ГЛОССАРИЙ - Автоматизированная информационная система
реклама
Министерство образования и науки Республики Казахстан Семипалатинский госдуарственный педагогический институт Факультет естественных наук Кафедра общей биологии Учебно-методический комлпекс дисциплины «Молекулярная биология» для студентов 4 курса специальности 050113 «Биология» Семей, 2011 Составитель: и.о. доцента кафедры общей биологии Садыкова Р.А. ________________ Утверждено на заседании кафедры: протокол № 1 от «___»_________ 2011 г. Зав. кафедрой общей биологии, к.б.н._____________________ Калиева С.К. Обсуждено на заседании учебно-методического естественных наук Протокол № ___ от «___»____________ 2011 г. совета факультета Декан факультета естественных наук, к.б.н.:_______________ Аралханов М.С. Содержание стр. 1. 2 3 4 5 6 Раздел 1. Глоссарий по дисциплине Раздел 2. Краткий конспект лекций Раздел 3. Методические указания для проведения лабораторных занятий Раздел 4. Методические рекомендации по СРСП Раздел 5. Методические рекомендации по СРС Раздел 6. Контрольно-измерительные средства РАЗДЕЛ 1. ГЛОССАРИЙ Автотрофы – организмы, синтезирующие нужные им органические вещества из неорганических соединений. Автогамия — самооплодотворение как форма полового размножения у простейших путем слияния гаплоидных ядер в одной зародышевой клетке. Адаптация — приспособление. Аденин – пурин, входящий в состав нуклеиновых кислот и нуклеотидов, играющих важную роль в переносе энергии. Аденозинтрифосфат (АТФ) – органическое вещество, содержащее аденин, рибозу и три фосфатные группы; играет важнейшую роль в переносе энергии в биологических системах. Активный перенос – перенос веществ в клетку или из клетки через плазматическую мембрану против градиента концентрации с помощью механизма, требующего затраты энергии. Аллель – один из нескольких альтернативных вариантовгена, которые могут находиться в данном участке (локусе) хромосомы. Аминокислота – органическое соединение, содержащее аминогруппу и карбоксильную группу; аминокислоты могут соединяться между собой , образуя пептидные цепи белковых молекул. Анаболизм – биохимические реакции, в результате которых из более простых веществ синтезируются более сложные, что приводит к запасанию энергии, к образованию новых материалов для построения клеток и к росту. Аналогичные (органы) — сходные по функции, но разные по происхождению. Анафаза – стадия митоза или мейоза, на которой хромосомы расходятся к полюсам веретена; следует за метафазой. Анаэробный — безвоздушный; термин относится к организмам, существующим в бескислородной среде. Антиген – чужеродное вещество, обычно белок или комплекс полисахарида с белком, которое, попадая в организм, вызывает образование специфических антител. Антитело – специфический белок, вырабатываемые организмом в ответ на появление в крови или тканях чужеродного вещества. Апомиксис — размножение без оплодотворения при партеногенезе. Апоморфный — признак отражает эволюционно продвинутое состояние морфологии органов. Ароморфоз — тип биологического прогресса в эволюции, который приводит к повышению морфофизиологической организации организмов. Аутосомы – обычные парные хромосомы в отличие от половых хромосом. Ацеломический — не имеющий вторичной полости тела — целома. Бактерии – очень мелкие, обычно одноклеточные, микроорганизмы, для которых характерно отсутствие оформленного ядра. Белки – макромолекулярные вещества, содержащие углерод, водород. Кислород, азот и обычно также серу и фосфор. Построены из аминокислот, соединенных в цепи пептидными связями. Бентос — организмы, обитающие на дне водоемов. Бесполое размножение — форма размножения, не включающая мейоз и слияние гамет. Билатеральная симметрия — тип симметрии, при котором через тело животного можно провести лишь одну плоскость симметрии, делящую его на две идентичные половины. Биогеоценоз — однородный участок земной поверхности с определенным составом живых организмов и косных компонентов, объединенных обменом веществ и энергии в единый природный комплекс. Биосфера — оболочка Земли, населенная живыми организмами. Буферы – вещества, которые, находясь в растворе, предотвращают резкие сдвиги рН, возникающие при добавлении кислот или оснований. Вирус – мельчайший инфекционный агент, состоящий из нуклеиновой кислоты, заключенной в белковую оболочку; может размножаться и мутировать внутри клетки-хозяина. Витамины – органические соединения, которые необходимы данному организму в малых количествах для нормального обмена веществ и должны содержаться в пище, так как организм не способен синтезировать их. Водородная связь – слабая связь между двумя молекулами (или частями одной молекулы) через атом водорода, который соединяется с двумя атомами (обычно один из них – кислород); такие связи играют важнейшую роль в структуре нуклеиновых кислот. Гамета — гаплоидная половая клетка. Гаметическая редукция хромосом — мейоз происходит при образовании гамет. Гаплоидный — содержащий одинарный хромосомный набор в клетках. Ген – биологическая единица наследственной информации, способная к само воспроизведению и рапсоложенная в определенном участке (локусе) определенной хромосомы. Гермафродит — двуполый организм, способный производить как яйцеклетки, так и сперматозоиды. Гетеротроф — питающийся готовыми органическими веществами. Гликолиз – превращение сахаров в более простые соединения в процессе обмена веществ. Гомологичные (органы) — сходные по происхождению, но не обязательно сходные по функциям. Дезоксирибоза – сахар с пятью углеродными атомами в молекуле, отличающийся от рибозы отсутствием одного из атомов кислорода; входит в состав ДНК. Денатурация – изменение физических свойств и трехмерной структуры белка, нуклеиновой кислоты или иного макромолекулярного вещества в результате какого-либо слабого воздействия, не разрушающего первичной структуры. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – вещество, из которого состоят хромосомы; содержит генетическую информацию, закодированную в специфических последовательностях нуклеотидов, из которых построена ДНК. Диплоидия — двойной хромосомный набор в клетках. Живорождение — развитие яиц в теле самки с последующим рождением молоди. Зигота — клетка, возникающая при слиянии гамет, имеет диплоидный набор хромосом. Зиготическая редукция хромосом — мейоз происходит на фазе зиготы. Жизненный цикл — морфогенез вида между двумя одноименным фазами его циклического развития (от зиготы до зиготы и т. п.). Изогамия — образование одинаковых гамет у особей одного вида. Иммиграция — образование энтодермы путем погружения клеток и бластодермы в бластоцель. Инвагинация — образование гаструлы путем впячивания бластодермы на вегетативном полюсе. Конъюгация — половой процесс у инфузорий, сопровождающийся обменом ядерного материала между особями. Онтогенез — индивидуальное развитие организма. Орган — структурно-функциональная единица тела многоклеточного организма, образованная одной или несколькими тканями. Органелла — структурно-функциональная единица одноклеточного организма. Паразит — организм, постоянно или временно обитающий внутри другого или на нем и приносящий ему ущерб. Партеногенез — форма размножения, при которой новая особь развивается из яйцеклетки без оплодотворения. Пиноцитоз — поглощение клеткой мелких капель жидкости. Плазмодий — многоядерная амебоидная клетка. Планктон — организмы, обитающие в толще воды и не способные плыть против течения. Плейстон — полупогруженные в воду плавающие организмы. Половое размножение — форма размножения, которая сопровождается образованием гамет и последующим слиянием гамет во время оплодотворения. Почкование — бесполое размножение путем образования новых особей из выростов тела родителей. Прокариоты — организмы с клетками без ядер и органелл, окруженных мембранами. Прямое развитие — без образования стадии личинки. Радиальная симметрия — симметрия по отношению к любой плоскости, проходящей через продольную ось тела. Регенерация — восстановление утраченных частей тела организма за счет роста тканей. Реснички — двигательные органеллы клеток, по строению похожие на жгутики у жгутинокосцев. Симбиоз — взаимополезное сожительство организмов разных видов. Синцитий — многоклеточная структура с отсутствующими границами между клетками. Сперматозоид — мужская гамета, обычно способная к движению. Сперматофор — пакет сперматозоидов с защитной оболочкой. Спора — фаза в жизненном цикле некоторых паразитических простейших, выполняющая функцию расселения вида во внешней среде и содержащая молодые стадии паразита. Спорогония — бесполое размножение на фазе зиготы у споровиков с образование спорозоитов. Фагоцитоз — поглощение пищевых частиц клеткой при помощи псевдоподий. Филогенез — историческое развитие таксонов. Эволюция — происхождение и изменение живого в историческом масштабе. Эктодерма — наружный зародышевый слой, покрывающий гаструлу. Эмбрион — зародыш. Энтодерма — внутренний зародышевый листок, образующий эмбриональную кишку (гастроцель) на стадии гаструлы. Эукариоты — организмы, в клетках которых имеются окруженные мембранами ядро и органеллы. Ювенильный —неполовозрелый. Яйцеклетка — женская гамета. Яйцо — яйцеклетка или зигота, окруженная оболочками, как начальная стадия развития организма. Сложное яйцо может содержать кроме яйцеклетки желточные клетки. РАЗДЕЛ 2. Краткий конспект лекций: Лекция №1. Введение. Предмет молекулярной биологии. История развития. Эволюция клетки. Биологическое значение нуклеиновых кислот. Цель лекции: Дать основные понятия предмету, истории его развития. Ознакомить с основными задачами курса. 