УДК 577
реклама
УДК 577.15; 581.19; 577.1; 581.133.1 На правах рукописи КУДИЯРОВА ЖАНАР СЫРЛЫБАЙХАНОВНА Изучение ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчине Автореферат диссертации на соискание академической степени доктора философии (Ph.D.) в области биологии по специальности «генетика» Республика Казахстан Алматы, 2009 Работа выполнена в Казахском национальном университете им. альФараби. Научные руководители: академик НАН РК, доктор биологических наук, профессор Гильманов М.К., доктор биологических наук, профессор Ирель Б. Рецензенты: доктор биологических наук, Хайленко Н.А., доктор биологических наук, профессор Сейтхожаев А.И. Защита диссертации состоится «03» июня 2009 года на заседании Государственной аттестационной комиссии КазНУ им. аль-Фараби по адресу: 050040, г. Алматы, пр. аль-Фараби, 71, биологический факультет, ауд. 214. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке КазНУ им. аль-Фараби. Автореферат разослан «___» мая 2009 года. Секретарь ГАК С.Б. Даулетбаева 2 ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена исследованию ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчинным болезням. Наиболее важные результаты были получены при изучении НАДФ-ГДГсферосом и ФК МДГ-ГОАТ. Было проведено комплексное исследование с привлечением ученых из ведущих научных центров Европы. Так часть работы по изучению регуляции НАДФ-ГДГ-сферосом выполнялось в Свободном Университете города Амстердам, (Нидерланды) под руководством профессора Альберта де Бура, а изучение активности ФК МДГ-ГОАТ у различных генотипов пшеницы проводилось в Международном Ротамстэдском Исследовательском центре Генетического улучшения зерновых культур, (Великобритания), под руководством профессоров Димы Хабаш и Найджела Халфорд. Актуальность темы. Ключевые реакции обмена центральной аминокислоты азотного обмена - глютамата, являются одними из главных звеньев в метаболизме высших растений. Глютамат является донором аминогруппы для синтеза всех аминокислот злаковых культур. Так как процессы ассимиляции азота определяет белковую продуктивность то естественно, что изучение энзимологических механизмов функционирования обмена глютамата может открыть новые пути для управления процессами, которые определяют урожай злаковых культур. За последние 35 лет роль ГДГ в метаболизме глютамата в растениях являются предметом продолжительной дискуссии (Oaks and Hirel, 1985; Dubois et. al., 2003; Terce Laforgue et. al., 2004). Известно, что в обеспечении нормального протекания процессов роста и развития растения очень большую роль играют ключевые ферменты метаболизма. Поэтому одной из цели нашего исследования явилось изучить роль центральных ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом важнейших злаковых культур, в первую очередь пшеницы. Неблагоприятные факторы внешней среды, такие как засоление, высокая температура, недостаток влаги, грибной патогенез, и другие оказывают отрицательное воздействие на рост и развитие растений. Засоление почв является одним из существенных факторов, ограничивающих продуктивность злаковых растений во многих агроклиматических зонах. Избыточные концентрации соли вызывают осмотический и оксидативный стрессы, а ионы хлора оказывают токсическии эффект. Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, изменением интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. (Чиркова, 2002; Eimer, 2004; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Ермакова и др., 2005). Изучение ферментов азотного обмена в условиях засоления имеет очень важное значение для понимания процессов токсического действия солей на генотипы злаковых культур. Также и грибные болезни в мире ежегодно 3 уничтожают 30-40% урожая злаковых культур. Если говорить о наиболее опасных заболеваниях грибной этиологии на зерновых, то, прежде всего это различные виды ржавчины: стеблевая, бурая и желтая. Изучение ключевых ферментов обмена глютамата, в норме и при стрессовых условиях у важнейших злаковых культур Казахстана, открывают новые пути для управления процессами, которые определяют, в конечном счете, биологическую продуктивность, его качество, и устойчивость растений к стрессовым условиям, таким как засоление и ржавчинные заболевания. Цель, объекты, предмет и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование ключевых ферментов обмена глютамата, их активности в ходе онтогенеза пшеницы и у сортов и генотипов злаковых культур, различающихся по устойчивости к засолению, высокой температуре и ржавчине. Объектами исследования являлись различные сорта и генотипы пшеницы (Triticum aestivum L.), (Triticum durum Desf.), ячменя (Hordeum vulgare L.), риса (Oriza sativa L.) и кукурузы (Zea maize L.). Предметами исследования являются семена злаковых культур и листья, стебли, корни, колосковые чешуйки, пшеницы. Для достижения поставленной цели, нами решались следующие задачи: -выяснить механизмы активации НАДФ-ГДГ-сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы; -получить гомогенные препараты ФК МДГ-ГОАТ из семян пшеницы и определить его полипептидный состав; -выявить активность ФК МДГ-ГОАТ у организмов, различающихся в эволюционном плане; -установить роль активности ФК МДГ-ГОАТ в онтогенезе злаковых культур. -исследовать активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы, ячменя и риса, различающихся по устойчивости к засолению и у сортов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчине. Научная новизна работы: -физико-химическими методами был установлен механизм активация НАДФ-ГДГ-сферосом при прорастании и созревании зерна пшеницы. Установлена КМ НАДФ-ГДГ сферосом равная 1 мкМ, что говорит об очень важной роли этого фермента в ассимиляции азота; -получен гомогенный препарат ФК из покоящегося зерна пшеницы, который состоит из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа, что свидетельствует о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами, геном малатдегидрогеназы и геном глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы; -установлено, что ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, он имеется только у эволюционно молодых растений; -выявлена активность ФК МДГ-ГОАТ в онтогенезе злаковых культур; -определены активности ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы, ячменя и риса, различающихся по устойчивости к засолению и у сортов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчине. 4 Основные положения, выносимые на защиту: -под воздействием фузикокцина активируется протонная АТФ-аза, осуществляющая транспорт ионов кальция в цитоплазму алейроновых клеток зерна пшеницы. Затем ионы кальция совместно с низкомолекулярным регулятором, вызывают активацию фосфокиназы «С», которая в свою очередь приводит к активации строго НАДФ специфичной ГДГ-сферосом; -гомогенные препараты ФК из покоящегося зерна пшеницы состоят из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа, что свидетельствует о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами, геном малатдегидрогеназы и геном глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы; -ФК отсутствует у микроорганизмов, в водорослях, низших растениях и эволюционно древних высших растениях и является эволюционно молодым белковым комплексом, который имеется у эволюционно молодых растений; -активность ФК играет очень важную роль при прорастании и созревании зерна пшеницы – важнейшие этапы морфогенеза злаковых культур; -устойчивые генотипы злаковых культур активируют ФК в ответ на засоление, и к ржавчине, тогда как неустойчивые к засолению генотипы не обладают такой способностью. Методы исследований. В ходе исследовании были применены следующие методы: хроматографии, спектрофотометрии, SDS-электрофореза, электронной микроскопии, и масспектрометрии. Были разработаны и применены методы изучения НАДФ-ГДГ-сферосом, очистки регулятора и ФК МДГ-ГОАТ, и методика определения активности АТФ-азы плазматических мембран из алейроновых слоев семян пшеницы. Все результаты, полученные в ходе исследовании, были обработаны и проанализированы с помощью компьютерных программ, а для их интерпретации и обсуждения использовались литературные источники из отечественной и зарубежной литературы, периодики, Интернет порталы, сайты и др. Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы получили апробацию на следующих международных научных форумах таких как: Международной биохимической конференции (Ташкент, 2006г.); на Конгрессах Федерации европейских биохимических обществ (ФЕБО): 31-ом, конгрессе (Стамбул, 2006); 32-ом конгрессе (Вена, 2007); 33-ем конгрессе (Афины, 2008); Международном симпозиуме «Азот-2007» (Ланкастер, 2007); во 2-ом Международном симпозиуме «Ростовые вещества растений: внутриклеточные гормональные механизмы и их применение в агрономии» (Киев, 2007); V-ой Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2007); Всемирном конгрессе Науки, Инжиниринга и Технологии (Венеция, 2007); а также в семи научнопрактических и международных конференциях Казахстана таких как: IV Международных научных конференциях молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии» (Алматы, 2006, 2008); Международный Конгресс студентов и молодых ученых, «Мир науки» Казахстанские химические дни-2007 (Алматы, 2007); Труды V международной 5 научно-практической конференции, «Социально-гуманитарные проблемы современного образования», (Талдыкорган, 2007); «Қазақстаннын биологиялық қауіпсіздігін қамтамасыз ету мәселелері», ЕМК «Ботаника және фитоинтродукция Институты», (Алматы, 2008); Международной научнопрактической конференции «Биоразнообразиe и устойчивое развитие природы и общества», посвященная 75-летию КазНУ им. аль-Фараби и 75-летию биологического факультета. