НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития
Фармацевтический факультет
__________________________
Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии
Химико-токсикологический
анализ азотной и азотистой
кислот
Учебно–методическое пособие для студентов 5 курса
фармацевтического факультета
Нижний Новгород
2006
2
Нитраты обладают высокой токсичностью для человека и сельскохозяйственных животных.
Нитраты под воздействием фермента нитратредуктазы восстанавливаются до нитритов, которые взаимодействуют с гемоглобином крови и окисляют в нем 2-х валентное железо в 3-х валентное. В результате образуется метгемоглобин – производное гемоглобина лишенное способности переносить
кислород. При этом нарушается нормальное дыхание клеток и тканей организма (тканевая гипоксия),
накапливается молочная кислота, холестерин и резко падает количество белка. Наблюдается покраснение, затем цианоз слизистых оболочек и кожи, одышка и метгемоглобинонурия, моча приобретает
кроваво-красный цвет. Нитраты и нитриты попадают в организм через различные пути: через продукты питания как растительного, так и животного происхождения; через питьевую воду; с лекарственными препаратами. Нитриты и нитраты быстро всасываются в желудочно-кишечном тракте,
выделяются преимущественно в неизменном виде через почки и кишечник. Смертельная доза нитрита натрия составляет 2 г.
Основная масса нитратов (40-80% суточного количества) попадает в организм человека с овощами, фруктами и консервами. Чрезмерное использование азотных удобрений для увеличения массы
овощных культур приводит к накоплению нитратов и нитритов в овощах. Использование таких продуктов в пищу вызывает тяжелые отравления.
Определить по внешнему виду содержание нитратов в овощах и фруктах трудно или вообще невозможно. У вегетирующих (с листьями и стеблями) растений по интенсивности зеленой окраски листьев и черешков, особенно нижних ярусов, можно лишь ориентировочно судить: чем она темнее,
тем больше нитратов в них содержится. При осмотре клубней картофеля, корнеплодов, плодов, ягод
это сделать еще труднее. Замечено, что корнеплоды моркови одного сорта, но имеющие более яркую
окраску, содержат нитратов меньше, чем корнеплоды, окрашенные менее интенсивно. Зеленые
стручки фасоли содержат нитратов больше, чем желтые. Сходная зависимость между окраской и содержанием нитратов наблюдается у сортов сладкого перца. В арбузах и дынях много нитратов под
коркой и в незрелых плодах. В сочных перезревших арбузах наличие нитратов легко определить по
пустотам в мякоти, из которых выпадают семена. Все овощи, поступающие в продажу, должны подвергаться контролю на содержание в них нитратов и нитритов.
Изолирование солей азотной и азотистой кислот из объектов проводят настаиванием с водой,
для очистки от высокомолекулярных соединений используют диализ водной вытяжки через полупроницаемую мембрану.
Качественное определение нитратов и нитритов в растворе можно провести по реакциям:

с дефиниламином в концентрированной серной кислоте;

с реактивом Грисса;

с цинковой пылью и щелочью.
Полуколичественное определение нитратов и нитритов в питьевой воде можно проводить с
помощью оригинальных методов, предложенных А.Л. Рычковым (1-й Московский медицинский институт имени И.М. Семашко). Для этого используются аптечные препараты: риванол (этакридина
лактат), физиологический раствор (0,9%-й раствор хлорида натрия в дистиллированной воде), антипирин (1-фенил-2,3-диметилпиразолон-5).
Количественное определение проводят фотоэлектроколориметрическим методом по реакции
диазотирования и азосочетания с реактивом Грисса. Полученные данные сравнивают с данными предельно допустимого содержания и дают заключение о возможности употребления в пищу данных
продуктов.
3
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Изолирование нитратов и нитритов из растительного объекта.
Измельченный растительный материал (картофель, лук, капуста и др.) в количестве 2-10 г помещают в мешочек из пленки для диализа, а затем диализационный
стаканчик на 200 мл и заливают дистиллированной водой в обеме 50-100 мл. Чтобы
мешочек был полностью погружен в воду, ее сначала наливают в мешочек (5 мл), а затем в стаканчик. Проводят диализ в течение 4-6 часов. Диализат используют для определений.