1 Эволюция клетки Все живые существа состоят из клеток - маленьких, окруженных мембраной полостей, заполненных концентрированным водным раствором химических веществ. Простейшие формы жизни - это одиночные клетки, размножающиеся делением. Более высокоразвитые организмы, такие как мы сами, можно сравнить с клеточными городами, в которых специализированные функции осуществляют группы клеток, в свою очередь связанные между собой сложными системами коммуникаций. В известном смысле клетки находятся на полпути между молекулами и человеком. Мы изучаем клетки, чтобы понять, каково их молекулярное строение, с одной стороны, и чтобы выяснить, как они взаимодействуют для образования столь сложного организма, как человек, - с другой. Считается, что все организмы и все составляющие их клетки произошли эволюционным путем от общей предковой клетки. Два основных процесса эволюции - это 1) случайные изменения генетической информации, передаваемой от организма к его потомкам, и 2) отбор генетической информации, способствующей выживанию и размножению своих носителей. Эволюционная теория является центральным принципом биологии, позволяющим нам осмыслить ошеломляющее разнообразие живого мира. Эта глава, как и книга в целом, посвящена развитию - от молекул до многоклеточных организмов. В ней обсуждается эволюция клетки, сначала как самовоспроизводящейся единицы, состоящей из более мелких частей, а затем как строительного блока для более крупных структур. По мере изложения материала мы будем последовательно знакомиться с компонентами и функциями клетки, которые детально рассматриваются в следующих главах в основном в том же порядке. Мы узнаем, как свойства больших молекул определенного типа обеспечивают передачу потомству и выражение в фенотипе (экспрессию) наследственной информации, обусловливая эволюционный процесс. Эти молекулы, заключенные в мембрану, составляют сущность самореплицирующейся клетки. Затем мы опишем основные этапы эволюции - от небольших, похожих на бактерии клеток до значительно больших и более сложно устроенных, таких, например, как клетки современных растений и животных. Наконец, будут высказаны гипотезы о том, каким образом отдельные свободноживущие клетки породили большие многоклеточные организмы, как клетки специализировались и как, объединившись, образовали столь сложные органы, как мозг. Естественно, в эволюционном подходе есть свои опасности: большие пробелы в наших знаниях мы заполняем рассуждениями, детали которых могут быть ошибочными. Не в наших силах вернуться в прошлое и стать свидетелями уникальных молекулярных событий, происходивших миллиарды лет назад. Однако эти древние события оставили много следов, которые мы можем анализировать. Предковые растения, животные и даже бактерии сохранились как ископаемые. Но, что еще более важно, каждый современный организм содержит информацию о признаках живых организмов в прошлом. В частности, существующие ныне биологические молекулы позволяют судить об эволюционном пути, демонстрируя фундаментальное сходство между наиболее далекими живыми организмами и выявляя некоторые различия между ними. Анализируя молекулярное подобие и различие, мы пытаемся воссоздать признаки живших некогда существ. Эту задачу можно сравнить с той, которую решает ученый филолог, восстанавливая текст древнего автора, искаженный при неоднократных копированиях и редактированиях. Задача трудна и доказательства несовершенны, и все-таки этот путь дает возможность делать разумные предположения относительно основных стадий в эволюции живых клеток. Рис. 1-1. Типичный опыт, имитирующий первозданные условия на Земле. Воду нагревают в герметичном сосуде, содержащем СН4, NH3 и Н2. Через смесь газов и водяного пара пропускают электрический разряд. Органические соединения накапливаются в U-образной ловушке. Рис. 1-2. Некоторые соединения, которые могли образоваться в опыте, описанном на рис. 1-1. Соединения, выделенные цветом, являются важными компонентами современных живых клеток. Задача молекулярной биологии – познание и истолкование строения, функций и взаимодействий молекул, лежащих в основе жизненных процессов. Поскольку основу жизнедеятельности определяют огромные молекулы биологических полимеров, прежде всего белков, нуклеиновых кислот и их комплексов, то их изучение и является главным направлением молекулярной биологии. Возникнув главным образом из биохимии, молекулярная биология соединяет в себе подходы и методы физики, химии, генетики, цитологии и ряда других смежных наук. В наши дни молекулярная биология заняла ключевые позиции среди биологических наук. Благодаря развитию молекулярной биологии открываются новые пути в изучении наследственных болезней человека и природы развития злокачественных новообразований. Молекулярная биология позволяет найти подходы к изысканию неизвестных эффективных лекарственных веществ, познать механизмы их действия, открывает новейшие способы борьбы со многими вирусными заболеваниями. Благодаря развитию молекулярной биологии открываются перспективы переделки наследственной природы сельскохозяйственных растений и животных. Решение задач по молекулярной биологии способствует более глубокому пониманию и прочному усвоению важнейших положений теории, наглядно иллюстрирует многообразие её практических применений, значительно повышает интерес к курсу. Задачи помогают выявить и раскрыть в теории самое главное, активно овладеть им и сознательно строить дальнейшее на этой прочной основе. Подробное изложение хода рассуждения и способов решения задач способствует выработке у студентов генетического образа мышления на основе знания основных законов и явлений наследственности. 1.1. От молекул - к первой клетке 1.1.1. Простые биологические молекулы могут образовываться в пребиотических условиях Условия, существовавшие на Земле в первый миллиард лет ее истории, все еще являются предметом спора. Мы не знаем, была ли поверхность нашей планеты вначале расплавленной? Содержала атмосфера аммиак или же метан? Можно только предполагать, что Земля была весьма неспокойным местом - с постоянными вулканическими извержениями, неистовыми ливнями и сверкающими молниями. Не было совсем или было очень мало кислорода, и отсутствовал озоновый слой, поглощающий жесткое ультрафиолетовое излучение Солнца. В таких условиях, очевидно, возникали простые органические (т.е. содержащие углерод) молекулы. Лучшее тому доказательство лабораторные эксперименты. Если через нагретую смесь воды и газов, таких, как СО2, СН4, NH3 и Н2, пропускать электрический разряд или ультрафиолетовое излучение, они реагируют с образованием малых органических молекул. Обычно набор таких молекул невелик, но каждая образуется в сравнительно больших количествах (рис. 1-1). Среди продуктов есть ряд соединений, таких, как цианистый водород (HCN) и формальдегид (НСНО), которые легко вступают в последующие реакции в водном растворе (рис. 1-2). Наиболее важно, что в эксперименте удается получить четыре основных класса внутриклеточных малых молекул: аминокислоты, нуклеотиды, сахара и жирные кислоты. Хотя в таких опытах нельзя точно воспроизвести условия, существовавшие ранее на Земле, они показывают, что органические молекулы образуются на удивление легко. Кроме того, наша формирующаяся планета имела огромные преимущества перед любым экспериментатором: она была очень велика и обеспечивала широкий спектр условий. Но важнее всего то, что в распоряжении Земли были сотни миллионов лет. В таких условиях кажется вполне вероятным, что в какой-то момент, в каком-нибудь месте сконцентрировались многие из простых органических молекул, входящих в состав современных клеток. 