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты настоящей диссертационной работы в значительной степени расширяют теоретические представления об основных ферментах обмена глютамата, и о процессах которые определяют белковую продуктивность злаковых культур. На основе полученных результатов предлагается применить активность ФК для отбора жизнеспособных семян злаковых культур. Активность ФК в определенной степени может служить маркерным признаком устойчивости генотипов пшеницы и ячменя к засолению, высокой температуре и ржавчинным болезням. Объем и структура работы. Диссертация состоит из обозначений и сокращений, введения, обзора литературы, раздела, описывающего материалы и методы исследований, содержащих результаты исследований и их обсуждения, заключения и списка использованных источников из 168 наименований. Текст изложен на 93 страницах. Работа проиллюстрирована 18 рисунками и 15 таблицами. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ Выбор направления исследований Ключевые ферментативные реакции процессов ассимиляции азота и обмена центральной аминокислоты азотного обмена - глютамата, являются одними из главных звеньев в метаболизме высших растений. Именно глютамат является донором аминогруппы для синтеза всех аминокислот. Глютамат также является той аминокислотой, которой аккумулируется минеральный азот. В ходе онтогенеза обмен глютамата претерпевает ряд существенных морфогенетических изменений, и их познание открывает пути для управления процессами, которые определяют продуктивность злаковых культур. Поэтому целью настоящего исследования является познание основных этапов функционирования обмена глютамата. Изучение ключевых ферментов, осуществляющих реакции обмена глютамата в норме и при стрессовых условиях у важнейших злаковых культур Казахстана, открывают новые пути для управления процессами, которые определяют, в конечном счете, биологическую продуктивность, его качество, и устойчивость растений к стрессовым условиям, таким как засоление и ржавчинные заболевания. В обзоре литературы приводятся сведения, отражающие состояние изучаемой проблемы, ее актуальность и современный взгляд ученых всего мира на энзимологические механизмы азотного обмена и новые научные подходы их изучения на молекулярно – генетическом уровне. 6 Метод изучения НАДФ-ГДГ-сферосом Схема очистки сферосомы включала: растирание на холоду в фарфоровой ступке в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,8, взятого в четырехкратном объеме (мл) по отношению к навеске чешуй (г). Гомогенат центрифугировали при 10000g в течение 10 мин. Осадок отбрасывали, а в бесклеточный экстракт для осаждения нуклеиновых кислот и хлорофилла добавляли стрептомицин сульфат в соотношении 1:5. Через 2 часа экстракт центрифугировали 10 мин при 8000g для осаждения зеленых пигментов, нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Супернатант пропускали через колонку с сефадексом G-50 для освобождения стрептомицин сульфата и низкомолекулярных соединений. После чего проводили ионообменную хроматографию на DEAE целлюлозе, типа DE-52, фирмы "Watman", (Великобритания). В качестве заключительной стадии очистки применяли аффинную хроматографию на 2,5 ADP-сефарозе, фирмы Pharmacia (Швеция). Эта стадия очистки позволяла полностью очистить НАДФ-ГДГ от примесей НАД-ГДГ. Имея гомогенные препараты НАДФ-ГДГ, мы смогли перейти к изучению очень важного вопроса определения субъединичного состава этого фермента. С этой целью очищенный препарат НАДФ-ГДГ кипятили 5 минут в 0.05М трисглициновом буфере, рН-8.3, в присутствии 0,1% 2-меркапто-этанола и 0.1% SDS, после чего смесь подвергали SDS- электрофорезу в ПААГ по Laemmli (1970) [161]. Активность глютаматдегидрогеназы определяли по реакции восстановительного аминирования 2-оксоглютарата по изменению адсорбции при длине волны 340 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, AmershamBioscience. Для проведения реакции брали реакционную смесь следующего состава: 0,0002 М НАДН, 0,02 М 2-оксоглютарата и 0,225 М NH4CI. Объем реакционной смеси доводили 0,1 М трис-HCI буфером рН 8,3 до 2 мл. Скорость ферментативной реакции определяли изменением за 1 мин. Удельную активность рассчитывали в мкМ окисленного НАДН на 1 мг белка. Метод очистки регулятора Схема очистки регулятора включала следующие стадии: гомогенизацию, центрифугирование, гидрофобную хромотографию на колонке с октилсефарозой CL- 4B и обратно-фазовую хроматографию на колонке типа RP18. Для очистки брали 2 кг семян пшеницы сорта «Арай», которые замачивали в водопроводной воде содержащей 1 мМ СаCl2 и 0,1 мМ 6-БАП, который необходим для активации образования регулятора в зародышах прорастающих семян пшеницы. Спустя сутки семена трехкратно промывали дистиллированной водой, после чего просушивали их под вентилятором от остатков влаги и затем семена гомогенизировали на ножевом гомогенизаторе типа MPW-309 Mechanika Precyzyina (Польша) в 4 литрах 70% этанола. Гомогенат фильтровали через капроновую ткань, и фильтрат центрифугировали в течение 10 минут при 10000 х g. Супернатант наносили на колонку с октилсефарозой CL- 4B. Гидрофобная хроматография спиртового экстракта из проросших семян пшеницы сорта «Арай» на колонке с октилсефарозой CL-4B. Размер колонки 3,5х20 см. Колонку уравновешивали 10 % этанолом. Отмывку 7 от не связавшихся веществ проводили 10%-ным этанолом. Регулятор смывали элюцией 50% этанолом, после чего колонку промывали 80% этанолом для освобождения колонки от адсорбированных на ней веществ. Затем пик содержащий регулятор подвергали обратно-фазовой хроматографии на колонке типа RP18. Методика определения активности АТФ-азы плазматических мембран из семян пшеницы Целые семена пшеницы замачивали в растворе регулятора и через 2 часа отрезали зародышевые части зерна, которые растирали в трис–НCl буфере, pH7,4. Гомогенат центрифугировали и полученный бесклеточный экстракт содержащий 14-3-3 белки использовали для опыта. Спектрофотометрическое определение Н+-АТФ-азной активности проводили таким образом: к 0,2 мл полученного супернатанта приливалось 1,7 мл 0,025М трис-НCl, pH-8,0. Инкубировали в течении 30 минут при 25˚С и добавлялось 0,1 мл Са2+ и Mg2+ с конечными концентрациями в пробирке 0,003М. В контрольные пробирки вносили по 1 мл 20% ТХУ. Затем пробирки оставляли на 1 час в термостате при 25˚С после чего для прекращения реакции в опытную пробирку добавляют по 1мл 20% ТХУ. Содержимое пробирок фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат использовали для определения фосфора. Для этого к 0,2мл фильтрата добавляем 0,2мл железно-молибдатного реактива и 1,6мл трис-НCl буфера, pH-8,0. Инкубируем 15 минут, и замеряли поглощение при 660нм. Спектрофотометрический метод определения активности ферментного комплекса (ФК МДГ-ГОАТ) Нами впервые был разработан спектрофотометрический метод определения активности ФК МДГ-ГОАТ. Реакционная смесь для определения ФК содержала 1,1мМ NAD, 12мМ малата и 87мМ глутамата натрия и реакционная смесь доводилась до объема 2 мл 0,05М трис-глициновым буфером, рН 7,7. Процедура определения активности ФК имеет свои особенности. Сначала мы в течение 1-2 минут определяли базовую активность малатдегидрогеназы. Для этого реакционная смесь содержала все ингредиенты кроме глутамата, и только после определения базовой активности добавляется глутамат. Активность ФК определяется по приросту активности после добавления глутамата. Для определения активности от конечной активности отнимали активность МДГ. Активности обеих реакции рассчитывали по изменениям адсорбции за одну минуту. Также необходимо было провести спектрофотометрическое определение активности ГДГ в реакции восстановительного аминирования. Для определения активности ФК теперь необходимо вычесть активность ГДГ в реакции окислительного дезаминирования глютамата. Для этого полученную активность ГДГ делим на 12, так как для этого фермента характерно постоянное соотношение скоростей прямой и обратной реакции равное 1/12. В результате, чистая активность ФК 8 определяется путем определения полной активности в реакционной смеси с вычетом активности МДГ и ГДГ. Так, как описание методов выделения и очистки ФК из изучаемых объектов относится к результативной части, то их описания будут приведены в главе «Результаты исследования и их обсуждение». Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом по Бэйли (1965) при длине волны 330 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, Amersham-Bioscience и по методу Брэдфорда. Все опыты проводились в 6-7 кратной повторности, и в таблицах приводится данные наиболее типичного из опытов. Все результаты были подвергнуты стандартной статистической обработке. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГДГ сферосом и её регуляция В Институте Молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина в лаборатории структуры и регуляции ферментов впервые было изучено строение и функция сферосом неизученных органелл растительной клетки. Впервые было установлено, что сферосомы на 70% - тов состоит из ГДГ и 30% из одного фосфолипида- фосфатидилинозитола (ФИ). Нами было проведено изучение регуляции ГДГ сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы и других злаковых культур. В основе разработанного метода лежит метод описанный Р. Дильбаркановой и М.