэзофагеальной
рефлюксной болезни, и разработка на этой основе прототипа клеточной
биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов.
Задачи исследования
1.
Изучение фенотипа альвеолярных макрофагов у мышей различных
генетических линий – C57/BL6 и Вalb/c по функциональной (фагоцитарная
способность, миграционная активность), секреторной (продукция нитритов,
цитокинов) и морфологической (оценка формы клеток) характеристикам, клеточному
ответу (стресс-ответ)
2.
Определение роли SP-D с учетом его количественных и олигомерных
характеристик в формировании фенотипа макрофагов и в процессе его
репрограммирования у экспериментальных животных.
3.
Разработка
лабораторного
прототипа
клеточной
биотехнологии
репрограммирования альвеолярных макрофагов у экспериментальных животных:
мышей различных генетических линий C57/BL6 и Balb/c
4.
Определение фенотипа и изменений фенотипической пластичности
альвеолярных макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных ХОБЛ.
Изучение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с
помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных ХОБЛ
5.
Оценка фенотипа, изменений фенотипической пластичности альвеолярных
макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных БА. Определение
возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с помощью
клеточной биотехнологии репрограммирования у больных БА.
6.
Определение фенотипа и изменений фенотипической пластичности
альвеолярных макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных ГЭРБ и
при сочетанной патологии ГЭРБ и БА. Изучение возможности коррекции
изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов у больных с сочетанной патологией
ГЭРБ и БА с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования.
7.
Изучение фенотипа и изменений фенотипической пластичности альвеолярных
макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных саркоидозом органов
дыхания. Определение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных
макрофагов с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных
СОД.
4
Научная новизна
Установлены различия функциональных свойств альвеолярных макрофагов
М1 и М2 фенотипов по показателям клеточного ответа с учетом фагоцитарной,
миграционной, секреторной активности клеток и морфологических характеристик,
позволяющие конкретно охарактеризовать особенности развития иммунного ответа
при дисбалансе М1/М2 фенотипов альвеолярных макрофагов.
Определена роль белка SP-D в формировании фенотипа макрофагов и в
процессе их репрограммирования при заболеваниях легких и ГЭРБ.
Впервые разработан лабораторный прототип новой клеточной биотехнологии
репрограммирования альвеолярных макрофагов – как новой стратегии управления
иммунным ответом при заболеваниях легких, позволяющий использовать ключевую
значимость эндогенных факторов микроокружения макрофагов для направленного
репрограммирования макрофагов, с целью формирования необходимого
«терапевтического» фенотипа макрофагов при заболеваниях с воспалительным
компонентом, поражающих бронхо-легочную систему.
Определены функциональные фенотипы альвеолярных макрофагов при
наличии воспалительного компонента в бронхо-легочной системе у больных ХОБЛ,
СОД, БА, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ. Впервые оценены изменения
фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов у больных при
заболеваниях легких с воспалительным компонентом в бронхо-легочной системе и
гастроэзофагеальной рефлюксной болезни с анализом критериев фенотипа
макрофагов: содержания поверхностно-клеточных макрофагальных маркеров М1 и
М2 фенотипа, секреторной активности по продукции цитокинов и морфологической
характеристики.
Впервые
установлена целесообразность применения
разработанного
лабораторного
прототипа
клеточной
биотехнологии
репрограммирования
альвеолярных макрофагов, у больных ХОБЛ на I-II стадиях заболевания, при
впервые выявленном саркоидозе органов дыхания, у пациентов с БА, не получающих
базисной терапии ИГКС, при ГЭРБ с целью формирования необходимого
«терапевтического» фенотипа макрофагов. Установлено, что фенотипическая
пластичность альвеолярных макрофагов у больных при сочетанной патологии ГЭРБ и
БА снижена по сравнению с пациентами, страдающими только одним из указанных
заболеваний и клинически здоровыми лицами, что значительно затрудняет процесс
репрограммирования макрофагов.
Впервые наряду с количественной оценкой содержания SP-D в биологических
жидкостях – БАЛЖ и сыворотке крови – пациентов с заболеваниями легких и
гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью проведен анализ изменения
олигомерного состава сурфактантного белка D в бронхо-альвеолярной жидкости
пациентов (БАЛЖ). Показана роль белка SP-D как эндогенного фактора
репрограммирования в фенотипировании и изменении фенотипической пластичности
альвеолярных макрофагов при заболеваниях ХОБЛ, БА, СОД и ГЭРБ, что позволяет
конкретизировать важные клеточные и молекулярные звенья в концепции
воспалительного ответа в бронхо-легочной системе и иммунного ответа в целом при
данной патологии.
5
Теоретическая значимость
Установлено влияние белка SP-D
на процесс фенотипирования и
репрограммирования макрофагов: отсутствие эндогенной продукции SP-D значимо
влияет на клеточные ответы макрофагов разных фенотипов, а также существенно
изменяет секреторную функцию макрофагов и приводит к формированию изменений
в цитокиновом профиле макрофагов М1 и М2 фенотипов.
Смоделирован процесс репрограммирования макрофагов на основе изменения
их микроокружения – концентрации сыворотки в культуральной среде, который
может явиться основой для разработки экспериментального прототипа клеточной
биотехнологии репрограммирования макрофагов с целью задания им нужного
«терапевтического» фенотипа М1 или М2, что позволит воздействовать на самые
начальные звенья формирования воспалительной реакции и достичь необходимой
сбалансированности всех звеньев иммунного ответа уже на ранних стадиях
патологического процесса.
Разработан лабораторный прототип клеточной биотехнологии направленного
репрограммирования альвеолярных макрофагов in vitro на основании изменения
концентрации сыворотки и, соответственно, SP-D в культуральной среде.
Практическая значимость
Выявленные
различия
фенотипической
пластичности
альвеолярных
макрофагов в зависимости от стадии заболеваний и характера проводимого лечения
позволяют персонифицировать патогенетический подход к терапии у больных ХОБЛ,
БА, СОД, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ.
Локальные и системные изменения качественного и количественного состава
SP-D при заболеваниях с воспалительным поражением бронхо-легочной системы
могут быть использованы в качестве дополнительных критериев диагностики
заболеваний и при оценке тяжести клинического течения заболеваний у больных с
поражением бронхо-легочной системы.
Использование эндогенного фактора – сурфактантного белка D для
направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов дает новые
возможности воздействия на патогенетические звенья воспалительной реакции и
достижения необходимой сбалансированности М1/М2 фенотипов альвеолярных
макрофагов, что может быть использовано в разработке новых схем патогенетической
терапии при воспалительных изменениях бронхо-легочной системы.
Прогрессивное снижение уровня SP-D в БАЛЖ при различных стадиях ХОБЛ,
при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА, а также его повышение при БА и СОД по
сравнению со здоровыми лицами позволяет рассматривать данный критерий как
дополнительный диагностический маркер.
Увеличение уровня SP-D в системной циркуляции при ХОБЛ, БА и СОД и
зависимость его уровня от тяжести течения заболевания и проводимой терапии также
может служить дополнительным диагностическим критерием при верификации
диагноза.
Установленные изменения олигомерного состава SP-D в БАЛЖ в зависимости
от тяжести заболевания и проводимой терапии также могут быть использованы как в
6
диагностике, так и в контроле над эффективностью проводимой терапии заболеваний
с воспалительным поражением бронхо-легочной системы.
Полученные данные являются основой для разработки и возможности
применения в клинической практике клеточной биотехнологии управления
иммунным ответом при лечении пациентов с поражением бронхо-легочной системы,
имеющим воспалительный компонент, на начальных стадиях заболеваний.
Положения, выносимые на защиту
1. Альвеолярные макрофаги М1 и М2 фенотипов обладают специфичностью
функциональных ответов по секреторной способности, морфологическим
характеристиками, фагоцитозу, миграции и клеточным стресс-ответам. Макрофаги
М1 фенотипа характеризуются более выраженной фагоцитарной активностью в
отношении микроорганизмов (Staphylococcus аureus) по сравнению с М2 фенотипом.
Миграционная активность макрофагов М2 фенотипа в условиях аутологичной
бронхо-альвеолярной лаважной жидкости выше по сравнению с показателями М1
фенотипа. Макрофаги М2 фенотипа характеризуются большим базальным уровнем
белков HSP32 и HSP70 по сравнению с М1 фенотипом.
2. Сурфактантный белок D является эндогенным бивалентным фактором
репрограммирования макрофагов. Мономерные формы белка формируют М1
фенотип макрофагов, олигомерные формы (додекамеры) – формируют М2 фенотип.
Изменение концентрации сурфактантного белка D в микроокружении макрофагов
направленно меняет фенотип макрофагов.
3. Прототип клеточной биотехнологии репрограммирования макрофагов,
разработанный на основе использования эндогенных факторов репрограмирования изменения концентрации SP-D в культуральной среде, обеспечивает возможности
воздействия на звенья формирования воспалительной реакции при поражении
бронхо-легочной системы.
4. Изменение фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов
является патогенетическим звеном в формировании воспалительного компонента в
бронхо-легочной системе при ХОБЛ, БА, СОД, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ.
5. Изменение олигомерного состава сурфактантного белка D является
патогенетическим фактором нарушения фенотипа и фенотипической пластичности
альвеолярных макрофагов при ХОБЛ, БА, СОД и сочетании БА и ГЭРБ.
Апробация работы
Материал диссертации доложен и обсужден на V, VI, VII Национальных
конгрессах терапевтов (Москва, 2010, 2011, 2012), на XXI и XXII
конгрессах
Европейского респираторного общества (Амстердам, 2011; Вена, 2012), на ежегодной
научной сессии Американского общества по экспериментальной медицине и
биологии (Сан Диего, США, 2012); на ежегодной научной конференции ГБОУ ВПО
МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России (Москва, 2011), на конференции
молодых ученых федерального государственного бюджетного учреждения
«Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской
академии медицинских наук «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и
лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2012), на ежегодном конгрессе
ассоциации по изучению структуры и физиологии артерий «Artery 12» (Вена, 2012г.),
7
на межкафедральной конференции лаборатории клеточных биотехнологий НИМСИ
ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, кафедр патологической
физиологии лечебного факультета, факультетской терапии и профессиональных
болезней, пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии, терапии и
семейной медицины ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России
(Москва, 2012 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 15 статей в
журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и
изданий, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста и состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти
глав результатов собственных исследований, включающих экспериментальную и
клиническую часть исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций,
библиографического списка, состоящего из 42 отечественных и 164 иностранных
источников. Работа содержит 46 таблиц и 24 рисунка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа включала два этапа: экспериментальный и клинический (рисунок 1).
Рисунок 1. Дизайн клинико-экспериментального исследования.
Общая характеристика экспериментальных животных
Экспериментальная часть исследования выполнена на культурах альвеолярных
макрофагов, выделенных из бронхо-альвеолярной лаважной жидкости 200 мышей
различных генетических линий - C57/BL6 и Balb/c, из которых 20 мышей линии
C57/BL6 не имели гена сурфактантного белка D (SP-D).
8
Исследования экспериментального этапа работы выполнялись на базе ГБОУ
ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России и Пенсильванского
университета, Филадельфия, США. Все эксперименты на животных были проведены
в соответствии с положениями приказа №755 МЗ СССР от 12.08.1977, а также с
соблюдением правил Надлежащей лабораторной практики (GLP, Good Laboratory
Practice).
В соответствии с задачами исследования все животные были разделены на 2
группы: первая группа включала 160 животных - 80 мышей линий C57/BL6 и 80
Balb/c, во вторую группу были включены 40 животных - 20 мышей генетической
линии C57/BL6, имеющие ген SP-D, и 20 мышей C57/BL6, лишенных гена SP-D.
Альвеолярные макрофаги мышей первой группы были использованы для
изучения фенотипа макрофагов по функциональной (фагоцитарная способность,
миграционная активность), секреторной (продукция нитритов, цитокинов),
морфологической (оценка формы клеток) характеристикам и клеточному ответу
(стресс-ответ), для разработки модели репрограммирования макрофагов.
Альвеолярные макрофаги мышей второй группы - С57/BL6, с геном и без гена
SP-D, были использованы для определения роли сурфактантного белка D (SP-D) в
формировании фенотипа макрофагов и его репрограммирования.
Первая и вторая группы животных были сопоставимы по возрасту, весу, полу
(таблица 1).
Таблица 1
Характеристика групп экспериментальных животных
Группа
Генетическая линия
Цвет
Возраст,
Вес, г
Пол
исследо
мышей
нед.
вания
I
С57/BL6, n=80
Черный 8,75±0,09 23,99±0,2 Самцы
2
Balb/c, n=80
Белый
9,09±0,07 23,90±0,2 Самцы
4
C57/BL6 без гена SP-D,
Черный 8,95±0,17 23,55±0,4 Самцы
II
n=20
3
C57/BL6 с геном SP-D,
n=20
Черный
9,00±0,16 23,80±0,4
7
Самцы
Животные содержались в условиях аккредитованного вивария ГБОУ ВПО
МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России и вивария Пенсильванского
университета (Филадельфия, США), в стандартных условиях, не допускающих
попадания патогенных микроорганизмов при естественном освещении и свободном
доступе к воде и пище (Приказ № 63 МЗ СССР от 10.03.1966; «Санитарные правила
по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических
клиник (вивариев)» за № 1045-73, утвержденные Главным государственным
санитарным врачом СССР от 06.04.1973; протокол Комиссии по содержанию
9
животных (Пенсильванский университет, США)). Перед началом экспериментов все
животные в течение 2 часов находились в условиях лаборатории.
