На правах рукописи - Института клинической и
реклама
На правах рукописи ЗАЙЦЕВА Наталья Сергеевна МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ГИПЕРОСМОТИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ ПРЕПАРАТА «РАПАН» НА ПРОЦЕССЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ КЕРАТИНОЦИТОВ IN VITRO 14.03.03 – патологическая физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск, 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН), Новосибирск Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, академик РАН, доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. ультраструктурных исследований ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН доктор биологических наук, зав. лаб. молекулярной биологии клетки ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН. Шкурупий Вячеслав Алексеевич Бгатова Наталия Петровна Усынин Иван Федорович Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (Томск). Защита состоится «27» мая 2014 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д.001.048.01 при ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, д. 2., г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН и на сайте http://centercem.ru Автореферат разослан « » 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н. Пальчикова Наталья Александровна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Кожа образует внешний покров организма, обеспечивая защиту от негативного влияния окружающей среды - дегидратации, механического повреждения, попадания инфекционных агентов, т.е. является одним из важнейших факторов поддержания гомеостаза. Кожа состоит из эпидермиса, дермы и гиподермы, образующих единую морфофункциональную систему. Фибробласты дермы и антигенпрезентирующие клетки эпидермиса – клетки Лангерганса участвуют в процессе пролиферации и дифференцирования кератиноцитов, посредством цитокинов, в первую очередь - факторов роста, а кератиноциты, в свою очередь, способны изменять пролиферативную активность клеток соединительной ткани дермы [Maas-Szabowski N. et al., 1999; Lim C.P. et al., 2009]. В результате обеспечивается сбалансированность структуры и функций эпидермиса и дермы при физиологической и репаративной регенерации. В норме, сбалансированные процессы пролиферации и последующего дифференцирования кератиноцитов, направленны от базального к роговому слою, что обеспечивает формирование эпидермального барьера, главная функция которого состоит в защите внутренней среды организма от нежелательных влияний факторов внешней среды. Ряд распространенных хронических заболеваний кожи, таких как псориаз, атопический дерматит, проявляется формированием стойких очагов патологических высыпаний (локальных воспалительных проявлений) и приводит к нарушению эпидермального барьера, что связано с чрезмерной активацией пролиферации кератиноцитов, наряду с угнетением их дифференцирования в результате хронического воспаления в дерме [Tschachler E., 2007; Bieber T., Novak N., 2009]. Лечение хронических заболеваний кожи высокоминерализованными природными водами (бальнеотерапия) приводит к уменьшению проявление воспаления, улучшению гидратации рогового слоя и снижению шероховатости эпидермиса [Harari M. et al., 2000; Proksch E. et al., 2005]. В клинике ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН показана высокая эффективность высокоминерализованных растворов, применяемых при лечении больных атопическим дерматитом. Применение препарата «Рапан», полученного из рапы озера Малое Островное Краснозерского района, Новосибирской области, приводит к снижению интенсивности острых проявлений заболевания и его пролиферативной фазы - акантозов, наряду, с активацией дифференцировочных процессов, что приводит к нормализации барьерной функции эпидермиса [Лузгина Н.Г. и др., 2006; Новиков А.И. и др., 2006]. Однако эти исследования носят описательный характер и не затрагивают механизмов, детерминирующих получаемые эффекты. Есть основания полагать, что терапевтические эффекты высокоминерализованных растворов реализуются в результате развития гиперосмотического стресса кератиноцитов. Однако этому явлению посвящены лишь отдельные исследования. Известно, что гиперосмотическое воздействие вызывает резкое повышение концентрации внутриклеточных ионов Ca2+, что сопряжено с торможением пролиферации кератиноцитов [Dascalu A. et al., 2000]. Кроме того, гиперосмотическое воздействие может вызывать дегидратацию клетки, что моделирует про3 цесс обезвоживания эпидермиса на воздухе, и может являться одним из механизмов, запускающих процессы дифференцирования кератиноцитов. В работах in vitro показано, что при обезвоживании клеток под воздействием сорбитола, усиливается экспрессия ряда кератинов (К1, К10), и других маркеров дифференцирования кератиноцитов, таких как трансглутаминаза-1, инволюкрин и филаггрин [Mammone T. et al., 2007], что свидетельствует о стимулирующем влиянии гиперосмотического воздействия на процессы дифференцирования кератиноцитов. Кроме того, показано, что дифференцирование кератиноцитов может быть связано с активацией процессов генерации активных форм кислорода (АФК) [Chamulitrat W. et al., 2004]. Экзогенное воздействие стрессора может нарушать физиологический окислительно-восстановительный баланс клеток, и запускать активацию редокс-чувствительных сигнальных систем, в частности, фактора транскрипции Nrf2, обладающего не только гомеостатической, но и дифференцировочной функцией. Так, установлено, что Nrf2, действуя в синергизме с фактором Notch1 [Wakabayashi N. et al., 2010а; Wakabayashi N.et al., 