Исследование структуры 1F0K 1. Общее описание структуры 1F0K 1.1. Компоненты структуры, описанной в документе PDB 1F0K Идентификатор Число остатков Название Комментарии цепи молекулы A 364 (350 в структуре) UDP-NЦепь реального ACETYLGLUCOSAMI белка - с 7 по 357 NE-Nостаток B 364 ACETYLMURAMYL(PENTAPEPTIDE) PYROPHOSPHORYL -UNDECAPRENOL NACETYLGLUCOSAMI NE TRANSFERASE ID SO4 HOH Название Формула SULFATE ION O4 S1 2- (SO42-) H2 O1 (H2O) Число копий 1 296 Комментарии Изображение компонентов структуры 1F0K Белок в остовной модели, разным цветом разные полипептидные цепи. Лиганды из 2-х и более атомов — в шарнирной модели с раскраской по атомам. Молекулы воды и одноатомные лиганды — в шариковой модели Размеры белка: 110 Å – между атомами Lys93A.NZ и Lys96B.NZ – между концами полумесяца; 36 Å – между атомами Lys221A.NZ и Glu325A.CG – «толщина» Белок можно аппроксимировать сферой радиусом r0=50 Å. Объём сферы V0= (4/3)πr03≈5*10^-25 м^3 Объем клетки E.сoli (r=0.5μm и h=2μm) Ve= hπr2=1.5*10^-18 м^3 Количество белков, которые могут уместиться в клетке n=Ve/V0=3*10^6 Количество копий N=n/4400=682 Количество белков на линейке длиной 0.13μm: n2=0.13μm/10nm=13 Нужно создать, некое плоское образование из белков с линейными размерами не менее λ/2. Для оценки можно рассмотреть квадрат с такой длиной стороны. Тогда на каждой его стороне нужно не менее n3 белков 2r0*n3≥λ/2 n3≥ λ/4r0. Минимальная длина видимого света λ=400nm. n3=10. Поэтому минимальное количество белков для образования видимого в световой микроскоп объекта n32=100. 2. Торсионные углы в полипептидной цепи 2.1. Измерение двугранных углов остатка Met10 в белке MURG_ECOLI, цепь А Название двугранного угла Угол определяется по координатам атомов (обращение к атому в соответствие с синтаксисом RasMol, в скобках – название атома) φ *9:A.C (карбонильный углерод 10 остатка цепи А) ψ *10:A.N (азот амидной группы 10 остатка цепи А) *10:A.CA (CA атом 10 остатка цепи А) ω *10:A.N (азот амидной группы 10 остатка цепи А) *10:A.CA (CA атом 10 остатка цепи А) *10:A.C (карбонильн ый углерод 10 остатка цепи А) Результат измерения с помощью RasMol *10:A.CA (CA атом 10 остатка цепи А) *10:A.C (карбонильны й углерод 10 остатка цепи А) -119.1 *10:A.C (карбонильны й углерод 10 остатка цепи А) *11:A.N (азот амидной группы 11 остатка цепи А) *11:A.N (азот амидной группы 11 остатка цепи А) *11:A.CA (CA атом 11 остатка цепи А) 123.3 179.4 2.2. Изображение, иллюстрирующее определение угла φ, в плоскости, перпендикулярной связи *10:A.N - *10:A.CA. *10:A.CA находится за *10:A.N. Угол (на картинке) *9:A.C *10:A.N - *10:A.C равен φ. 2.3. Комментарии Для большинства аминокислотных остатков характерно расположение пар (φ, ψ) в районе (-70; 40) и (-120; 140). При этом аминокислоты α-спиралей на карте располагаются в основном в районе (-70; -40), а β-листов – около (-120; 140). Также в белке не встречаются углы φ около 0 (-30; 30) и около 150 (120; 180). Тем не менее некоторые аминокислоты, например Gly, могут иметь (φ, ψ) около (80; 10). Такое разнообразие возможных углов для глицина объясняется тем, что у него нет заместителей, которые не дают возможность вращения. Напротив, в аминокислоте пролин могут невозможно вращение вокруг связи N-Cα, поэтому φ только около -60. ψ могут быть в районе 150 и -40, так как из-за гетероцикла вращение вокрут связи Cα-С также ограничено. Для спиралей и тяжей характерны свои определённые диапазоны углов. Это неудивительно, потому что в регулярной структуре уже определено, как в ней расположены