Характеристика клинического материала
Исследования клинического этапа работы выполнялись на базе ГБОУ ВПО
МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, ГКБ №70 Департамента
здравоохранения (ДЗ) г. Москвы, ГКБ №11 ДЗ г. Москвы, ФКУЗ «ГКГ МВД России»
(г. Москва) и ФБГУ «ЦНИИТ» РАМН (г. Москва). В клиническом этапе
исследования были использованы бронхо-альвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ)
и сыворотка крови пациентов с ХОБЛ, СОД, БА, ГЭРБ и сочетанной патологией
ГЭРБ и БА, а также клинически здоровых лиц.
Использован биологический материал 151 человек, из которых у 132 человек
по результатам проведения фибробронхоскопии (ФБС) выявлен воспалительный
компонент в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и ГЭРБ, и 19
практически здоровых обследуемых – контрольная группа. В группы исследования
вошли 41 пациент с ХОБЛ I, II и III стадии (по 12, 15 и 14 человек, соответственно),
30 пациентов с СОД (СОД впервые выявленный без приема глюкокортикостероидов
(ГКС) – 15 человек, СОД рецидивирующий с приемом ГКС – 15 человек), 30 больных
БА (интермиттирующая БА без применения ингаляционных ГКС (ИГКС) – 15
человек, персистирующая БА с применением ИГКС - 15 человек), 15 больных ГЭРБ
(эрозивная форма) и 16 больных сочетанной патологией ГЭРБ и БА (с базисной
терапией ИГКС по поводу БА).
Диагнозы были установлены на основании клинических, инструментальных и
лабораторных методов исследования в соответствии с принятыми диагностическими
критериями.
Контрольную группу составили 19 клинически здоровых лиц, из которых 9
человек были курящими, 10 - некурящими.
Все обследуемые перед проведением
инвазивных процедур ФБС
и
эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС)
подписывали форму информированного
согласия.
Группы исследования были сопоставимы по полу и возрасту.
Критерии включения в исследование:
В исследование включались лица мужского и женского пола, в возрасте 18-70
лет, с установленными диагнозами: ХОБЛ I-III стадии (в соответствии с
рекомендациями «Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики
хронической обструктивной болезни легких», GOLD, 2007) в стадии ремиссии для IIII стадии и без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения
в исследование для больных с I и II стадией; впервые выявленным или
рецидивирующим СОД (наличие диагностических критериев СОД) без применения
гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения в исследование при впервые
выявленном СОД), некурящие; интермиттирующей и персистирующей БА (в
соответствии с рекомендациями Глобальной стратегии лечения и профилактики
бронхиальной астмы, GINA, 2007) в стадии ремиссии на момент включения в
исследование и без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до
включения в исследование для больных интермиттирующей БА, некурящие;
10
эрозивной ГЭРБ (диагностические критерии в соответствии с клиническими
рекомендациями Российской гастроэнтерологической ассоциации (РГА)) в стадии
ремиссии на момент включения в исследование, некурящие; сочетанной патологией
ГЭРБ и БА (диагностические критерии персистирующей БА (Глобальная стратегия
лечения и профилактики бронхиальной астмы, GINA, 2007) и эрозивной ГЭРБ
(клинические рекомендации РГА) в стадии ремиссии на момент включения в
исследование и применением ИГКС по поводу БА, некурящие; с подтвержденными
при ФБС воспалительными изменениями бронхо-легочной системы.
Группу контроля составили клинически здоровые добровольцы в возрасте 18 –
70 лет, мужского и женского пола без патологии органов дыхания, ЖКТ и наличия
других критериев исключения; не применявшие гормональные препараты в течение 6
месяцев до включения в исследование.
Критерии исключения из участия в исследовании:
острый
инфаркт
миокарда,
нестабильная
стенокардия,
недостаточность
кровообращения IIБ – III стадии, пароксизмальные нарушения ритма сердца,
гипертонические кризы, острое нарушение мозгового кровообращения; дыхательная
недостаточность III ст.; онкологические заболевания;
туберкулез;
острые
инфекционные заболевания; заболевания соединительной ткани с изменениями
функции дыхательной системы; нарушения свертывающей системы крови; сахарный
диабет; беременность или кормление грудью, возраст моложе 18 или старше 70 лет.
Терапия пациентов группы исследования соответствовала клиническим
статусам и симптоматике.
 Пациенты группы ХОБЛ с I и II стадиями заболевания получали
ингаляционные холинолитики и β2-агонисты короткого и пролонгированного
действия, пациенты с III стадией ХОБЛ дополнительно принимали ИГКС
(средние дозы 1600-2000 мкг/сут в пересчете на беклометазона дипропионат) и
β2-агонисты пролонгированного действия.
 В группе СОД пациенты с впервые выявленным саркоидозом включались в
исследование сразу после верификации диагноза до назначения какой-либо
терапии. В группе рецидивирующего саркоидоза органов дыхания пациенты
получали системные глюкокортикостероиды – средние дозы в пересчете на
преднизолон составляли 5-15 мг/сутки.
 В группе БА объем терапии у пациентов основывался на клиническом течении
заболевания и существующих стандартах терапии в зависимости от тяжести
течения БА. Пациенты с интермиттирующей астмой получали β2-агонисты
короткого и пролонгированного действия, пациенты с бронхиальной астмой
персистирующего течения – ингаляционные глюкокортикостероиды в средних
дозах 800-1500 мкг в пересчете на беклометазона дипропионат и β2-агонисты
пролонгированного действия.
11
Таблица 2
Характеристика больных ХОБЛ, СОД, БА, ГЭРБ и БА, ГЭРБ
и клинически здоровых лиц
Показатели
Клинический
Возраст,
Количество
диагноз
лет
обследованных
(М±m)
Всего Муж- ЖенГруппа
чин
щин
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)
I стадия
ХОБЛ, легкое
48,66±3,03
12
7
5
течение
II стадия
ХОБЛ, средне58,0±1,27
15
11
4
тяжелое течение
III стадия
ХОБЛ, тяжелое
58,6±2,02
14
12
2
течение
Саркоидоз органов дыхания (СОД)
СОД
СОД впервые
44,72±3,89
15
8
7
ГКС (-)
выявленный
СОД
СОД
45,10±3,06
15
10
5
ГКС (+)
рецидивирующий
Бронхиальная астма (БА)
БА
Интермиттирующая 46,56±4,18
15
9
6
ИГКС (-)
БА без приема
ИГКС
БА
Персистирующая
48,24±3,27
15
8
7
ИГКС(+)
БА с приемом ИГКС
Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ)
ГЭРБ
ГЭРБ
46,41±4,18
15
10
5
Сочетанная патология: ГЭРБ + БА
ГЭРБ +
Сочетанная
49,30±3,64
16
12
4
БА(ИГКС+) патология ГЭРБ и
БА
Клинически здоровые лица
Здоровые
Здоровые курящие 53,34±2,48
9
6
3
Здоровые
51,83±3,52
10
7
3
некурящие
Значения
ОФВ1
(% от
должного)
90,75±1,93
58,37±2,70
38,62±2,51
97,1 ± 4,6
108,1 ± 4,8
88,47±2,90
70,27±5,23
101,6±4,81
75,6±4,27
101,4±3,06
102,7±4,18
 Больным ГЭРБ
проводилась терапия антисекреторными средствами –
блокаторами протонной помпы (омепразол, 20-40 мг в сутки).
 При сочетанной патологии БА и ГЭРБ больные получали ИГКС в средних
дозах 800-1500 мкг в пересчете на беклометазона дипропионат, β2-агонисты
пролонгированного действия (базисная терапия БА), блокаторы протонной помпы
(20-40 мг омепразола в сутки) для поддерживающей терапии ГЭРБ.
12
Методики, использованные при проведении экспериментов
Выделение АМ
АМ были выделены из бронхо-альвеолярной лаважной жидкости мышей,
больных и клинически здоровых лиц. Для получения БАЛЖ у мышей в легкие через
внутритрахеальный катетер 4 раза вводилось по 1 мл стерильного фосфатного
буфера с температурой +37°С (Lasbury, M.E., et al., 2003). АМ больных и
клинически здоровых лиц были выделены из БАЛЖ, полученной в результате
проводимой фибробронхоскопии (T. Thum и соавт., 2006). Полученный БАЛЖ
центрифугировался (Heraeus-biofuge primo R, Германия) 4 минуты при 1000 об/мин.
Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл среды RPMI 1640 с доведением
концентрации клеток в питательной среде RPMI 1640 до 1∙106/мл (Orosi et al., 1993).
Одновременно с подсчетом количества клеток в камере Горяева производилось
определение жизнеспособности АМ методом исключения красителя трипанового
синего.
Культивирование АМ
АМ в стерильных условиях помещались в лунки стерильных культуральных
планшетов из расчета 0,5 млн макрофагов на 1 лунку 48-луночного планшета.
Планшеты с АМ для культивирования помещались в СО2 инкубатор (Sanyo, Япония)
при 37ºС и 5% СО2. Через час культивирования во всех лунках с АМ производилась
замена среды на следующую комбинацию: 0,5 мл RPMI 1640 + сыворотка (FBS, 10%)
+ антибиотик (пенициллин / стрептомицин, 100 ед/мл / 100 мкг/мл). Планшеты вновь
помещались в инкубатор при +37ºС и 5% СО2.
Определение фагоцитарной способности АМ
Фагоцитарная функция макрофагов (концентрация клеток 1 х 106/мл)
оценивалась прямым визуальным подсчетом поглощенных микроорганизмов
(инактивированный нагреванием штамм Staphylococcus aureus 9198 с концентрацией
клеток 1 х 109/мл) при соотношении макрофаги:стафилококк – 1:400; 1:600; 1:800;
1:1000 (оптический микроскоп MICROS МС50, Австрия) через 3 часа после начала
культивирования (+37+0,5оС, 5% СО2). Рассчитывался процент фагоцитирующих
клеток от общего числа АМ и среднее количество микробов, захваченных одной
клеткой (для фагоцитирующих клеток).
Определение миграционной активности АМ
Определение миграционной активности АМ основано на принципе метода
Бойдена - прохождении лейкоцитов из одной половины камеры с взвесью клеток в
другую половину камеры, содержащую хемоатрактант, и разделенных между собой
мембранным фильтром. Анализ хемотаксиса проводился непосредственно по
методике Neuro Probe Protocol (http://www.neuroprobe.com/protocols/BY312Boyden.html). В качестве хемоаттрактанта была использована БАЛЖ мышей линий
С57/BL6 и Balb/c. Подсчет количества мигрировавших клеток проводился в каждой
ячейке под оптическим микроскопом (MICROS МС50, Австрия). Миграционная
активность оценивалась по индексу миграции – отношение количества
мигрировавших клеток к количеству немигрировавших в одной лунке.
13
Определение морфологической характеристики АМ
Морфологическая характеристика (форма клеток) АМ оценивалась методом
световой микроскопии (MICROS МС50, Австрия). Подсчет клеток округлой и
фибробластоподобной расплющенной формы проводился
при помощи
модифицированного метода Шиллинга в 100 клетках в 5 полях зрения (Шиллинг В.,
1926).
Определение уровня продукции нитритов в культуральной среде
Продукция нитритов АМ оценивалась спектрофотометрически по содержанию
нитритов в культуральной среде с помощью реакции Грисса (Redente E.F., et al.,
2009).
У больных с поражением бронхо-легочной системы и здоровых лиц
секреторная активность альвеолярных макрофагов по продукции нитритов не
оценивалась, поскольку данный критерий не является достоверным у людей
(Schneemann M., 2007; Fang F.C., 2007; Murray P.J., 2011).
Определение уровня цитокинов
Уровень цитокинов в БАЛЖ и в культуральной среде после
репрограммирования АМ экспериментальных животных, больных и клинически
здоровых лиц оценивался методом проточной цитофлуорометрии (Вeckman Coulter
FC500, США) набором для мультиплексного определения 10 цитокинов (BMS820FF)
мыши и набором для мультиплексного определения 11 цитокинов (BMS810FF)
человека в соответствии с инструкциями производителя. Анализ полученных данных
проводился лицензированной программой разработчика FlowCytomix Pro ver. 3.0.
Оценка содержания стресс-белков HSP32 и HSP70
Содержание стресс-белков HSP32 и HSP70 оценивали методом вестерн-блот
анализа. Просмотр результатов осуществляли хемилюминесцентно (ECL+, Amersham
Inc., Pittsburgh, PA). Количественное определение проводилось путем
денситометрического сканирования экспонированных пленок или направленным
просмотром на устройстве Kodak 440 Imaging System (New Haven, CT).
Определение содержания поверхностных макрофагальных маркеров
человека
Определение поверхностных макрофагальных маркеров проводилось на
проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter FC500, США) после исходного
выделения
АМ, а также после процедуры репрограммирования клеток.
Использованы моноклональные антитела к CD80, CD25, CD163, CD206 (Beckman
Coulter; BD Pharmingen для CD163) (Martinez F.O., et al., 2008). Подготовка проб
макрофагов для анализа проводилась по инструкциям производителя. Оценивали
процентное содержание маркеров М1 и М2 фенотипов среди всех выделенных
макрофагов у конкретного пациента.
Методика репрограммирования макрофагов (Zhang Х., Morrison С., 1993г.)
Методика использована для получения М1 и М2 фенотипов макрофагов у
мышей C57/BL6 с геном и без гена SP-D. Первичная культура наивных макрофагов
разделялась на три пула. В первый пул (формирование М1) на 6 часов добавлялся 0,5
нг/мл ЛПС (E. coli O111:B4, List Biologic Laboratories, Campbell, CA); во второй пул
(формирование М2) - 5 нг/мл ЛПС. Третий пул являлся контролем (М0 фенотип). Для
14
индукции воспалительного ответа использовали ЛПС в концентрации 500 нг/мл.
Активация производилась через 6 часов после добавления программирующих
концентраций ЛПС или через 7 часов после посадки на планшеты. Через 24 часа
после индукции, среда отбиралась из лунок для анализа.