2010b], индуцирует дифференцирование в клетках [Lin H.Y. et al., 2011]. Однако прямая связь редокс-чувствительных сигнальных систем в инициации и реализации гиперосмотического стресса не описана в литературе. Другой потенциальной мишенью гиперосмолярных воздействий на клетку являются белки цитоскелета, которые должны подвергаться структурной реорганизации во время гипертонического «сжатия», и приводить к изменению клеточного сигналинга с активацией адаптивного ответа клетки. Таким образом, реализация позитивных эффектов гиперосмотических растворов может осуществляться различными механизмами, обеспечивающими адаптацию клетки к обезвоживанию и гиперосмотическому стрессированию. Поскольку в естественных условиях утрата воды клетками может колебаться в различных пределах, представляет интерес выяснение механизмов клеточного ответа как в процессах гомеостазирования в норме, так и при патологических состояниях. Понимание этих механизмов, наряду с получением новых фундаментальных данных, в дальнейшем позволит разрабатывать методы направленной модуляции структурно-функционального состояния эпидермального барьера человека. Цель и задачи исследования Целью работы было исследование механизмов гиперосмотического воздействия препарата «Рапан» на кератиноциты и их роль в модуляции процессов пролиферации и дифференцирования в условиях in vitro. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать влияние гиперосмотического воздействия растворов препарата «Рапан» различных концентраций на жизнеспособность кератиноцитов линии HaCaT и их пролиферативную активность. 2. Исследовать индукцию дифференцирования кератиноцитов, различных вариантов клеточной гибели и процессов аутофагии в ответ на гиперосмотическое воздействие. 4 3. Исследовать продукцию активных форм кислорода и изменение трансмембранного митохондриального потенциала в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии. 4. Исследовать активацию редокс-чувствительной сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии. 5. Исследовать влияние гиперосмотического воздействия на реорганизацию цитоскелета кератиноцитов. 6 Исследовать in vitro продукцию цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-10 и активность транскрипционного фактора NF-κB в кератиноцитах в ответ на гиперосмотическое воздействие. Научная новизна работы Впервые установлено, что элиминация кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» осуществляется процессом аутофагии, но не апоптозом. Получены данные о торможении клеточного цикла кератиноцитов в стадии G1/G0 после гиперосмотического воздействия растворами препарата «Рапан», в отличие от классического торможения клеточного цикла в стадиях G2/M в условиях гиперосмотического воздействия. Установлено, что воздействие гиперосмотических растворов препарата «Рапан» на кератиноциты приводит к быстрому усилению продукции АФК и падению трансмембранного митохондриального потенциала, что впервые указывает на прямую связь гиперосмотического и окислительного стресса в кератиноцитах и приводит к активации редокс-чувствительной системы Nrf2/Keap1/ARE в ответ на гиперосмотическое воздействие. Впервые показано, что гиперосмотическое воздействие сопряжено с ингибированием транскрипционного фактора NF-κB. Кроме того, воздействие гиперосмотическими растворами влияет на продукцию ИЛ-6 в кератиноцитах, в зависимости от сроков воздействия на клетки, не оказывая при этом влияния на продукцию ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-10. Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты могут быть полезны в практике научных исследований, касающихся понимания механизмов влияния гиперосмотических растворов на основные функции жизненного цикла клеток, в частности кератиноцитов: пролиферации (регенерации), дифференцирования и видов клеточной гибели некрозом, апоптозом и возможно, через механизмы аутофагии. Данные, полученные в проведенных экспериментах могут быть полезны при преподавании патологической физиологии, по разделам физиология кожи, процессы пролиферации и воспаления, патофизиологии стресса (окислительный стресс, как составляющий элемент ответной реакции организма на стрессирующее воздействие), а также для преподавания в области клеточной биологии в разделе: влияние осмотических воздействий на процессы пролиферации и дифференцирования. Результаты, полученные в диссертационном исследовании уточняют механизмы позитивных эффектов гиперосмотических растворов, в частности препа5 рата «Рапан» на процессы воспаления в коже, что в значительной степени позволяет отойти от эмпирических подходов в лечении целого ряда заболеваний кожи, характеризующих хроническое воспаление с выраженным отечным и гиперрегенераторными компонентами в период их обострений. Положения, выносимые на защиту 1. Гиперосмотические растворы, в зависимости от их концентраций, продолжительности воздействия, а также физиологического состояния кератиноцитов на момент воздействия (стадия клеточного цикла), способны модулировать основные биологические процессы: пролиферацию, дифференцирование и клеточную гибель, через механизмы гомеостазирования, включающие процессы окислительного стресса и сигнальные функции АФК, а также активацию редоксчувствительной системы Nrf2/Keap1/ARE. 2. Гиперосмотические растворы способны модулировать состояние цитоскелета кератиноцитов (актина и тубулина) через активацию малой ГТФазы Rac1,что сопряжено с изменением активности транскрипционного фактора NFκB, не изменяя продукции цитокинов ИЛ-1β и ФНО-α, ИЛ-10, однако, индуцируя изменение продукции ИЛ-6, в зависимости от времени экспозиции гиперосмотического воздействия. Апробация работы Результаты работы представлены и обсуждены на Пятой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно – приспособительных процессов» 12-14 апреля 2011г. Новосибирск; на Шестой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» 16-17 апреля 2013г. Новосибирск Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения; выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 272 источника (15 отечественный и 257 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и иллюстрированы 28 рисунками. Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 8788), с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы» МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клеточная культура.В работе использовали перевиваемые кератиноциты линии HaCaT [Boukmap P. et al., 1988], любезно предоставленные П.П. Лактионовым, ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск. Клетки растили в питательной среде F12/DMEM (Invitrogene, США) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки 6 крупного рогатого скота FBS (HyClon, США), 1мМ L-глютамин, 50ед/мл пенициллин, 50ед/мл стрептомицин-пеннициллина в стандартных условиях: в инкубаторе при 5% СО2 атмосфере, температуре 37⁰С и 95% влажности. Приготовление гиперосмотических растворов. Гиперосмотические растворы (ГР) готовили с использованием препарата «Рапан», полученного из рапы озера Малое Островное, Краснозерского района (производство ЗАО «СИБТЕХВАС», Новосибирск). Сухую навеску препарата «Рапан» разводили в полной культуральной ростовой среде для кератиноцитов. Использовали три концентрации препарата «Рапан»: 2, 4, 8 г на 1 литр полной ростовой среды. Исследование жизнеспособности кератиноцитов. Для определения количества жизнеспособных клеток использовали МТТ-тест [Twentyman P.R., Luscombe M., 1987]. По прошествии срока инкубации клеток с ГР добавляли МТТ (3-(4,5диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолий, Sigma-Aldrich, США) в концентрации 0,15 мг/мл. Через 3 ч среду удаляли. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида, результат оценивали колориметрически, измеряя оптическую плотность растворов при длине волны 540 нм, используя планшетный спектрофотометр BioTek ELx808 (Biotek, США). Определение состояния апотоза и некроза в клетках. Индукцию апоптоза и некроза смотрели через сутки гиперосмотического воздействия (24ч), а также спустя еще сутки, после устранения гиперосмотического воздействия (48ч). Для определения типа клеточной гибели исследовали уровень трансмембранного митохондриального потенциала, который определяли с помощью флуоресцентного красителя 3,3'-дигексилоксакарбоцианина йодида, DiOC6 (Invitrogen, США) и целостности клеточной мембраны с помощью интеркалирующего красителя иодида пропидия PI (Sigma, США) [Gorczyca W., 1999]. Измерение интенсивности флуоресценции проводили на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson, США), λEm = 520 нм для DiOC6 и λEm = 670 нм для PI, с использованием программного обеспечения СellQuest (BD,США). Клетки с высоким значением интенсивности флуоресценции DiOC6 и неповрежденной клеточной мембраной принимали за жизнеспособные, клетки cо сниженным митохондриальным потенциалом (с низкой интенсивностью флуоресценции DiOC6) и непроницаемые для PI – за находящиеся на ранних стадиях апоптоза, клетки с нарушенной целостностью мембраны (проницаемые для PI) – за некротические клетки. Исследование пролиферативной активности клеток и распределения по стадиям клеточного цикла. Для определения пролиферативной активности клеточную суспензию инкубировали в течение 10 мин с 20 мкМ раствором CFSE (Sigma-Aldrich, США) После инактивации избытка CFSE раствором PBS, клетки ресуспендировали, рассаживали в лунки 6-луночного планшета и растили с добавлением гиперосмотических растворов «Рапана» в концентрации 2,4,8 г/л. Далее среду удаляли, клетки отмывали раствором PBS и меняли культуральную среду на свежую. Измерения проводили через 24 ч воздействия ГР, а также через 24 ч после устранения воздействия ГР (48ч). По степени разведения красителя [Lyons A.B., 2000] судили о количестве делений, произошедших в культуре с момента начала исследования. 7 Для изучения распределения клеток по стадиям клеточного цикла измеряли количество внутриядерной ДНК. Использовали краситель иодид пропидия PI, уровень флуоресценции которого пропорционален количеству ДНК. Это позволяет оценить относительное количество клеток с различным содержанием ДНК, и выделить группы клеток, соответствующие различным фазам клеточного цикла: G0/G1, S, G2/M [Collins J.M. et al., 1980]. Флуоресценцию CFSE измеряли при λEm = 520 нм, PI при λEm = 670 нм, на проточном цитофлуориметре FACSCalibur, с использованием программного обеспечения СellQuest. Определения внутриклеточного содержания различных белков. Для исследования процессов дифференцирования кератиноцитов проводили суточное воздействия гиперосмотическим раствором в концентрации 8 г/л. Внутриклеточного распределения маркеров дифференцирования исследовали спустя 48 часов, после прекращения воздействия, в случае исследования аутофагии и пролиферативной активности измерения проводили через 24 часа экспозиции непосредственно после эксперимента и еще спустя сутки после устранения воздействия (48 ч). Распределения транскрипционного фактора Nrf2 исследовали через 30 и 120 минут гиперосмотического воздействия, а также через 4 и 24 часа. Распределение субъединиц NF-κB исследовали через 1 и 24 часа воздействия гиперосмотическими растворами. Изменение