1.1.2. Полинуклеотиды способны направлять собственный синтез Простые органические молекулы, такие, как аминокислоты или нуклеотиды, могут ассоциировать с образованием больших полимеров. Две аминокислоты могут соединиться с помощью пептидной связи, а два нуклеотида могут быть соединены фосфодиэфирной связью. Последовательное повторение этих реакций ведет к образованию линейных полимеров, называемых соответственно полипептидами и полинуклеотидами. У современных организмов полипептиды, называемые белками, и полинуклеотиды в форме рибонуклеиновой кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) обычно считаются наиболее важными компонентами. Универсальные «кирпичики», из которых состоят белки - это всего лишь 20 аминокислот, а молекулы ДНК и РНК построены только из четырех типов нуклеотидов. Остается лишь гадать, почему именно эти наборы мономеров, а не другие со схожими химическими свойствами были отобраны для биосинтеза. Самые первые полимеры могли образоваться несколькими путями, например при разогреве сухих органических соединений или в результате каталитического эффекта высоких концентраций неорганических полифосфатов. При проведении аналогичных реакций в пробирке образуются полимеры различной длины со случайной последовательностью, у которых наличие данной аминокислоты или нуклеотида в каждом положении определяется случайно (рис. 1-3). Но если уж полимер образовался, он способен влиять на образование других полимеров. Особенно это относится к полинуклеотидам, которые могут служить матрицей в реакции полимеризации и, таким образом, определять последовательность нуклеотидов в новых полинуклеотидах. Например, полимер, состоящий из одного типа нуклеотидов (полиуридиловой кислоты, или poly U), может служить матрицей для синтеза второго полимера, составленного из другого типа нуклеотида (полиадениловой кислоты, или poly A). Подобные матричные свойства основаны на специфическом, так называемом комплементарном связывании полинуклеотидов друг с другом. Poly U способствует образованию poly А, выстраивая вдоль своей цепи необходимые субъединицы (рис. 1-4). Рис. 1-3. Четыре типа нуклеотидов (показаны буквами, A, U, G, С) могут спонтанно полимеризоваться с высвобождением воды. В результате получается смесь олигонуклеотидов случайной длины и случайной последовательности. Рис. 1-4. Нуклеотиды способны связываться друг с другом (причем G предпочтительно связывается с С, а А - с U) при помощи сравнительно слабых химических связей (слева). Такое связывание позволяет одному полинуклеотиду служить матрицей для синтеза другого (справа). Специфическое спаривание комплементарных нуклеотидов сыграло, видимо, решающую роль в возникновении жизни. Рассмотрим, например, полинуклеотид, подобный РНК и содержащий основания урацил (U), аденин (А), цитозин (С) и гуанин (G). Благодаря комплементарному спариванию оснований - А с U и G с С - при добавлении РНК к смеси активированных нуклеотидов в условиях, благоприятствующих полимеризации, синтезируется новая молекула РНК, последовательность нуклеотидов которой комплементарна последовательности нуклеотидов в исходной РНК. Таким образом, новые молекулы представляют собой как бы слепок исходной молекулы, каждому А которой соответствует U в копии и т. д. На первой стадии информация, содержащаяся в последовательности исходной цепи РНК, сохраняется в новообразующихся комплементарных цепях. На второй стадии копирование с использованием комплементарной цепи в качестве матрицы восстанавливает исходную последовательность (рис. 1-5). Механизмы комплементарного матричного копирования изящны и просты, они занимают центральное место в процессах переноса информации в биологических системах. Генетическая информация каждой клетки закодирована в последовательности оснований ее полинуклеотидов, и эта информация передается из поколения в поколение благодаря комплементарному спариванию оснований. Рис. 1-5. Репликация последовательности полинуклеотида (здесь молекулы РНК). На стадии 1 исходная молекула РНК служит матрицей для образования молекулы РНК с комплементарной последовательностью. На стадии 2 эта комплементарная молекула в свою очередь служит матрицей для образования молекулы РНК с исходной последовательностью. Поскольку каждая матрица способна произвести много комплементарных копий, эти реакции могут привести к «размножению» исходной последовательности. Для быстрого образования полинуклеотидов в пробирке обязательно должны присутствовать специфические белковые катализаторы-ферменты, которых не могло быть в «пребиотическом бульоне». Там, однако, были, очевидно, минералы и ионы металлов, способные служить менее эффективными катализаторами. Кроме того, катализаторы лишь ускоряют реакции, которые происходили бы и без них, но за достаточно долгое время. Поскольку и время, и химически активные предшественники нуклеотидов имелись в изобилии, то вполне возможно, что в пребиотических условиях на Земле стало возможным возникновение медленно реплицирующихся систем полинуклеотидов. 1.1.3. Самореплицирующиеся молекулы подвержены естественному отбору При любом процессе копирования неизбежно происходят ошибки и размножаются неточные копии оригинала. Следовательно, в результате многократных циклов репликации образующаяся последовательность нуклеотидов будет существенно отличаться от исходной. Так формируется разнообразие молекул. В случае РНК эти молекулы, вероятно, будут иметь и разные функциональные свойства. Ведь молекулы РНК -это не просто цепочка символов, неким абстрактным образом несущая информацию. Они обладают химической индивидуальностью, влияющей на их поведение. Конкретная последовательность нуклеотидов определяет свойства молекулы, особенно характер ее свертывания (кон-формацию) в растворе. Мономеры полинуклеотида могут не только спариваться со свободными комплементарными нуклеотидами среды с образованием нового полимера, но и образовывать пары с комплементарными нуклеотидными остатками того же самого полимера. Последовательность GGGG в одной части полинуклеотидной цепи может сравнительно прочно связаться с СССС из другого участка молекулы. Из-за подобных взаимодействий возникают различные трехмерные изгибы, и молекула в целом приобретает уникальную форму, полностью определяемую ее нуклеотидной последовательностью (рис. 1-6). Трехмерная укладка полинуклеотида влияет на его стабильность и на способность реплицироваться, так что не все молекулы в репликативной смеси будут одинаково успешно размножаться. В лабораторных опытах было показано, что система реплицирующихся молекул РНК подвержена своего рода естественному отбору, при котором в зависимости от конкретных условий начнет преобладать та или иная последовательность. Таким образом, молекула РНК обладает двумя важными свойствами: закодированная в ее нуклеотидной последовательности информация передается в процессе репликации, а уникальная пространственная структура определяет характер взаимодействия с другими молекулами и реакцию на внешние условия. Оба этих свойства – информационное и функциональное - являются необходимыми предпосылками эволюционного процесса. Рис. 1-6. В результате спаривания нуклеотидов из разных участков одной и той же полинуклеотидной цепи (РНК) молекула принимает определенную форму. Нуклеотидная последовательность молекулы РНК аналогична наследственной информации, или генотипу организма. Пространственная укладка аналогична фенотипу - совокупности признаков организма, подверженных действию естественного отбора. 1.1.4. Специализированные молекулы РНК могут катализировать биохимические реакции Естественный отбор зависит от условий среды. Для реплицирующейся молекулы РНК критическим компонентом среды является набор других молекул РНК в растворе. Кроме того, что эти молекулы служат матрицами при собственной репликации, они могут катализировать разрушение и образование ковалентных связей, в том числе и связей между нуклеотидами. Некоторые специализированные молекулы РНК могут катализировать изменения в других молекулах РНК, разрезая нуклеотидную последовательность в определенной точке, другие типы молекул РНК способны вырезать часть своей собственной нуклеотидной последовательности и соединять отрезанные концы (процесс, называемый самосплайсингом). Каждая реакция, катализируемая РНК, зависит от специфического расположения атомов на поверхности каталитической молекулы РНК, которое приводит к тому, что один или несколько ее нуклеотидов становятся высокоактивными. Можно предположить, что некоторые реакции имели кардинальное значение в первичном бульоне. Рассмотрим, в частности, полимеризацию РНК, процесс, в котором в качестве матрицы используется данная молекула РНК и который катализируется ею. РНК, действуя на собственные копии, будет реплицироваться с высокой скоростью и эффективностью (рис. 1-7, А). Это может способствовать репликации других типов молекул РНК в прилежащих областях. Некоторые из них могут обладать каталитической активностью, которая помогает или препятствует сохранению или репликации РНК другими способами. Если благоприятные воздействия взаимосвязаны, то различные типы молекул РНК, специализированные для разных реакций, сформируют кооперативную систему, которая будет реплицироваться с необычно высокой эффективностью (рис. 1-7, Б). Рис. 1-7. Схема трех последовательных стадий эволюции самореплицирующейся системы молекул РНК, способных направлять синтез белков. 