К. Гильмановым. Так как, белковый компонент сферосомы составляет более 2/3 от массы сферосомы, то необходимо было более детально изучить его. С этой целью белковый компонент сферосомы был подвергнут SDS–электрофорезу по Laemmli (1970). Для разделения был использован плоский 12% полиакриламидный гель. Окраску белковых зон проводили красителем Кумасси Blue R-250. Было установлено, что в составе сферосомы имеется лишь 1 полипептид с молекулярной массой 52 кДа. Эти результаты еще раз подтвердили наличие в сферосоме лишь одного белка – глютаматдегидрогеназы. Нами было сделано лишь уточнение молекулярной массы субъединиц этого белка, которое оказалось равным 52 кДа. Ковалентно присоединенный к ГДГ фосфатидилинозитол выполняет роль своеобразного якоря. Благодаря наличию этого «якоря» в своем составе ГДГ заякоривается только на фосфатидилинозитольных мембранах вследствие полного стерического соответствия фосфатидилинозитолам мембраны. При встрече молекулы глютаматдегидрогеназы с фосфатидилинозитольной везикулой происходит погружение гидрофобных диацильных хвостов «якоря» ГДГ в фосфатидилинозитольную мембрану и якорь прочно удерживается в мембране благодаря гидрофобному взаимодействию между близко стоящими диацильными хвостами фосфолипидов мембраны. Белок ГДГ ковалентно соединен с «якорем» через длинную гибкую гликановую цепочку, благодаря чему фермент имеет определенную подвижность. В конечном счете, 9 многочисленные молекулы ГДГ полностью покрывают толстым слоем всю поверхность сферосомы. Большой интерес представляет изучение воздействия ионов кальция на активность ГДГ сферосомы. Для этого были поставлены следующие опыты. К препарату высокоочищенных сферосом добавляли 1/10 от объема сферосом раствор 10 mM CaCl2 и через 30 минут инкубации сферосомы освобождали от не связавшихся ионов кальция гель-хроматографией на колонке с Сефадексом G-50. Явилось интересным изучить, влияют ли ионы кальция на структуру сферосом. Для этого применили метод электронной микроскопии. Действие ионов кальция приводит к сильному изменению структуры сферосомы – появлению в белковой оболочке ряда своеобразных отверстий. Естественно, что такое сильное изменение структуры сферосом связано с соединением ионов кальция с сайтами EF-hand loop motifов в ГДГ сферосом. Нами показано, что интактные сферосомы (на которые ионы кальция не действовали) не проявляют никакой ГДГ активности. Было проведено изучение активности ГДГ сферосом после действия ионов кальция. Проведенные нами прямые замеры активности глютаматдегидрогеназы после воздействия ионов кальция на сферосомы, показали равные как с НАДН так и с НАДФН в качестве кофермента активности глютаматдегидрогеназы равной 10 мкМ на мг белка, в мин. Теперь встал вопрос о том, что раз ГДГ регулирется ионами кальция, то необходимо было найти регулятор который увеличивает концентрацию ионов кальция в цитоплазме. Б.Е. Султанбаевым с соавторами впервые было установлено, что в прорастающих зародышах пшеницы под воздействием цитокинина образуется регулятор, который увеличивает содержание ионов кальция в цитоплазме. Так как свойства этого регулятора не были изучены, то возникла острая необходимость их изучения. Для изучения регулятора необходимо было разработать эффективный метод его очистки. За основу метода очистки регулятора был принят метод Б.Е. Султанбаева. Главной особенностью разработанного нами метода является то, что мы впервые для более высокой очистки регулятора, применили метод обратно-фазовой хроматографии на колонке типа RP18, что позволило получить гомогенный препарат регулятора незагрязненный другими фитогормонами. При обратно-фазовой хроматографии регулятор элюировался в первом пике. В результате нами был получен высокоочищенный препарат регулятора. Имея гомогенный препарат регулятора, нами была изучена его структура. Структура регулятора была установлена методом масспектрометрии на масспектрометре марки Agilent 1100 с ионной ловушкой типа Esquire 3000 plus (США). Анализ был проведен в Институте Биомедицинской Химии им. В.Н. Ореховича. Было установлено, что по своему масс-спектру регулятор является фузикокцином. Как ранее было установлено, что в беззародышевой части зерна в алейроновом слое находится сферосома. Мы изучили действие фузикокцина на беззародышевые половинки сухих семян зерна пшеницы сорта «Стекловидная10 24». Как показал опыт фузикокцин не вызывал появление НАДФ-ГДГ сферосом. Для установления причины этого мы изучили литературу по фузикокцину. Из данных литературы известно, что фузикокцин осуществляет активацию ионного транспорта только вместе с 14-3-3 белками. Известно, что фузикокцин активирует Н+-АТФ-азу плазматических мембран клеток растении. Для изучения свойств нового природного биорегулятора - мы решили испытать его действие на АТФ-азную активность плазматических мембран из алейроновых клеток семян пшеницы. Было установлено, что регулятор не активировал АТФ-азу плазматических мембран алейроновых клеток, когда он действовал на изолированные беззародышевые части зерна пшеницы. В то же время активация АТФ-азы имело место, если регулятор действовал на целое зерно. Это говорит о том, что регулятор в зародышах семян пшеницы индуцировало синтез другого регулятора. Таким регулятором является, скорее всего, 14-3-3 белки, которые необходимы для действия фузикокцина. Для выделения этих белков из зародышевой части семян пшеницы мы провели следующий опыт. Целые семена пшеницы замачивали в растворе регулятора и через 2 часа отрезали зародышевые части зерна, которые растирали в трис–НCl буфере, pH7,4. Гомогенат центрифугировали и полученный бесклеточный экстракт, содержащий 14-3-3 белки использовали для опыта. Обработка этим препаратом беззародышевых частей зерна не приводило к активации АТФ-азы. Это говорит о том, что 14-3-3 белки сами по себе не могут активировать АТФ-азу. Активация достигалось лишь тогда, когда этот препарат действовал совместно с регулятором. Результаты этих исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 – Влияние регулятора на активность АТФ-азы плазматических мембран из беззародышевой части семян и из целого зерна пшеницы Варианты Активность АТФАктивность АТФазы плазматических азы плазматических 2+ мембран с ионами Mg мембран с ионами Ca2+ мкМ Pi /мг белка мкМ Pi /мг белка без с без с регулятора регулятором регулятора регулятором Беззародышевые 180 ± 21 250 ± 55 140 ± 26 280 ± 53 части Целое зерно 200 ± 36 160 ± 41 400 ± 32 Таким образом, активация АТФ–азы осуществляется регулятором совместно с 14-3-3 белками. Была изучена катионная специфичность активируемой АТФ-азой и было установлено, что она является Са2+ зависимым ферментом. Катионная специфичность активированного регулятора и 14-3-3 белками 11 АТФ-азы говорит о том, что именно этот фермент повышает уровень цитозольного кальция в клетке. Таким образом, мы предположили, что фузикокцин действуя на прорастающий зародыш в злаках, вызывает образования в нем 14-3-3 белков или их аналогов. Только затем они, действуя совместно на алейроновый слой, вызывает в нем активацию НАДФ-ГДГ сферосом. Для проверки нашего предположения был поставлен следующий опыт. Был получен раствор нашего фузикокцина в концентрации 20 ng/ml. В этом растворе были замочены целые семена пшеницы и через 24 часа у проросших семян пшеницы были удалены зародышевые части, и из беззародышевых половинок семян была выделена фракция сферосом, гель - хроматографией на колонке с сефарозой 4В. Изучение ГДГ активности выделенных сферосом показала, что она имеет высокую НАДФН-ГДГ активность (около 50мкМ НАДФ на мг белка в минуту). В то же время выделенная фракция сферосом не проявляла никакой НАДH активности. Таким образом, становится совершенно ясным, что активация НАДФ-ГДГ сферосом алейронового слоя семян злаков регулируется фузикокцином и каким-то другим низкомолекулярным регулятором вероятнее всего 14-3-3 белками. Так как, наше исследование не является биохимическим, то решение вопроса о природе этого регулятора не входила в задачи этого исследования. Очень важным явилось изучить особенности сферосом выделенных из активно ассимилирующих органов. Наиболее ассимилирующим органом растений являются созревающие семена растений. Поэтому мы решили выделить сферосомы из семян пшеницы и кукурузы в фазу их молочновосковой спелости. Для выделения сферосом мы впервые применили новый метод очистки с использованием нового наноструктурированного углеродного сорбента типа нанокарбосорб, который был разработан под руководством профессора З.А. Мансурова в Институте проблем горения при КазНУ им. аль-Фараби. Было установлено, что сферосомы выделенные из созревающих семян из пшеницы и кукурузы имеют высокую НАДФН-ГДГ активность и не проявляли никакой НАДH-ГДГ активности. Было определено константы Михаэлиса к ионам аммония выделенных сферосом. Установлено, что Км для ионов аммония НАДФН-ГДГ сферосом из созревающих семян пшеницы и кукурузы был равен около 1 мкМ ионов аммония. Это говорит об очень высоком сродстве к ионам аммония НАДФН ГДГ сферосом из выделенных из созревающих семян злаков. Таким образом, получены неопровержимые доказательства участия НАДФН - ГДГ сферосом в ассимиляции аммония в созревающих семенах злаков. Так как, в активации НАДФН - ГДГ играют большую роль протеинкиназа «С» мы решили проверить, как проявиться дефосфорилирование ГДГ сферосом выделенных из созревающих семян злаков на их НАДФН и НАДН активности. Для этого мы воздействовали на выделенные НАДФН-ГДГ сферосомы пшеницы и кукурузы препаратом щелочной фосфатазой из кишечника цыпленка. (Фирма Sigma, США). После дефосфорилирования активность НАДФН-ГДГ снизилась два раза и появилась равная ей НАДН-ГДГ активность. 12 То есть, это активности, которые возникают при активации латентной ГДГ– сферосом ионами кальция. Таким образом, мы можем предположить, что в созревающих колосьях пшеницы и в созревающих початках кукурузы под воздействием цитокинина сначала происходит образование фузикокцина, затем под воздействием фузикокцина образуется 14-3-3 белки или их аналоги. После совместного воздействия фузикокцина и 14-3-3 белков увеличивается уровень ионов кальция в цитоплазме и активируется фосфокиназа «С», что приводит к активации НАДФН-ГДГ сферосом в созревающих семенах злаковых культур. Именно этот фермент играет главную роль в ассимиляции минерального азота в созревающих семенах злаковых культур в самый ответственный момент морфогенеза растений. Путь ассимиляции азота через НАДФН–ГДГ сферосом является наиболее экономичным и простым, по сравнению с путем через систему ГС-ГОГАТ. Для ассимиляции аммония через оксоглютарат требуется лишь один эквивалент НАДФН, который легко синтезируется при фотосинтезе зеленых в колосьях злаков. В то же время для ассимиляции аммония через систему ГС-ГОГАТ требуется один эквивалент НАДН и один эквивалент АТФ. А эти энергетические кофакторы образуются лишь при дыхании, которое идет в ночное время. О преимуществе пути ассимиляции неорганического азота через путь, катализируемый, НАДФН-ГДГ сферосом говорит простой, но очень эффективный опыт профессора А.