атому остова, и, следовательно, торсионные углы. Для остатков β-листов характерны углы около (-120; 140). Оба угла относительно близки к 180 и разных знаков, а по модулю почти равны, поэтому получается плоская зигзагообразная структура, как и необходимо. Аминокислоты α-спиралей на карте располагаются в основном в районе (-70; -40). Остов «закручен» против часовой стрелки, при этом φ и ψ одинаковых знаков. Это согласуется с тем, сто спираль – правый винт: если соответствующим образом свернуть полоску (так, чтобы её можно было бы положить на поверхность некоторого цилиндра) и «двигаться» вдоль не, то она будет закручиваться как раз влево Карты Рамачандрана По оси абсцисс – угол φ, по оси ординат – угол ψ. Карта Рамачандрана для множества всех остатков, кроме Gly и Pro, в белке MURG_ECOLI 180 150 120 90 60 PSI 30 0 -180 -150 -120 -90 -60 -30 0 -30 -60 -90 -120 -150 -180 PHI 30 60 90 120 150 180 Карта Рамачандрана для множества остатков Pro в белке MURG_ECOLI 180 150 120 90 60 PSI 30 0 -180 -150 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 120 150 180 -30 -60 -90 -120 -150 -180 PHI Карта Рамачандрана для множества остатков Gly в белке MURG_ECOLI 180 150 120 90 60 PSI 30 0 -180 -150 -120 -90 -60 -30 0 -30 -60 -90 -120 -150 -180 PHI 30 60 90 Карта Рамачандрана для множества остатков альфа-спиралей в белке MURG_ECOLI 180 150 120 90 60 PSI 30 0 -180 -150 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 150 180 -30 -60 -90 -120 -150 -180 PHI Карта Рамачандрана для множества остатков бета-листов в белке MURG_ECOLI 180 150 120 90 60 PSI 30 0 -180 -150 -120 -90 -60 -30 0 -30 -60 -90 -120 -150 -180 PHI 30 60 90 120 3. Исследование элементов вторичной структуры. 3.1. Исследование альфа-спирали № 79 - № 95:A белка MURG_ECOLI 3.1.1. Рисунки Рисунки a) Спираль в остовной модели с «торца», около каждого С –атома приведен номер остатка b) Спираль в толстой проволочной модели, изображены атомы N, C,C,O, показаны водородные связи. Стрелочками обозначены направления оси. c) Расположение C атомов (в шариковой модели) относительно спирали. 3.1.2. Описание параметров спирали 3.1.2.1. Средние значения углов <φ>=-58.29 <ψ>=-32.97 3.1.2.2. Параметры спирали: Шаг 6.15Å Число элементов на виток +4 (закручена по часовой стрелке) d=6.15Å/4=1.54Å 1 2 h2 1 6.0042 l 5.6532 2.4 , где l – расстояние через 2 4 2 4 полвитка, а h – высота (расстояние через виток). 3.1.2.3. Паттерн водородных связей: Примеры водородных связей: H (92; 96); H (91; 95); H (90; 94) Паттерн: H(i; i+4) «Исключения» H(77; 81) H(73; 76) 3.1.2.4. Атомов С направлены во вне от оси спирали. 3.1.2.5. Дополнительные задания Характерная длина водородной связи О—N. Измеренные длины (в Å): 3.053, 2.893, 2.706, 2.899, 3.056. Были измерены водородные связи в разных частях спирали. Ближе к краю длина в среднем больше. Средняя длина связи: 2.921 Å Радиус спирали, проведенной через ядра атомов, около 2.4 Å. Чтобы молекула воды помещалось, необходимо, чтобы туда помещалась: 2r(спирали)≥2r(C)+2r(O). На самом деле 2*2.4<2*1.70+2*1.52 4.8<6.44. Поэтому молекула воды точно не уместится. На один аминокислотный остаток приходится шаг спирали d=1.54Å. Поэтому длина спирали белка SCP-1 равна 900d=900*1.54Å=1386Å. Радиус r 3.2. Исследование антипараллельной -структуры № 100 - № 106, № 109 - № 114 белка ARGRS (YEAST ARGINYL-TRNA SYNTHETASE) структуры 1bs2 3.2.1. Картинки Тяжи в толстой проволочной модели, изображены атомы N, C,C,O, показаны водородные связи. Расположение атомов С (в шариковой