1.1.5. Информация передается от полинуклеотидов к полипептидам Итак, мы предполагаем, что 3,5-4 млрд. лет назад где-то на Земле самореплицирующиеся системы молекул РНК положили начало эволюционному процессу. Системы с различными наборами последовательностей нуклеотидов конкурировали за запасы предшественников, необ ходимых им для построения копий (аналогично тому, как сейчас конкурируют организмы за пищевые ресурсы). Успех зависел от точности и скорости копирования, а также от стабильности копий. Хотя структура полинуклеотидов хорошо приспособлена для хранения и передачи (репликации) информации, каталитические возможности молекул РНК, по-видимому, слишком ограничены, чтобы обеспечить все функции современной клетки. Большая универсальность присуща полипептидам, они состоят из аминокислот с химически разнообразными боковыми цепочками и способны принимать разные пространственные формы, которые насыщены реакционноспособными участками. Свойства полипептидов делают их идеально подходящими для выполнения широкого круга структурных и функциональных задач. Даже полипептиды со случайной последовательностью, возникавшие под действием пребиотических синтетических механизмов, видимо, имели каталитические свойства и, в частности, могли облегчать репликацию молекул РНК. Полинуклеотиды, способствующие синтезу полезных полипептидов в своем окружении, должны были приобрести большое преимущество в эволюционной борьбе. Но каким образом полинуклеотиды могли бы осуществлять подобный контроль? Как информация, закодированная в их последовательности, может определять последовательность полимеров иного типа? Ясно, что полинуклеотиды должны действовать как катализаторы для сборки отобранных аминокислот. У современных организмов согласованная система молекул РНК направляет синтез полипептидов, т. е. синтез белка, однако этот процесс идет при участии других белков, синтезированных заранее. Биохимический аппарат, осуществляющий синтез белка, чрезвычайно сложен. Молекулы РНК одного типа содержат генетическую информацию о последовательности соответствующего полипептида. Роль других молекул РНК заключается в связывании определенной аминокислоты и переносе ее к месту сборки полипептидной цепи. Основой взаимодействия этих двух типов молекул РНК является комплементарность их оснований, что позволяет последовательности нуклеотидов информационной РНК направлять включение определенных аминокислот, доставляемых молекулами транспортной РНК, в растущую полипептидную цепь. Предшественники этих двух типов молекул РНК, повидимому, направляли первый синтез белка без помощи белков (рис. 1-7, В). Сегодня сборка новых белков в клетке происходит на поверхности рибосом - сложных частиц, состоящих из нескольких больших молекул РНК (но уже другого класса) и более чем из 50 различных типов белков. В гл. 5 мы покажем, что рибосомной РНК принадлежит роль главного катализатора в процессе синтеза белка, она составляет более 60% массы рибосомы. По крайней мере в эволюционном аспекте эта РНК представляет собой основной компонент рибосомы. Итак, на сегодняшний день представляется весьма вероятным, что РНК примитивным образом направляла первичный синтез белков. Для более эффективного биосинтеза клетке необходимо было создать набор «инструментов» (в форме белков), часть которых могла быть использована при репликации РНК и в процессе синтеза этих белковых «инструментов». Синтез специфических белков под управлением РНК потребовал «разработки» кода, с помощью которого полинуклеотидная последовательность определяет последовательность аминокислот в белке. Этот код - генетический код - записан в «словаре» трехбуквенных слов: различные триплеты нуклеотидов кодируют специфические аминокислоты. Код, по-видимому, был «выбран» произвольно и до сих пор остается фактически одинаковым у всех живых организмов. Это наводит на мысль, что все современные клетки являются потомками одной прими тивной линии клеток, сумевших «разработать» эффективный механизм синтеза белка. Как только эволюция нуклеиновых кислот продвинулась до кодирования ферментов, обеспечивающих их собственное воспроизведение, распространение репликативной системы должно было резко ускориться. Взрывной характер такого автокаталитического процесса можно видеть на примере жизненного цикла некоторых современных вирусов бактерии: проникнув в бактерию, эти вирусы направляют синтез белков, избирательно катализирующих их собственную репликацию, и в короткое время оккупируют всю клетку. 1.1.6. Первая клетка окружает себя мембраной Одним из решающих событий, приведших к формированию первой клетки, очевидно было формирование внешней мембраны. В самом деле, белки, синтезируемые под контролем определенного типа РНК, не могли бы облегчить репродукцию именно этих молекул РНК, если бы не удерживались поблизости от них. Более того, до тех пор, пока белки свободно диффундировали в популяции реплицирующихся молекул РНК, они в равной степени способствовали размножению любого из конкурирующих видов РНК. Если возникала РНК, производящая улучшенный тип фермента, новый фермент не способен был избирательно обеспечить выживание именно этой измененной РНК. Отбор молекул РНК по качеству кодируемых ими белков не мог начаться раньше, чем появился некий замкнутый объем (компартмент), заключивший в себя белки, произведенные молекулой РНК. Таким образом, эти белки становятся доступными только для РНК, порождающей их (рис. 1-8). Рис. 1-8. Схема, демонстрирующая эволюционное преимущество компартментализации. В смешанной популяции самореплицирующихся молекул РНК, способных направлять синтез белка (как показано на рис. 1-7), любой улучшенный вид РНК, производящий более полезный белок, вынужден делиться плодами этого преимущества со всеми своими конкурентами. Но если РНК заключена в каком-либо компартменте (таком, например, как липидная мембрана), то любой производимый ею белок используется для ее собственных нужд. Таким образом, появляется возможность отбора РНК по качеству производимого ею белка. Важнейшая роль в эволюции клеточных мембран, по-видимому, принадлежит классу амфипатических молекул, которые обладают простым физико-химическим свойством: одна их часть гидрофобна (нерастворима в воде), а другая - гидрофильна (растворима в воде). Когда такие молекулы попадают в воду, они располагаются так, что их гидрофобные части приходят в тесный контакт друг с другом, а гидрофильные части - в контакт с водой. Амфипатические молекулы способны спонтанно агрегировать, образуя двухслойные структуры в виде маленьких замкнутых пузырьков, изолирующих водное содержимое от внешней среды (рис. 1-9). Этот феномен может быть продемонстрирован в пробирке путем простого смешивания фосфолипидов и воды: при подходящих условиях действительно образуются маленькие пузырьки. Все ныне существующие клетки окружены плазматической мембраной, состоящей из амфипатических молекул, главным образом фосфолипидов, такой структуры; в клеточных мембранах в состав липидного бислоя входят также амфипатические белки. В электронном микроскопе такие мембраны имеют вид листков толщиной около 5 нм с выраженной трехмерной структурой (следствие плотной укладки фосфолипидных молекул хвост к хвосту). Не совсем ясно, в какой момент эволюции биологического катализа были сформированы первые клетки. Они могли появиться, когда молекулы фосфолипидов пребиотического бульона случайно собрались в мембранную структуру, заключившую в себя самореплицирующуюся смесь каталитических молекул РНК. Однако принято считать, что синтез белков осуществлялся до появления клеток. В любом случае, как только они оказались заключенными в замкнутую мембрану, молекулы РНК начали эволюционировать не только на основе их собственной структуры, но также в зависимости от их воздействия на другие молекулы в том же компартменте: нуклеотидные последовательности РНК могли теперь влиять на признаки целой клетки. Рис. 1-9. Клеточные мембраны состоят из фосфолипидов. Поскольку эти молекулы имеют гидрофильные «головы» и липофильные (гидрофобные) «хвосты», на поверхности раздела воды и масла они самопроизвольно будут располагаться головными концами к воде, а хвостовыми к маслу. В воде эти молекулы ассоциируют с образованием замкнутых двухслойных пузырьков (везикул), в которых липофильные хвосты контактируют друг с другом, а гидрофильные контактируют с водой. 