структуры цитоскелета кератиноцитов проводили через 1 и 24 часа. Для идентификации маркера пролиферации ki-67 использовали: первичные поликлональные антитела кролика anti-Ki67 (ab66155); вторичные флуоресцентно-меченные антитела к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor 488). Процесс аутофагии исследовали по уровню цитоплазматического белка Beclin1 (anti-Beclin1 ab16998; ab150085 AlexaFluor 488), аутофагосомы идентифицировали по окрашиванию структурного белка LC3B первичными олигоклональными антитела кролика anti-LC3b 710014 (Life Technologies); и вторичными, флуоресцентно мечеными антителами к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor488) Для определения маркеров дифференцирования кератиноцитов использовали первичные поликлонaльные антитела кролика к филаггрину Anti-Filaggrin antibody (ab24584, Abcam), лорикрину Anti-Loricrin antibody (ab85679, Abcam), цитокератину-5 Anti-Cytokeratin-5 antibody (ab24647, Abcam), и вторичными, флуоресцентно мечеными антителами к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor488). Для идентификации цитокератина 10 использовали мышиные моноклональные антитела Anti-Cytokeratin 10 (antibody ab9025, Abcam) и вторичные флуоресцентно меченые антитела против IgG мыши (ab150115 AlexaFluor 647). Для определения внутриклеточного распределения транскрипционного фактора Nrf2 использовали первичные поликлональные антитела кролика anti-Nrf2 (ab31163); вторичные флуоресцентно-меченные антитела к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor 488); Для идентификации белка Keap1- первичные моноклональные антитела мыши anti-Keap1 (ab150654); вторичные флуоресцентно меченые антитела против IgG мыши (ab150115 AlexaFluor 647). Для определения субъединицы p65 транскрипционного фактора Nf-kB использовали первичные моноклональные антитела мыши anti-NF-kB p65 antibody 8 (sc-8008), вторичные флуоресцентно меченые антитела против IgG мыши (ab150115 AlexaFluor 647); для определения субъединицы р50 использовали первичные поликлональные антитела кролика аnti-NF-kB p105/p50 antibody (ab7971), вторичные флуоресцентно-меченные антитела к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor 488) Для выявления тубулина использовали конъюгированные поликлональные антитела anti-ɑ-Tubulin Alexa488 (Molecular Probes®). Актиновый цитоскелет окрашивали реактивом: phalloidin Alexa 532 (Molecular Probes®) Во всех препаратах ядра окрашивали DAPI в антифейде ProlongGold (Invitrogen). Последующий анализ готовых препаратов проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM710 (Carl Zeiss, Германия), с использованием программного обеспечения ZEN 2011 (Carl Zeiss, Германия). Исследование продукции активных форм кислорода и трансмембранного митохондриального потенциала. Продукцию супероксид-аниона определяли при помощи индикатора дигидроэтидия DHE (Sigma, США), в концентрации 20мкМ. Продукцию перекиси водорода определяли при помощи - H2DCF-DA (Sigma, США), в концентрации - 10мкМ. Флуоресценцию измеряли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur в каналах: FL1 (λEm =520нм), FL2 (λEm = 670 нм), с использованием программного обеспечения СellQuest. Для исследования образования перекиси водорода в реальном времени применяли лазерную сканирующую конфокальную микроскопию. Использовали индикатор H2DCF- [Joshi D.C., Bakowska J.C., 2011] концентрации 7,5 мкМ, записывали базовый уровень флуоресценции в течение 5 минут, после чего добавляли гиперосмотический раствор. Измерение проводили на лазерном сканирующем микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss, Германия) в течение 30 мин. Для минимизации фототоксического поражения клеток сканирование проводили на малой мощности лазера (1%), 488 нм для H2DCF-DA и 563 нм для TMRM (см. ниже), на малой разрешающей способности микроскопа (256х256 пикселей). Изменение митохондриального потенциала исследовали при помощи потенциал зависимого красителя тетраметилродамина (TMRM) [Joshi D.C., Bakowska J.C., 2011] в концентрации 10 нМ (Sigma, США). Измерения ∆Ψm проводили с момента добавления гиперосмотического раствора к кератиноцитам на протяжении 30 мин в тех же условиях, что и при определении перекиси водорода в реальном времени. Определение продукции цитокинов Определение продукции цитокинов проводили с использованием иммуноферментного анализа. Экспозицию проводили в течение 1 часа, затем меняли среду и оставляли на 24 часа. Во второй экспериментальной группе гиперосмотический раствор оставляли на 24 часа. Продукцию ИЛ-6, ИЛ-1β, ИЛ-10, ФНО-α детектировали с помощью тест-систем для определения соответствующих цитокинов (Вектор-Бест, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Измерения проводились на спектрофотометре, ELX 808 (Biotek, США) Статистическая обработка экспериментальных данных Анализ результатов исследования проводился средствами пакета статистических программ 9 STATISTICA 7.0. и GraphPad Prism. Вероятность достоверности различий между исследуемыми показателями экспериментальных групп оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, с использованием критерия Тьюки. Отличия между сравниваемыми величинами показателей считали достоверными при р<0,05. Количественные данные представлены как М ± m, где М – средняя, m – ошибка средней. * - обозначены достоверные отличия с контрольной группой. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследование жизнеспособности кератиноцитов и типов клеточной гибели после гиперосмотического воздействия В результате МТТ теста установлено, что гиперосмотическое воздействие приводит к дозозависимому уменьшению количества жизнеспособных клеток в культуре (Рисунок 1). Рисунок 1. Результаты исследования жизнеспособности кератиноцитов линии HaCaT через 24 часа после гиперосмотического воздействия. Для выяснения причин снижения жизнеспособности кератиноцитов в культуре проведено исследование различных типов клеточной гибели в ответ на гиперосмотическое воздействие. Установлено, что культивирование кератиноцитов с ГР в концентрациях 4 и 8 г/л не приводило к индукции апоптоза через 24 часа воздействия, а спустя 48 часов признаки апоптотической гибели наблюдались лишь у незначительного количества клеток (менее 4% после воздействия ГР в концентрации 8 г/л), Рисунок 2. Кроме того, количество некротических кератиноцитов после гиперосмотического воздействия сопоставимо с таковым в контроле, т.е. не превышает уровень естественной элиминации кератиноцитов в популяции 10 Рисунок 2. Результаты исследование гибели кератиноцитов через 24 и 48 часов после гиперосмотического воздействия. Таким образом, на данном этапе исследования было установлено, что выбранные концентрации гиперосмотических растворов препарата «Рапан» не вызывают цитотоксического действия, и, как следствие, апоптотической или некротической гибели кератиноцитов. Поэтому уменьшение количества жизнеспособных кератиноцитов в эксперименте, по-видимому, связано с цитостатическим эффектом гиперосмотического воздействия и изменением пролиферативной активности клеток. Для понимания степени выраженности цитостатического эффекта различных концентраций ГР исследовали темпы пролиферации клеток и динамику клеточного цикла. Исследование пролиферативной активности и динамики клеточного цикла кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие Воздействие на кератиноциты ГР в концентрациях 4 и 8 г/л приводило к торможению пролиферации, что показано на Рисунке 3. Через 24 часа после воздействия ГР в концентрациях 4 и 8 г/л более 1 деления совершило 35 и 40% клеток в экспериментальных группах. В контрольных кератиноцитах и при концентрации ГР 2 г/л доля таких клеток составляла 70%. 11 Рисунок 3. Пролиферативная активность кератиноцитов HaCaT через 24 и 48 ч после воздействия гиперосмотических растворов различных концентраций. Количество кератиноцитов прошедших более 2х делений после воздействия ГР также снижалось примерно в два раза по сравнению контрольными клетками. Таким образом, гиперосмотическое воздействие приводило к концентрационнозависимому торможению пролиферативных процессов в кератиноцитах. Через 48 часов, наблюдали увеличение количества пролиферирующих кератиноцитов в каждой исследуемой группе, что свидетельствует о восстановлении пролиферации, после устранения гиперосмотического воздействия и обратимости наблюдаемого эффекта. Исследование динамики клеточного цикла, как и в предыдущем эксперименте, проводили через 24 и 48 часов после гиперосмотического воздействия. Обнаружено, что через 24 ч после воздействия ГР в концентрации 4 и 8 г/л происходит накопление клеток в фазах G0/G1 (около 80% клеток), и снижение количества клеток, находящихся в фазах S и G2/M, относительно контрольных клеток (Рисунок 4). 12 Рисунок 4. Результаты исследования распределения кератиноцитов по стадиям клеточного цикла после гиперосмотического воздействия. Через 48 ч (24 ч экспозиции с ГР и 24ч культивирования в ростовой среде без ГР) динамика клеточного цикла восстанавливалась во всех экспериментальных группах, что свидетельствует о том, что механизмы ареста клеточного цикла реализуются непосредственно во время воздействия ГР, и прекращают свою работу, после устранения этого воздействия. Большой разброс значений количества клеток, находящихся в стадии G0/G1 через 48ч, может быть следствием того, что часть клеток задерживается в стадии G0. Для проверки гипотезы о накоплении клеток в стадии G0 после торможения пролиферации, исследовали экспрессию маркера пролиферации ki-67. Данный маркер обнаруживается в делящихся клетках в разном количестве в фазах G1, S, G2 в ядре и в M-фазе ассоциирован с хромосомами [Scholzen T., Gerdes J., 2000]. Условным маркером фазы G0 является отсутствие данного белка в клетке. Использование ki-67 позволяет выявить кератиноциты в стадии G0, для определения количества «клеток кандидатов», подвергающихся последующему дифференцированию [Gandarillas A. et al., 2000]. После гиперосмотического воздействия в кератиноцитах HaCaT наблюдали уменьшение количества ki-67 в ядрах, и увеличение количества клеток, в ядрах которых ki-67 отсутствовал. Обнаружено, что после воздействия ГР количество 13 кератиноцитов, позитивных по данному маркеру было вдвое ниже, чем в контроле через 24 ч, и на ¼ ниже через 48 часов (Рисунок 5) Рисунок 5. Изменение экспрессии ki-67 у кератиноцитов после гиперосмотического воздействия (нормировано на контроль). Таким образом, удалось установить, что гиперосмотическое воздействие приводило к торможению пролиферации кератиноцитов и накоплению их в стадии G1/G0 клеточного цикла. После устранения гиперосмотического воздействия происходило восстановление нормальной динамики клеточного цикла, что в целом, свидетельствует об обратимости получаемых эффектов, однако часть популяции оставалась в стадии G0, что для кератиноцитов сопряжено с последующим дифференцированием [Gandarillas A. et al., 2000; Micallef L. et al., 2009]. Исследование процессов дифференцирования кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие Процесс дифференцирования кератиноцитов сопровождается элиминацией клеточных органелл и накоплением белков необходимых для формирования рогового слоя, активную роль в данном процессе играет аутофагия [Aymard E. et al., 2011]. Для обнаружения индукции аутофагии в кератиноцитах исследовали внутриклеточное распределение маркера аутофагии - белка Beclin 1, и аутофагосом, выявляемых при помощи их структурного белка LC3B [Yan F.P. et al., 2007]. Через сутки после воздействия гиперосмотическим раствором препарата «Рапан» в концентрации 8 г/л отмечали выраженное увеличение количества цитоплазматического белка Beclin 1, что показано на Рисунке 6. Усиление экспрессии данного белка происходит в ответ на активацию процесса образования аутофагосом. 