Лабораторный прототип направленного репрограммирования АМ при
изменении концентрации сыворотки в питательной среде
Репрограммирование в М1 фенотип:
АМ в среде RPMI 1640 в стерильных условиях помещались в лунки
стерильных культуральных планшетов (0,5 млн АМ на 1 лунку 48-луночного
планшета) и находились в течение 1 часа в инкубаторе (Sanyo) (+37ºС, 5% СО2).
Затем питательная среда во всех лунках заменялась на следующую комбинацию:
RPMI 1640, FBS (0%), пенициллин / стрептомицин, 100ед/мл / 100 мкг/мл. Планшеты
помещались в инкубатор (Sanyo) (+37ºС, 5% СО2). Через 12 часов культивирования в
лунки добавлялся ЛПС (500 нг/мл), после чего АМ культивировались еще в течение
24 часов. Таким образом, общее время культивирования АМ составляет 37 часов.
Результаты изменения маркеров фенотипа, функциональных и клеточных ответов
оценивались через 24 часа после стимуляции ЛПC.
Репрограммирование в М2 фенотип:
АМ в среде RPMI 1640 в стерильных условиях помещались в лунки
стерильных культуральных планшетов (0,5 млн АМ на 1 лунку 48-луночного
планшета) и находились в течение 1 часа в инкубаторе (Sanyo) (+37ºС, 5% СО2).
Затем питательная среда во всех лунках заменялась на следующую комбинацию:
RPMI 1640, FBS (40%), пенициллин / стрептомицин, 100ед/мл / 100 мкг/мл.
Планшеты помещались в инкубатор (Sanyo) (+37ºС, 5% СО2). Через 12 часов
культивирования в лунки добавлялся ЛПС (500 нг/мл), после чего АМ
культивировались еще в течение 24 часов. Таким образом, общее время
культивирования АМ составляет 37 часов. Результаты изменения маркеров фенотипа,
функциональных и клеточных ответов оценивались через 24 часа после стимуляции
ЛПС.
Репрограммирование АМ с использованием сыворотки, не содержащей
SP-D
За 48 часов до проведения эксперимента сыворотка FBS подвергалась
предварительной обработке: на 1 мл FBS было добавлено по 20 мкл 100мМ CaCl2 и по
30 мкл гранул мальтозы (M5895 Sigma, США). Полученная смесь инкубировалась
при 40С в течение 48 часов. Через 48 часов подготовленная смесь
центрифугировалась в течение 5 минут при 400g. Полученный супернатант FBS не
содержал SP-D и был использован для процедуры репрограммирования наряду с
обычной FBS.
Процедура репрограммирования АМ при использовании FBS,
содержащей SP-D, и без SP-D проводилась в соответствии с методикой,
представленной выше.
Получение сыворотки крови пациентов и здоровых лиц
Венозная кровь пациентов и здоровых лиц
забиралась в пробирки
VACUETTE® с активатором образования сгустка для получения сыворотки. После
забора крови пробирка осторожно однократно переворачивалась и выдерживалась в
15
течение 60 минут в вертикальном положении при комнатной температуре (не ниже
+20оС), затем центрифугировалась при 3000 об./мин в течение 15 минут (центрифуга
Eppendorf 5415 R, Германия) c последующим отделением сыворотки крови.
Количественное определение уровня SP-D в БАЛЖ и сыворотке человека
Уровень SP-D в БАЛЖ и сыворотке больных и здоровых лиц определялся
методом иммуноферментного анализа ELISA (BioVendor). Результаты уровня SP-D в
БАЛЖ представлены с учетом фактора разведения, т.е. содержания уровня общего
белка в БАЛЖ. Определение уровня общего белка в БАЛЖ проводилось методом
Брэдфорда (Beirne P, et al., 2009).
Определение олигомерных форм SP-D
Определение олигомерного состояния белка SP-D в БАЛЖ и сыворотке крови
проводили методом вестерн-блот анализа с использованием трис-ацетатных гелей
(Invitrogen NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Gel, cat # EA03752BOX) и антител против SPD. Антитела против SP-D были предоставлены Пенсильванским университетом
(США).
Методы статистической обработки
Статистическую обработку полученных числовых результатов выполняли на
персональном компьютере с использованием программы Statistica 8.0 for Windows
(StatSoft Inc, США). Все выборки проверялись на нормальность распределения. Для
определения значимости различий между исследуемыми признаками в выборке с
нормальным распределением были использованы параметрические методы
статистики (t-критерий Стьюдента). Сравнение средних осуществлялось в
несвязанных массивах посредством расчета критерия Стьюдента (t-теста) методом
непрямых разностей (вероятность ошибки р<0,05 оценивалась как значимая, р<0,01 –
очень значимая и р<0,001 – максимально значимая). В случаях, когда распределение
данных не соответствовало нормальному и в случае анализа малых выборок, для
определения статистической значимости различий использовался непараметрический
U-тест по методу Манна и Уитни для независимых выборок. Различия считали
статистически достоверными при значениях p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Фенотипическая активность альвеолярных макрофагов М1 и М2
фенотипов мышей различных генетических линий – C57/BL6 и BALB/с
В результате проведенных экспериментальных исследований выявлены
существенные различия функциональных (фагоцитоз, миграционная активность,
секреторная способность), клеточных ответов (стресс-ответ) альвеолярных
макрофагов мышей М1 и М2 фенотипов.
Более выраженной фагоцитарной активностью в отношении микроорганизмов
(на примере Staphylococcus аureus) обладали макрофаги М1 фенотипа по сравнению с
М2 фенотипом. При максимальном соотношении 1 АМ : 1000 Staphylococcus аureus
фагоцитарная активность М1 макрофагов превышала показатели М2 макрофагов
более чем в 2 раза. Установлена более выраженная зависимость фагоцитарной
16
активности М1 фенотипа от концентрации Staphylococcus аureus, чем у М2 фенотипа
(рисунок 2).
Рисунок 2. Фагоцитарная активность альвеолярных макрофагов М1 фенотипа
(мыши С57/BL6), и макрофагов М2 фенотипа (мыши BABL/c)
Миграционная способность альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов
(мыши С57/BL6 и Balb/c) изучалась в отношении наиболее «свойственного»
альвеолярным макрофагам хемоаттрактанта – бронхо-альвеолярной лаважной
жидкости (БАЛЖ). Выявлено, что способность макрофагов мигрировать в
направлении «собственной» БАЛЖ была существенно выше по сравнению с
хемоаттракцией «чужеродной» БАЛЖ (таблица 3).
Таблица 3
Оценка миграционной активности альвеолярных макрофагов М1 фенотипа (мыши
С57/BL6) и М2 фенотипа (мыши BALВ/c)
Индекс миграции, абс.
Линия мышей C57/BL6
Линия мышей Balb/c
(М1 макрофаги)
(М2 макрофаги)
Хемоаттрактант «собственная» БАЛЖ
1,50±0,11‡
1,88±0,13*#§
Хемоаттрактант «чужеродная» БАЛЖ
1,12±0,12
0,93±0,12
*р<0,05 относительно использования хемоаттрактанта «собственной» БАЛЖ у М1
макрофагов (линия мышей C57/BL6), #p<0,001 относительно использования хемоаттрактанта
«чужеродной» БАЛЖ у М2 макрофагов (линия мышей Balb/c), ‡р<0,05 относительно
использования хемоаттрактанта «чужеродной» БАЛЖ у М1 макрофагов (линия мышей
C57/BL6), §р<0,001 активность макрофагов М2 (линия Balb/c) относительно активности М1
(линия C57/BL6) при использовании хемоаттрактанта БАЛЖ BALB/c
17
Показатели миграционной активности макрофагов М2 фенотипа, полученных
от мышей BALB/c, в ответ на собственную БАЛЖ BALB/c были в 2 раза выше, чем
при применении чужеродной БАЛЖ С57/BL6 (1,88+0,13 vs 0,93+0,12, р<0,001), а
миграционная активность макрофагов М1 фенотипа мышей С57 в ответ на БАЛЖ
С57/BL6 была почти в 1,5 раза выше по сравнению с хемоаттракцией чужеродной
БАЛЖ BALB/c (1,50+0,11 vs 1,12+0,12, р<0,05). В случае применения в качестве
хемоаттрактанта БАЛЖ BALB/c, активность макрофагов М2 (линия Balb/c) была
существенно выше, по сравнению с М1 (линия C57/BL6) (1,88+0,13 vs 1,12+0,12,
р<0,001). В том же случае, когда в качестве хемоаттрактанта использовался БАЛЖ
С57/BL6, активность макрофагов М1 существенно превышала показатели М2
фенотипа (1,50+0,11 vs 0,93+0,12, р<0,001).
Секреторная активность АМ М1 и М2 фенотипов анализировалась по
продукции нитритов и цитокинов. Продукция нитритов оценивалась в условиях
культуры клеток по показателям культуральной среды с активированными клетками,
т.е. среды с макрофагами после добавления ЛПС. Показано, что продукция нитритов
АМ мышей C57/BL6 была почти в 2 раза выше по сравнению с АМ мышей линии
Balb/c (8,4 мкМ и 4,3 мкМ, соответственно (рисунок 3).
*р<0,05 относительно продукции нитритов макрофагами мышей линии Balb/c
Рисунок 3. Продукция нитритов альвеолярными макрофагами М1 фенотипа (мыши
С57/BL6) и М2 фенотипа (мыши BABL/c).
Анализ продукции цитокинов в БАЛЖ мышей линий C57/BL6 и Balb/c выявил
преобладание цитокинов Th1 профиля у C57/BL6 и Th2 профиля - у Balb/c (таблица
4). Учитывая, что у животных линии C57/BL6 преобладают макрофаги М1 фенотипа,
а у линии Balb/c – М2 фенотипа, установлено, что макрофаги М1 фенотипа
преимущественно секретируют провоспалительные Th1 цитокины, а макрофаги М2
фенотипа – Th2 противовоспалительные (таблица 4).
18
Таблица 4
Уровень цитокинов в БАЛЖ мышей C57/BL6 и BALB/c
Цитокины
IL-2 (Th1)
IL-5 (Th2)
IL-6 (Th1)
INFγ (Th1)
Уровень цитокинов в БАЛЖ, пг/мл
Линия мышей C57/BL6
Линия мышей Balb/c
(n=80)
(n=80)
35,17±3,22
21,74±2,01**
36,55±5,3
41,81±5,81 *
197,18±25,90
173,14±17,34
69,47±9,23
63,50±8,35
IL-4 (Th2)
TNF-α (Th1)
IL-17 (Th1)
GM-CSF (Th1)
74,97±7,25
14,76±1,84
18,70±3,55
86,64±6,84
81,64±6,54 *
7,93±2,15 **
11,60±8,31
87,37±6,54
*р<0,05 относительно линии мышей С57/BL6,
**р<0,001 относительно линии мышей С57/BL6
Проведенный анализ морфологической характеристики АМ показал, что при
стандартных условиях культивирования клеток (10% FBS, +370С, 5% СО2) через 36
часов от момента посадки макрофагов на плашку у C57/BL6 преобладали АМ
округлой формы (87,43±2,41%), что соответствует преобладанию М1 фенотипа
макрофагов
(рисунок 4). У линии Balb/c – клетки расплющенной
фибробластоподобной формы, характерной для М2 фенотипа, составляли
31,42±3,14% (рисунок 4).
округлые М1 клетки
расплющенные М2 клетки
Рисунок 4.
Форма АМ мышей C57/BL6 и Balb/c через 36 часов от начала
культивирования в стандартных условиях (10% FBS, 5% CO2).
Клеточные ответы АМ М1 и М2 фенотипов анализировались по показателям
стресс-ответа – продукции белков теплового шока HSP32 и HSP70. Установлено
значимое превышение показателей базальной продукции HSP32 и HSP70 у
макрофагов М2 фенотипа по сравнению с М1 макрофагами (таблица 5).
19
Таблица 5
Продукция HSP32 альвеолярными макрофагами М1 и М2 фенотипа
Фенотип макрофагов
М1 макрофаги, исходно (мыши С57/BL6, n=80)
М2 макрофаги, исходно (мыши Balb/c, n=80)
М1 макрофаги, стимулированные ЛПС (мыши
С57/BL6, n=80)
М2 макрофаги, стимулированные ЛПС (мыши
Balb/c, n=80)
Продукция HSP32, опт.ед.
М+m
5,41+0,08
6,74+0,41*
9,57+2,46
8,48+1,85
*р<0,001 относительно линии мышей С57/BL6
Полученные данные
определяют специфичность функциональных и
клеточных ответов макрофагов разных фенотипов, что позволяет выделить
дополнительные признаки, характеризующие особенности развития иммунного
ответа в бронхо-легочной системе при воспалительных изменениях.
Определение роли SP-D в формировании фенотипа макрофагов и в
процессе его репрограммирования
Показано, что фактор микроокружения альвеолярных макрофагов SP-D
является эндогенным фактором репрограммирования. В ходе экспериментов на АМ
мышей второй группы - C57/BL6 без гена SP-D и с геном SP-D, проводился анализ
роли SP-D в формировании фенотипа и его репрограммировании по критериям
фенотипа макрофагов: секреторной активности макрофагов (продукция цитокинов),
показателям клеточного ответа АМ (продукция стресс-белка HSP70).