Качественное определение нитратов и нитритов в диализате.
1. На часовое стекло поместить три капли раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте и несколько капель исследуемого раствора. В присутствии нитрати нитрит-ионов появляется темно-синее окрашивание.
2. К 10 мл исследуемого раствора прибавить 1 мл раствора, состоящего из 10%-го раствора реактива Грисса в 12%-й уксусной кислоте, и нагреть до 70–80 С на водяной
бане. Появление розового окрашивания свидетельствует о наличии нитрит-ионов.
3. К 10 мл исследуемого раствора прилить 10–15 капель щелочи, добавить 25–50 мг
цинковой пыли, полученную смесь нагреть. Нитраты восстанавливаются до аммиака,
4
который обнаруживается по покраснению фенолфталеиновой бумаги, смоченной в дистиллированной воде и внесенной в пары исследуемого раствора.
4. Риванольная реакция (для анализа питьевой воды). К 1 мл исследуемого раствора
прибавляют 1 мл физиологического раствора и смешивают с 1 мл риванольного раствора (таблетку риванола растворяют при нагревании в 200 мл 8%-й соляной кислоты).
Если появится бледно-розовая окраска, значит, уровень нитратов и нитритов в питьевой воде недопустим.
5. Антипириновая реакция (для анализа питьевой воды). Антипирин в присутствии 50
мг/л нитритов образует нитропроизводное, окрашенное в салатовый цвет. Если в растворе присутствуют следы дихромата калия, то чувствительность реакции сильно возрастает, и при содержании нитритов более 1,6 мг/л появляется розовая окраска.
Для проведения этого анализа 1 мл питьевой воды смешивают с 1 мл физиологического раствора (концентрация нитритов при таком разведении уменьшается вдвое), добавляют 1 мл раствора антипирина (1 таблетку антипирина растворяют в 50 мл 8%-й соляной кислоты) и быстро 2 капли 1%-го раствора дихромата калия. Смесь нагревают
до появления признаков кипения. Если в течение 5 мин раствор становится бледнорозовым, то в нем содержится более 1,6 мг/л нитрит-ионов, а в анализируемой питьевой воде их вдвое больше. В этом случае содержание нитрит-ионов превышает предельно допустимую концентрацию.
Количественное определение нитратов и нитритов.
Для проведения анализа необходимы следующие реактивы:
1. 12 %-ный раствор уксусной кислоты, готовят разведением дистиллированной водой
25 мл ледяной уксусной кислоты до 200 мл.
2. Раствор сульфаниловой кислоты готовят растворением 1 г реактива в 300 мл 12 %ной уксусной кислоты, приготовленной согласно п. 1. Раствор хранят в темной склянке.
3. Раствор α-нафтиламина готовят растворением 0,2 г реактива в нескольких каплях
ледяной уксусной кислоты с последующим смешиванием с 300 мл 12 %-ной уксусной
кислоты. Допускается окрашивание реактива α-нафтиламина в слаборозовый цвет. Полученный раствор хранят в темной склянке.
4. Реактив Грисса—Илосвая готовят непосредственно перед употреблением, смешивая
равные объемы растворов сульфаниловой кислоты и α-нафтиламина.
5. Смесь для восстановления: сульфат бария 100 г, сульфат марганца 10 г, цинковая
пыль 2 г, лимонная кислота 75 г, сульфаниловая кислота 4 г, нафтиламин 2 г.
Проведение анализа
Определение нитритов
К 100 мл пробы в колбе или цилиндре Несслера с притертой пробкой добавляют 5 мл
реактива Грисса—Илосвая, раствор тщательно перемешивают и через час измеряют
его оптическую плотность в кюветах длиной 50 (100) мм на спектрофотометре при
длине волны 543 нм или на фотоэлектроколориметре при светофильтре с наиболее
близкими к этой длине волны характеристиками (например, для ФЭК-56—светофильтр
№ 6), с кюветой сравнения, заполненной дистиллированной водой, в которую также
добавляется реактив Грисса—Илосвая.