модели) относительно оси структуры 3.2.2. *Протокол Средние значения углов <φ>=-116.37 <ψ>=125.89 Основной паттерн водородных связей Примеры: H(106; 109); H(109; 106). H(104; 111); H(111; 104). H(102; 113); H(113; 102). Паттерн. Пусть один из антипараллельных тяжей начинается на остаток a, другой кончается на b, при этом данные остатки взаимодействуют за счёт водородных связей. Тогда паттерн будет: H(a+2i; b-2i); H(b-2i; a+2i), i . Паттерн Н-связей в бета-структурах неудобно записывать так же , как паттерн для спиралей, потому что необходим параметр, отвечающий за сдвиг номеров остатков одного тяжа относительно номеров другого. Также не у каждого остатка одинаковые водородные взаимодействия. Расположение атомов С относительно оси структуры Атомы С направлены в бок от оси структуры (плоскости, содержащей) остовы двух тяжей, при этом чередуются (то с одной, то с другой стороны плоскости). При этом атомы С расположенных один над другим остатком расположены по одну сторону от плоскости 3.3. Исследование паралельной -структуры № 213 - № 218, № 184 - № 189 белка MURG_ECOLI 3.3.1. Картинки 4. Тяжи в толстой проволочной модели, изображены атомы N, C,C,O, показаны водородные связи. Расположение атомов С (в шариковой модели) относительно оси структуры 4.1.1. * Протокол Средние значения углов <φ>= -107.63 <ψ>=123.23 Основной паттерн водородных связей Примеры: H(184; 214); H(214; 186). H(186; 216); H(216; 188). H(188; 218). Также есть H-связи внутри цепей: H(184; 186); H(186; 188); H(187; 189); H(216; 218) Паттерн. Пусть один из параллельных тяжей начинается на остаток a, другой кончается на b, при этом данные остатки «один под другим». Тогда паттерн будет: H(a+2i; b+1+2i); H(b+1+2i; a+2+2i), i . H(b+2+i, b+i); H(a+2+i, a+i) – дополнительные, для некоторых i. Внутри тяжей. Расположение атомов С относительно оси структуры Атомы С направлены в бок от оси структуры (плоскости, содержащей) остовы двух тяжей, при этом чередуются (то с одной, то с другой стороны плоскости). При этом атомы С расположенных один над другим остатком расположены по одну сторону от плоскости Сравнение строения антипараллельной и параллельной -структуры Отличаются паттерны водородных связей, однако на каждую пару остатков в обеих структурах приходится в среднем по 1 водородной связи В параллельных β-листах водородные связи часто возникают между остатками одного и того же тяжа. Средние значения углов φ и ψ практически не отличаются Антипараллельные β-тяжи могут соединяться через β-поворот (короткую последовательность), а параллельные – обязательно через длинный участок полипептидной цепи. Атомы Сβ расположены в обеих структурах одинаково: направлены в бок от оси структуры (плоскости, содержащей) остовы двух тяжей, при этом чередуются (то с одной, то с другой стороны плоскости). При этом атомы С расположенных один над другим остатком расположены по одну сторону от плоскости Дополнительно 1. Основным отличием является, видимо, способ образования водородных связей (паттерны см. выше). В тяжах водородные связи образуются между двумя отдельными фрагментами цепи, а в спирали – между близко расположенными (в последовательности, а не только в пространстве) остатками одного и того же фрагмента. То, что разность между номерами связанных остатков постоянна, определяет спиральность структуры. Отдельный вопрос в том, что определяет, в какую вторичную структуру будет складываться данный фрагмент полипептидной цепи. Видимо, каким-то образом влияют боковые радикалы аминокислот: они могут притягиваться, отталкиваться или чисто механически мешать. Другими словами, взаимное расположение радикалов с минимальной ΔG (предпочтительное) зависит от последовательности аминокислот, а в разных элементах вторичной структуры разное взаимное расположение атомов С (и, следовательно, самих радикалов). Также, наверное, можно предугадать элемент структуры по тому, какие углы φ и ψ характерны для присутствующих в последовательности аминокислот, ближе ли они к углам, характерным для листов или для спиралей. 