Анализ продукции цитокинов макрофагами М1 и М2 фенотипа (фенотип АМ задан
по методике X. Zhang, D.C. Morrison, 1993) у мышей второй группы показал, что SP-D
существенным образом влиял на фенотипическую активность АМ. Отсутствие гена
SP-D не влияло на продукцию Th1 цитокинов IL-12 и TNF-α в М2 фенотипе
макрофагов, но приводило к увеличению секреции IL-12 и к снижению продукции
TNF-α в М1 фенотипе. Отсутствие гена SP-D приводило к увеличению продукции IL6 в М1 и М2 фенотипе. Выявлена зависимость эффектов SP-D от фенотипа
макрофагов и на примере IL-10, и наиболее ярко она проявилась на примере IL-13 отсутствие SP-D не влияло на продукцию указанных цитокинов АМ М1 фенотипа и
повышало ее у АМ М2 фенотипа. Исключение составил лишь один из исследуемых
цитокинов - IFN-γ: удаление гена SP-D не приводило к изменению продукции этого
цитокина ни в одном из фенотипов макрофагов (таблица 6). Данные о зависимости
влияния SP-D на продукцию разных Th1 и Th2 цитокинов от фенотипа макрофагов
предопределяет и изменение баланса Th1 / Th2 цитокинов. В М1 фенотипе отсутствие
SP-D оказывает разнонаправленный эффект на различные Th1 и Th2 цитокины, а в
М2 фенотипе за счет увеличения продукции Th2 цитокинов баланс Th1/Th2
сдвигается в сторону Th2 цитокинов (таблица 6).
20
Таблица 6
Продукция цитокинов Th1 и Th2 профиля АМ мышей C57/BL6
с геном и без гена SP-D
Цитокины
TNF-α,
пг/мл
IL-12,
пг/мл
INF-γ,
пг/мл
IL-6,
пг/мл
IL-10,
пг/мл
IL-13,
пг/мл
Линия
мышей,
фенотип АМ
C57/BL6 М1 8714±865**‡ 51,0±3,0‡ 798±84 31000±2000**‡ 329±40
6,0±2,0
**
**
‡
**‡
с геном М2 4412±468 11,0±2,0
533±44
21500±2000
780±35
5,0±1,5‡
SP-D,
n=20
C57/BL6 М1 6142±432## 70,0±8,0## 901±66## 43000±2000##
218±44
4,0±2,3
без гена
SP-D,
М2 3655±275
10,0±2,5
622±77
28000±1000
526±54## 12,0±2,5##
n=20
**р<0,001 относительно М0 макрофагов линии C57/BL6 с геном SP-D; ## р<0,001
относительно М0 макрофагов линии C57/BL6, лишенных гена SP-D; ‡ р<0,001 относительно
макрофагов линии C57/BL6 без гена SP-D
Клеточный ответ АМ мышей второй группы оценивался по продукции стрессбелка HSP70. У мышей с геном SP-D после стимуляции макрофагов 500 нг/мл ЛПС
(по методике X. Zhang, D.C. Morrison, 1993) и в М1, и в М2 фенотипах макрофагов
отмечалось увеличение синтеза HSP70 (рисунок 5). Содержание HSP70
увеличивалось более, чем в 100 раз.
Рисунок 5. Увеличение содержания HSP70 в макрофагах мышей линии C57/BL6,
имеющих ген SP-D (контроль), и лишенных гена SP-D, М0, М1 и М2 фенотипов в
ответ на действие 500 нг/мл ЛПС в течение 24 часов.
При этом было установлено, что предварительное репрограммирование
макрофагов на М1 и М2 фенотипы практически не повлияло на способность
21
нормальных макрофагов индуцировать синтез защитных стресс-белков. Наблюдалась
лишь тенденция к снижению ЛПС-индуцированного синтеза HSP70 в М1 фенотипе
по сравнению с М2 фенотипом. В макрофагах мышей, лишенных гена SP-D, в ответ
на стимуляцию ЛПС (500 нг/мл) синтез HSP70 в М1 фенотипе практически не
изменялся (р>0,05), а в М2 фенотипе был более чем в 2 раза увеличен (р<0,001) по
сравнению с соответствующим фенотипом макрофагов мышей, генотип которых
содержал ген SP-D. Полученные данные указывают, что SP-D существенным образом
влияет на синтез HSP70 в зависимости от фенотипа макрофагов (рисунок 5).
Показана значимая роль SP-D в процессах фенотипирования и
репрограммирования АМ и как фактора микроокружения. Установлено, что в
сыворотке, добавляемой в питательную среду при культивировании клеток,
содержится SP-D (рисунок 6).
Додекамеры
Мономеры
Рисунок 6. Олигомерный состав SP-D в сыворотке различных концентраций (0%,
10%, 40%) и в сыворотке при добавлении антител, блокирующих SP-D.
При этом подтверждена гипотеза об изменении количества SP-D в сыворотке
соответственно изменению концентрации самой сыворотки. Проведенный анализ
качественного состава SP-D (олигомеры) при изменении концентрации сыворотки
показал, что в бессывороточной среде (0% FBS) SP-D отсутствует. При увеличении
концентрации ФБС до 10% и 40% в питательной среде общее количество SP-D
пропорционально возрастало. При увеличении содержания SP-D его олигомерный
состав изменялся пропорционально изменению концентрации белка в питательной
среде (рисунок 6, таблица 7). Установлено, что при добавлении к сыворотке антител,
блокирующих SP-D, белок в сыворотке не определялся (рисунок 6, таблица 7).
Полученные данные об изменении содержания и олигомерного состава SP-D в
зависимости от концентрации сыворотки позволяют предположить, что увеличение
концентрации сыворотки в питательной среде с возросшим количеством
мультимерных форм SP-D способствуют направленному репрограммированию
альвеолярных макрофагов в сторону М2 фенотипа, а снижение концентрации
сыворотки и уменьшение уровня SP-D со снижением количества мультимеров – в
сторону М1 фенотипа.
22
Таблица 7
Олигомерный состав SP-D при различных концентрациях FBS
в питательной среде
Олигомерная форма
SP-D, опт. ед.
Мономеры
Додекамеры
Мультимеры
Концентрация сыворотки FBS в питательной среде
100%
40%
10%
0%
18,53±0,06
6,49±0,06
4,69±0,13
9,69±0,08
5,03±0,06
4,20±0,01
6,62
-
При оценке роли SP-D как фактора микроокружения в процессе
фенотипирования
и
репрограммирования
макрофагов
анализировались
общепринятые критерии фенотипа макрофагов: секреторная способность (продукция
нитритов), морфологическая характеристика АМ.
Продукция нитритов АМ мышей генетических линий C57/BL6 и Balb/c
значимо различалась при культивировании клеток с добавлением стандартной
сыворотки и сыворотки, содержащей антитела, блокирующие SP-D. При
культивировании АМ с сывороткой, содержащей блокирующие SP-D антитела,
продукция нитритов была существенно выше, чем при использовании стандартной
сыворотки и составляла 63,13±26,10 мкМ vs 21,32±0,39 мкМ для 10% концентрации и
27,38±3,28 мкМ vs 4,96±0,06 для 40% концентрации, соответственно. Аналогичная
динамика наблюдалась и у АМ мышей линии Balb/c: 9,90±0,14 мкМ vs 7,12±0,23 мкМ
для 10% концентрации и 5,19±0,96 мкМ vs 1,93±0,45 мкМ для 40% концентрации,
соответственно. Полученные данные указывают на то, что в отсутствие SP-D как
фактора микроокружения
отмечается тенденция к репрограммированию АМ в
сторону М1 фенотипа.
Анализ морфологической характеристики АМ М1 и М2 фенотипов показал,
что при культивировании АМ с 10 и 40% сывороткой, содержащей блокирующие SPD антитела, процентное содержание клеток расплющенной формы (М2) у АМ мышей
линий C57/BL6 и Balb/c достоверно снижалось по сравнению с аналогичными
концентрациями стандартной сыворотки (таблица 8).
Таким образом, установлено влияние SP- D на процесс фенотипирования и
репрограммирования макрофагов: отсутствие эндогенной продукции SP-D
существенно изменяло секреторную функцию макрофагов и приводило к
формированию изменений в цитокиновом профиле макрофагов М1 и М2 фенотипов,
а также значимо влияло на клеточные ответы макрофагов разных фенотипов.
Отсутствие SP-D в микроокружении макрофагов приводило к изменению
фенотипирования макрофагов и их репрограммирования, что подтверждено
существенным изменением секреторной способности макрофагов
на примере
продукции нитритов и выраженным изменением морфологических характеристик
клеток в процессе репрограммирования.
23
Таблица 8
Морфологическая характеристика макрофагов при репрограммировании клеток
различными концентрациями сыворотки FBS
Концентрация FBS в
питательной среде, %
Клетки расплющенной формы,
%
0 vs 0+АТблок
Клетки округлой формы,
%
C57/BL6, n=80
90,70±1,11 vs 90,90±0,89
83,25±3,69 vs 89,00±4,60
61,50±5,29 vs 83,00±3,29
Balb/c, n=80
89,60±1,02 vs 90,20±1,
10 vs 10+АТблок
40 vs 40+АТблок
67,75±4,03 vs 78,77±3,92
49,00±7,0 vs 83,00±1,35
32,25±4,03 vs 21,33±3,92**
51,00±7,0 vs 17,00±1,35**
0 vs 0+АТблок
10 vs 10+АТблок
40 vs 40+АТблок
9,30±1,11 vs 9,10±0,89
16,75±3,69 vs 11,00±4,60*
38,50±5,29 vs 17,00±3,29**
10,40±1,02 vs 9,80±1,06
*р<0,05 относительно ФБС без добавления блокирующих антител, **р<0,001 относительно
ФБС без добавления блокирующих антител
Разработка
лабораторного
прототипа
клеточной
биотехнологии
направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов мышей
генетических линий C57/BL6 и Balb/c
В основу разработки лабораторного прототипа клеточной биотехнологии
репрограммирования макрофагов положена способность макрофагов существенно
модифицировать/репрограммировать
свой
фенотип
в
зависимости
от
микроокружения. Показано, что изменение концентрации сыворотки, добавляемой в
питательную среду при культивировании альвеолярных макрофагов, способно
вызывать направленное изменение фенотипа клеток в сторону М1 или М2 фенотипа,
что подтверждено такими общепринятыми критериями фенотипа, как секреторная
активность макрофагов по продукции нитритов и цитокинов и изменением
морфологической характеристики клеток.
Выбранная продолжительность культивирования и точки тестирования были
определены в ходе пилотных экспериментов. Выбор пониженных и повышенных
концентраций FBS при культивировании макрофагов также проводился
экспериментально.
Увеличение продукции нитритов АМ обеих линий животных при снижении
концентрации сыворотки FBS в культуральной среде с 10% до 0%, что свойственно
М1 фенотипу макрофагов. Повышение концентрации FBS с 10% до 40% приводило к
достоверному снижению продукции нитритов у АМ обеих линий, что
свидетельствует о репрограммировании фенотипа АМ в сторону М2 (таблица 9).
24
Таблица 9
Характеристика секреторной функции макрофагов М1 и М2 фенотипов при их
репрограммировании различными концентрациями сыворотки
Альвеолярные макрофаги мышей линии С57/BL6, n=80
0% FBS
5% FBS
10% FBS
20% FBS
30% FBS
Продукция
нитритов,
мкМ
68,00±15,60#
39,42±9,16
21,50±11,46*
25,39±12,46
40% FBS
#
5,23±1,15#
4,13±0,34#
2,80±1,48#
7,66±0,64
Альвеолярные макрофаги мышей линии Balb/c, n=80
Продукция
нитритов,
мкМ
13,52±0,94#
8,62±2,84
7,57 ±1,23
5,86±1,76
*р<0,05 по сравнению с оценкой аналогичных параметров у линии Balb/c
#р<0,05 по сравнению с данными для 10% FBS для аналогичной линии животных
В процессе репрограммирования альвеолярных макрофагов их секреторная
активность также оценивалась по продукции макрофагальных
цитокинов в
культуральной среде. Показано, что при снижении концентрации сыворотки в
культуральной среде до 0%
у макрофагов мышей обеих линий преобладает
продукция цитокинов Th1 профиля при снижении уровня антивоспалительных Th2
цитокинов, что характерно для макрофагов М1 фенотипа. Повышение концентрации
FBS в питательной среде до 40% приводило к достоверному увеличению продукции
антивоспалительных цитокинов при снижении уровня провоспалительных цитокинов,
что свойственно М2 макрофагам.
Установлено, что снижение концентрации сыворотки в питательной среде при
культивировании макрофагов до 0% и повышение ее до 40% достоверно изменяло
соотношение клеток округлой и расплющенной формы у обеих линий мышей.
При этом увеличение концентрации FBS до 40% в питательной среде при
культивировании макрофагов максимально увеличивало процентное содержание
клеток расплющенной формы и снижало количество круглых клеток у обеих линий
экспериментальных животных, что позволяет рассматривать концентрацию FBS 40%
как максимально эффективную для репрограммирования макрофагов в сторону М2
фенотипа. Снижение концентрации FBS до 0% являлось наиболее эффективной
концентраций для репрограммирования макрофагов в сторону М1, поскольку именно
на этой концентрации FBS были достигнуты максимальные показатели увеличения
содержания клеток округлой формы у обеих генетических линий животных (таблица
10).
Эффективность процедуры репрограммирования макрофагов оценивалась по
макрофагальному (морфологический) индексу, показано, что увеличение
концентрации FBS в питательной среде с 10% до 40% вызывало прогрессивное
достоверное увеличение величины макрофагального индекса в 4,7 раза у мышей
линии C57/BL6 и в 2,8 раза у мышей линии Balb/c (р<0,001) (таблица 10), а
снижение концентрации FBS в питательной среде до 0% достоверно снижало
25
показатели макрофагального индекса по сравнению с 10% FBS в 1,7 раза у мышей
линии C57/BL6 (р<0,05) и в 3,75 раза у мышей линии Balb/c (р<0,001) (таблица 10).
Таким образом, проведенный анализ параметров фенотипа альвеолярных макрофагов
продемонстрировал эффективность разработанного на основании изменения
концентрации сыворотки и, соответственно, SP-D, в культуральной среде
лабораторного
прототипа
клеточной
биотехнологии
направленного
репрограммирования альвеолярных макрофагов in vitro.