1.1.7. Все современные клетки используют ДНК в качестве наследственного материала Нарисованная нами выше картина, конечно, весьма умозрительна. Не существует ископаемых остатков, по которым можно было бы проследить зарождение первой клетки. Тем не менее анализ современных организмов и лабораторные опыты убедительно показывают, что в основных чертах наш эволюционный обзор справедлив. События, обусловившие образование первой клетки (пребиотический синтез малых молекул, саморепликация молекул РНК, трансляция последовательностей РНК в аминокислотные последовательности, возникновение окруженных мембранами компартментов в результате самосборки молекул липидов), очевидно, происходили 3,5-4 млрд. лет назад. Полезно сравнить нашу гипотетическую первую клетку с простейшими современными клетками, микоплазмами. Микоплазмы это похожие на бактерий мелкие организмы, обычно ведущие паразитический образ жизни, тесно связанный с какими-либо клетками растений или животных (рис. 1-10). Они имеют в диаметре около 0,3 мкм и содержат нуклеиновую кислоту в количестве, достаточном для кодирования приблизительно 750 различных белков. Некоторые из этих белков являются ферментами, другие выполняют структурные функции, часть белков находится внутри клетки, но есть и встроенные в ее мембрану. Все вместе они синтезируют те из нужных клетке малых молекул, которых нет в окружающей среде, перераспределяют энергию, необходимую для протекания биосинтетических реакций, и поддерживают в клетке необходимые химические условия. Первые клетки на Земле, по-видимому, содержали значительно меньше компонентов, чем микоплазмы, и делились значительно медленнее. Однако существует и более существенное различие между примитивными клетками и микоплазмами (и, разумеется, любыми другими современными клетками): генетическая информация в существующих ныне клетках хранится в ДНК, а не в РНК, что было присуще примитивным клеткам. В современных клетках есть оба типа полинуклеотидов, но в ходе эволюции они специализировались и работают сообща, выполняя каждый свою функцию. Небольшие химические различия между этими двумя типами молекул делают их приспособленными для решения разных задач. Например, ДНК используется в качестве хранилища генетической информации, поскольку ее молекула более стабильна, чем молекула РНК. Частично это обусловлено тем, что у ДНК отсутствует гидроксильная группа сахара, и поэтому РНК в большей степени подвержена гидролизу. Кроме того, ДНК в отличие от РНК существует преимущественно в виде двухцепочечных молекул, состоящих из двух комплементарных полинуклеотидных цепей, Такая двухцепочечная структура позволяет ДНК относительно легко реплицироваться (что будет изложено в гл. 3) и репарировать повреждения: при этом неповрежденная цепь ДНК служит матрицей для восстановления комплементарной дефектной цепи. Используя все тот же принцип комплементарности, ДНК направляет синтез отдельных молекул РНК, однако в этом случае спаривание происходит между несколько различающимися типами нуклеотидов. Синтезированные таким образом одноцепочечные молекулы РНК выполняют две другие функции первобытных полинуклеотидов: они направляют синтез белков и как кодирующие молекулы (информационные РНК), и как каталитические молекулы (рибосомные и другие неинформационные РНК). Рис. 1-10. Предполагаемые стадии эволюции от простых самореплицирующихся систем молекул РНК до современных клеток, у которых ДНК является хранилищем генетической информации, а РНК выполняет роль посредника в осуществлении белкового синтеза. Существующие на сегодняшний день представления об эволюции первобытных молекул можно суммировать так. Генетические и каталитические свойства РНК позволяют предположить, что именно эти молекулы первыми включились в эволюцию. После возникновения эффективного синтеза белка ДНК приняла на себя генетическую функцию, белки стали основными катализаторами, а РНК сохранилась главным образом как промежуточное звено между ними (рис. 1-12). ДНК стала необходимой только тогда, когда клетки сильно усложнились и для них потребовалось значительно больше генетической информации, чем та, которую могли стабильно поддерживать молекулы РНК. Заключение Живые клетки скорее всего появились на Земле приблизительно 3,5 млрд, лет назад в результате спонтанной агрегации молекул. Изучение современных организмов и содержащихся в них молекул позволяет предполагать, что развитие автокаталитических механизмов, присущих живым системам, началось с эволюции группы молекул РНК, которые могли катализировать собственную репликацию. Со временем одна из этих групп согласованно катализирующих РНК приобрела способность к прямому синтезу полипептидов. Первые клетки, по-видимому, широко использовали каталитические функции и РНК, и белков, а в качестве вещества наследственности содержали только РНК. После того как накопление дополнительных каталитических белков сделало возможным развитие более эффективных и сложных клеток, двухцепочечная ДНК заменила РНК в роли хранителя генетической информации. Лекция №2. Молекулярные механизмы репликации. Цель лекции: Ознакомить генетической информации. с основными механизмами репликации 1. Макромолекулы Основные клеточные макромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды – это полимеры аминокислот, нуклеотидов и сахаров, синтезируемые из соответствующих малых молекул. Макромолекулы отвечают за сборку клеточных компонентов, за катализ химических реакций, за осуществление движений клетки и (самое важное) за наследственность. Выполнение всех этих жизненно важных функций обеспечивается информационным содержанием биологических макромолекул. На долю макромолекул приходится большая часть сухого вещества клетки. Их молекулярные массы составляют от 10тыс. до 1млн., т.е. по такие молекулы занимают промежуточное положение между органическими малыми молекулами и такими надмолекулярными структурами, как рибосомы или вирусы. Обычно в построении каждой макромолекулы участвуют лишь субъединицы одного семейства. Так, аминокислоты, связываясь с другими аминокислотами, образуют белки; нуклеотиды, связываясь с другими нуклеотидами, образуют нуклеиновые кислоты; а сахара, связываясь с другими сахарами, образуют полисахариды. Поскольку для нормального функционирования макромолекулы решающее значение имеет точная последовательность субъединиц (мономеров), при биосинтезе макромолекул должны действовать механизмы, точно определяющие положение каждого мономера в цепи полимера. Макромолекулярные цепи образуются с помощью ковалентных связей, которые достаточно прочны, чтобы поддерживать последовательность субъединиц макромолекулы в течение длительного времени. Но заключённая в этой последовательности информация выражается с помощью более слабых нековалентных связей. Такие слабые связи могут возникать как между разными частями одной и той же молекулы, так и между разными макромолекулами. В совокупности эти связи определяют и пространственную структуру макромолекулярных цепей, и их взаимодействие. Нековалентные связи в биологических молекулах подразделяют на три типа: ионные взаимодействия, водородные связи и вандерваальсовы взаимодействия. Ионные взаимодействия образуются между полностью заряженными группами или между частично заряженными группами. В отсутствие воды ионные силы очень велики. Они обусловливают прочность многих минералов, например мрамора и агата. В результате взаимодействия с молекулами воды заряженные группы экранируются, поэтому в водном растворе ионные взаимодействия сравнительно слабы (энергия равна примерно энергии водородной связи). Водородную связь образует атом водорода, «поделённый» между двумя электроотрицательными атомами (например, О и N). Вандерваальсовы притяжения возникают из-за флюктуаций электрических полей между любыми двумя атомами на очень близких расстояниях. Каждый атом имеет характерный вандерваальсов радиус (Н – 1,2Å; О – 2,0Å; О – 1,4Å; N – 1,5Å). Индивидуальные вандерваальсовы взаимодействия значительно слабы, но могут оказаться существенными при очень тесном сближении поверхностей двух макромолекул. Ещё одно важное слабое взаимодействие создаётся пространственной структурой воды, которая стремится вытеснить гидрофобные группы, нарушающие сеть из связанных водородными связями молекул воды, и таким образом объединяет эти гидрофобные группы и сводит к минимуму их влияние (рис.3). Такое выталкивание из водного раствора иногда считают четвёртым типом слабой нековалентной связи и называют гидрофобным взаимодействием. В водном растворе нековалентные связи примерно в 100 раз слабее ковалентных – их энергия лишь ненамного превышает среднюю энергию столкновений молекул, обусловленную тепловым движением, при 37°С. Нековалентные связи обусловливают специфичность биологического узнавания, например узнавание ферментом своего субстрата. 