14 В состав аутофагосом входит структурный белок LC3B [Tanida I. et al., 2004]. Установлено, что этот белок локализуется в везикулярных структурах (аутофагосомах) и в контрольных клетках. Однако количество и размер аутофагосом увеличивается через сутки после воздействия гиперосмотическим раствором. Рисунок 6. Результат измерения уровня белка Beclin1в кератиноцитах после гиперосмотического воздействия (8 г/л). Для изучения дальнейших процессов дифференцирования, исследовали внутриклеточное распределение белков филаггрина и лорикрина (Рисунок 7). Обнаружено, что после суточной экспозиции с гиперосмотическим раствором препарата «Рапан» в концентрации 8 г/л происходит заметное усиление экспрессии исследуемых белков через 48 часов после воздействия (72 часа от начала эксперимента), накопление их в цитоплазме. Кроме того выявлено изменение структуры филаментной сети цитокератинов- 5,-10, и увеличение количества кератиноцитов в популяции, усиленно экспрессирующих цитокератин -10 после гиперосмотического воздействия, что также свидетельствует об индукции дифференцировочных процессов. 15 Рисунок 7.. Внутриклеточное распределение филаггрина и лорикрина после воздействия гиперосмотическими растворами в концентрации 8 г/л. Увеличение х400. Исследование особенностей продукции активных форм кислорода (АФК) при гиперосмотическом воздействии на кератиноциты Исследования продукции АФК на проточном цитофлуориметре Исследование продукции АФК для выявления раннего клеточного ответа проводили на двух сроках: через 10 и 120 минут после начала гиперосмотического воздействия. Установлено, что уже через 10 минут после начала воздействия гиперосмотическими растворами в концентрациях 4 и 8 г/л происходило увеличение количества детектируемого супероксид-аниона (Рисунок 8А). Одновре16 менно отмечали увеличение количества перекиси водорода в ответ на гиперосмотические воздействие на концентрациях 2, 4, 8 г/л (Рисунок 8Б). Через 120 минут после начала эксперимента уровень продукции супероксид-аниона и перекиси водорода клетками восстанавливался до контрольного во всех группах. Большинство АФК в клетке образуется из супероксид-аниона. Вероятно, супероксид-анион под воздействием гиперосмотического раствора в концентрации 2 г/л все же образуется, но в меньшем количестве, чем в случае более высоких концентраций растворов. В результате быстрого конвертирования супероксид аниона в перекись водорода, это количество не может быть детектировано использованным методом. В то же время, данные о продукции перекиси водорода свидетельствует о том, о том, что гиперосмотическое воздействие всеми выбранными концентрациями сопряжено с повышением продукции гидроперекисей. А Б Рисунок 8. Результат измерения продукция супероксид-аниона (А) и гидроперекисей (Б) кератиноцитами в ответ на гиперосмотическое воздействие Б) Исследование на конфокальном микроскопе в реальном времени. 17 Исследование продукции АФК при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии позволяет исследовать динамику изменения продукции АФК в живых клетках в реальном времени. Результат исследование представлен с индикатором перекиси водорода - H2DCF-DA (Рисунок 9). Установлено, что увеличение концентрации АФК начиналось с первых минут и продолжалось в течение 10 минут, после чего сохранялось постоянным. Измерение проводили в течение 30 минут, поскольку по истечению этого времени начиналось увеличение продукции АФК и в контрольных клетках, по-видимому, из-за фототоксического эффекта лазерного облучения [Flock A. et al., 1998]. Митохондрии являются важным источником АФК, образующихся в цепи переноса электронов на митохондриальных мембранах [Genova M.L. et al., 2004]. Было проведено исследование изменения митохондриального потенциала кератиноцитов ∆Ψm, в ответ на гиперосмотическое воздействие. Обнаружено, что в первые 5 минут после добавления к культуре клеток гиперосмотического раствора препарата «Рапан» происходило падение митохондриального потенциала, после чего его уровень значимо не изменялся (Рисунок 10). Быстрое падение митохондриального потенциала в ответ на гиперосмотическое воздействие, скорее всего, связано с разобщением цепи переноса электронов, являющегося защитным механизмом клетки, который приводит к постепенному снижению уровня продукции АФК [Mailloux R.J., Harper M., 2011]. Тот факт, что у части популяции кератиноцитов после гиперосмотического воздействия усиливалась экспрессия маркеров дифференцирования, в то время как у других происходило восстановление клеточного цикла, можно объяснить гетерогенностью популяции кератиноцитов в культуре по продукции перекиси водорода, которая является ключевым медиатором терминального дифференцирования кератиноцитов [Deruy E. et al., 2010]. Рисунок 9. Результат измерения продукции АФК кератиноцитами во время гиперосмотического воздействия. Значения интенсивности флуоресценции нормированы на контроль. Время – в секундах. 