Таблица 10
Морфологическая характеристика макрофагов при репрограммировании клеток
различными концентрациями сыворотки FBS
Линия С57/BL6, n=80
Концентрация FBS в
Клетки округлой
Клетки
Макрофагальный
питательной среде, %
формы, %
расплющенной
(морфологический)
формы, %
индекс
‡
0
90,80±1,11
9,20±1,11
0,10±0,01
** ‡
5
91,60±1,36
8,40±1,36
0,09±0,02
**
10
81,43±2,41
13,57±2,41
0,17±0,03
‡
20
67,23±0,86
32,77±0,86
0,49±0,02
30
57,41±1,20
42,59±1,20
0,74±0,03
#
#
40
55,0±0,55
45,0±0,55
0,81±0,02
Линия Balb/c, n=80
0
89,2±1,02 ‡
10,8±1,02
0,12±0,03
5
79,0±0,68 ‡
21,0±0,68
0,27±0,02
10
69,58±3,14
31,42±3,14
0,45±0,03
**‡
20
57,6±3,65
42,4±3,65
0,74±0,03
30
49,4±1,72
50,6±1,72
1,02±0,02
#
#
40
43,8±1,15
56,2±1,15
1,28±0,01
**р<0,001 по сравнению с равнозначной концентрацией FBS у линии Balb/c
‡ р<0,001 по сравнению с концентрацией FBS 10% для одноименной линии животных
#р<0,001 по сравнению с концентрацией FBS 20% для одноименной линии животных
Оценка фенотипической активности альвеолярных макрофагов М1 и М2
фенотипов и роли SP-D при формировании воспалительного компонента в
бронхо-легочной системе у больных с заболеваниями легких и ГЭРБ
Для решения клинических задач по рациональной терапии больных, особенно
с учетом современных позиций развития клеточных технологий, несомненна
значимость оценки фенотипа и фенотипической пластичности АМ при хронических
заболеваниях с поражением бронхо-легочной системы. Способность АМ быстро
изменять свой фенотип играет значимую роль в формировании иммунного ответа.
Возможно, именно патологическое снижение пластичности АМ и утрата ими
способности адекватно изменять свой фенотип вносит определенный вклад в
развитие воспалительных заболеваний. Таким образом, оценка фенотипа макрофагов
и их пластичности может обладать диагностическим и прогностическим значением.
Привлечение новых направлений протеиномики в клиническую медицину и
определение роли важных белковых фракций в патогенезе заболеваний и их влиянии
26
на течение воспалительных реакций, и, прежде всего, SP-D как
фактора
микроокружения альвеолярных макрофагов при поражении бронхо-легочной
системы, несомненно,
обеспечит развитие
перспективных направлений в
патогенетических подходах терапии еще на ранних стадиях развития заболеваний с
воспалительными изменениями в бронхо-легочной системе.
Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных
макрофагов при ХОБЛ
Изучение фенотипа и оценка изменений фенотипической пластичности АМ у
больных ХОБЛ in vitro проводились по следующим критериям фенотипа:
содержанию на поверхности клеток макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа,
продукции цитокинов (оценка секреторной функции), морфологической
характеристике в условиях культуры клеток.
Анализ указанных критериев фенотипа выявил смещение баланса М1/М2
фенотипов АМ в сторону М1 с зависимостью от стадии заболевания. Полученные
данные свидетельствовали о нарушении процесса фенотипирования альвеолярных
макрофагов
и прогрессировании дисбаланса Th1/Th2 ответов с утяжелением
заболевания. Показано, что прогрессирование клинического течения заболевания и
нарастание обструктивных изменений (ОФВ1) у больных ХОБЛ по сравнению с
клинически здоровыми некурящими лицами сопровождается увеличением
содержания М1 маркеров CD25 (в 1,23 раза при I стадии ХОБЛ и в 1,62 раза при III
стадии) и CD80 (в 3,11 раза при I стадии и в 4,85 раза при III стадии), снижением
содержания М2 маркеров CD163 (в 1,21 раза при I стадии, в 1,45 раза при III стадии)
и CD206 (в 1,54 раза при I стадии, в 1,63 раза при III стадии). Прогрессирование
ХОБЛ и нарастание обструктивных изменений сопровождалось возрастанием в
культуре клеток количества АМ округлой формы (М1 фенотип) по сравнению с
клинически здоровыми лицами - на 6,4% при I стадии и на 5,17% при III стадии;
отмечен дисбаланс Th1/Th2 цитокинов с выраженным преобладанием продукции Th1
цитокинов (IL-12p70, IL-1β) и снижением – Th2 цитокинов (IL-4).
Полученные
данные
свидетельствуют
о
выраженном
изменении
функциональных свойств АМ при ХОБЛ по сравнению с клинически здоровыми
лицами, а также о зависимости нарушения функций АМ от стадии заболевания и
выраженности обструктивных изменений (ОФВ1). Наиболее значимые нарушения
функциональных свойств АМ отмечены на III стадии ХОБЛ.
Анализ фенотипической пластичности АМ и ее изменений у больных с
различными стадиями ХОБЛ проводился in vitro с помощью лабораторного
прототипа
клеточной
биотехнологии
направленного
репрограммирования
альвеолярных макрофагов, разработанного на экспериментальном этапе работы на
основе изменения концентрации стандартной сыворотки и SP-D в культуральной
среде по критериям, использованным для исходного определения фенотипа АМ при
ХОБЛ.
При снижении концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% в питательной среде
фенотип АМ направленно менялся в сторону М1, что подтверждено увеличением
содержания маркеров М1 фенотипа: CD25 в 1,30 раза при I стадии, в 1,15 раза при II
27
стадии, в 1,17 раза при III стадии (р<0,05), CD80 в 1,08 раза при I стадии, 1,32 раза
при II стадии, в 1,31 раза при III стадии; и снижением содержания маркеров М2
фенотипа: CD163 в 1,19 раз при I стадии, в 1,24 раза при II стадии, в 1,81 раза при III
стадии и CD206 в 1,69 раз при I стадии, 1,28 раз при II стадии, в 1,42 раза при III
стадии; увеличением содержания в культуре клеток АМ округлой формы в 1,05 раз
при I стадии, в 1,07 раз при II и III стадиях; преобладанием продукции Th1 цитокинов
при снижении Th2.
Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% в питательной среде
способствовало изменению фенотипа АМ больных ХОБЛ в сторону М2, о чем
свидетельствует увеличение содержания поверхностных маркеров М2 фенотипа:
CD163 в 1,24 раза при I стадии, в 1,46 раз при II стадии и в 1, 07 раза при III стадии и
CD206 в 1,22 раза, в 1,33 раза и в 1, 42 раза при I, II и III стадии, соответственно,
снижение содержания М1 маркеров: CD25 в 1,45, 1,22 и 1,28 раз при I, II и III стадии;
и CD80 в 1,77, 1,47 и 1,21 раза при I, II и III стадии, соответственно; снижение
содержания в культуре клеток АМ округлой формы в 1,15 раз при I стадии, в 1,14 раз
при II стадии и в 1,12 раз при III стадии ХОБЛ; снижение уровня цитокинов Th1
профиля при увеличении продукции Th2 цитокинов.
Фенотипическая пластичность (ФП) АМ при ХОБЛ по содержанию
поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и морфологической характеристике
оценивалась количественно и представлена как фенотипическая пластичность в
сторону М1 (ФП-М1) – при действии фактора репрограммирования макрофагов (0%
сыворотки), фенотипическая пластичность в сторону М2 (ФП-М2) - при действии
фактора репрограммирования макрофагов (40% сыворотки) и
суммарная
фенотипическая пластичность (ФПсум) (рисунок 7, 8).
Установлено, что АМ больных ХОБЛ обладают способностью к
фенотипической пластичности при применении лабораторного прототипа клеточной
биотехнологии направленного репрограммирования, при этом способность к
фенотипической пластичности зависит от стадии заболевания. Анализ показателей
фенотипической пластичности АМ при ХОБЛ показал, что наиболее низкой ФП
характеризуются АМ больных III стадией ХОБЛ, принимающих ИГКС.
Таким образом, коррекция дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ при ХОБЛ
наиболее целесообразна при I и II стадиях заболевания. Полученные результаты
могут явиться основой для персонализации патогенетического подхода терапии у
больных при I и II стадиях заболевания ХОБЛ для достижения необходимой
сбалансированности М1/М2 фенотипов АМ, что может быть использовано в
разработке новых стратегий патогенетической терапии при ХОБЛ.
28
Рисунок 7. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ
и здоровых лиц в условиях культуры клеток по содержанию поверхностно-клеточных
маркеров.
Рисунок 8. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ
(морфологическая характеристика клеток) и клинически здоровых лиц.
Роль сурфактантного белка D (SP-D) в формировании воспалительного
компонента при ХОБЛ
Проведен анализ уровня и олигомерного состава SP-D в БАЛЖ больных ХОБЛ,
а также уровня SP-D в сыворотке больных. Полученные данные сопоставлены с
результатами клинически здоровых лиц. Показано, снижение уровня SP-D в БАЛЖ по
мере прогрессирования ХОБЛ и нарастания обструктивных изменений в легких
(ОФВ1): с 390,86±69,49 нг/мл при I стадии ХОБЛ до 287,01±53,62 нг/мл при III
29
стадии ХОБЛ. У больных ХОБЛ уровень SP-D в БАЛЖ был существенно ниже, чем
у клинически здоровых некурящих лиц – в 1,4 раза при I стадии ХОБЛ и в 1,8 раза –
при III стадии (р<0,05). Тогда как в сыворотке крови уровень SP-D возрастал с
увеличением тяжести заболевания - в 1,4-2,6 раз при I-III стадии ХОБЛ, по сравнению
с клинически здоровыми некурящими лицами (р>0,05).
Для анализа роли и значения SP-D в патогенезе ХОБЛ
оценивался
олигомерный состав SP-D в БАЛЖ на различных стадиях заболевания. У клинически
здоровых лиц SP-D в БАЛЖ присутствовал в форме мономеров, тримеров и
додекамеров (таблица 11).
Таблица 11
Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ при ХОБЛ
и у клинически здоровых лиц
Показатели
Отсутствие терапии ИГКС
Стадия ХОБЛ
I
II
(n=12)
(n=15)
Терапия ИГКС
III
(n=14)
Отсутствие терапии ИГКС
Здоровые лица
Здоровые
Здоровые
курящие
некурящие
(n=9)
(n=10)
53,34±2,48
51,83±3,52
86,44±2,96
97,63±1,14
Возраст, лет
58,66±1,76
58,87±1,56
58,71±2,92
ОФВ1, %
90,75±1,93
58,37±2,70
38,62±2,51
SP-D в
БАЛЖ,
390,86±40,12* 336,74±17,67** 287,01±18,96** 394,00±27,67 533,20±21,12
нг/мл
SP-D в
сыворотке,
76,87±20,79
106,61±25,54** 144,52±18,46** 137,00±19,24
54,60±4,77
нг/мл
Мономеры
SP-D,
4,19±0,56
2,86±0,14*
3,26±0,26
4,79±0,31
4,37±0,66
опт.ед.
Тримеры
SP-D,
3,02±0,24
3,94±0,26
3,65±0,29
опт.ед.
Додекамеры SP-D,
2,36±0,18*
2,95±0,32
3,92±0,28
опт.ед.
*р<0,05 относительно здоровых некурящих; **р<0,001 относительно здоровых некурящих
В зависимости от стадии ХОБЛ олигомерный состав SP-D в БАЛЖ изменялся:
при I стадии отмечены все определяемые формы – мономеры, тримеры и
додекамеры; при II и III стадии – только мономерные формы белка (таблица 11).
Полученные данные показали, что при прогрессировании ХОБЛ и нарастании
обструктивных изменений (ОФВ1) существенно изменяется не только уровень, но и
олигомерный состав SP-D. Установленные изменения олигомерного состава
позволяют судить о значимой роли сурфактантного белка D в фенотипировании
альвеолярных макрофагов и тенденции к формированию М1 фенотипа АМ, что было
подтверждено при изучении фенотипа АМ при разных стадиях ХОБЛ.
30
Таким образом, анализ количественного и качественного состава SP-D не только
позволяют оценить роль данного белка в формировании
воспалительного
компонента в бронхо-легочной системе при ХОБЛ, но и может быть использован при
диагностике заболевания и его тяжести в качестве дополнительных критериев.
Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных
макрофагов при БА
Оценка фенотипа и анализ изменений фенотипической пластичности АМ у
больных БА in vitro проводились по критериям фенотипа: содержание на поверхности
клеток макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, продукции цитокинов (оценка
секреторной функции), морфологической характеристике в условиях культуры
клеток.
Анализ указанных критериев фенотипа и сравнение с клинически здоровыми
лицами выявили смещение М1/М2 фенотипов АМ при БА в сторону М2, наиболее
выраженное при интермиттирующей БА без применения ИГКС. Наличие дисбаланса
М1/М2 фенотипов и его выраженность подтверждены увеличением содержания М2
поверхностных маркеров по сравнению с клинически здоровыми лицами: CD163 в
2,18 раза при интермиттирующей БА без применения ИГКС и в 1,99 раз при
персистирующей БА(ИГКС+), а CD206 в 1,38 раза у больных БА(ИГКС-) и в 1,32 раза
у больных БА(ИГКС+), а так же снижением содержания М1 маркеров: CD25 в 1,37
раза у больных БА(ИГКС-) и в 1,19 раза у больных БА(ИГКС+), повышением CD80
в 1,07 раза в группе БА(ИГКС-) и снижением его в 1,13 раза у больных БА(ИГКС+).
Кроме того, по сравнению с клинически здоровыми лицами количество АМ
округлой формы снижалось в 1,05 раза при БА(ИГКС-) и в 1,21 раза – в группе
БА(ИГКС+). Изменения Th1 и Th2 цитокинового профиля по сравнению с
клинически здоровыми лицами в БАЛЖ при БА носили разнонаправленный характер,
но изменения уровня цитокинов определялись степенью тяжести заболевания.