Н. Павлова. Он затемнял созревающие колосья пшеницы, но оставлял незатемненными листья и стебли, в которых сосредоточен основной фотосинтетический аппарат растения. Самым удивительным оказалось, то, что при затемнении созревающих колосьев уменьшало более чем в два раза содержание белка в созревших семенах. Этот опыт говорит о важной роли фотосинтеза именно колосьев для накопления белка. Этим же ученым была установлена связь между содержанием цитокининов в колосьях и продуктивностью сортов пшеницы. То есть, было установлено, что имеется прямая корреляция между содержанием цитокинина и продуктивностью различных генотипов пшеницы. Наши исследования теперь непосредственно впервые проливают свет на связь цитокининов с белковой продуктивностью злаковых культур. Таким образом, очень важный процесс ассимиляции азота в созревающих семенах злаковых культур находится под прямым контролем цитокинина, одного из важнейших фитогормона растений. Известно, что цитокинин играет исключительно важную роль в процессах морфогенеза растений. Таким образом, активность НАДФН–ГДГ-сферосом является очень важной для формирования семян растений. Так как НАДФ-ГДГ связано со сферосомами, а сферосомы имеются только в семенах то естественно, что НАДФ–ГДГ играет ключевую роль только при прорастании и созревании семян. Поэтому НАДФ-ГДГ не был обнаружен в других органах растения. Таким образом, можно придти к заключению о том, что НАДФН-ГДГсферосом играет важную роль в ассимиляции минерального азота в наиболее 13 важные этапы морфогенеза растении - при прорастании и созреваний семян злаков и её активность очень важна для формирования белковой продуктивности. Изучение свойств ферментного комплекса МДГ-ГОАТ В Институте молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина в лаборатории структуры и регуляции ферментов был открыт новый ферментный комплекс, состоящий из малатдегидрогеназы и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы. Авторами была постулирована следуящая последовательность реакции катализруемых ФК: сначала МДГ окисляет малат с помощью кофермента НАД до оксалоацетата, при этом кофермент НАД восстанавливается до НАДH. Затем ГОАТ осуществляет реакцию переаминирования глютамата с оксалоацетатом, образуя при этом аспартат и 2-оксоглютарат. Особо следует отметить, что в ходе этой реакций расщепление глютамата происходит без выделения аммиака, которое имеет место при расщеплении глютамата глютаматдегидрогеназой. Очистка ФК МДГ-ГОАТ из пшеницы Для определения размерности генов кодирующих ФК в первую очередь необходимо было получить гомогенный препарат ФК. Схема очистки ферментного комплекса включала следующие этапы: гомогенизацию, центрифугирование, осаждение сульфатом аммония (30-70%), обессоливание на сефадексе G-50, ионообменная хроматография на ДЕАЕ целлюлозе, DE-52 и гель-хроматография на колонке с Сефакрилом S-300. Ферментный комплекс выделяли из сухих семян пшеницы сорта Казахстанская-10. Для выделения ФК навеску 10 г размолотого зерна пшеницы тщательно растирают в 0,05М трис-HCl буфере, рН 7,5 взятом в соотношении 1:4, (вес к объему), затем гомогенат центрифугируют при 10 000хg в течение 20 минут. Полученную надосадочную жидкость освобождали от низкомолекулярных примесей в том числе и от эндогенных субстратов гельхроматографией на колонке с Сефадексом G-50, размером (3,5x20см). Затем фракции, содержащие активность ФК, наносят на колонку с ДЭAЭ-целлюлозой типа DE-52, предварительно уравновешенную буфером для выделения, размером (5х2 см), Фирма Ваттман (Англия). Для удаления не связавшихся белков колонку элюируют стартовым буфером. После удаления балластных белков проводят ступенчатую элюцию сначала 0,1М NaCl в том же буфере и затем 0,5М NaCl, который элюировал ФК с колонки (рисунок 1). Фракции пика содержащей активностью ФК после ионообменной хроматографии наносили на колонку с Сефакрилом S-300 с размером колонки (2х95см). Хроматографическое разделение контролировалось прибором Uvicord SU, 2238, LRB (рисунок 2). 14 Рисунок 1 - График элюции белка из пшеницы сорта Казахстанская-10 на колонке с ДЕАЕ типа ДЕ-52 Рисунок 2 - Гель-хроматография ФК МДГ-ГОАТ из пшеницы сорта «Казахстанская-10» на колонке с Сефакрилом S-300 Имея препарат ФК не содержащий никаких примесей ГДГ в первую очередь, нам необходимо было установить, действительно ли выделенный ферментный препарат осуществляет те реакций, которые были постулированы для ФК. С этой целью полученный ферментный препарат инкубировали в 15 течение 30 минут в реакционной смеси, которая содержала субстраты ФК NAD, малат и глютамат. Затем инкубационную смесь кипятили. В кипяченной реакционной смеси с помощью тонкослойной хроматографии нами был обнаружен аспартат. С помощью гомогенной ГДГ животных (Sigma) определяли содержание 2-оксоглютарата, и было обнаружено, что действительно конечным продуктом реакции ФК является 2-оксоглютарат. В то же время с помощью фирменного препарата МДГ (Sigma) мы не смогли обнаружить оксалоацетат. Это говорит о том, что этот промежуточный продукт вероятнее всего не выходит из активных центров ФК и поэтому не может накапливаться, что говорит об очень близком расположении активных центров МДГ и ГОАТ в ФК. Вследствие этого оксалоацетат практически не покидает ФК. Так как, оксалоацетат не накапливается, то поэтому реакции, катализируемые, ФК имеют однонаправленный и необратимый характер. Таким образом, ФК катализирует реакции, который носит катаболический характер для глютамата и анаболический характер для аспартата. Изучая совокупность реакции, катализируемых ФК можно придти к выводу о том, что ФК катализирует новый эффективный путь синтеза аспартата в растениях. По известным молекулярным массам определяют их логарифмы и строили калибровочный график. Активность ФК выходила во фракции в соответствующей молекулярной массе 110 кДа, как это было установлено гельхроматографии на той же колонке белков-метчиков с известными молекулярными массами. Для построения калибровочного графика использовались белки с молекулярными массами: ферритин - 440 кДа, каталаза - 232 кДа, лактатдегидрогеназа - 140 кДа, ферментный комплекс - 110 кДа, алкогольдегидрогеназа - 73 кДа, гемоглобин - 64 кДа, цитохром - 12,3 кДа. Были изучены основные физико-химические свойства ФК из пшеницы. В первую очередь был проведен SDS-электрофорез по Laemmly (1970). Электрофорез проводился с присутствием белков-метчиков с известными молекулярными массами. Определение молекулярной массы показало, что ФК состоит из двух гетерологичных субъединиц с молекулярными массами 60 кДа и 50 кДа соответственно. Из данных литературы известно, что все известные МДГ имеют размер полипептидной цепи равной 60 кДа из этого можно сделать вывод о том, что полипептид с молекулярной массой 60 кДА относится к МДГ, а 50 кДа относится к ГОАТ. Таким образом, гены ФК кодируют две полипептиды 60 кДа и 50 кДа. Мы можем сделать вывод о том, что эти гены находятся рядом так, как продукт генов ФК является единым. Одним из самых интересных вопросов явилось изучить особенности ФК у растений, различающихся в эволюционном плане. Мы провели изучение ФК в водорослях, грибах, мхах, хвощах, плаунах, папоротниках, и голосемянных растениях, таких как сосна, ель и кедр. Ни в одном из этих эволюционно старых растений обнаружить ФК нам не удалось. Мы так же не обнаружили активность ФК ни в семенах, ни в проростках лилии, которая является одним из первых цветковых растений на Земле. Также ФК не было обнаружено в 16 микроорганизмах и в клетках животных. Это говорит о том, что ФК имеется только у эволюционно молодых высших растениях. Однако, небольшая активность ФК была обнаружена в розоцветных яблоках и грушах, сравнительно высокая активность ФК была обнаружена в бобовых - горохе и фасоли, и высокая активность ФК была обнаружена в тыквенных и злаковых растениях, как это видно из таблицы 2. Таблица 2 - Активность ферментного комплекса [МДГ-ГОАТ] у растений, различающихся в эволюционном плане Вид растения Яблоко Горох Фасоль Тыква Пшеница Ячмень Рис Кукуруза Активность ФК МДГ-ГОАТ, мкМ/мг 28,22 ± 0,84 148,67 ± 3,71 194,35 ± 3,89 469,35 ± 9,38 248,3 ± 4,96 206,77 ± 4,13 347,04 ± 6,94 503,08 ± 15,09 Полученные результаты говорят о том, что ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, и о возможности использования активности ФК для установления эволюционных взаимоотношений различных семейств растений. До настоящего времени активность ФК изучалась только в покоящемся семени пшеницы, и поэтому было необходимо изучить активность ФК при различных фазах морфогенеза. Поэтому сначала была изучена активность ФК при прорастании семян различных злаковых культур: пшеницы, ячменя, кукурузы и риса. Было установлено, что активность ФК повышается в 2 раза в зародыше пшеницы уже на 6 час прорастания и остается на высоком уровне в течение 4-х суток. В то время как в эндосперме зерна пшеницы активность ФК меняется незначительно, эти данные говорят о важной роли ФК в энергетическом обеспечении быстро растущего зародыша. Наиболее существенные изменение в активности ФК связаны с фазой созревания семян. Было изучено активность ФК в стеблях, листьях, колосковых чешуях и семенах пшеницы сорта “Арай" по мере их созревания (Таблица 3). Как видно из таблицы 3 для фазы формирования и налива зерна характерны очень высокая активность ФК для всех органов. А уже в фазы молочно-восковой и полной спелости зерна происходит уменьшение активности ФК в стеблях, листьях и колосковых чешуях, тогда как в семенах она остается высокой. 