1.2. Нуклеиновые кислоты Главные функции нуклеиновых кислот состоят в хранении и передаче генетической информации. Неизвестны существа, где эти функции осуществлялись бы без их участия. Решающим фактором при отборе для этих целей в процессе эволюции именно нуклеиновых кислот явилось сочетание возможностей, во-первых, к образованию ими гигантских устойчивых линейных полимеров и, во-вторых, к сборке на матрице такого полимера его «негативной копии», которая в свою очередь может служить матрицей для синтеза точной копии исходного. Другие биополимеры не обладают указанным сочетанием свойств. Вместе с тем не стоит забывать, что непременными участниками процесса воспроизведения генетической информации являются белки. Нуклеиновые кислоты являются важнейшими регуляторами и участниками многих процессов биосинтеза. Правда, и эта их роль не уникальна – они делят её опять-таки с белками. Хранение и передача генетической информации – это одна из форм биологической памяти. У большинства живых существ хранителями наследственной информации являются наиболее консервативные по структуре и свойствам двухцепочечные дезоксирибонуклеиновые кислоты – ДНК. Лишь у части наиболее просто организованных живых существ – вирусов генетическими нуклеиновыми кислотами (ГНК) являются двухцепочечные рибонуклеиновые кислоты – РНК, а также одноцепочечные ДНК и РНК. Эволюционно РНК возникла раньше ДНК, на какой-то более поздней стадии эволюционного процесса ДНК заменила РНК в качестве вещества наследственности. ДНК представляет собой длинный неразветвлённый полимер, состоящий всего из четырёх субъединиц – дезоксирибонуклеотидов, азотистые основания которых представлены аденином (А), цитозином (Ц), гуанином (Г) и тимином (Т). Нуклеотиды связаны между собой ковалентными фосфодиэфирными связями, соединяющими 5′-атом углерода одного остатка дезоксирибозы с 3′атомом углерода следующего остатка (рис 16). В 1953г. Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком была построена модель структуры ДНК. Уотсон и Крик показали, что ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей. Каждая цепь закручена в спираль вправо, и обе они свиты вместе, т.е. закручены вправо вокруг одной и той же оси, образуя двойную спираль. Цепи антипараллельны, т.е. направлены в противоположные стороны, так что 3′-конец одной цепи располагается напротив 5′-конца другой (рис.18). Каждая цепь состоит из сахарофосфатного остова, вдоль которого перпендикулярно длинной оси двойной спирали располагаются основания. Основная особенность этой модели заключается в том, что все основания ДНК расположены внутри двойной спирали, а сахарофосфатный остов – снаружи. Отсюда следует, что основания одной цепи должны быть очень сильно сближены с основаниями другой цепи. Согласно этой модели, оптимальное соответствие цепей достигается в том случае, если при комплементарном спаривании одно большое пуриновое основание (А или Г – каждое с двойным гетероциклом) связывается с меньшим по размеру пиримидиновым основанием (Т или Ц – с одинарным гетероциклом). В противном случае условия для спаривания оснований, входящих в состав сдвоенных полинуклеотидных цепочек, были бы неблагоприятными (двум пуриновым основаниям было бы слишком «тесно», а два пиримидиновых были бы расположены в среднем слишком далеко друг от друга). Более того, построение моделей показало, что между Г и Ц или между А и Т образуется больше эффективных водородных связей, чем между любыми другими комбинациями нуклеотидов. Структура нуклеиновых кислот Молекулы ДНК выглядят под электронным микроскопом как длинные нити. Незамкнутые или образующие неправильной формы кольца. Циклическую форму имеют молекулы ДНК вирусов, бактерий, а также митохондрий и хлоропластов. Молекулы ДНК в ядрах эукариот не обладают циклической формой. Диаметр нитей ДНК близок к 20 Å, длина варьирует в очень широких пределах. Длина нитей ДНК у прокариот лежит в пределах от 5000 Å до 2×10 7 Å, т.е. 0,05 – 2 мм. Это соответствует молекулярному весу 108 – 4×1011. У эукариотов вероятные значения длины ДНК достигают сантиметров и соответствуют 1010 – 1011 дальтон. Нити ДНК относительно негибки; наименьший радиус их изгиба составляет несколько сотен ангстрем. Нити РНК значительно тоньше (≈7 Å) и обладают меньшей упругостью, чем нити ДНК, образуя либо плотные клубки, либо короткие толстые палочки. Длина нитей РНК варьирует в пределах от 400 до 4×104 Å, а молекулярный вес – от 25×103 до 2×106 дальтон. Количественные характеристики биспиральной молекулы ДНК таковы: каждый виток спирали содержит 10 нуклеотидов, проекция витка на ось молекулы составляет 34,6 Å, трансляционное расстояние на каждый нуклеотид равняется, следовательно, 3,4 Å; диаметр молекулы близок к 20 Å; поперечник большой борозды равен, примерно, 17 Å, а малой – 11 Å (рис.19). Рисунок 18 Схема биспиральной структуры ДНК. Рисунок 19 Количественные характеристики биспиральной молекулы ДНК. 1. 3. Репликация ДНК В комплементарности оснований ДНК заложена и возможность её удвоения, заключающаяся в разъединении комплементарных цепей и достройке к каждой из них новых комплементарных цепей (рис.23). Процесс удвоения молекулы ДНК называется репликацией (редупликацией). Рисунок 23 Репликация двойной спирали ДНК. Способ воспроизведения ДНК, предложенный Уотсоном и Криком, называется полуконсервативным механизмом редупликации. Как отметил Г.Стент, можно выделить три способа редупликации: 1) консервативный – вновь синтезированная молекула не содержит материала родительской ДНК; 2) полуконсервативный – каждая вновь синтезированная молекула представлена одной родительской и одной вновь синтезированной цепями; 3) дисперсный – материал исходной молекулы случайно распределяется в обеих цепях дочерней двойной спирали (рис.24 ). Экспериментальные доказательства полуконсервативности редупликации ДНК были получены М.Мезельсоном и Ф.Сталем в 1957г. Рисунок 24 Возможные пути воспроизведения ДНК. 1 – консервативный; 2 – полуконсервативный; 3 – дисперсный. Светлым показаны вновь реплицированные цепи или их участки. Хотя принцип репликации генов прост и элегантен, реальный клеточный аппарат копирования сложен и включает в себя много различных белков. Основная реакция показана на рис. 25. Фермент ДНК-полимераза катализирует присоединение дезоксирибонуклеотида к 3′-концу цепи ДНК. Каждый нуклеотид вступает в реакцию в форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата; высвобождение из этой активированной формы пирофосфата и его последующий гидролиз обеспечивают энергией реакцию репликации ДНК и делают её фактически необратимой. Репликация ДНК начинается с локального разделения двух комплементарных цепей. Затем каждая цепь используется в качестве матрицы для образования новой молекулы ДНК путём последовательного присоединения дезоксирибонуклеотидов. Выбор каждого следующего нуклеотида происходит на основе его способности образовывать комплементарную пару с очередным нуклеотидом родительской матричной цепи. Рост полинуклеотидной цепочки идёт только с её 3′-конца, т.е. в направлении 5′→3′. ДНК-полимераза неспособна начать матричный синтез на одноцепочечной ДНК, если нет хотя бы олигонуклеотидного биспирального участка или, иначе говоря, затравочного олигонуклеотида, комплементарного матрице. В сложных системах in vitro и in vivo всегда, по-видимому. В среде встречаются продукты распада ДНК и в их числе хотя бы незначительные количества олигонуклеотидов (три- и тетрануклеотидов, как минимум), комплементарных тому или иному участку одноцепочечной ДНК. Присоединяясь к одноцепочечной матрице, они могут служить затравкой. В последнее время установлено, что in vivo во многих случаях затравочным олигонуклеотидом является не ДНК, а РНК. Это можно объяснить тем, что в отличие от ДНК матричный синтез РНК может начинаться без затравки и, более того, РНК-полимеразы в отличие от ДНК-полимераз обладают большей специфичностью в отношении выбора начальной точки участка, подлежащего репликации. Реакция репликации ДНК требует для своего протекания присутствия двухвалентных катионов Мg2+ в концентрации 102–10-3. Она стимулируется также физиологическими значениями концентрации КСl и Н-ионов. В оптимальных условиях одна молекула энзима обеспечивает включение в строящуюся ДНК около 1000 нуклеотидов в минуту. ДНК-полимераза имеет один центр связывания нуклеозидтрифосфата, общий для всех четырёх дНТФ. Выбор из среды дНТФ, основание которого комплементарно очередному основанию матрицы, протекает без ошибок только в том случае, когда структура центра связывания субстрата не искажена. Радиоавтографические исследования, проведённые в начале 1960-х годов на целых реплицирующихся хромосомах, меченных импульсной меткой (3Нтимидин), выявили существование ограниченной зоны репликации, перемещающейся вдоль родительской спирали ДНК. Эта активная зона из-за своей Y-образной формы была названа репликационной вилкой. В каждом таком участке синтезируется ДНК двух новых дочерних спиралей. Репликационная вилка асимметрична. Из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывно, а другая с перерывами. Первую называют ведущей (или лидирующей), поскольку она синтезируется быстрее, а вторую – отстающей. Синтез второй цепи идёт медленнее, потому что, хотя в целом вся эта цепь строится в направлении 3′→5′, каждый из её фрагментов в отдельности наращивается в направлении 5′→3′. Благодаря тому, что ДНК на отстающей части вилки строится при помощи механизма, работающего прерывисто по типу «шитья назад иголкой», в репликационной вилке не требуется никакого другого фермента, кроме (5′→3′)-ДНК-полимеразы. Рисунок 25 Механизм репликации ДНК (по Албертс Б. и др.,1986) Точность копирования при репликации ДНК столь велика, что в среднем на каждые 1×109 комплементарных пар, образующихся в процессе воспроизведения генома млекопитающих, насчитывающего 3×109 пар оснований, приходится лишь около одной ошибки. Процесс репликации ДНК требует совместного действия многих белков. В нём участвуют: 1) ДНК-полимераза и РНК-праймаза, катализирующие полимеризацию нуклеозидтрифосфатов; 2) ДНК-геликазы и дестабилизирующие белки, помогающие расплести спираль ДНК, которую предстоит копировать; 3) ДНК-лигазы и фермент, разрушающий молекулы РНК-затравки; они нужны для сшивания прерывисто синтезируемых фрагментов отстающей цепи ДНК; 4) ДНК-топоизомеразы, помогающие решить «проблему кручения» спирали ДНК; 5) инициаторные белки, способствующие образованию новой репликационной вилки в точке начала репликации. Лекция №3. Молекулярные механизмы транскрипции. Матричный синтез РНК. Цель лекции: Ознакомить с основными механизмами траскрипции. 