Наиболее значимо по сравнению с клинически здоровыми был снижен уровень Th1
цитокина IL-12p70 в 2,4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 1,8 раза в группе БА (ИГКС+),
при этом уровень некоторых других Th1 цитокинов был повышен: IL-2 в 9 раз в
группе БА(ИГКС-) и в 5,5 раз в группе БА(ИГКС+), а TNF-α в 7 раз в группе
БА(ИГКС-) и в 4,2 раза в группе БА(ИГКС+). Выявлены также разнонаправленные
изменения уровня Th2 цитокинов при различной тяжести БА. По сравнению с
клинически здоровыми лицами установлено повышение уровня IL-4 – в 4 раза в
группе БА(ИГКС-) и в 2,5 раза в группе БА(ИГКС+), но при этом уровень IL-10
снижался – в 4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 2,14 раза в группе БА(ИГКС+).
Таким образом, выявлено наличие нарушений функциональной способности
АМ у больных БА, наиболее выраженное у лиц с интермиттирующей БА, не
принимавших ИГКС, что, вероятно, и объясняет дальнейшее прогрессирование
заболевания и зачастую отсутствие контроля над течением БА.
Анализ ФП АМ и ее изменений у больных с БА проводился in vitro с
помощью лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного
репрограммирования
альвеолярных
макрофагов,
разработанного
на
экспериментальном этапе работы на основе изменения концентрации стандартной
31
сыворотки и SP-D в культуральной среде по критериям, использованным для
исходного определения фенотипа АМ.
Снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% в питательной среде
способствовало направленному изменению фенотипа АМ в группе БА(ИГКС-) в
сторону М1, что подтверждено увеличением содержания маркеров CD25 и CD80 в
1,30 и 1,36 раз, соответственно, снижением содержания М1 маркеров CD25 и CD80 в
1,11 и 1,77 раз, соответственно; увеличением количества АМ округлой формы в
культуре клеток в 1,2 раза, а также возрастанием продукции цитокинов Th1 профиля.
У больных БА(ИГКС+) снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0%
изменяло фенотип АМ в сторону М2, что подтверждено снижением содержания М1
маркеров: CD25 и CD80 в 1,44 и 1,29 раз, соответственно, увеличением М2 маркеров
CD163 и CD206 в 1,32, 1,27 раз, соответственно; снижением количества АМ
округлой формы в культуре клеток в 1,17 раза; возрастанием продукции Th2
цитокинов.
При оценке макрофагальных маркеров на поверхности АМ у больных БА с
интермиттирующей формой без применения ИГКС увеличение концентрации
сыворотки FBS с 10% до 40% сопровождалось увеличением содержания маркеров М2
фенотипа: CD163 в 1,49 раз, CD206 в 1,40 раза, и снижением маркеров М1фенотипа:
CD25 в 1,11 и CD80 в 1,77. Кроме того, снижение количества АМ округлой формы в
культуре клеток в 1,15 раза и увеличение продукции цитокинов Th2 профиля также
подтверждают направленность процесса репрограммирования в сторону М2
фенотипа.
При персистирующей БА с применением ИГКС повышение концентрации
сыворотки FBS с 10% до 40% приводило к увеличению содержания М1 маркеров:
CD25 в 1,32 раза, CD80 в 1,48 раза, а также снижению содержания М2 маркеров:
CD163 в 1,37 раза и СD206 в 1,12 раза. Количество АМ округлой формы в культуре
клеток возрастало в 1,27 раза, увеличивалась продукция Th1 цитокинов. Полученные
данные подтверждают репрограммирование АМ при
персистирующей БА с
применением ИГКС в сторону М1 фенотипа.
Изменения фенотипической пластичности АМ при БА оценивались
количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров
фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки
(рисунок 9, 10).
В результате установлено, что независимо от проводимой терапии и тяжести
течения БА АМ обладают способностью к ФП. Показатели суммарной ФП АМ
больных интермиттирующей БА, не получавших ИГКС, были сопоставимы с
показателями клинически здоровых лиц, за исключением маркера СD80.
32
Рисунок 9. Фенотипическая пластичность по содержанию поверхностно-клеточных
маркеров альвеолярных макрофагов больных БА и клинически здоровых лиц в
условиях культуры клеток.
Рисунок 10. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных БА и
клинически здоровых лиц (морфологическая характеристика клеток).
При БА с применением ИГКС показатели ФП были инвертированы по
сравнению с группой БА(ИГКС-) и здоровыми лицами, что свидетельствует о
возможном влиянии ИГКС на ФП, однако при этом не выявлено значимого влияния
применения ИГКС на исходные характеристики фенотипа. Выявленные нарушения
функциональной способности АМ при БА, наиболее выраженные при
интермиттирующей БА без приема ИГКС, а также показатели ФП данной категории
лиц позволяют определить целесообразность персонализированного подхода к
патогенетической терапии у данной категории больных БА и применение у них
биотехнологии направленного репрограммирования АМ с целью направленной
коррекции баланса М1/М2 фенотипов АМ.
33
Роль сурфактантного белка D (SP-D) в формировании воспалительного
компонента в бронхо-легочной системе у больных БА
Проведен анализ уровня и олигомерного состава SP-D в БАЛЖ больных БА, а
также уровня SP-D в сыворотке больных. Полученные данные сопоставлены с
результатами клинически здоровых лиц. Показано, что уровень SP-D в БАЛЖ
превышает показатели клинически здоровых лиц, при этом более высокие значения
SP-D в БАЛЖ характерны для персистирующей БА с применением ИГКС (таблица
12). Содержание SP-D в системной циркуляции при БА любой степени тяжести и
независимо от применения ИГКС было существенно повышено по сравнению со
здоровыми лицами (таблица 12).
Выявлена зависимость изменения олигомерного состава SP-D в БАЛЖ при БА
от тяжести течения и проводимой терапии ИГКС (таблица 12).Установлено, что при
более тяжелом течении БА с применением ИГКС по сравнению со здоровыми лицами
значимо повышается уровень SP-D, при этом
его качественный состав
характеризуется изменением соотношения олигомерных форм белка относительно
здоровых. При более легком течении БА - интермиттирующем, без приема ИГКС,
уровень SP-D в БАЛЖ также увеличен по сравнению с клинически здоровыми
лицами, однако в БАЛЖ белок присутствует только в форме мономеров, что является
значимым фактором, влияющим на
взаимодействие SP-D с АМ на уровне
рецепторов, поскольку предполагает нарушение процесса фенотипирования
альвеолярных макрофагов и формирование более выраженного дисбаланса М1/М2
фенотипов АМ у данной категории больных.
Таблица 12
Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ больных БА и здоровых лиц
Показатели
Интермиттирующая
БА без ИГКС, n=15
Персистирующая
БА с ИГКС, n=15
Возраст, лет
46,56±4,18
48,24±3,89
Здоровые
некурящие,
n=10
51,83±3,52
ОФВ1, % от
должного
SP-D в БАЛЖ, нг/мл
88,47±2,90
70,27±5,23
97,63±1,14
671,1±52,05
748,32±69,25*
533,20±21,12
68,56±7,07*
71,21±6,97**
54,60±4,77
5,20+0,36
4,99+0,17
4,37±0,66
-
4,92+0, 27*
3,65±0,29
-
4,38+0,22
3,92±0,28
SP-D в сыворотке,
нг/мл
Мономеры SP-D,
опт.ед.
Тримеры SP-D,
опт.ед.
Додекамеры SP-D,
опт.ед.
*р<0,05 относительно здоровых некурящих, **р<0,001 относительно здоровых некурящих
34
Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных
макрофагов при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА
Изучение фенотипа и оценка изменений фенотипической пластичности АМ у
больных ГЭРБ и сочетанием ГЭРБ и БА in vitro проводилось по следующим
критериям фенотипа: содержание на поверхности клеток макрофагальных маркеров
М1 и М2 фенотипа, продукция цитокинов (оценка секреторной функции),
морфологическая характеристика в условиях культуры клеток.
Выявлено смещение баланса М1/М2 фенотипов АМ в сторону М1 фенотипа
при ГЭРБ. По сравнению с клинически здоровыми лицами на АМ при ГЭРБ
существенно возрастало содержание маркеров М1 фенотипа CD25 (в 1,08 раз) и
СD80 (в 3,25), снижалось содержание М2 маркера CD206 (в 1,21 раз); в БАЛЖ
больных ГЭРБ по сравнению со здоровыми был преимущественно увеличен уровень
Th1 цитокинов – наиболее значимо - IL-6 (в 28 раз) и IL-1β (в 14,4 раза). При этом
выраженных различий по количеству АМ округлой формы в культуре клеток у
больных ГЭРБ по сравнению со здоровыми не выявлено (79,00±3,61% vs
81,67±0,58%, соответственно), что может быть объяснено частичным «отмыванием»
фенотипа АМ при культивировании.
Дисбаланс М1/М2 фенотипов АМ выявлен также при сочетании ГЭРБ и БА: по
сравнению с клинически здоровыми лицами содержание АМ, имеющих маркеры М1
фенотипа, возрастало на 16%, маркеры М2 фенотипа – на 79%; в культуре клеток в
1,8 раза возрастал процент АМ расплющенной формы (М2 фенотип). При сочетании
ГЭРБ и БА по сравнению с клинически здоровыми уровень Th1 цитокинов в БАЛЖ
преимущественно снижался, за исключением IL-2 (был повышен в 1,71 раза) и IL-6
(повышен в 6,8 раз), а изменения Th2 цитокинов были разнонаправленными –
возрастал уровень IL-5 (в 3,42 раза), но снижался IL-4 (в 1,4 раза) и IL-10 (в 2,23 раза).
Сравнение основных критериев фенотипа АМ при сочетанной патологии с больными
ГЭРБ и больными БА показал, что присоединение ГЭРБ достоверно смещает фенотип
макрофагов у пациентов с БА в сторону М1 (содержание CD25 и CD80 на АМ
возрастает в 1,08 и 1,93 раза, соответственно). Эти данные позволяют предположить,
что более тяжёлое течение БА при её сочетании с ГЭРБ может быть обусловлено
именно сдвигом фенотипа макрофагов в сторону провоспалительного М1 фенотипа,
и, соответственно, усилением воспаления в бронхо-легочной системе.
Анализ ФП АМ и ее изменений у больных ГЭРБ и сочетанием ГЭРБ и БА
проводился по критериям фенотипа АМ in vitro с помощью разработанного
экспериментально лабораторного прототипа направленного репрограммирования
альвеолярных
макрофагов, на основе изменения концентрации стандартной
сыворотки и SP-D в культуральной среде.
На АМ больных ГЭРБ при снижении концентрации сыворотки FBS с 10% до
0% в питательной среде возрастало содержание маркеров М1 фенотипа (CD25 - в
1,19 раз, CD80 – в 1,46 раз), снижалось содержание маркеров М2 фенотипа (СD163
– в 1,63 раз, СD206 – в 1,32 раза); количество АМ округлой формы в культуре клеток
возрастало на 8,86%; увеличивалась продукция цитокинов Th1 профиля, что
характерно для приобретения клетками М1 фенотипа.
35
Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% в питательной среде
способствовало направленному репрограммированию АМ больных ГЭРБ в сторону
М2 фенотипа, что подтверждено увеличением содержания поверхностных
макрофагальных маркеров М2 фенотипа (CD163 в 1,77 раз, CD206 в 1,63 раза),
снижением - М1 фенотипа (CD25 в 1,29 раза, CD80 в 2,17 раза), преимущественным
возрастанием продукции цитокинов Th2 профиля и увеличением количества АМ
расплющенной формы в культуре клеток на 46,04%.
На АМ больных с сочетанием ГЭРБ и БА снижение концентрации сыворотки
FBS с 10% до 0% приводило к значимому возрастанию содержания М2 маркеров
(CD163 в 1,26 раза, CD206 в 1,23 раза), содержание М1 маркеров изменялось
разнонаправленно – содержание маркера СD25 было снижено в 1,08 раза, CD80 –
увеличено в 1,37 раза. Полученные данные характерны для приобретения АМ М2
фенотипа макрофагов. Также выявлено преимущественно увеличение продукции
цитокинов Th2 профиля, однако количество АМ расплющенной формы в культуре
клеток практически не изменялось (65,00+3,46% vs 65,66+2,72%).
Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% способствовало in
vitro увеличению содержания на АМ при сочетании ГЭРБ и БА маркеров М1
фенотипа (CD25 в 1,13 раз, CD80 в 1,19 раз), снижению – М2 фенотипа (CD163 в 1,3
раза, CD206 в 1,14 раза), увеличивалось количество АМ округлой формы в культуре
клеток (на 17,3%); возрастала продукция цитокинов Th1, т.е. АМ направленно
приобретали М1 фенотип.
Изменения ФП АМ при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА оценивались
количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров
фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки
(рисунок 11,12).
Рисунок 11. Фенотипическая пластичность по содержанию поверхностно-клеточных
маркеров АМ при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА в условиях культуры клеток.
36
Рисунок 12. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию клеток округлой
формы при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА.
В сравнении с клинически здоровыми лицами и больными ГЭРБ при
сочетанной патологии выявлена инверсия показателей ФП макрофагов, а также
наиболее низкие показатели суммарной ФП. Совокупность полученных данных
ограничивает
возможность
применения
технологии
направленного
репрограммирования АМ при сочетанной патологии ГЭРБ и БА. При анализе
поверхностных маркеров фенотипа установлено, что максимальной ФП в сторону М2
фенотипа обладали АМ при ГЭРБ, что, учитывая выраженность дисбаланса М1/М2
фенотипов при данной нозологии, позволяет использовать направленное
репрограммирование АМ при ГЭРБ как один из вариантов персонифицированного
подхода к патогенетической терапии для коррекции воспалительных изменений в
бронхо-легочной системе.