17 Таблица 3 – Активность ФК по органам в 3-х фазах созревания (молочной - I, молочно-восковой – II и полной спелости - III) пшеницы сорта “Арай” Органы пшеницы Фазы растения Стебель Листья Колосковые чешуйки Зерно I Активность ФК МДГ-ГОАТ в мкМ НАДН/мл II III Активность ФК МДГ-ГОАТ в мкМ НАДН/мг II III I 295± 12.6 300± 13.5 203± 8.9 234± 11.7 96.5±5.3 12.9± 2.6 217± 10.5 150± 6.7 43± 7.0 8.06± 1.6 314± 13.8 180± 9.7 3.2± 0.4 165± 7.9 2.6± 0.4 697± 15.7 606± 14.7 238± 11.6 546±10.9 464± 8.6 485± 9.1 364± 6.6 Таблица 4 – Активность ГДГ по органам в 3-х фазах созревания (молочной - I, молочно-восковой – II и полной спелости - III) пшеницы сорта “Арай” Органы Активность пшеницы ГДГ в мкМ НАД/мл Фазы I II III растения Стебель 1,61± 0.3 3,55± 0.56 - 1,27± 0.2 2,63± 0.1 - Листья Чешуйки 3,22± 0.6 1,93± 0.33 6,77± 0.48 4,19± 0.61 - 2,33± 0.41 1,46± 0.28 3,05± 0.18 3,84± 0.1 - Зерно 5,80± 0.45 12,9± 0.8 14,8± 3.2 I Активность ГДГ в мкМ НАД/мг II III 3,86± 0.52 10,3± 0.2 9,8± 0.23 Из таблицы 4 становится, очевидным, что активность ГДГ, которая до нашего исследования считалось основным ферментом обмена глютамата в сотни раз меньше активности ФК. Это говорит о том, что ФК, а не ГДГ играет первостепенную роль в азотном обмене злаковых культур. Полученные результаты свидетельствует об очень важной роли ФК в процессах формирования и налива зерна и об её важной роли мобилизации и оттока ассимилятов из ассимилирующих органов в созревающее зерно в этот очень важный период жизни растении. Об этом также свидетельствует высокая активность ФК в зерне на протяжении всей фазы созревания. Аналогичная картина была получена при изучении активности ФК в ходе созревания ячменя. Таким образом, активность ФК коррелирует с наиболее важными фазами в 18 онтогенезе растении и в первую очередь они связаны с фазами прорастания и созревания семян злаковых культур. Учитывая важную роль ФК в катаболизме глютамата и синтезе аспартата, явилось очень важным изучить связь активности ФК с жизнеспособностью семян пшеницы. Для этого были взяты семена двух сортов пшеницы с различной всхожестью, так семена пшеницы сорта «Дербес» имели всхожесть- 96%, а семена пшеницы сорта Опакс -14 %. Анализировались 7-дневные проростки изучаемых сортов пшеницы. Активность ФК определялась отдельно в корешках и колеоптилях. Было показано, что активность ФК, выраженная в мкМ-лях NADH на мл бесклеточного экстракта была равна для стебля и корешка сорта «Дербес», соответственно 166 мкМ на мг/белка и 152 мкМ на мг/белка, а для сорта «Опакс» 80 мкМ на мг/белка и 66 мкМ на мг/белка. Как видно из приведенных данных более жизнеспособный сорт «Дербес» имел активность в 2 раза выше, чем менее жизнеспособный сорт «Опакс». Таким образом, можно сделать предположение о том, что активность ФК в определенной степени может служить диагностическим признаком для отбора жизнеспособных семян злаковых культур. Изучение активности ФК МДГ-ГОАТ генотипов злаковых культур различающихся по солеустойчивости Ранее нами была установлена, важная роль ФК в азотном и энергетическом метаболизме злаковых культур. Из этого следует, что этот очень важный ферментный комплекс должен играть немаловажную роль в процессах адаптации злаковых культур к абиотическим и биотическим стрессовым факторам. Известно, что при стрессовых условиях в растениях резко усиливаются катаболические процессы. До настоящего времени, считалось, что основным ферментом катаболизма глютамата является ГДГ. Этот фермент при стрессах играет отрицательную роль, так как одним из продуктов её реакции является аммиак. Накопление токсического аммиака приводит к деструкции клеточных мембран. Поэтому задачей нашего исследования явилось изучение активности ФК МДГ-ГОАТ генотипов злаковых культур различающихся по солеустойчивости. Здесь на первый план выдвигается ФК, который осуществляет катаболизм глютамата без выделения токсического аммиака. Поэтому крайне целесообразным явилось, впервые изучить активность этого фермента у генотипов различающиеся по устойчивости к ионному стрессу, что откроет пути для понимания процессов адаптации растений к засолению. С этой целью нами было проведено изучение солеустойчивости генотипов злаковых культур. Из них: 12 сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) – Казахстанская-10, Казахстанская-16, Казахстанская-126, Толкын, Надежда, Мирас, Арай, Дауыл, Стекловидная-24, Нуреке, Саратовская-29, Ырыс; 19 -14 сортов ячменя (Hordeum vulgare L.) – Иран-4470, Би-10, Бота, Дигаплоид, Арна, Унумли арпа, Асем, Жулдыз, Юбилейная, Табыс, Сауле, К142, Байшешек Одесская-100; -12 константных генетических линий ячменя – Б3 класс 54, Б2 класс 96, Б1 класс 71, Б7 класс 87, Б2 класс 40, Б4 класс 99, Б2 класс 84, Б8 класс 62, Б1 класс 1, Б4 класс 55, Б4 класс 13, Б4 класс 51; -8 сортов риса (Oryza Sativa L.) - Кубань, Маржан, Аналог, Мадина, Алакольский, Солнечный, Пак-ли, Заря. Результаты исследования таблицах 5-7. Определение солеустойчивости изучаемых генотипов осуществляли следующим образом. Семена изучаемых злаковых культур замачивали по вариантам в следующих растворах: 1 – Н2О (контроль); 2 - 1,5% или 2% NaCl (хлоридное засоление); 3 - 1,5% или 2% Na2SO4 (сульфатное засоление); 4 1,5% NaCl с 1,5% Na2SO4 (хлоридно-сульфатное засоление). Эти соли были выбраны потому, что они являются характерными для Казахстана, в особенности для Аральского региона. После замачивания семена раскладывали в чашки Петри на сырую фильтровальную бумагу смоченной солями каждого варианта. Затем растения проращивали в течение 5 дней в темноте и еще 5 дней на свету. После 10 дней проращивания определяли процент всхожести по вариантам, затем определяли среднюю длину стебля и корня каждого варианта, после чего отрезали стебель от корней и определяли массу стеблей и корней в отдельности по вариантам. Затем стебли и корни каждого варианта гомогенизировали в 0,05M трис-HCl буфере и центрифугировали при 10000g 10 мин. В бесклеточных экстрактах определяли содержание белка выраженную в мг/мл. Таблица 5 - Изучение солеустойчивости сортов пшеницы к хлоридному и сульфатному засолению Сорта пшеницы % прорастания в NaCl, Na2SO4 Длина листьев, см Длина стеблей, см 1 2 4 5 16,1 14,5 9,6 7,4 3,5 13,4 10,8 9,3 4,2 3,3 5.6 9.2 3.1 2.1 4.8 6.6 4.1 3.7 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская-10 96 92 92 90 90 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 71 93 69 44 Масса одного растения, мг 3 контроль 0,134 0,132 0,132 0,130 0,130 1,5% NaCl 0.130 0.143 0.120 0.093 20 Продолжение таблицы 5 1 Казахстанская-10 2 21 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская-10 100 93 77 73 71 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская-10 46 41 40 - Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская-10 86 98 71 66 53 3 0.084 1,5 Na2SO4 0,181 0,155 0,147 0,111 0,108 2% NaCl 0,123 0,098 0,096 2% Na2SO4 0,165 0,137 0,145 0,103 0,96 4 1.5 5 1.4 10,2 6,3 5,3 4,7 4,1 7,0 6,6 6,3 5,3 4,0 5,4 3,6 1,8 - 3,1 2,6 1,1 - 5,7 4,7 2,5 1,8 1,2 4,5 3,8 3,8 2,8 1,1 Как видно из таблицы 5, следующие сорта пшеницы – “Дауыл”, “Толкын”, “Арай” являются солеустойчивыми, а “Саратовская-29” и “Казахстанская-10” являются чувствительными к засолению. Как видно из таблиц следующие сорта пшеницы – “Дауыл”, “Толкын”, “Арай” являются солеустойчивыми, а “Саратовская-29” и “Казахстанская-10” являются чувствительными к засолению. Таблица 6 – Изучение солеустойчивости генотипов ячменя Генотипы 1 Б3 кл 54 Б1 кл 1 Б4 кл 51 Б8 кл 62 Б2 кл 96 Б7 кл 87 % прорастания на NaCl к контролю 2 89 80 80 90 52 58 Длина стебля (см) контроль 2% NaCI 3 8,7 9,8 11,0 10,2 6,5 7,1 4 4,5 7,2 9,5 9,8 2,4 3,3 21 Длина корня (см) контроль 2% NaCI 5 8,5 6,4 6,8 6,8 7,2 5,5 6 3,7 2,8 3,5 5,2 2,9 2,2 Продолжение таблицы 6 1 Б2 кл 84 Иран 4470 Би-10 Дигаплоид Бота Арна 2 23 85 90 91 77 42 3 6,1 9,1 13,0 13,8 8,4 5,4 4 2,1 7,1 3,2 8,3 2,7 2,2 5 4,2 7,6 9,3 12,1 7,4 5,9 6 1,8 5,7 3,0 6,3 2,3 4,2 Была выполнена такая же процедура определения солеустойчивости сортов и константных линии ячменя, которая позволила установить, что сорта ячменя – “Иран-4470”, “Би-10” и константные линии ячменя – “Б1 класс 1”, “Б4 класс 51”, “Б8 класс 62”, “Б3 класс 54” и “Дигаплоид” являются солеустойчивыми, а сорта “Бота” и “Aрна” и линии “Б2 класс 96”, “Б7 класс 87”, “Б2 класс 84” являются чувствительными к засолению. Таблица 7 – Изучение солеустойчивости сортов риса к хлоридному и сульфатному засолению Сорта риса Кубань Маржан Кубань Маржан Кубань Маржан Кубань Маржан % прорастания Масса Длина в NaCl, Na2SO4 растения, листьев, см к контролю мг контроль 95 0.113 4.2 97.5 0.117 5.3 1,5% NaCl + 1,5% Na2SO4 102.5 0.074 2.8 2% NaCl 52.6 0.079 3.1 100 0.096 3.4 2% Na2SO4 65.8 0.080 2.6 102.5 0.099 3.1 Длина стеблей, см 2.2 3.4 2.0 1.4 3.5 3.0 3.5 Соответственно для риса сорт “Маржан” является солеустойчивым, а сорт “Кубань” - чувствительным к засолению. После того как были отобраны наиболее и наименее солеустойчивые генотипы злаковых культур, мы смогли перейти к изучению уровня активности ФК у сортов пшеницы различающихся, по солеустойчивости. Результаты этих исследовании по изучению активности ФК у сортов пшеницы различающихся, по устойчивости к солевому стрессу представлены в таблице 8. 