3.3 Матричный синтез РНК. Транскрипция Транскрипцией называют механизм, с помощью которого последовательность оснований в одном из цистронов цепи ДНК «переписывается» в комплементарную ей последовательность оснований мРНК. На матрице двухцепочечных ДНК синтезируется подавляющее большинство РНК животных клеток, бактерий и ДНК-содержащих вирусов. На матрице двухцепочечных РНК образуются одноцепочечные РНК ряда вирусов. Матричный синтез одноцепочечных РНК существенно отличается от редупликации ДНК и двухцепочечных РНК. Прежде всего он является консервативным, а не полуконсервативным: продукт синтеза не включает каких-либо компонентов матрицы. Кроме того, энзимы матричного синтеза РНК – РНК-полимеразы отличаются от ДНК-полимераз определённой специфичностью к разным матрицам и даже участкам матриц. Консервативный характер синтеза и необходимость в ряде случаев реплицировать не обе цепочки матрицы, а лишь одну, и не на всём протяжении, а лишь на определённых участках её, привели к возникновению не только специальных механизмов узнавания начальной точки синтеза, но и систем «выбора цепи» для асимметричного синтеза, а также завершения (терминации) процесса. Наконец, существенная особенность матричного синтеза РНК, отличающая его от репликации ДНК, состоит в том, что для начала процесса не нужен затравочный фрагмент второй полинуклеотидной цепочки. Синтез начинается с реакции между двумя мононуклеотидами. Поэтому для матричного синтеза РНК характерно наличие сложной стадии инициации, имеющей ряд существенных отличий от последующих реакций. Общая схема матричного синтеза РНК представлена на рис.26. Первый нуклеотид входит в состав цепи без отщепления пирофосфата, а последующие, отщепляя пирофосфат, присоединяются к 3′-углеродному атому рибозы. Цепочка растёт в направлении 5′→3′, и в этом отношении процесс подобен матричному синтезу ДНК. Процесс синтеза РНК, катализируемый РНК-полимеразой, делится на четыре стадии: 1) присоединение энзима к матрице; 2) инициация синтеза; 3) наращивание синтезируемой цепи РНК – элонгация; 4) завершение синтеза РНК – терминация. Первая стадия обусловлена взаимодействием РНК-полимеразы с небольшими участками ДНК определённой структуры. РНК-полимераза узнаёт участок ДНК, относительно богатый АТ-парами и пиримидиновыми блоками и прочно с ним связывается. Данный участок называется промотором. В зоне, относительно богатой АТ-парами, прочность связи между цепями снижена и поэтому именно здесь предполагается временное расхождение цепей, необходимое для начала транскрипции. Фрагмент одной из цепей ДНК 5′ 3′ С А Т С А Т А Центр связывания субстрата С РНК-полимераза G НО 3′ Р Р~ Р~ Р Р 1 Р Инициация 2 С С А Т С А Т С С А G НО 3′ Р U Р~ Р~ Р А Т С Элонгация С А U 2 Р~ Р~ Р 2 1 Т С С А G НО 3′ Р Р Р~ Р~ Р Р 1 Р Центр связывания 3′-ОН-группы Рисунок 26 Схема синтеза РНК на матрице ДНК – стадии инициации и элонгации. Вторая стадия процесса – начало синтеза, инициация – достаточно чётко отграничена от стадии присоединения энзима к ДНК. В неё входит, во-первых, присоединение начального нуклеозидтрифосфата к первому центру энзима, который специализирован на взаимодействии с 3′-ОН-группой рибозила; вовторых, присоединение второго нуклеозидтрифосфата к расположенному рядом второму центру энзима, который называют центром связывания субстрата, и. В-третьих, замыкание первой фосфодиэстерной связи с отщеплением пирофосфата. Первый нуклеозидтрифосфат в цепи РНК отличается от последующих не только тем, что не отщепляет пирофосфат, но и тем, что он всегда или почти всегда содержит пурин – гуанин или аденин. Третья стадия процесса – элонгация. Образовавшийся при инициации динуклеотид связан с матричной ДНК, в то время как связь с ним РНКполимеразы ослабляется, ибо после замыкания фосфодиэстерного мостика исчезает С′3—ОН-группа начального нуклеотида, взаимодействовавшая с центром 1, а второй нуклеотид после отщепления пирофосфата уже не является субстратом, на взаимодействии с которым специализирован центр 2. Поэтому центр 1 вступает в связь с С′3—ОН-группой второго нуклеотида, для чего молекула РНК-полимеразы смещается вдоль цепи на расстояние, равное дистанции между соседними нуклеотидами. Это движение энзима в направлении роста полинуклеотидной цепи называется транслокацией. Далее, как это показано на рис.26, к центру 2 присоединяется следующая молекула субстрата, замыкается новый фосфодиэстерный мостик, и далее процесс продолжается за счёт многократного повторения таких же этапов. Скорость полимеризации при 37ºС равна примерно 30 нуклеотидов в 1с. Фермент продолжает присоединять нуклеотиды к растущей цепи РНК до тех пор, пока не встретит на своём пути ещё одну специфическую нуклеотидную последовательность в цепи ДНК, так называемый стоп-сигнал, или сигнал терминации траскрипции. Последняя стадия матричного синтеза РНК – терминация, завершение роста цепочки и её отделение в конце цистрона или оперона. Достигнув точки терминации, РНК-полимераза отделяется и от матричной ДНК, и от новосинтезированной цепи РНК. Во время продвижения фермента вдоль матричной цепи на коротком её участке образуется двойная спираль РНК— ДНК. Однако она не столь стабильна, как спираль ДНК—ДНК. Поэтому последняя быстро восстанавливается, вытесняя РНК. Вследствие этого каждая цепь РНК отделяется от ДНК-матрицы в виде свободной одноцепочечной молекулы РНК. Лекция №4. Биосинтез белка. Трансляция генетической информации. 3.4 Синтез белка. Трансляция 3.4.1 Транспортные РНК Роль главных агентов в процессе синтеза белка играют молекулы тРНК: к ним присоединяются аминокислоты перед полимеризацией, т.е. перед объединением в полипептиды. Присоединяясь к молекуле тРНК своим карбоксильным концом, аминокислоты активируются – переходят в богатую энергией форму, способную спонтанно образовать пептидную связь, что и приводит к синтезу полипептидов. Этот процесс активации – необходимый этап белкового синтеза, поскольку свободные аминокислоты не могут прямо присоединяться к полипептидной цепи. (Спонтанно способен идти лишь обратный процесс – гидролитический разрыв пептидных связей.) В каком именно месте будет присоединена к растущей полипептидной цепи данная аминокислота, зависит не от самой аминокислоты, а от присоединившей её молекулы тРНК. Существует специальный набор ферментов, так называемых аминоацилтРНК-синтетаз, которые присоединяют аминокислоты к соответствующим молекулам тРНК. Для каждой из аминокислот имеется своя особая синтетаза. Реакция протекает в два этапа и приводит к образованию молекулы аминоацилтРНК. Реакция образования аминоацил-тРНК обратима, так как энергия, освобождающаяся при отщеплении пирофосфата, практически не растрачивается, а резервируется при формировании эфирной связи между карбонилом аминокислоты и остатком ά-ортофосфата. Молекулы тРНК играют роль конечных «адапторов», переводящих информацию, заключённую в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, на язык белка. Транспортные РНК относятся к категории относительно низкополимерных РНК клетки. Их молекулярный вес составляет всего лишь 25 – 28 тыс. дальтон. Единственная полинуклеотидная цепочка состоит из 75 – 85 нуклеотидов. Для нуклеотидного состава тРНК характерно преобладание гуанина и цитозина (суммарная молярная доля – около 60%) . Структура и свойства тРНК, во-первых, обеспечивают связывание остатка аминокислоты в форме, обладающей достаточным запасом энергии для последующего образования пептидной связи; во-вторых, определяют точную ориентацию аминокислотного остатка на рибосоме и, в-третьих, обеспечивают строгую специфичность и выбора, и включения в строящийся пептид транспортируемой аминокислоты. Первая функция сама по себе не требует специфичности взаимодействия с активированными аминокислотами, и ей соответствует универсальный для всех тРНК 3′-концевой участок молекулы, так называемый акцепторный, который включает тринуклеотид ЦЦА. Именно 3′-ОН-группа концевого аденина замещается остатком аминокислоты. Вторая функция требует жёсткости и ряда общих особенностей структуры всех тРНК. Высокая доля спирализованных участков, в которых преобладают наиболее прочные пары – ГЦ, обеспечивает необходимую жёсткость вторичной структуры молекулы (рис.27). В молекулах тРНК имеются четыре спирализованных участка (рис.27, А, Б, В, Г), три из которых (рис.27, Б, В, Г) увенчаны петлями из неспаренных нуклеотидов, и, кроме того, имеется центральная неспирализованная область. 