Роль сурфактантного белка D (SP-D) в формировании воспалительного
компонента в бронхо-легочной системе при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА
Выполнена оценка уровня и олигомерного состава сурфактантного белка D в
БАЛЖ и уровня SP-D в сыворотке больных ГЭРБ и сочетанной патологией ГЭРБ и
БА. Проведено сопоставление полученных данных с показателями клинически
здоровых лиц.
По сравнению со здоровыми лицами наиболее снижен уровень SP-D в БАЛЖ при
ГЭРБ (в 3,4 раза), при сочетанной патологии уровень SP-D в БАЛЖ был ниже в 1,3
раза. Кроме того, уровень SP-D в БАЛЖ при сочетанной патологии был в 2,7 раза
выше, чем при ГЭРБ, но в 1,8 раза ниже, чем при БА(ИГКС+). Полученные данные
позволяют предположить, что присоединение ГЭРБ к БА приводит к снижению
уровня SP-D в БАЛЖ. Значимых изменений уровня SP-D в системной циркуляции
при ГЭРБ и сочетанной патологии по сравнению с клинически здоровыми лицами не
выявлено (р>0,05) (таблица 13).
37
Таблица 13
Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ при ГЭРБ и сочетанной патологии
Показатели
Возраст, лет
SP-D в БАЛЖ,
нг/мл
SP-D в
сыворотке,
нг/мл
Мономеры SPD, опт.ед.
Тримеры SP-D,
опт.ед.
Додекамеры
SP-D, опт.ед.
ГЭРБ,
Персистирующая
БА с
применением
ИГКС, n=15
48,24±3,89
Здоровые
некурящие,
n=15
46,41±4,18
Сочетание ГЭРБ
и БА с
применением
ИГКС, n=16
49,30±3,64
155,83±18,13
414,72±50,22
748,32±69,25*
533,20±21,12
49,05±6,00
57,92±7,79
71,21±6,97**
54,60±4,77
5,93±0,12
5,41±0,06
4,99+0,17
4,37±0,66
-
-
4,92+0,27*
3,65±0,29
-
-
4,38+0,22
3,92±0,28
n=10
51,83±3,52
*р<0,05, ** р<0,001 относительно здоровых некурящих
Выявлены существенные нарушения олигомерного состава SP-D в БАЛЖ при
ГЭРБ и сочетанной патологии по сравнению со здоровыми лицами – в БАЛЖ при
данных нозологиях отсутствуют тримерные и додекамерные формы белка. Анализ
распределения олигомерных форм SP-D в БАЛЖ показал, что присоединение ГЭРБ к
БА приводит к исчезновению в БАЛЖ тримерных и додекамерных форм SP-D по
сравнению с БА (таблица 13). Выраженное изменение олигомерного состава SP-D и
его уровня при ГЭРБ и сочетанной патологии предопределяют изменения
взаимодействия белка с АМ на рецепторном уровне и провоспалительную
направленность его действия, что было подтверждено при исходном определении
фенотипов АМ и формировании дисбаланса М1/М2 фенотипов при ГЭРБ и
сочетанной патологии.
Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных
макрофагов при СОД
Фенотип и изменения ФП АМ больных СОД различного течения (впервые
выявленный и рецидивирущий СОД) in vitro оценивались по критериям фенотипа:
содержание на поверхности АМ макрофагальных маркеров, свойственных М1 или
М2
фенотипу,
секреторная
способность
АМ
(продукция
цитокинов),
морфологическая характеристика.
Установлено, что выраженность дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ по
сравнению с клинически здоровыми лицами определялась характером течения
заболевания и проводимой терапией. Впервые выявленный СОД, нелеченый ГКС,
38
характеризовался в 4 раза большим преобладанием альвеолярных макрофагов,
имеющих маркеры М1 фенотипа (СD80 18,84±3,61% vs 4,68±0,96%), а
рецидивирующий СОД с применением ГКС – в 3,5 раза (СD80 16,72±3,11% vs
4,68±0,96%) по сравнению с клинически здоровыми лицами. Содержание М2
маркеров СD163 и СD206 на АМ больных СОД по сравнению с клинически
здоровыми лицами также было изменено, однако значимым было изменение только
содержания CD206 и только в группе впервые выявленного СОД – снижение по
сравнению со здоровыми лицами составило 1,7 раза (р<0,05), при этом содержание
СD163 относительно группы контроля практически не изменялось (22,79±11,20% vs
23,12±3,87%). При рецидивирующем СОД содержание М2 маркеров по сравнению с
клинически здоровыми лицами существенно не изменялось (р>0,05). Анализ
морфологической характеристики АМ показал, что при впервые выявленном СОД
77,56±4,71% клеток имели округлую форму, при рецидивирующем СОД –
72,57±7,76%, что однако значимо не отличалось от клинически здоровых лиц
(81,67±0,58%). При этом независимо от течения заболевания в БАЛЖ больных
выявлен выраженный дисбаланс Th1/Th2 цитокинов. При СОД по сравнению с
клинически здоровыми лицами в БАЛЖ достоверно снижался уровень таких Th1
цитокинов, как INF-γ и IL-8, но в то же время возрастал уровень других Th1
цитокинов - IL-6 и TNF-α. Независимо от течения СОД в БАЛЖ больных был снижен
уровень Th2 цитокинов - IL-10, IL-4 и IL-5.
Анализ ФП АМ и ее изменений у больных СОД проводился по критериям
фенотипа АМ in vitro с помощью экспериментально разработанного лабораторного
прототипа биотехнологии направленного репрограммирования АМ, на основе
изменения концентрации стандартной сыворотки и SP-D в культуральной среде.
Показано, что при впервые выявленном СОД снижение концентрации
сыворотки FBS с 10% до 0% способствовало репрограммированию АМ в сторону М1
фенотипа, что подтверждает увеличение содержания М1 маркеров СD25 (в 1,47 раз) и
СD80 (в 1,52 раза) и снижение М2 маркеров CD163 (в 1,22 раза) и CD206 (в 1,36 раза);
увеличение продукции Th1 цитокинов АМ; достоверное увеличение в 1,15 раз
количества АМ округлой формы в культуре клеток.
Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% при впервые
выявленном СОД направленно репрограммировало АМ в сторону М2 фенотипа: на
АМ снижалось содержание М1 маркеров CD25 (в 1,14 раз), CD80 (в 1,96 раз),
возрастало - М2 маркеров СD163 (в 1,23 раза), CD206 (в 1,24 раза); увеличивалась
продукция АМ Th2 цитокинов и количество АМ расплющенной формы в культуре
клеток (в 1,73 раза).
При рецидивирующем СОД снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до
0% способствовало репрограммированию АМ в сторону М2 фенотипа, что
подтверждено снижением содержания М1 маркера CD80 (в 1,26 раз) и увеличением
содержания М2 маркера CD206 (в 1,14 раз), однако при этом достоверно не
изменялось содержание маркера CD25 (35,70±4,85% vs 35,81±4,50%) и снижалось
содержание CD163 (в 1,21 раз); снижалась продукция АМ Th1 цитокинов и
увеличивалось количество клеток расплющенной формы (в 1,58 раза).
39
Изменение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% при рецидивирующем
СОД
направленно репрограммировало АМ в сторону М1 фенотипа, о чем
свидетельствует увеличение содержания М1 маркеров СD25 (в 1,59 раз) и СD80 (в
1,27 раз) и снижение М2 маркера CD206 (в 1,4 раза), при этом содержание М2
маркера CD163, наоборот, возрастало (в 1,19 раз); продукция Th1 цитокинов
возрастала, при этом в культуре клеток на 7,3% увеличивалось количество АМ
округлой формы.
Изменения ФП АМ при СОД оценивались количественно по изменению
содержания поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и формы клеток при
действии различных концентраций сыворотки (рисунок 13, 14).
Установлено, что наибольшей ФП характеризуются АМ при впервые
выявленном СОД, нелеченом ГКС. Анализ полученных данных обосновывает
возможность применения
направленного репрограммирования АМ лишь при
впервые выявленном СОД, поскольку показатели суммарной ФП при
рецидивирующем течении СОД были существенно ниже и преимущественно
инвертированы по сравнению данными при впервые выявленном СОД. Таким
образом, проведение анализа фенотипа и показателей ФП
у АМ для
персонализированного подхода к патогенетической терапии целесообразно у больных
впервые выявленным СОД.
Рисунок 13. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию поверхностноклеточных маркеров при СОД в условиях культуры клеток.
40
Рисунок 14. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию клеток округлой
формы при СОД.
Роль SP-D в формировании воспалительного компонента в бронхолегочной системе при СОД
Изучен уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ, уровень SP-D в
сыворотке больных СОД. Выполнено сопоставление полученных данных с
показателями клинически здоровых лиц. Уровень SP-D в БАЛЖ
при
рецидивирующем СОД был на 17% повышен относительно клинически здоровых
лиц, при впервые выявленном - на 23% (таблица 14).
Таблица 14
Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ при СОД
Впервые
выявленный СОД
без применения
ГКС, n=15
44,72±3,89
660,45±46,71
Возраст, лет
Уровень SP-D в БАЛЖ,
нг/мл
Уровень SP-D в сыворотке,
83,72±9,55*
нг/мл
Мономеры SP-D в БАЛЖ,
5,40±0,31
опт.ед.
Тримеры SP-D в БАЛЖ,
опт.ед.
Додекамеры SP-D в БАЛЖ,
5,29±0,45*
опт.ед.
*р<0,05 относительно здоровых некурящих
Рецидивирующий
СОД с
применением
ГКС, n=15
45,10±3,06
628,00±58,82*
Здоровые
некурящие,
n=10
51,83±3,52
533,20±21,12
72,25±11,44*
54,60±4,77
5,06±0,21
4,37±0,66
4,31±0,18*
3,65±0,29
5,52±0,27*
3,92±0,28
41
В системной циркуляции уровень SP-D при СОД также превышал значения
здоровых лиц - на 32% при рецидивирующем СОД и на 53% - при впервые
выявленном СОД (таблица 14).
В зависимости от течения СОД различался олигомерный состав SP-D в БАЛЖ.
При впервые выявленном СОД в БАЛЖ отсутствовали тримеры SP-D, при
рецидивирующем течении
- присутствовали все олигомерные формы белка
(мономеры, тримеры и додекамеры), однако их соотношение отличалось от
показателей клинически здоровых лиц (таблица 14).
Изменение уровня SP-D в сочетании с измененным олигомерным составом
белка в БАЛЖ влияет на изменение взаимодействия SP-D с АМ на уровне
рецепторов, что отражено в нарушении процесса фенотипирования АМ при СОД и
формировании дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ. Увеличение уровня SP-D в БАЛЖ
и системной циркуляции при СОД может быть использовано в качестве
дополнительного диагностического маркера заболевания.
42
ВЫВОДЫ
1. Альвеолярные макрофаги М1 фенотипа по сравнению с альвеолярными
макрофагами М2 фенотипа in vitro характеризуются более выраженной
фагоцитарной
активностью
в
отношении
бактериальных
агентов
(Staphylococcus аureus), более высоким (в 2 раза) уровнем продукции нитритов
и повышенной продукцией цитокинов Th1 профиля (с достоверными
различиями по IL-2 и TNF-α, р<0,05), но более низкой (в 1,25 раза)
выраженностью клеточного стресс ответа, подтвержденной различием в
продукции белков теплового шока HSP32 и HSP70. Миграционная активность
альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов зависит от используемого
хемоаттрактанта: способность к миграции макрофагов на «собственный»
хемоаттрактант - БАЛЖ существенно выше, чем на «чужеродный»;
миграционная активность М2 фенотипа существенно выше по сравнению с М1
фенотипом.
2. SP-D как фактор микроокружения альвеолярных макрофагов является
эндогенным фактором репрограммирования. SP-D влияет на формирование
фенотипа, а именно на функциональную активность и морфологическую
характеристику альвеолярных макрофагов в процессе их репрограммирования.
Повышение уровня SP-D с возрастанием количества мультимерных форм
способствует направленному репрограммированию альвеолярных макрофагов
в сторону М2 фенотипа, а снижение уровня SP-D с уменьшением количества
мультимеров – в сторону М1 фенотипа.
3. Увеличение концентрации сыворотки в культуральной среде до 40%
способствует изменению исходного фенотипа макрофагов в сторону М2,
снижение концентрации сыворотки до 0% - в сторону М1 фенотипа.
Разработанный лабораторный прототип клеточной биотехнологии с
использованием различных концентраций сыворотки, содержащей SP-D,
направленно репрограммирует альвеолярные макрофаги.
4. 4. У больных ХОБЛ соотношение М1/М2 альвеолярных макрофагов смещено
в сторону М1 фенотипа по сравнению с клинически здоровыми лицами.
Выраженность дисбаланса сопряжена с утяжелением клинического статуса
больных ХОБЛ. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов
больных ХОБЛ снижается с увеличением тяжести ХОБЛ.
5. Локальный (в БАЛЖ) и системный (в сыворотке крови) уровни SP-D, а также
олигомерный состав данного белка у больных ХОБЛ существенно отличаются
от здоровых лиц. Прогрессирование ХОБЛ сопровождается снижением SP-D в
БАЛЖ относительно уровня клинически здоровых лиц в 1,4-1,8 раз и
повышением уровня SP-D сыворотке в 1,4-2,6 раз. Олигомерный состав SP-D в
БАЛЖ на I стадии ХОБЛ характеризуется снижением количества додекамеров
по сравнению с клинически здоровыми лицами и наличием лишь мономерных
форм при II и III стадии.
6. У больных БА М1/М2 баланс альвеолярных макрофагов смещен в сторону М2
фенотипа по сравнению с клинически здоровыми лицами. Более выраженный
43
дисбаланс М1/М2 фенотипов выявлен при легком течении БА, у пациентов, не
применяющих ИГКС. Показатели суммарной фенотипической пластичности,
определяемой по поверхностным маркерам и морфологической характеристике
альвеолярных макрофагов, у пациентов с БА, не получавших ИГКС, были
сопоставимы с показателями клинически здоровых лиц.
