5. меры предосторожности

УТВЕРЖДЕНА
Приказом Росздравнадзора
от 07 февраля 2008 г. № 475-Пр/08
"УТВЕРЖДАЮ"
Генеральный директор
ЗАО “НВО Иммунотех”
_____________________ А.П. Осипов
"_23_" __октября_____ 2007 г.
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ИММУНОГЛОБУЛИНА Е В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(ИммуноФА-IgE)
Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/0167 от 7 февраля 2008 г.
1. НАЗНАЧЕНИЕ.
Набор ИммуноФА-IgE предназначен для количественного определения содержания общего иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови человека методом одностадийного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Иммуноглобулины класса Е являются медиаторами аллергических реакций немедленного типа. Эти аллергические реакции развиваются при взаимодействии аллергена с
фиксированными на клетках специфическими IgE. В результате активации иммуноглобулином Е тучных клеток и базофилов выделяется ряд цитокинов. При повторной встрече
аллергена с сенсибилизированной тучной клеткой или базофилом он перекрестно связывается с IgE, фиксированным на поверхности эффекторных клеток. Это приводит к деградации клеток и высвобождению ими медиаторов аллергической реакции: ранее синтезированных – гистамина, протеаз; вновь синтезированных – лейкотриенов, простагландинов,
а также цитокинов, усиливающих воспалительную реакцию и IgE-ответ. Результатом воздействия этих факторов является расширение периферических кровеносных сосудов,
скопление эозинофилов и нейтрофилов в участке воздействия, повышение проницаемости
капилляров, отек тканей, секреция слизи, сокращение гладкой мускулатуры. Период полураспада и выведения сывороточного IgE составляет 2 - 3 дня, для антител, связанных с
тучными клетками и базофилами – несколько недель.
IgE присутствует в крови в более низких концентрациях по сравнению с другими
иммуноглобулинами. Его уровень повышается в процессе роста организма: до года он не
превышает 15 МЕ/мл, с 2 до 5 лет – 60 МЕ/мл, до 9 лет составляет до 90 МЕ/мл и достигает своего максимума в 10 – 16 лет, когда его концентрация в норме может составлять от
100 до 200 МЕ/мл, после чего уровень IgE начинает снижаться.
Наряду с известными атопическими или аллергическими заболеваниями дыхательных путей (бронхиальная астма, бронхоспазм, риниты), кожи и слизистых оболочек (экзема, крапивница, отек Квинке, экзантема) и желудочно-кишечного тракта (хроническая
диарея), при которых часто наблюдается длительное повышение уровня IgE, содержание
IgE в крови может также превышать нормальные границы при широком спектре заболеваний, которые не сопровождаются аллергическими симптомами. Сюда входят инфекции,
воспалительные заболевания, паразитарные болезни, болезни иммунной системы.
Количественное определение IgE имеет важное значение для оценки иммунного
статуса и диагностики аллергических заболеваний, иммунодефицитов, паразитарных инвазий и парапротеинемий.
Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 41 исследуемого образца, 6
калибровочных проб, 1 пробы контрольной сыворотки, всего 96 определений.
2. ПРИНЦИП МЕТОДА
Метод анализа основан на двуцентровой схеме твердофазного иммуноферментного
анализа с использованием двух типов антител. Исследуемые образцы сыворотки крови
инкубируют в планшете с иммобилизованными на твердой фазе антителами к IgE и одновременно с конъюгатом моноклональных антител к IgE с пероксидазой. Количество связавшегося конъюгата выявляют с помощью раствора субстрата (3,3`,5,5`тетраметилбензидин с добавлением перекиси водорода). Интенсивность окраски продукта
окисления субстрата прямо пропорциональна концентрации IgE, содержащегося в анализируемом образце.
3. СОСТАВ НАБОРА:
- планшет 96-луночный полистироловый, стрипованный, сенсибилизированный
моноклональными антителами к IgE - 1 шт.;
- калибровочные пробы на основе сыворотки крови теленка, аттестованные по
Международному стандарту для иммуноглобулина Е человека 2nd IRP 75/502, содержащие известные количества IgE: 0 МЕ/мл (2,0 мл); 25; 50; 100, 250; 500 МЕ/мл (по 0,5 мл);
концентрации IgE в калибровочных пробах могут незначительно изменяться от серии к
серии, точные значения концентраций указаны на этикетках флаконов; готовые для
использования - 6 фл.;
- контрольная сыворотка на основе сыворотки крови теленка с известным содержанием IgE, готовая для использования - 1 фл. (0,5 мл);
- конъюгат моноклональных антител к IgE с пероксидазой, готовый для использования - 1 фл. (12,5 мл);
- фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) с добавлением твин-20, рН 7,0+0,5,
концентрированный - 1 фл. (15 мл);
- раствор субстрата на основе ТМБ с добавлением перекиси водорода, готовый
для использования – 1 фл. (12,5 мл);
- стоп-реагент, готовый для использования - 1 фл. (15 мл);
- пленка для заклеивания планшета - 1 шт.