2. Реверсивный поворот Для поиска поворотов были выполнены команды: structure select turn and :A Наиболее похожий на реверсивный поворот (из 4 остатков): 43-46:A. Это почти согласуется с данными PDBSum. Средние значения углов <φ>=-72.80 <ψ>= -26.15 Имеется водородная связь, стабилизирующая структуру, между первым и последним элементом: H(73, 76) 5. Исследование контактов между аминокислотными остатками 5.1. Контакты альфа-спирали с остальной частью цепи А белка MURG_ECOLI Имя атома остатка спирали Расстояние в Å Предположительная природа контакта Arg89A.NH1 Ile71A.CB Arg80A.NE Ile71A.CG2 Имя контактирующего атома Ser117A.OG Thr134A.OG1 Ser64A.O Lue133A.CD1 2.82 3.349 2.806 3.098 Met92A.CE Gly111A.O 3.212 Водородная связь Вандерваальсово взаимодействие Водородная связь Гидрофобное или вандерваальсово взаимодействие Вандерваальсововзаимодействие Существует плотная группа из 3-х или более гидрофобных контактирующих остатков: Ile91A (в спирали), Met10A, Leu40A. Изображение в толстой проволочной модели, раскраска по атомам. Расстояния между тремя остатками не превышают 5Å, все остатки гидрофобные, поэтому предполагаем, что между ними реализуется гидрофобное взаимодействие. Боковые гидрофобные радикалы направлены навстречу друг другу, то есть образуют кластер. 5.2. Поиск S-S- мостиков Изображение дисульфидных мостиков в белке инсулина. Выделены остатки цистеина, S-S связи изображены более тонкой желтой палочкой, чем ковалентные Все остатки цистеина вовлечены в дисульфидные мостики. В белке MURG_ECOLI в каждой субъединице только один остаток цистеина, они не образуют дисульфидных мостиков. Наличие большого (по сравнению, например, с MURG_ECOLI) количества остатков цистеина в инсулине, а так же то, что все они соединены дисульфидными мостиками объясняется: размерами белка (белок маленький, поэтому нужно маленьким количеством связей удержать сложную структуру) тем, что белок (как гормон) предназначен не для работы не внутри клетки, а вне её (внутри клетки цистеиновые мостики не так распространены, т.к. там восстановительная среда и атом серы обычно в виде -SH). 5.3. Поиск водородных связей между боковой группой серина и боковыми группами других остатков Водородные связи были найдены с помощью скрипта ser_contacts.spt Рассматривается взаимодействие между Ser268A.OG и Asn161A.ND2. Расстояние между атомами 3.049Å. Водородные связи между остатками серина и атомами основной цепи белка, возможно, есть: Ser117A.OG – Ala114A.O. Расстояние 2.755Å. 5.4. *Поиск ионных контактов в цепи А структуры MURG_ECOLI Для поиска ионных контактов был написан скрипт ions.spt Была выбрана пара остатков Glu349 – Arg352 В ионных взаимодействиях участвуют 20 аминокислотных остатков (в 1 субъединице) (см. результаты работы скрипта ions.spt). Всего заряженных остатков 71 (расчёт в Excel), поэтому доля заряженных остатков, образующих ионные контакты, равна 20/71≈0.28=28% Описание структуры 1F0K в БД PDBsum 1. цепи A белка MURG_ECOLI 2 структурных домена: 1f0kA01 1f0kA02. Скрипты определяют множества domain01 и domain02, соответствующие разным доменам, и рисуют цепь A белка в cartoons-модели с раскраской по доменам. 