7. Уровень SP-D системный (в сыворотке крови) и локальный (в БАЛЖ) при БА
повышен по сравнению с клинически здоровыми лицами в 1,3 и 1,2-1,4 раза,
соответственно. Утяжеление течения БА с применением ИГКС повышает
уровень SP-D в БАЛЖ на 15%. Олигомерный состав SP-D у больных БА
изменяется при утяжелении БА и изменении проводимой терапии: у больных
интермитирующей БА, не получающих ИГКС, преобладают мономерные
формы, а на фоне приема ИГКС у больных персистирующей БА олигомерный
состав SP-D аналогичен здоровым.
8. У больных ГЭРБ М1/М2 баланс альвеолярных макрофагов смещен в сторону
М1 по сравнению со здоровыми лицами. При сочетании ГЭРБ и БА М1/М2
дисбаланс фенотипов альвеолярных макрофагов характеризуется увеличением
количества клеток с маркерами М1 фенотипа на 16%, а с маркерами М2
фенотипа – на 79% по сравнению с клинически здоровыми лицами. При
сочетании ГЭРБ и БА суммарная фенотипическая пластичность альвеолярных
макрофагов снижена по сравнению с клинически здоровыми лицами и
больными с БА и с ГЭРБ.
9. Как у больных ГЭРБ, так и при сочетании ГЭРБ и БА уровень SP-D в БАЛЖ
снижен по сравнению с клинически здоровыми лицами в 3,4 раза и 1,3 раза,
соответственно. В сыворотке крови у обеих категорий пациентов уровень SP-D
значимо не изменен. Олигомерный состав SP-D при обеих клинических
ситуациях характеризуется наличием лишь мономерных форм белка в отличие
от клинически здоровых лиц, у которых в БАЛЖ присутствовали все
олигомерные формы SP-D.
10. У больных с СОД выраженность М1/М2 дисбаланса альвеолярных макрофагов
по сравнению с клинически здоровыми лицами определялась характером
течения заболевания и проводимой терапией. Впервые выявленный СОД, не
леченный ГКС, характеризовался четырехкратным преобладанием клеток с
маркером М1 фенотипа (СD80), а рецидивирующий СОД с применением ГКС
– его увеличением в 3,5 раза по сравнению с клинически здоровыми лицами.
Альвеолярные макрофаги у больных с впервые выявленным СОД обладают
большей суммарной фенотипической пластичностью по сравнению с клетками,
выделенными от пациентов с рецидивирующим течением заболевания, но
более низкой – по сравнению с клинически здоровыми лицами.
11. У больных СОД уровень SP-D в БАЛЖ повышен по сравнению с клинически
здоровыми лицами на 23% при впервые выявленном заболевании и на 18% при
рецидивирующем СОД, леченном ГКС. В сыворотке крови по сравнению со
здоровыми лицами содержание SP-D возрастало при впервые выявленном СОД
в 1,3 раза, при рецидивирующем СОД – в 1,5 раза. В олигомерном составе SPD в БАЛЖ при впервые выявленном СОД преобладали мономерные формы
44
белка, тогда как при рецидивирующем СОД с применением ГКС в БАЛЖ
наряду с мономерами присутствовали тримеры и додекамеры с изменением
соотношения олигомерных форм по сравнению с клинически здоровыми
лицами.
12. Выявленные локальные и системные изменения уровня SP-D, а также его
олигомерного состава в БАЛЖ при патологии, сопряженной с воспалительным
поражением бронхо-легочной системы (подтвержденным данными ФБС и
цитокиновым
профилем),
являются
дополнительными
маркерами
дифференциальной диагностики заболеваний и оценки тяжести их течения.
Изменения содержания и олигомерного состава SP-D в БАЛЖ влияют на
процесс
фенотипирования
альвеолярных
макрофагов,
участвуя
в
формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при
заболеваниях легких и ГЭРБ.
45
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Вассерман Е. Н., Абрамова Е. В., Круглов С. В., Лямина С. В.,
Шимшелашвили Ш. Л., Малышев Ю. И., Беарс М. Ф., Гоу А. Д., Малышев И.
Ю. Отсутствие гена SP-D приводит к усилению ЛПС-индуцированного
синтеза HSP70 в М2, но не в М1 фенотипе перитонеальных макрофагов:
возможная роль интерлейкина – 10 // Фундаментальные исследования. – 2010. №6. - С. 19-27
2. Вассерман Е.Н., Лямина С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Абрамова Е.В., Назаров
В.А., Круглов С.В., Малышева Е.В., Беарс М.Ф., Гоу А.Д., Малышев И.Ю. SPD контролирует баланс Th1 и Th цитокинов и обладает признаками
эндогенного фактора репрограммирования макрофагов // Фундаментальные
исследования. – 2010. - №6. - С. 28-36
3. Лямина С.В., Круглов С.В., Веденикин Т.Ю., Малышев И.Ю. Новая стратегия
управления иммунным ответом при заболеваниях легких ‒ роль
сурфактантного белка D как бивалентного фактора репрограммирования
макрофагов // Фундаментальные исследования. – 2011. - №1. - С. 90-98
4. Малышев И.Ю., Лямина С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Вассерман Е.Н.
Функциональные ответа альвеолярных макрофагов, сурфактантный белок D и
заболевания легких // Пульмонология. – 2011. - №3. – С.101-107
5. Лямина С.В., Маев И.В., Юренев Г.Л., Малышев И.Ю. Бронхиальная астма и
гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь: взгляд клинициста и патофизиолога
// Терапевтический архив. – 2011. - №6. – С. 73-78
6. Лямина С.В., Круглов С.В., Веденикин Т.Ю. Бородовицына О.А., Суворова
И.А.,
Шимшелашвили
Ш.Л.,
Малышев
И.Ю.
Альтернативное
репрограммирование М1/М2 фенотипа перитонеальных макрофагов мышей in
vitro с помощью интерферона гамма и интерлейкина 4 // Клеточные технологии
в биологии и медицине. – 2011. - №4. – С.235-239
7. Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Малышев И.Ю. Современный подход к
анализу иммунного ответа при заболеваниях легких: сурфактантный белок D и
его роль // Современные проблемы науки и образования. – 2011. - №4.http://www.science-education.ru/98-4717
8. Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Круглов С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Буданова
О.П., Малышев И.Ю. Особенности фагоцитарной и миграционной активности
альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов // Фундаментальные
исследования. – 2011. - №11(3). -С. 536-539
9. Лямина С.В., Круглов С.В., Калиш С.В., Малышев И.Ю. Репрограммирование
альвеолярных макрофагов – новая возможность управления иммунным ответом
// Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. –
2011. - №4. – С. 42-46
10. Лямина С.В. Новая стратегия управления иммунным ответом при
заболеваниях легких // Терапевт. – 2011. - №2. - С. 47-48
46
11. Лямина С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Малышев И.Ю. Сурфактантный белок D
– эндогенный регулятор воспаления и иммунной защиты // Патологическая
физиология и экспериментальная терапия. – 2012. - №1. – С. 60-66
12. Лямина С.В., Малышев И.Ю. Сурфактантный белок D в норме и при
заболеваниях легких // Российский медицинский журнал. – 2012. - №1. – С. 5055
13. Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Бородовицына О.А., Суворова И.А.,
Шимшелашвили Ш.Л., Малышев И.Ю., Круглов С.В. Репрограммирование
механизмов синтеза оксида азота у М1 и М2 фенотипов перитонеальных
макрофагов мышей in vitro в присутствии разных концентраций сыворотки //
Медицинская иммунология. – 2012. - №1-2. - Том 14. – С. 127-132
14. Малышев И.Ю., Круглов С.В., Лямина С.В. Гипоксия, воспаление и
фенотипическая пластичность макрофагов: центральная роль HIF-1 и NF-kB //
Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2012. - №3. – С.
42-50
15. Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Бородовицына О.А., Круглов С.В., Малышев
И.Ю. Показатели функциональной активности макрофагов фенотипов М1 и
М2 – необходимые компоненты оценки врожденного иммунного ответа //
Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2012. - №8 – С.
1030-1035
16. Karoli N., Rebrov A., Lyamina N., Senchikhin V., Lyamina S. Changes in nitric
oxide production in patients with COPD / // Europ. Resp. J. – 2006. - Vol. 28. P.190s
17. Atochina-Vasserman E.N., Abramova H., Lyamina S.V., Monastyrskaya E.A.,
Nazarov V.A., Kruglov S.V., Beers M.F., Gow A.J., Malyshev I.Y.. Regulation Of
NO Metabolism And Cytokines Production In Lipopolysaccharide (LPS)-Stimulated
Peritoneal Macrophages // Am. J. Respir. Crit. Care Med..- 2010. –Vol. 181. - A2453
18. Лямина С.В., Вассерман Е.Н., Круглов С.В., Малышев И.Ю. Роль
модулирующего цитокина, SP-D и стресс-белков в регуляции воспалительной
реакции // Материалы V Национального конгресса терапевтов. Москва, 2010. –
C. 157
19. Lyamina S.V., Monastyrskaya E.A., Borodovitsina O.A., Belousova D.A.,
Manukhina E.B., Malyshev I.Y. Alveolar Macrophages Phenotype: Adaptive
Programming and Disorders in Pulmonary Diseases. Adaptation Biology and
Medicine (Volume 6: Cell Adaptations and Challenges) // Editors: P. Wang, C.-H.
Kuo, N. Takeda and P.K. Singal; 2011. - Narosa Publishing House Pvt. Ltd., New
Delhi, India, pp. 209-225
20. Лямина С.В., Сметнева Н.С., Попкова А.М., Малышев И.Ю. SP-D –
дополнительный специфический маркер тяжести заболевания при хронической
обструктивной болезни легких // Материалы VI Национального конгресса
терапевтов. Москва 2011. – C. 131
21. Лямина С.В. Регуляция пластичности иммунного ответа – путь к успеху в
лечении заболеваний легких // Материалы VI Национального конгресса
терапевтов. Москва 2011. – C. 267
47
22. Лямина С.В.. Калиш С.В., Игонина Н.П., Попкова А.М., Малышев И.Ю.
Особенности фенотепирования альвеолярных макрофагов при бронхиальной
астме, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и их сочетании // Материалы
VII Национального конгресса терапевтов. Москва 2012. – C. 121-122
23. Lyamina S.V., Vedenikin T.Yu., Malyshev I.Yu. Long-term exposure to tobacco
smoke on alveolar macrophages phenotype with regard to genetic and age
predisposition // Eur Respir J. – 2012. –Vol. 40. - Suppl. 56. - P3743
24. Lyamina S.V., Kalish S.V., Malyshev I.Yu. Regulation of immune response
plasticity - a path to success in pulmonary diseases management // Eur Respir J. –
2012. –Vol. 40. - Suppl. 56. - P810
25. Lyamina S.V., Kalish S.V., Malyshev I.Yu.. Change of phenotype and phenotypic
plasticity of alveolar macrophages in COPD // Eur Respir J 2012. – Vol. 40. - Suppl.
56. - P811
26. Smetneva N.S., Popkova A.M., Lyamina S.V., Seregin A.A., Malyshev I.Yu..
Association between endothelium-dependent vasodilatation and serum pulmonary
surfactant protein D concentration in patients with chronic obstructive pulmonary
disease // Artery Research. – 2012 - Vol. 6(4). – P. 200.
48
Lyamina Svetlana Vladimirovna
Formation of bronchopulmonary inflammatory component in pulmonary diseases and
gastroesophageal reflux disease: the role of surfactant protein D
and macrophages reprogramming
Abstract
Inflammatory reactions play a crucial role in the development of pulmonary
diseases. Macrophages and their microenvironment take direct part in inflammatory
reactions. The aim of the study was to assess the phenotype and changes of phenotypic
flexibility of alveolar macrophages, to analize the role of surfactant protein D (SP-D) in the
formation of inflammatory component in bronchopulmonary system in lung diseases and
gastroesophageal reflux disease, and to use the resulting data for the development of the
prototype of cell biotechnology for alveolar macrophages reprogramming.
In consequence of the study, specificity of functional responses of M1 and M2
alveolar macrophages phenotypes was educed. These phenotypes specifically differ on
secretory capacity, morphological characteristics, ability for phagocytosis and migration,
differ on their cellular stress-response. M2 macrophages are characterized by major basal
production of HSP32 and HSP70 proteins in comparison with M1 phenotype. Ascertained,
that surfactant protein D is an endogenous bivalent reprogramming factor for macrophages.
Monomeric forms of SP-D assemble M1 macrophages phenotype, oligomeric forms
(dodecamers) – M2 phenotype. Laboratory prototype of the new cell biotechnology for
alveolar macrophages reprogramming was developed. This prototype allows to use the core
role of endogenous reprogramming factors for the purpose of direct macrophages
reprogramming and formation of essential “therapeutic” potential of the immune response
in the diseases with bronchopulmonary inflammation.
It was shown that changes of macrophages phenotype and phenotypic flexibility are
the pathogenetic component in inflammatory formation in such diseases as chronic
obstructive pulmonary disease, pulmonary sarcoidosis, bronchial asthma, gastroesophageal
reflux disease and the combination of asthma and gastroesophageal reflux disease. The
change of surfactant protein D oligomeric structure is the pathogenetic factor for disorders
of macrophages phenotype and phenotypic flexibility in chronic obstructive pulmonary
disease, pulmonary sarcoidosis, bronchial asthma, gastroesophageal reflux disease and the
combination of asthma and gastroesophageal reflux disease.
The identified changes of oligomeic structure of surfactant protein D in bronchoalveolar lavage fluid in terms of the disease severity and administered therapy can be used
as diagnostic criteria and criteria for the response rate in patients with bronchopulmonary
inflammation.
49