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Специфичность. Не обнаружено перекрестной реактивности моноклональных антител к IgE с иммуноглобулинами изотипов G и М и другими компонентами сыворотки
крови человека.
Чувствительность. Минимальная концентрация IgE, определяемая с помощью
набора, составляет не более 2,0 МЕ/мл.
Воспроизводимость результатов. Коэффициент вариации результатов определения
концентрации IgE в образцах сывороток крови (n =10) не превышает 8 %.
Точность. Процент открытия составляет 90-110 %.
Линейность. Линейность определения в диапазоне концентраций 25-500 МЕ/мл составляет 90 – 110%.
Клиническая проверка набора. Концентрация IgE, определяемая с помощью набора
реагентов ИммуноФА-IgE в сыворотке крови здоровых лиц (n=350), не превышала 150
МЕ/мл.
Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора ИммуноФА-IgE
уточнить значения концентраций IgE, соответствующие нормальным для обследуемого
контингента.
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора - класс 2а.
Все компоненты набора, за исключением стоп-реагента, в используемых концентрациях являются нетоксичными.
Стоп-реагент действует на кожу и слизистые прижигающим образом, вызывая раздражение и ожоги, поэтому в случае попадания на кожные или слизистые покровы его
следует немедленно тщательно смыть большим количеством проточной воды.
При работе с набором и утилизации отходов следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарноэпидемиологических учреждений системы Министерства
здравоохранения СССР"
(Москва, 1981 г.).
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые
перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и
другие возбудители вирусных инфекций.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
- Фотометр вертикального сканирования одно- или многоканальный, позволяющий
измерять оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450 нм;
- термостат суховоздушный на +( 37+1)оС;
- пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2-20 мкл, 200-1000 мкл;
- пипетка полуавтоматическая многоканальная с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объем жидкости 50-250 мкл;
- шейкер;
- стакан химический мерный вместимостью 300 мл;
- вода дистиллированная;
- бумага фильтровальная или салфетки марлевые;
- перчатки резиновые или пластиковые.
7. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ.
Исследуемые пробы крови для получения сыворотки собирают в сухие пробирки.
До проведения анализа возможно хранение образцов сывороток при температуре +(2-8)оС
в течение 3 суток или в замороженном состоянии при температуре минус 20 оС в течение
2 месяцев.
8. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре +(20-25 о С) не менее 30 минут.
Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждой серии анализов.
8.1. Приготовление рабочего раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБР).
Содержимое флакона с концентратом ФСБР перенести в мерный стакан вместимостью 300 мл, дважды ополоснуть флакон дистиллированной водой, все промывные воды
объединить с разведенным ФСБР и довести общий объем раствора до 300 мл дистиллированной водой. Полученный рабочий раствор ФСБР можно хранить в закрытой емкости
при температуре +(2-8)оС не более 7 суток.
Примечание. При хранении концентрата ФСБР могут образовываться кристаллы,
поэтому при необходимости отбора аликвоты ФСБР необходимо слабо подогреть флакон
с буферным раствором до полного растворения кристаллов, поместив его в водяную баню
или термостат при температуре +37оС.
9. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Внесение реагентов следует проводить согласно схеме на рис. 1.
9.1. Вставить в свободную рамку необходимое количество лунок для калибровочных проб, исследуемых образцов и контрольной сыворотки для постановки в дубликатах.
Неиспользуемые стрипы необходимо тщательно заклеить пленкой для заклеивания планшетов и хранить в упаковке при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности
набора.
9.2. В два ряда лунок планшета внести в дубликатах по 0,02 мл калибровочных
проб (КП), начиная с минимальной концентрации.
9.3. Внести в две лунки планшета по 0,02 мл контрольной сыворотки (КС).
9.4. В оставшиеся лунки внести в дубликатах по 0,02 мл исследуемых образцов сывороток крови (ИС).
A
B
C
D
E
F
G
H
1
КП1
КП2
КП3
КП4
КП5
КП6
КС
ИС
2
КП1
КП2
КП3
КП4
КП5
КП6
КС
ИС
3
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
4
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
5
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
6
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
7
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
8
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
9
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
10
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
11
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
12
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
Рис. 1. Схема заполнения лунок планшета.