18 Рисунок 10. Результат измерения трансмембранного митохондриального потенциала (∆Ψm) кератиноцитов во время гиперосмотического воздействия. Значения интенсивности флуоресценции нормированы на контроль. Время –в секундах. Таким образом, функциональное состояние отдельных клеток определяет последствия гиперосмотического воздействия на эти клетки, проявляющиеся в торможением клеточного цикла и дифференцированием, либо напротив – активной пролиферацией. Вместе с тем, кроме разобщения цепи переноса электронов на митохондриальных мембранах, повышенное образование АФК может приводить к активации редокс-чувствительных сигнальных систем клетки, необходимых для их элиминации. Исследование активации сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии Исследование изменения активности белка Nrf2 проводили через 30 и 120 минут воздействия гиперосмотическим раствором. Эти сроки были выбраны, согласно данным полученным при исследовании продукции АФК кератиноцитами. Кроме того, исследования ядерной транслокации Nrf2 проводили через 4 и 24 часа экспозиции. Установлено, что воздействие гиперосмотическим раствором препарата «Рапан» в концентрации 8 г/л приводило к активации транскрипционного фактора Nrf2, перераспределению данного транскрипционного фактора внутри клетки и его накоплению в ядре (Рисунок 11). Полученные результаты согласуются с наблюдаемым ранее снижением продукции АФК, что свидетельствует об активации ферментов антиоксидантных систем, гены которых находятся под контролем транскрипционного фактора Nrf2 [Kaspar J.W. et al., 2009]. Однако, в данном случае, нельзя отводить фактору транскрипции Nrf2 основную роль в элиминации АФК, так-как несмотря на быструю диссоциацию с репрессорным белком Keap1 и транслокацию в ядро, активация генов мишеней и внут19 риклеточных антиоксидантных ферментов требует большего времени, чем разобщение цепи переноса электронов на мембранах митохондрий, которое происходит за минуты [Desai B.N. et al., 2002]. Поэтому, скорее всего, реализуется синергическое действие активации транскрипционного фактора Nrf2 и разобщения цепи переноса электронов. Рисунок 11. Результат измерения количества транскрипционного фактора Nrf2 в ядрах кератиноцитов на разных сроках воздействия гиперосмотическим раствором (8 г/л). Характеристика цитоскелета кератиноцитов при гиперосмотическом воздействии Проведено исследование актинового и тубулинового компонентов цитоскелета кератиноцитов при гиперосмотическом воздействии. Обнаружено изменение в характере распределения актиновых филаментов в клетках. Наблюдали уменьшение количества стресс-фибрилл и образование в кератиноцитах ламеллоподобного края (Рисунок 12). Обнаруженный характер перераспределения актина свидетельствует об активации белков подгруппы Rac, а именно Rac1. Наблюдаемых характер распределения микротрубочек также свидетельствует об активации Rac1, так как в отношении тубулина именно эта ГТФаза стимулирует рост микротрубочек во время поляризации клеток [Rodriguez O.C. et al., 2003; Wittmann T., Waterman-Storer C.M., 2004], которую наблюдали во время гиперосмотического воздействия (Рисунок 13). Таким образом, на данном этапе исследования установлено, что гиперосмотическое воздействие приводит к реорганизации актинового и тубулинового цитоскелета клетки, что на молекулярном уровне характеризуется переключением с преимущественной работы Rho белка, на активацию Rac1 белка. Полученные результаты являются полезными данными, т.к. малые ГТФазы семейства Rac играют важную роль в различных внутриклеточных процессах, выступая первым звеном в проведении внутриклеточных сигналов, включая реализацию механизмов адаптивного ответа клетки на воздействия окружающей среды, в частности активацию стресс киназы р38 и транскрипционного фактора NF-κB [Zampetaki A. et al., 2005] 20 Рисунок 12. Структура актинового цитоскелета кератиноцитов: А. – контрольные клетки; Б – клетки во время гиперосмотического воздействия. Увеличение х1000. Рисунок 13. Реорганизация тубулинового цитоскелета кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие. Увеличение х400. 21 Исследование продукции цитокинов и активации транскрипционного фактора NF-κB в ответ на гиперосмотическое воздействие Продукцию цитокинов исследовали при помощи иммуноферментного анализа. Измерения проводили через сутки после непрерывного и часового воздействия гиперосмотическими растворами препарата «Рапан». В обоих случаях не было отмечено изменений в продукции секретируемых ИЛ-1β, ИЛ-10 и ФНО-α. Указанные цитокины формируют в коже коммуникационную и регуляторную сеть, для взаимодействия клеток между собой. Продукция этих цитокинов резко увеличивается в ответ на механическое повреждение, воздействие антигенов, стимуляторов воспалительных реакций и др. Процесс реагирования запускается с усиления продукции ИЛ-1β и ФНО-α [Лезвинская Е.