Подготовка средств измерений к работе
5
Методы приготовления градуировочных растворов
Для приготовления основного стандартного раствора нитрита натрия 0,4927 г
дважды перекристаллизованной и высушенной до постоянной массы при 110°С соли
растворяют в мерной литровой колбе в дистиллированной воде. Для консервации добавляют 2 мл хлороформа с таким расчетом, чтобы общий объем раствора был 1000
мл. Раствор устойчив шесть месяцев при хранении в холодильнике при 4—5°С. 1 мл
основного стандартного раствора содержит 0,1 мг нитритного азота.
Рабочий стандартный раствор нитрита натрия готовят разбавлением в 100 раз
основного раствора в день проведения анализа. 1 мл этого раствора содержит 1 мкг
нитритного азота.
В мерные колбы на 100 мл или цилиндры Несслера отмеривают микробюреткой различные количества рабочего стандартного раствора и доводят до метки водой.
Для приготовления градуировочных растворов с концентрациями нитритного азота
0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 мкг/л и т. д. отбирают соответственно 0,05; 0,10; 0,25; 0,50; 0,75 мл
и т. д. рабочего стандартного раствора.
Установление градуировочных характеристик метода
Градуировочный график строят по результатам измерений оптической плотности нескольких градуировочных растворов. Каждый раствор готовят параллельно не
менее трех раз. В каждый раствор добавляют по 5 мл реактива Грисса—Илосвая, перемешивают и через час измеряют оптическую плотность растворов относительно воды. По средним значениям оптической плотности строят Градуировочный график.
Обработка результатов
По найденному значению оптической плотности с помощью градуировочного
графика определяют концентрацию нитритного азота (мкг/л) в исследуемом диализате.
Определение нитратов.
5 мл диализата помещают в пробирку, прибавляют 0,3 г смеси для восстановления, содержимое пробирки тщательно перемешивают в течение 2 мин и оставляют
на 10 минут, Затем пробирку центрифугируют 5 мин при скорости 5-6 тыс. об./мин.
Надосадочную жидкость фотоклориметрируют в кювете с толщиной слоя 1 см, при
длине волны 540 нм (зеленый светофильтр). Раствор сравнения 12% уксусная кислота,
обработанная смесью для восстановления. По калибровочному графику определяют
содержание нитратов, восстановленных до нитритов, в пробе.
Расчет содержания нитритов и нитратов в исследуемом объекте ведут по формуле
Х
А  V1 A 1000  50

, мг кг 
n  V2 n 1000  10
где Х – содержание нитритов и нитратов, мг/кг;
А – содержание нитритов по калибровочному графику, мкг;
n – навеска объекта, кг;
V1 – общий объем диализата с учетом разведения, мл;
V2 – объем диализата, взятый на анализ, мл.
Полученные результаты сравнивают с нормативными значениями и делают вывод о возможности применения данного продукта в пищу.
Таблица 1.
Допустимое содержание нитратов в пищевых продуктах
6
Объекты
Картофель
Капуста
Морковь
Свекла
Лук репчатый
С, мг/кг
открытый грунт
250
900
400
1400
80
С, мг/кг
закрытый грунт
500
250
-
7
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8
ЛИТЕРАТУРА
М.Д. Швайкова Токсикологическая химия. М.: «Медицина», 1975.
В.Ф. Крамаренко Токсикологическая химия. Киев: «Вища школа», 1989.
Руководство по морским гидрохимическим исследованиям. — М.: Гидрометеоиздат, 1969, с. 205—210.
Руководство по методам химического анализа морских вод.—Л.: Гидрометеоиздат, 1977, с. 78—82.
New Baltic manual/Cooperative research report—ICES, 1972, N 29 A, p. 57.
В.И. Ештокин Анализ нитритов и нитратов реактивом Грисса.
М.Д. Трухина Методы определения нитратов и нитритов. Азотсодержащие соединения и их влияние на организмы. Московский государственный педагогический университет.