9.5. Внести во все лунки планшета по 0,1 мл конъюгата. Процедуру внесения образцов и конъюгата следует выполнять как можно быстрее. Вся операция не должна превышать 10-15 минут. Рекомендуется перемешать содержимое лунок на шейкере при комнатной температуре +(20-25)0С в течение 1-2 минут. Закрыть планшет крышкой или
пленкой для заклеивания планшета и инкубировать в термостате в течение 1 часа при
температуре 37+1оС.
9.6. Удалить содержимое лунок и затем отмыть планшет. Для этого в лунки
планшета внести по 0,25 мл рабочего раствора ФСБР (см п. 8.1), встряхнуть 1-2 минуты на
шейкере, после чего удалить его содержимое декантированием. Процедуру повторить еще
два раза. При автоматической промывке необходимо вручную удалить содержимое лунок
планшета, только после этого приступить к отмывке с помощью прибора, внося в каждую
лунку планшета 300–350 мкл рабочего раствора ФСБР. По окончании промывки тщательно удалить остатки жидкости из лунок, несколько раз резко вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.
9.7. Внести во все лунки планшета по 0,1 мл раствора субстрата в той же последовательности, что и конъюгат. Инкубировать планшет в течение 10 - 15 мин при температуре 37+1оС в темноте.
Примечание. При внесении раствора субстрата рекомендуется всегда использовать
новые наконечники.
9.8. Внести во все лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата, по 0,1 мл стоп-реагента и тщательно перемешать содержимое лунок на шейкере в течение 1 минуты при комнатной температуре +(20-25)0С.
9.9. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 450 нм.
Процедура измерения оптической плотности не должна превышать 15 мин.
10. РАСЧЕТЫ.
10.1. Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности от
концентрации IgE в калибровочных пробах. Образец калибровочной кривой приведен на
рис.2.
ОП, 450 нм
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
200
400
600
IgE, МЕ/мл
Рис. 2. Типичный калибровочный график, полученный
с использованием набора ИммуноФА-IgE.
10.2. Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности контрольной сыворотки и анализируемых образцов и по калибровочной кривой
определить концентрацию IgE.
10.3. При построении калибровочной кривой и определении содержания IgE в исследуемых образцах с помощью автоматического анализатора иммуноферментных реакций рекомендуется использовать кусочно-линейный метод аппроксимации.
10.4. Если концентрация IgE в анализируемом образце превышает 500 МЕ/мл, следует развести образец калибровочной пробой 0 МЕ/мл, повторить определение и полученный результат умножить на фактор разведения.
10.5. Для выражения концентрации IgE в нг/мл значения, полученные в МЕ/мл,
следует умножить на коэффициент 2,4.
11. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА.
11.1. Набор реагентов ИммуноФА-IgE должен храниться в упаковке предприятия
при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности - 12 месяцев. Допускается хранение набора при температуре до +25оС не более 5 суток.
11.2. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре +(20-25)оС не менее 30 минут.
11.3. Неиспользованные стрипы после вскрытия упаковки необходимо тщательно
заклеить пленкой для заклеивания планшета и хранить в упаковке при температуре +(28)оС в течение всего срока годности набора.
11.4. Калибровочные пробы, контрольную сыворотку и конъюгат после вскрытия
флаконов можно хранить при температуре +(2-8)оС не более 2 месяцев, остальные компоненты набора – в течение всего срока годности.
11.5. Рабочий раствор ФСБР можно хранить в закрытой емкости при температуре
о
+(2-8) С не более 7 суток.
11.6. В случае дробного использования набора построение калибровочной кривой
необходимо проводить для каждого независимого эксперимента; кроме этого рекомендуется определение концентрации IgE в контрольной сыворотке.
11.7. До проведения анализа возможно хранение образцов сывороток крови в течение 3 суток при температуре +(2-8)оС или в замороженном состоянии при температуре
минус 20оС (и ниже) в течение 2 месяцев.
Допускается только однократное замораживание и размораживание образцов сывороток. После размораживания образцы нужно тщательно перемешать. Тепловая инактивация сывороток не допускается.
11.8. Исключается использование для анализа гемолизированных и мутных образцов сывороток крови.
11.9. Для отбора и добавления реагентов необходимо использовать полуавтоматические пипетки со сменными наконечниками, аттестованные на точность по значению
средней дозы и воспроизводимость результатов пипетирования.
11.10. Не допускается использование раствора субстрата и стоп-реагента из наборов, производимых другими фирмами.
11.11.Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
По вопросам, касающимся качества набора ИммуноФА-IgE, следует обращаться в
ЗАО «НВО Иммунотех», почтовый адрес: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, д. 1,
строение 11 А, тел. 939-46-83, факс 932-88-96; электронный адрес: support@immunotek.ru;
http://www.immunotek.ru.
и в Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «НЦЭСМП»
Росздравнадзора по адресу: 117246, Москва, Научный проезд, д.14а, тел. 120-60-95.