22 Таблица 8 – Активность ФК МДГ-ГОАТ у генотипов пшеницы различающихся по устойчивости к солевому стрессу Сорта пшеницы концентрация белка, мг/мл листья Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская – 10 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская – 10 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская – 10 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская – 10 Дауыл Толкын Арай Саратовская-29 Казахстанская – 10 корни контроль 0,23 0,18 0,30 0,30 0,40 0,38 0,22 0,24 0,28 0,29 1,5 % NaCI 0,37 0,17 0,30 0,29 0,39 0,41 0,24 0,35 0,25 0,31 1,5% Na2SO4 0,36 0,18 0,30 0,32 0,42 0,41 0,30 0,36 0,31 0,28 2% NaCI 0,53 0,25 0,20 0,29 0,40 0,39 2% Na2SO4 0,21 0,16 0,29 0,23 0,43 0,41 0,32 0,34 0,32 0,31 Активность ФК МДГГОАТ мкМ NADH/мг белка листья корни 111,7±2,2 100,6±2,0 126,3±2,2 98,5±1,9 101,5±2,1 108,7±2,2 139,6±2,8 102,5±2,0 101,3±1,0 98,6±2,1 176.6±3,5 196.5±3,9 112.6±2,2 68.0±1,3 74.5±1,5 152.5±3,2 168.5±3,4 122.2±2,3 67.8±1,4 80.5±1,6 151,6±3,0 181,1±3,6 122,0±2,4 57,8±1,16 44,6±0,9 198,5±3,8 165,6±3,3 112,3±2,2 72,5±1,4 88,5±1,8 215,4±4,6 170,7±3,4 165,0±3,3 - 139,6±2,7 145,0±2,9 128,3±2,6 - 162,5±3,2 178,8±3,4 133,6±2,6 51,0±1,0 39,5±0,8 192,5±3,8 172,3±3,3 128,5±2,6 82,2±1,6 75,6±1,5 Как видно из таблицы 8 у устойчивых сортов пшеницы в условиях солевого стресса происходит резкое возрастание активности ФК, тогда как у не солеустойчивых сортов такое увеличение активности не наблюдается. Эти результаты говорят о важной роли ФК в процессах активной адаптаций растений к солевому стрессу. Эти результаты необходимо было проверить на другом виде растений. С этой целью были взяты различные сорта ячменя и 23 риса, различающиеся по солеустойчивости. Результаты представлены в таблицах 9 и 11. Таблица 9 – Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов ячменя, различающихся по солеустойчивости Сорта ячменя концентрация белка, мг/мл листья Иран-4470 Би-10 Дигаплоид Бота Арна 0,40 0,50 0,70 0,30 0,20 Иран-4470 Би-10 Дигаплоид Бота Арна 0,51 0,50 0,61 0,41 0,60 корни Контроль 0,41 0,50 0,60 0,40 0,70 1,5 % NaCI 0,50 0,51 0,81 0,50 0,70 Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH/мг белка листья корни 204±4,0 247±4,9 220±4,4 347±6,7 385±6,9 388±7,7 211±4,2 155±3,1 198±3,9 268±5,2 247±5,1 362±7,2 378±7,5 283±5,6 358±7,5 473±9,4 297±5,9 202±4,0 215±4,1 220±4,3 Таблица 10 – Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов риса, различающихся по солеустойчивости Сорта риса концентрация белка, мг/мл листья корни Контроль 0,31 Кубань 0,21 Маржан 0,30 0,36 Кубань 0,21 2% NaCI 0,12 Маржан 0,30 0,50 Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ NADH/мг белка листья корни 69,5±1,3 78±1,6 82,6±2,1 91,5±1,5 40±0,4 30,5±0,7 71,5±2,1 88±0,8 Результаты таблиц 9 и 10 однозначно подтверждают главную особенность того, что именно генотипы с высокой устойчивостью к засолению обладают свойством увеличивать активность ФК, тогда как не устойчивые генотипы такой способностью не обладают. Эти данные еще раз подтвердили наш вывод о роли ФК в процессах адаптации растений к засолению. Теперь, можно с уверенностью говорить, о том, что активность ФК связано с устойчивостью 24 генотипов к засолению и кроме того повышение активности ФК играет большую роль при адаптации определенных генотипов злаковых культур к этому стрессовому фактору. Теперь легко можно объяснить причину этой роли, она заключается в том, что при повышении активности ФК катаболизм глютамата сдвигается в сторону нетоксического пути расщепления глютамата, то есть он идет без выделения токсического аммиака, и поэтому устойчивые генотипы в меньшей степени повреждаются от токсического аммиака. С другой стороны накопление аспартата при увеличении активности ФК также благотворно сказывается на метаболизме растений, так как известно, что аспартат служит источником для биосинтеза различных аминокислот и пуринов, что также повышает адаптационную способность растения. Таким образом, нами установлено, что ФК является одним из важнейших ферментов азотного обмена играющий очень важную роль в обеспечении жизнеспособности растений и их устойчивости к солевому стрессу. В свете полученных результатов интересным явилось изучить активность ФК у сортов ячменя, различающихся по устойчивости к другому абиотическому фактору–высокой температуре. Известно, что в Казахстане очень часто выращивание злаковых культур имеет место в регионах подверженных действию высоких температур. А выбор сортов ячменя для данного опыта, а не другой злаковой культуры объясняется тем, что в КИЗ-е (сейчас КАЗ TOO КазАгроИнновации») проведена большая работа по отбору стандартных сортов ячменя по признаку устойчивости к высокой температуре. В связи с вышеуказанным, явилось интересным изучить активность обеих ферментов катаболизма глютамата у сортов ячменя, резко различающихся по устойчивости к высокой температуре. Поэтому нами были изучены и отобраны три резко контрастных сорта по устойчивости к высокой температуре. Устойчивость проростков выбранных сортов ячменя к высокой температуре испытывали по методике описанной в руководстве под редакцией Г.В. Удовенко. Для опыта семена ячменя проращивали в течение 10 дней на чашках Петри на смоченной фильтровальной бумаге. Для осуществления стресса чашки Петри помещали в стерильный термостат при температуре 56 0С в течение 2 часов. Затем в течение 3 дней наблюдали выживаемость проростков. Полную устойчивость к этой температуре проявили два сорта ячменя “Унумли-арпа” и “Иран-4470”, тогда как 10 дневные проростки сорта “Сауле” сильно пострадали от стресса. Так как ФК осуществляет катаболизм глютамата без выделения токсического аммиака, то естественно, что мы предположили, что чем выше активность этого фермента, тем более высокой устойчивостью к высокой температуре должен обладать данный генотип. С целью проверки данного предположения нами было изучена активность ФК у вышеуказанных резко контрастных сортов ячменя. Одновременно изучалась активность ГДГ – фермента осуществляющего катаболизм глютамата с выделением токсического аммиака. Данные по изучению активности ФК и ГДГ у устойчивых к высокой 25 температуре сортов ячменя – “Унумли-арпа” и “Иран-4470” и не устойчивого к высокой температуре сорта – “Сауле” представлены в таблице 11. Таблица 11 – Активность ФК и ГДГ у устойчивых и не устойчивых к высокой температуре сортов ячменя Сорт ячменя Унумли-арпа Иран-4470 Сауле Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ/мг белка 560,7±11,2 490,3±9,8 238,7±4,79 Активность ГДГ мкМ/мг белка 10,6±2,1 12,8±2,5 4,0±0,91 Из таблицы 11 видно, что активность ФК устойчивых к температурному стрессу сортов более чем в 2 раза превышает активность ФК чувствительного к высокой температуре сорта. Эти данные однозначно говорят о том, что активность ФК может служить маркерным признаком генотипа ячменя с высокой устойчивостью к повышенной температуре. Следует указать, что активность ГДГ в несколько десятка раз меньше чем активность ФК, и её активность не коррелирует с признаком термоустойчивости генотипов ячменя. Активность ФК у генотипов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням Ржавчинные болезни злаковых культур наносит серьезный ущерб сельскому хозяйству Казахстана. Поэтому разработка эффективных методов тестирования генотипов зерновых культур на устойчивость к ржавчинным болезням являются одной из приоритетных задач ученых республики. Учитывая то, что ФК МДГ-ГОАТ осуществляет нетоксический путь катаболизма глютамата можно предположить, что высокая активность ФК определенных генотипов злаковых культур будет содействовать их устойчивости ржавчинным болезням. Поэтому еще одной из задач наших исследовании явилось изучение активности ФК МДГ-ГОАТ у различных сортов мягкой пшеницы различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням. В таблице 12 приведены результаты многолетних испытаний устойчивости к ржавчинным болезням. Как видно из таблицы 12, наиболее устойчивыми к ржавчинным болезням являются сорта Attila и Aldura, наименее устойчивые Саратовская-29 и Улугбек600. После этого мы могли перейти к изучению активности ФК МДГ-ГОАТ у 20-ти сортов мягкой пшеницы различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням. Результаты этого исследования приведены в таблице 13. Как видно из таблицы 13, наиболее устойчивые к ржавчинным болезням сорта «Attila» и « Aldura» имели активность МДГ-ГОАТ 270,7 мкМ NADH/ мг белка в мин и 220,4 мкМ NADH/ мг белка в мин. соответственно. Тогда как, наименее устойчивые сорта «Саратовская-29» и «Улугбек-600» имели 26 активность 130,84 и 134,88 мкМ NADH/ мг белка в мин соответственно. То есть активность ФК наиболее устойчивых к ржавчинным болезням сортов почти в 2 раза превышала активность ФК у неустойчивых сортов. Таблица 12 - Устойчивость 20-ти сортов к ржавчинным болезням Название (Name) Происхождение (origin) Вид (species) Attila Мексика T. aestivum Aldura США T. durum Randur Франция T. durum Безенчукская-139 Россия T. durum Алтын дала Казахстан T. durum Стекловидная-24 Казахстан T. aestivum Тома Казахстан T. durum Богарная-56 Казахстан T. aestivum Казахстанская Казахстан T. aestivum раннеспелая Эритроспермум-35 Казахстан T. aestivum VZ-187 Италия T. durum Pastor Мексика T. aestivum Красота Россия T. aestivum Шарора Таджикистан T. aestivum СИД-88 Казахстан T. durum Наурыз-8 Казахстан T. durum Cocorit-71 Мексика T. durum Bacanora Мексика T. aestivum Улугбек-600 Узбекистан T. aestivum Саратовская-29 Россия Т. aestivum Образ жизни яровая яровая яровая яровая яровая озимая яровая озимая яровая яровая яровая яровая озимая озимая яровая яровая яровая яровая озимая яровая Устойчивость к ржавчине, балл/% Стебле- Листо- Желтая вая (Sr) вая (Yr) (Lr) 4/20 4/20 4/30 2/5 4/40 1/5 4/60 4/60 4/10 3/20 3/10 4/20 4/70 4/80 4/30 2/50 4/40 3/50 3/70 4/40 4/40 4/5 3/5 4/80 4/50 4/20 - 4/60 2/10 3/10 2/10 - 2/10 2/5 4/40 4/50 - Как мы видим из этих таблиц, чем выше активность ФК, тем более устойчив сорт к ржавчине. Это можно объяснить следующим образом при поражении растении ржавчинным грибком резко усиливаются процессы катаболизма, особенно глютамата. Сорта, имеющие высокую активность ФК, активнее расщепляет глютамат по нетоксическому пути без выделения аммиака, и по этому они в меньшей степени повреждаются при ржавчинных болезнях по сравнению с неустойчивыми генотипами. Таким образом, высокая активность ФК повышает жизнеспособность устойчивых сортов и сопротивляемость к ржавчине. Все выше сказанное позволяет рекомендовать активность ФК МДГ-ГОАТ в качестве маркерного 27 признака для селекции генотипов пшеницы на устойчивость к ржавчинным болезням. Таблица 13 - Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы различающиеся по устойчивости к разным видам ржавчины Устойчивость к Активность ржавчине, балл/% ФК МДГ-ГОАТ, мкМ HAДH Название (Name) Стеблевая Листовая Желтая (Sr) (Lr) (Yr) на мл белка, на мг белка, 1мин 1мин. Attila 4/20 4/20 1001,61±21,3 270,70±5,4 Aldura 4/30 2/5 4/40 678,70±13,5 220,36±4,4 Randur 1/5 708,06±14,3 208,25±4,2 Безенчукская-139 4/60 4/60 719,35±14,4 197,08±3,9 Алтын дала 4/10 3/20 3/10 715,32±14,6 185,31±3,7 Стекловидная -24 4/20 4/70 4/80 580,32±17,4 174,79±3,4 Тома 4/90 687,09±20,6 167,58±3,5 Богарная-56 3/50 3/70 4/40 637,90±19,1 162,31±3,3 Казахстанская 4/40 4/5 3/5 708,06±21,2 162,02±3,2 раннеспелая Эритроспермум4/80 4/60 2/10 625,16±12,5 161,12±2,3 35 VZ-187 687,09±13,7 160,91±3,2 Pastor 541,12±10,8 159,15±4,7 Красота 2/1 2/5 627,41±12,6 158,84±6,7 Шарора 707,25±14,1 154,76±3,2 СИД-88 4/50 3/10 4/40 730,32±14,6 149,04±3,1 Наурыз-8 4/20 2/10 4/50 691,29±13,8 144,92±2,9 Cocorit-71 617,74±14,3 140,73±2,8 Bacanora 610,96±12,2 138,85±2,7 Улугбек-600 650,16±13,6 134,88±4,2 Саратовская -29 582,25±11,6 130,84±2,6 Таким образом, эта работа показывает, что МДГ-ГОАТ являясь сравнительно эволюционно молодым ферментным комплексом, играет исключительно важную роль в катаболизме глютамата и синтезе аспартата. Нами впервые установлено, что активность ФК играет важную роль в процессах морфогенеза злаковых культур особенно в периоды прорастания семян и их созревания. Нами также установлено, что ФК может служить маркерным признаком для селекции генотипов злаковых культур на устойчивость к абиотическим и биотическим стрессовым факторам. Таким образом, было подтверждено наше предположение о том, что активность ФК может служить маркерным признаком устойчивости генотипов 28 к ржавчинным болезням. Действительно, высокая активность ФК МДГ-ГОАТ у устойчивых сортов позволяет проводить катаболизм глютамата по нетоксическому пути, тем самым клетки растений этих сортов меньше страдают от токсического аммиака, чем у неустойчивых генотипов. Это повышает жизнеспособность устойчивых сортов и сопротивляемость к ржавчине. Все выше сказанное позволяет рекомендовать активность ФК МДГГОАТ для селекции генотипов на устойчивость к ржавчинным болезням. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В лаборатории структуры и регуляции ферментов Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина ЦБИ МОН РК, под руководством профессора М.К. Гильманова впервые были разработаны методы получения сферосом и их изучения. Однако до настоящего времени остаются неизученными регуляция ГДГ-сферосом. Также в этой лаборатории впервые был обнаружен новый ферментный комплекс ФК МДГ-ГОАТ. Однако до сегодняшнего дня оставалась неясной роль ФК в процессах морфогенеза и адаптации растений к стрессовым факторам. Учитывая исключительную важность этих недавно открытых ферментов в обмене глютамата, целью настоящего исследования явилось изучение регуляции НАДФ-ГДГ сферосом и активности ФК МДГ-ГОАТ в процессах морфогенеза и в генотипах злаковых культур различающихся по устойчивости к засолению и ржавчинным болезням. Для выполнения настоящей работы были использованы современные методы и приборы. В ходе исследования были получены наиболее важные результаты при изучении НАДФ–ГДГ–сферосом и ФК МДГ–ГОАТ злаковых культур. Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы: -установлено, что под действием фузикокцина активируется протонная АТФ-аза осуществляющая транспорт ионов кальция в цитоплазму алейроновых клеток зерна пшеницы. Ионы кальция совместно с низкомолекулярным регулятором, который возникает в зародышах пшеницы под действием фузикокцина, вызывают активацию фосфокиназы «С», что приводит к образованию строго НАДФ специфичной ГДГ-сферосом. Установлено, что это НАДФ–ГДГ–сферосом имеет КМ для ионов аммония около 1 мкМ, что говорит об очень важной роли этого фермента в ассимиляции азота; -показано, что ФК состоит из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа. Это говорит о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами малатдегидрогеназы и глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы; -установлено, что ФК отсутствует у микроорганизмов, в водорослях, низших растениях и эволюционно древних высших растениях. ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, и он имеется у эволюционно молодых растений; -активность ФК коррелирует с наиболее важными фазами в онтогенезе растении и в первую очередь они связаны с фазами прорастания и созревания семян злаковых культур; 29 -исследование активности ФК у 46-сортов пшеницы, ячменя и риса различающихся по солеусточивости показало, что устойчивые генотипы злаковых культур активируют ФК в ответ на засоление, тогда как неустойчивые к засолению генотипы не обладали такой способностью; -установлено, что устойчивые к ржавчине сорта имеют высокую активность ФК, тогда как неустойчивые к ржавчине сорта имеют низкую активность ФК. Оценка полноты решений поставленных задач. Поставленные в работе задачи выполнены. Обнаружены и охарактеризованы ключевые ферменты обмена глютамата злаковых культур. Впервые изучена регуляция НАДФ-ГДГ сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы. Установлены гормональные механизмы активации НАДФ-ГДГ сферосом злаковых культур. Были изучены роли ФК МДГ-ГОАТ при прорастании и созревании семян злаковых культур, также и роли ФК МДГ-ГОАТ в процессах адаптации злаковых культур к стрессовым факторам таким, как: засоление, высокая температура и ржавчинные заболевания. Рекомендации по конкретному использованию результатов исследований. Полученные результаты могут использоваться для повышения урожайности злаковых культур. Выделенные в ходе исследования регуляторы НАДФ-ГДГ сферосом могут использоваться в качестве эффективных биостимуляторов для повышения урожайности и стрессоустойчивости злаковых культур. Активность ФК МДГ-ГОАТ может служить в качестве ферментного маркера для селекции зерновых культур на устойчивость генотипов пшеницы, ячменя и риса к засолению, высокой температуре и ржавчинным болезням, а также для отбора жизнеспособных семян. Технико-экономический и научный уровень в сравнении с лучшими достижениями в этой области. Технико-экономический уровень высокий, так как, проведенные исследования позволили разработать неимеющий аналогов метод для быстрой селекции злаковых культур на устойчивость абиотическому и биотичскому стрессам. Научная новизна и практическая значимость выполненной работы соответствует современному научно-техническому уровню в области генетики и молекулярной биологии. Научный уровень представленной работы соответствует международным стандартам исследований, проводимых в данной области. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 Кудиярова, Ж.С., Бекбаева, Л.К., Рсалиев, Ш.С. Изучение активности ферментного комплекса МДГ-ГОАТ у сортов мягкой пшеницы различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням // Материалы научно-практической конференции «Современные проблемы биохимии и эндокринологии» с международным участием. - Ташкент, 2006. - С. 163-164. 30 2 Kudiyarova, Zh., Tuimebaeva, B., Rakhmetova, Zh. The new enzyme methods for determination of glutamate in clinic and food stuffs // 31-st FEBS Congress, The FEBS Journal. - Istanbul, 2006. – P. 256. 3 Гильманов, М.К., Кудиярова, Ж.С., Рахметова, Ж.К., Колдасова, А.С. Изучение физико-химических свойств нового ферментного комплекса МДГГОАТ основных злаковых культур // Вестник КазНУ. Серия биологическая. 2006. - Т.30, №4. - С. 37-43. 4 Бекбаева, Л.К., Кудиярова Ж.С., Рахметова, Ж.К., Рсалиев, Ш.С. Активность ферментного комплекса МДГ-ГОАТ как маркерный признак в устойчивости сортов яровой пшеницы к ржавчинным болезням // Вестник КазНУ. Серия биологическая. - 2006. - №3 (29). - С. 174-177. 5 Кудиярова, Ж.С., Рахметова, Ж.К. Бидай дәніндегі глютаматтың қайтымсыз ыдырауын жүзеге асыратын МДГ-ГОАТ ферменттік комплексін бөліп алып, құрылымын және каталитикалық қасиеттерін зерттеу // Тезисы докладов IV Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии». – Алматы, 2006. – С.145. 6 Kudiyarova, Zh., Sabitov, A.N., Gilmanov, M.K., Ibragimova, S.A., Ryskulova, S.T. Activation of Ca2+-dependent ATP-ase of plasmatic membranes of wheat seeds by secondary hormone of cytokinine (CSH) and 14-3-3 proteins // Известия Национальной академии наук Республики Казахстан. Серия химическая. - 2007. - Т. 365, №5. - С. 43-46. 7 Сабитов, А.Н., Кудиярова, Ж.С., Гильманов, М.К., Мансуров, З.А. Изучение фузикокцин регулируемой Mg2+, Сa2+, H+ - АТФ-азы плазматической мембраны растительной клетки // Тезисы докладов 61-ой Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по прикладным вопросам химии, “Мир науки”. – Алматы, 2007. – С. 130. 8 Гильманов, М.К., Кудиярова, Ж.С., Исраилова, М.З., Куланбаева, Т.С. Социально- экономическое значение применения в Казахстане нового метода определения глютамата в клинике и в продуктах питания // Труды V международной научно-практической конференции «Социально-гуманитарные проблемы современного образования». - Талдыкорган, 2007. - С. 179-180. 9 Sabitov, A.N., Musabekov, K., Gilmanov, M.K., Samenov, N.A., Kudiyarova, Zh.S. Cytokinine secondary hormone activates plasmatic membrane H+-ATP-ase which is important regulatory machine of the plant cell // 32тh FEBS Congress. Molecular machines / The FEBS Journal. - Vienna, 2007. – P. 134. 10 Kudiyarova, Zh.S., Sabitov, A.N., Gilmanov, M.K., Samenov, N.A. Secondary hormone of cytokinine and 14-3-3 proteins activate Ca2+ dependent ATPase of plasmatic membrane from aleuron layer of wheat seeds // 2 nd International Symposium Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture. - Kyiv, Ukraine, 2007. – P. 137. 11 Kudiyarova, Zh.S., Gilmanov, M.K., Rakhmetova, Zh.K., Omirbekova, N.Zh., Bekbaeva, L.K., Kurmanov, B.K. The structure and functions of evolutionary young enzyme complex MDh-GOAT // An international Symposium on the nitrogen nutrition of plants «Nitrogen 2007». - Lancaster, UK, 2007. – P. 56. 31 12 Gilmanov, M.K., Ibragimova, S.A., Samenov, N.A., Sabitov, A.N., Kudiyarova, Zh.S. The participation of mediator of cytokinin and spherosomes in mechanisms of activation of plant NADP-GDh // An international Symposium on the nitrogen nutrition of plants «Nitrogen 2007». - Lancaster, UK, 2007. – P. 54. 13 Kudiyarova, Zh.S., Sabitov, A.N., Gilmanov, M.K., Ibragimova, S.A., Ryskulova, S.T. Активация вторичным гормоном цитокинина и 14-3-3 белками Ca2+-АТФ-азы плазматической мембраны из алейроновых клеток семян пшеницы // Материалы V Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». - Минск, 2007. – C. 113. 14 Ибрагимова, С.А., Басыгараев, Ж.М., Алашбаева, Л.Ж., Кудиярова, Ж.С. Свойства и применение вторичного гормона цитокинина из зародыша пшеницы // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2007. - №1 (36). – C. 159. 