2. Всего в цепи A 357-7+1=351 а.о. На картинках из п. 1 номер в начале цепи (тяжа) соответствует остатку, предшествующему цепи (тяжу) (то есть если в начале номер a, а в конце b, то цепь (тяж) – это множество (a;b]). Проверено экспериментом: select *70:A and helix не выделяет ничего. Таким образом, количество остков в α-спиралях: (32-16 + 51-46 + 55-52 + 76-70 + 96-77 + 118-107 + 139-132 + 355-341) + (169-164 + 178-172 + 210-195 + 234-223 + 255-247 + 274-263 + 299-287 + 310-306 + 321-311 + 337-323) = 177 Доля 177 / 351 = 0.504 = 50.4% Количество остатков в α-спиралях: 5+18+10+6+4+5+17+10+7+10+11+3+9+13+14=142 В β-тяжах: (13-7 + 41-36 + 61-57 + 103-99 + 126-121 + 148-144 + 159-157) + (190-184 + 219-212 + 242-240 + 261-257 + 280-276 + 305-301) = 57 Доля 57 / 351 = 0.162 = 16.2% Можно взять данные о длинах тяжей и спиралей в ProMotif Beta strands | helices Количество остатков: В α-спиралях: 15+4+4+5+18+10+6+4+5+14+3+10+7+10+11+3+9+13+13=164 Доля: 164/351=0.467=46.7% В β-тяжах: 5+6+4+4+5+4+2+6+6+3+4+3+3=55 Доля: 55/351=0.157=15.7% Следующая по распространенности структура обозначена символом β – β-поворот, так же присутствует структура, обозначенная γ – γ-поворот. 3. β-поворот – элемент стуктуры, в котором остов цепи за 4 остатка поворачивает примерно на 180о. По определению, расстояние между Сα атомами первого и четвертого остатка элемента структуры не должно превышать 7Å, а также 2 остатка в середине не должны образовывать часть спирали Определение (из Motif description): A beta turn is defined for 4 consecutive residues (denoted by i, i+1, i+2 and i+3) if the distance between the Calpha atom of residue i and the Calpha atom of residue i+3 is less than 7Å and if the central two residues are not helical (either using the Kabsch and Sander criteria or using author defined criteria), Lewis et al. (1973). В цепи A найдено 18 β-поворотов. http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgibin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=1f0k&template=protein.html&o=BETA_TURNS&r=psplot&l=1 &s=1&c=7&chain=A 4. Рассмотрим описание спиралей цепи: ProMotif 19 helices http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgibin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=1f0k&template=protein.html&o=HELICES&r=psplot&l=1& s=1&c=5&chain=A «Кривость» спирали будем определять по столбцу таблицы «Deviation from ideal». Самая кривая: Glu47 - Leu50. Последовательность: EADL Дополнительная информация Residue conservation. Показано, какие аминокислоты заменяются реже (highly conserved), а какие чаще (poorly conserved). Таким образом можно понять, какие остатки наиболее важны для работы белка. Реакция, катализируемая ферментом: UDP-N-acetylglucosamine + Mur2Ac(oyl-L-Ala-gamma-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D- Ala)diphosphoundecaprenol = UDP + GlcNAc-(1->4)-Mur2Ac(oyl-L-Ala-gamma- D-Glu-L-Lys-DAla-D-Ala)-diphosphoundecaprenol Ссылка на описание pathway (цепочки реакций в организме), в которой участвует данный фермент – Peptidoglycan Biosynthesis (Part 2): http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/polysacc/PepGly2.html Классификация фермента: E.C.2.4.1.227 Transferases Glycosyltransferases Hexosyltransferases Ссылка на запись в Uniprot. Там приведено много данных о данном белке, в частности ссылки на все его исследования. http://www.ebi.uniprot.org/entry/P17443