М. и др., 2003]. Тот факт, что мы не наблюдали развитие подобной реакции, объясняется отсутствием в выбранной модельной системе клеточного повреждения и воспалительного процесса. Однако существенные различия были обнаружены в продукции ИЛ-6 (Рисунок 14). Часовое воздействие гиперосмотическим раствором приводило к двукратному увеличению концентрации ИЛ-6, спустя сутки после гиперосмотического воздействия. Рисунок 14. Результат ИФА продукции ИЛ-6 в кератиноцитах, в ответ на гиперосмотическое воздействие Продукцию всех вышеперечисленных цитокинов регулирует фактор транскрипции NF-κB. Причем провоспалительные и противовоспалительные цитокины активируются одним и тем же гетеродимером p50/RelA (p65), а «баланс» продукции цитокинов определяется множеством внешних и внутриклеточных факторов, от которых зависит судьба клетки. ФНО-α поддерживает активность NFκB в кератиноцитах, тогда как ИЛ-10 выполняет роль ингибитора [Wullaert A., Bonnet M. C., 2011]. В ходе исследования установлено, что кератиноциты HaCaT 22 в контрольной группе (обычные условиях культивирования, без ГР) характеризуются выраженной активностью p50 и p65 субъединиц NF-κB . Экспозиция кератиноцитов с ГР в течение 1 часа (имитация режима бальнеотерапии) не оказывала влияния на конститутивное количество транскрипционного фактора, находящегося в ядре. В то же время, более длительное гиперосмотическое воздействие (24ч) приводило к снижению ядерной локализации субъединиц p65 и p50, причем, в случае с p50 происходило практически полное удаление субъединицы из ядра (Рисунок 15), что, вероятно, служит причиной снижения продукции ИЛ-6 в тех же условиях (24ч в условиях ГР). Рисунок 15. Результат измерения уровня транслокации субъединиц р50 и р65 транскрипционного фактора NF-κB в ядрах кератиноцитов через 24 часа после гиперосмотического воздействия. Таким образом, удалось установить, что прямое влияние гиперосмотических растворов препарата «Рапан» на кератиноциты не приводит к продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ФНО-α, и противовоспалительного цитокина ИЛ-10, но сопряжено с усилением продукции ИЛ-6 в ответ на непродолжительную экспозицию с гиперосмотическими растворами, и ингибированием продукции ИЛ-6 при продолжительном воздействии на клетки. Снижение продукции ИЛ-6 согласуется с тем, что после суточной экспозиции с гиперосмотическими растворами происходит ингибирование транскрипционного фактора NF-κB. ВЫВОДЫ 1. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» различных концентраций оказывает обратимый дозозависимый цитостатический эффект на кератиноциты, сопровождающийся остановкой клеточного цикла в стадии G1/G0 и переходом части клеточной популяции в стадию G0, что свидетель23 ствует о возможности направленной регуляции клеточной пролиферации выбранными растворами. 2. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» сопряжено с индукцией аутофагии и последующим дифференцированием кератиноцитов in vitro, не вызывая усиления апоптотической или некротической гибели. 3. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» на кератиноциты приводит к развитию окислительного стресса, усилению продукции АФК и падению трансмембранного митохондриального потенциала, что служит доказательством прямой связи гиперосмотического и окислительного стресса. 4. Повышение продукции АФК при гиперосмотическом воздействии растворами препарата «Рапан» на кератиноциты, приводит к активации редоксчувствительной сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE, участвующей в элиминации образованных АФК, что указывает на ее гомеостазирующую функцию в указанных экспериментальных условиях. 5. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» приводит к реорганизации актинового и тубулинового компонентов цитоскелета кератиноцитов, сопряженной с активацией малой ГТФазы Rac1, которая обеспечивает развитие адаптивного ответа клеток. 6. Гиперосмотические растворы препарата «Рапан» изменяют активность транскрипционного фактора NF-κB в кератиноцитах, что следует из характера распределения субъединиц р50 и р65 (снижение общего количества субъединиц в ядрах клеток). Это явление сопряжено с изменением продукции ИЛ-6, зависящем от продолжительности гиперосмотического воздействия, но не оказывает индуцибельного влияния на продукцию ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-10. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Влияние высокоминерализованных природных вод на окислительновосстановительные процессы в кератиноцитах линии HaCaT / Н.С. Зайцева, А.В. Чечушков, П.М. Кожин, А.Е. Лемза, В.О. Ткачев, М.В. Соломатина, В.А. Старостенко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013 – Т. 156, № 12. - С. 775-778. (Из списка ВАК) 2. Эффекты действия высокоминерализованных природных вод на кератиноциты in vitro / Н.С. Зайцева, А.В. Чечушков, А.Е. Лемза, В.О. Ткачев, Н.Г. Лузгина // Бюллетень СО РАМН. – 2013. - Т.13, № 5. - С. 18-24. (Из списка ВАК) 3. Влияние гиперосмотических растворов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов in vitro / Н.С. Зайцева, В.О. Ткачев, Н.Г. Лузгина, В.А. Шкурупий // Фундаментальные аспекты компенсаторноприспособительных процессов: Материалы Пятой Всероссийской научнопрактической конференции 12-14 апреля 2011г. – Новосибирск, 2011. - С. 73-74. 4. Зайцева Н.С. Влияние гиперосмотического воздействия на внутриклеточную сигнальную систему Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах человека / Н.С. Зайцева, А.В. Чечушков, В.О. Ткачев // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы Шестой Всероссийской научнопрактической конференции 16-17 апреля 2013г. – Новосибирск, 2013. - С. 56-57. 1. 24 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ARE - антиоксидант-респонсивный элемент CFSE - карбоксифлуоресцеин DiOC6 - 3,3′- дигексилоксакарбоцианин йодид DMSО - диметилсульфоксид DHE - дигидроэтидий MTT - бромид 3-(диметилтиазол -2- ил)-2,5 – дифенил тетразолия NAD(P)H - никотинамидадениндинуклеотиддифосфат восстановленный NADH - никотинамидадениндинуклеотиддифосфат PBS - фосфатно-солевой буфер PI - йодид пропидия (Propidium iodide) TGF - трансформирующий фактор роста TMRM -тетраметилродамин (Tetramethylrhodamine) АФК - активные формы кислорода ИФА - иммуноферментный анализ ГР - гиперосмотический раствор Соискатель Зайцева Н.С. 25