15 Спанкулова, З.Б., Кудиярова, Ж.С. Екінші реттік цитокинин гормоны және 14-3-3 протеиндері бидай дәнінің алейрон қабатындағы Са 2+ тәуелді АТФазасын активтендіруі // Студенттер мен жас ғалымдардың екінші халықаралық конгресі, «Ғылым әлемі». – Алматы, 2008. - 107-108 бб. 16 Kudiyarova, Zh.S., Gilmanov, M.K. Cytokinine secondary hormone and 14-3-3 proteins activates Ca–ATP-ase from aleuron layers of wheat seeds // 33rd FEBS Congress, Biochemistry of Cell regulation / The FEBS Journal. - Athens, 2008. – P. 353. 17 Kudiyarova, Zh.S., Cytokinine secondary hormone and 14-3-3 proteins activate spherosomes anchored NADP-GDh in wheat seeds // «Қазақстаннын биологиялық қауіпсіздігін қамтамасыз ету мәселелері», ЕМК «Ботаника және фитоинтродукция Институты». – Алматы, 2008. - 149-151бб. 18 Kudiyarova, Zh.S., Rakhmetova, Zh, Bekbayeva, L.K., Omirbekova, N.Zh. New malate-dehydrogenase–glutamate oxaloacetate aminotransferase glutamate enzyme system from cereals and its bioengineering application // World Congress on science, Engineering and Technology. - Venice, 2008. - Vol. 34. - P. 631- 634. 19 Кудиярова, Ж.С. Изучение ФК МДГ-ГОАТ и глютаматдегидрогеназы (ГДГ) в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению // Междунар. научно-практическая конференция «Биологическое разнообразиe и устойчивое развитие природы и общества», посвященная 75летию КазНУ им. аль-Фараби и 75-летию биологического факультета. – Алматы, 2009. - С. 214-216. 32 Құдиярова Жанар Сырлыбайханқызы ГЛЮТАМАТ АЙНАЛЫМЫНЫҢ НЕГІЗГІ ФЕРМЕНТТЕРІН АСТЫҚ ДАҚЫЛДАРЫНЫҢ ГЕНОТИПТЕРІНІҢ МОРФОГЕНЕЗІНЕ БАЙЛАНЫСТЫ ЖӘНЕ ТҰЗДАНУМЕН ТАТ АУРУЛАРЫНА ҚАРСЫ ТӨЗІМДІЛІГІН ЗЕРТТЕУ «генетика» мамандығы бойынша биология саласында философия докторы (Ph.D.) академиялық дәрежесін алу үшін дайындалған диссертация авторефератына ТҮЙІН Тәжірибелік зерттеудің негізгі нысаналары ретінде бидайдың (Triticum aestivum L.), (Triticum durum Desf.) 32 түрлі генотиптері, арпаның (Hordeum vulgare L.), 14 түрлі сорттары және 12 генетикалық линиялары, күріштің (Oriza Sativa L.) 8 сорты алынды. Сонымен қатар зерттеуде жүгері, асқабақ, бұршақ, арша, шырша, кедр, алма және алмұрттың дәндері қолданылды. Жұмыстың мақсаты: астық дақылдарының генотиптерінің морфогенезіне байланысты және олардың тұзданумен тат ауруларына қарсы төзімділігіндегі глютамат айналымының негізгі ферменттерінің атқаратын қызметтерін зерттеу. Зерттеу мақсатында қолданылған әдістер: гомогенизациялау, центрифугалау, октилсефарозада гидрофобты хроматографиялау, RP 18 кері фазалы хромотографиясымен және көміртек-кремний нанокарбосорбентінде препаративті хроматографиясымен бөлу, пішінді анықтауға электрондық микроскопиялау, Н+-АТФ-азаның активтілігін анықтау, ионалмасу хроматографиясы, аффинді хроматографиясы, SDS–электрофорез, және глютамат айналымының негізгі ферменттері ГДГ-нің, НАДФглютаматдегидрогеназаның, МДГ–ГОАТ ферменттік комплексінің активтіліктерін анықтау үшін спектрофотометриялық әдісі, протеиндердің мөлшерін анықтау үшін Микробиурет және Брэдфорд әдістері қолданылды. Зерттеудің нәтижесінде: -морфогенетикалық және биохимиялық зерттеулер арқылы астық дақылдарының глютамат айналымындағы негізгі ферменттері анықталды. Бидай және жүгері дәндерінің пісу кезеңінде НАДФ-ГДГ сферосомасының ролі зор. Бидай дәндерінің өнуінде НАДФ-ГДГ-сферосомасын активтендіру механизмдері анықталды. Фузикокциннің әсерінен бидайдың алейрон қабатында кальций иондарының цитоплазмаға енуіне ықпал ететін протонды АТФ-аза активтенеді. Кальций иондары фузикокциннің әсерінен төменгі молекулалы қосылыстармен бірге «С»-фосфокиназасын активтендіреді, соның салдарынан НАДФ-ГДГ-сферосомалары түзіледі. -бидайдың құрғақ дәнінен малатдегирогеназа және глютаматоксалоацетатаминтрансферазадан тұратын ферменттік комплекс бөлініп алынды. SDS– электрофорез арқылы ол екі әртүрлі бөліктерден, яғни массасы 60 кДа және 50 кДа-дан тұратын полипептидтер екендігі анықталды. Демек, ол екі қабысқан 33 малатдегидрогеназаның және глютаматдегидрогеназаның гендерімен реттеледі. ФК-ның активтілігі микроорганизмдерде, балдырларда, төменгі сатылы өсімдіктерде және эволюциялық байырғы өсімдіктерде байқалған жоқ. Сондықтан ол эволюциялық жаңа белокты комплекс, себебі ол эволюциялық тұрғыдан кейін пайда болған өсімдіктерден табылған. ФК-ның активтілігі астық дақылдарының дәндерінің өміршеңдігін көрсетеді. Сонымен қатар ФК дәндердің өсу кезеңінде ұрықтың өсуін энергиямен қамтамасыз етеді. ФК-ның активтілігі өсімдіктің онтогенезінің маңызды кезеңдерімен тікелей байланысты, әсіресе өсіп-өну және пісіп жетілу кезеңдерінде атқаратын қызметі зор. Тұздануға төзімділігі әртүрлі бидайдың, арпаның және күріштің дәндеріне зерттеулер жүргізу нәтижесінде төзімді генотиптерде ФК-ның активтілігі жоғары, ал төзімсіз өсімдіктерде оның активтілігі томендігі байқалды. Сонымен қатар арпаның жоғары температураға төзімді сорттарында төзімсіз сорттарына қарағанда ФК-ның активтілігі екі есе жоғары болып табылды. Тат ауруларына да төзімділігі бойынша әртүрлі 20 сорттарында жүргізілген зерттеулер бойынша да төзімді сорттарда ФК-ның жоғары активтілігін, ал төзімсіз сорттарында төмен активтілікті көрсетті. Ғылыми-зерттеу жұмыстарының қорытындысын практикаға ендіру үшін берілетін ұсыныстар. НАДФ-ГДГ-сферосомасын активтендіру механизмдерін реттеу арқылы астық дақылдарының биологиялық өнімін арттыру және осы МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігін астық дақылдарының өміршеңдігін, тұзданумен тат ауруларына қарсы тұру қабілетін анықтайтын маркерлік белгі ретінде қолдануға болады деген ұсыныс жасаймыз. Бұл жумысты генетикалық селекцияда, биотехнология және энзимология салаларында қолдануға болады. 34 SUMMARY of dissertation for an academic degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in the field of biology sciences on a speciality of genetic Kudiyarova Zhanar Syrlybaikhanovna THE INVESTIGATION OF THE KEY ENZYMES OF METABOLISM OF GLUTAMATE IN RELATION WITH MORPHOGENESIS AND TOLERANCE OF CEREAL’S GENOTYPES TO SALT STRESS AND RUST INFECTION The major objects of investigation were 32 genotypes of wheat (Triticum aestivum L.), (Triticum durum Desf.), 14 cultivars and 12 constant lines of barley (Hordeum vulgare L.), 8 cultivars of rice (Oriza Sativa L.) and (Zea Maize L.). The purpose of the present research was to study of the new key enzymes of glutamate metabolism of the major cereal cultures in relations with morphogenesis and tolerance of genotypes to salt stress and rust infection. In this investigation were used next methods: homogenization, centrifugation, hydrophobic chromatography on column with octylsepharose, reverse-phase chromatography on column type RP 18, preparative chromatography on carbonsorbent nanocarbosorb, scanning electronic microscopy, biochemical methods of determination of activities of GDh, NADP-GDh of spherosome, MDh-GOAT and plasmatic membrane H+-ATP-ase, ion-exchange chromatography, gel– chromatography, SDS-electrophoresis, spectrophotometric methods and for determination of protein quantity were used Microbiyuret and Bradford methods. The obtained dates were statistically calculated by origin computer method. Results of investigations: It was shown that NADP-GDh of spherosome play key role in germinating and maturing wheat seeds. We studied the mechanism of activation of NADP-GDh of spherosome in germinating wheat seeds. It was established, that under action of fusicoccin it is activated proton ATP-ase which transports Ca2+ into the cytoplasm of aleurone cells of wheat seeds. Also fusicoccin activates the formation of the low-molecular regulator. Then this regulator is translocated to aleurone cells. Here Ca2+ and low-molecular regulator activate the phosphokinase "C". At last Ca2+ and phosphokinase "C" fully converts GDh of spherosome to NADP strong dependent GDh of spherosome. NADP-GDh of spherosome has high affinity to NH4+ KM about 1 μM. The activity of NADP-GDh of spherosome very high in maturing wheat and corn seeds. We purified EC MDh-GOAT from the dry wheat seeds. By SDSelectrophoresis showed that EC consists of two heterologic subunits with molecular masses of 50 kDa and 60 kDa. That means that EC is coded by two connected genes of MDh and GOAT. It was established, that EC is absent in microorganisms, in algae, bryophytes and other lowest plants and evolutionary ancient higher plants like lilies. EC was found in evolutionary young plants: Rozhacea, Cucurbitae and Leguminoza and cereal family plants. 35 It was shown that activity of the EC is important for growing wheat seeds embryos. It was shown that the activity of EC is very high in steams, leaves and ears of maturing wheat plants. It was shown, that activity of EC correlates with viability of wheat seeds. The studying of the activity of EC of 46-cultivars of wheat, barley and rice differing by tolerance to salt stress show that the tolerant genotypes have the ability to increase the activity of EC as response to salt stress, whereas intolerant genotypes haven’t this ability. Also it was shown that tolerant to high temperature cultivars of barley have 2 times higher activity of EC than the intolerant one. Also cultivars differing by tolerance to rust infection showed high activity of EC than intolerant cultivars. Recommendations for practical using. It was developed: the new methods of purification of the NADP-GDh of spherosome from maturing wheat and corn seeds and EC MDh-GOAT from dry wheat seeds. We recommend to use the activity of EC as enzyme marker for selection of the tolerant genotypes to biotic and abiotic stresses. The fields of application: Genetic, Biotechnology, Enzyme Engineering and Selection of cereal’s genotypes. 36 Формат 60х84 1/16. бумага офсет №1. Гарнитура Times New Roman, кегль 10 Усл. п. л. 2.0. Тираж 100 экз. Заказ № Подписано в печать: 22.05.2009 г. Отпечатано в компании «Copyland» Республика Казахстан, г. Алматы, 050000, пр. Сейфуллина, 541 тел.: 261-16-12, 261-48-44 E- mail: print@copyland.kz 37 38