3′- и 5′-концы полинуклеотидной цепочки объединены в наиболее значительный спирализованный участок (7 пар), завершающийся акцепторным олигонуклеотидом ЦЦА (рис.27, Д). Рисунок 27 Схема строения тРНК Противостоящая акцепторному концу петля содержит тринуклеотид – антикодон, который обеспечивает специфичность взаимодействия с мРНК (рис. 27, Е). Нуклеотиды, образующие антикодон, всегда расположены в середине петли. Выполнение третьей функции возможно лишь при условии существования большого числа разновидностей тРНК. Основная реакция в синтезе белка – это реакция, приводящая к образованию пептидной связи между карбоксильной группой на конце растущей полипептидной цепи и свободной аминогруппы аминокислоты. Белковая цепь синтезируется, следовательно, путём её постепенного наращивания от аминного конца к карбоксильному. На протяжении всего процесса растущий карбоксильный конец полипептидной цепи остаётся в активированном состоянии, будучи связан ковалентной связью с тРНК (в молекуле пептидил-тРНК). В процессе синтеза белка каждая добавляемая аминокислота несёт с собой энергию активации, необходимую не для её собственного присоединения, а для присоединения следующей аминокислоты. В процессе трансляции нуклеотидная последовательность мРНК считывается группами по три нуклеотида по мере того, как считывающий «аппарат» перемещается вдоль молекулы мРНК в направлении 5′→3′. Каждая аминокислота соответствует определённому триплету нуклеотидов (кодону) в молекуле мРНК, который спаривается с последовательностью из трёх комплементарных нуклеотидов в антикодоновой петле молекулы тРНК. Выбор аминокислоты, присоединяемой в каждый данный момент к растущему концу полипептидной цепи, определяется кодоном. Лекция №5. Структура рибосом и трансляция. Цель лекции: Ознакомить с ультраструктурой рибосом. Изучить основные этапы трансляции. 3.4.2 Структура рибосом Рибосомы найдены во всех известных живых существах, кроме истинных вирусов и некоторых других особенно просто устроенных клеточных паразитов, которые в своём развитии используют рибосомы клетки-хозяина. Рибосомы эукариот и прокариот сходны по своей структуре и функции. Каждая из них состоит из двух субчастиц – большой и малой, обратимо диссоциирующих после завершения синтеза одного полипептида (рис.28). В эукариотических рибосомах приблизительно половину их массы составляет РНК; малая субчастица состоит из одной молекулы рибосомной РНК (рРНК), связанной приблизительно с различными рибосомальными белками, а в большой субчастице свыше 40 различных рибосомных белков связано с тремя разными молекулами РНК. Прокариотические рибосомы несколько мельче и содержат меньшее число компонентов. В рибосомах обоих типов имеется бороздка, удерживающая растущую полипептидную цепь, и бороздка, удерживающая молекулу мРНК. Рисунок 28 Структура рибосомы На субчастицах рибосомы находится ряд участков и центров функциональной активности. На краю контактной поверхности, которой малая субчастица обращена к большой, расположена зона связывания мРНК (рис.29). Рибосома способна присоединить у эукариот фрагмент мРНК длиной 30 – 35 нуклеотидных остатков. Особое значение имеет небольшой её участок, близкий по протяжённости к кодону, который полностью или частично совпадает с центром специфического связывания аминоацил-тРНК, обозначаемый далее как Асп . . Асп –центр функционирует совместно с очередным кодоном мРНК, помогая связыванию только той аминоацил-тРНК, которая обладает соответствующим антикодоном. Само по себе взаимодействие кодона с антикодоном , хотя и специфично, но недостаточно для прочной фиксации аминоацил-тРНК. Асп –центр служит именно для повышения прочности её присоединения, причём это его действие не распространяется на аминоацилтРНК с «чужими» антикодонами. Рисунок 29 Рибосома бактерии, её субчастицы На большой субчастице, опять-таки на поверхности, которой она обращена к малой субчастице, находится область связывания пептидил-тРНК (тРНК, присоединённая к растущему концу полипептидной цепи), поэтому его называют пептидил-тРНК-связывающим участком или П-участком. Рядом с П-участком находится акцепторный участок, служащий для удержания только что прибывшей молекулы тРНК, нагруженной аминокислотой; его называют аминоацил-тРНК-связывающим участком или Ат-участком. Внутри П- и Ат-участков и между ними нужно выделить ещё один участок – Т (иногда обозначаемый ПТЦ – пептидил-трансферазный центр), который и определяет собственно катализ реакции пептидила. С большой субчастицей связана также транслоказная активность, обеспечивающая перемещение, уход новой пептидил-тРНК и сопряжённого с ней триплета мРНК из А-центра. Функция рибосомы заключается в том, чтобы удерживать в нужном положении мРНК, тРНК и белковые факторы, участвующие в процессе трансляции, до тех пор, пока между соседними аминокислотами не образуется пептидная связь. Рибосомы работают очень эффективно: в 1с одна бактериальная рибосома присоединяет к растущей полипептидной цепи 20 аминокислот, а человеческий организм за 1с производит 5×1014 молекул гемоглобина – белка с уникальной последовательностью 574 аминокислот. 3.4.3 Стадии трансляции Первая стадия – инициация – начинается с присоединения мРНК к малой субчастице, не связанной с большой субчастицей (рис.30). Характерно, что для начала процесса необходима именно диссоциированная рибосома. Связывание мРНК происходит в присутствии ионов Мg в концентрациях, близких к физиологическим. При этом два первых транслируемых кодона мРНК оказываются обращёнными к большой субъединице рибосомы. Замечательно, что мРНК связывается не любым своим отрезком, а именно начальной своей областью, где располагаются кодоны АУГ и ГУГ, соответствующие формилметионину (Кодоны АУГ и ГУГ соответствуют формилметионину, когда находятся в начале мРНК. В других областях мРНК они кодируют метионин и валин соответственно). Первой аминокислотой полипептида, строящегося на рибосоме, всегда служит формилметионин: Н3С—S—СН2 СН2 Н—С—N—СН О Н СООН Смысл того, что в первой (нулевой) аминокислоте синтезируемого полипептида аминогруппа блокирована, понятен. Формил стимулирует свойства отсутствующего пока пептидильного «хвоста», обеспечивая связь с Пучастком, и некоторые особенности пептидил-тРНК. Рисунок 30 Стадия инициации в биосинтезе белка Элонгация начинается с присоединения аминоацил-тРНК. Её следует считать первой, так как формилметионил-тРНК – это не аминоацил-тРНК, и, кроме того, после завершения синтеза полипептида (а по некоторым данным ещё по ходу элонгации) формилметионин в большинстве случаев отщепляется. Реакция присоединения Аа-тРНК к рибосоме, подготовленной к элонгации (и далее в начале каждого нового цикла элонгации) оказалась весьма сложной и отнюдь не сводится к взаимодействию кодона в Асп-центре с антикодоном. Каждый акт присоединения Аа-тРНК связан в естественных условиях с расщеплением одной молекулы ГТФ. Процесс элонгации полипептидной цепи на рибосоме может рассматриваться как цикл, слагающийся из трёх отдельных этапов (рис.31). На 1-м этапе молекула аминоацил-тРНК связывается со свободным Ат-участком большой субъединицы рибосомы, примыкающим к занятому П-участку; связывание осуществляется путём спаривания нуклеотидов антикодона с тремя нуклеотидами мРНК, находящимися в Асп –центре малой субъединицы. На 2-м этапе карбоксильный конец полипептидной цепи отделяется в П-участке от молекулы тРНК и образует пептидную связь с аминокислотой, присоединённой к молекуле тРНК в Ат-участке. Эта реакция катализируется пептидилтрансферазой. На 3-м этапе новая пептидил-тРНК переносится в Пучасток рибосомы, в то время как рибосома продвигается вдоль молекулы мРНК ровно на три нуклеотида. Этот этап требует затраты энергии, которая выделяется при расщеплении ГТФ. Процесс транслокации, составляющей 3-й этап, включает в себя и возвращение свободной молекулы тРНК, отделившейся от полипептидной цепи в П-участке во время 2-го этапа, в цитоплазматический пул тРНК. Поэтому после завершения 3-го этапа незанятый Ат-участок может принять новую молекулу тРНК, нагруженную очередной аминокислотой, т.е. цикл может начаться снова (рис.31). Б Рисунок 31 Этапы элонгации в биосинтезе белка В большей части клеток синтез белка – самый энергоёмкий из всех биосинтетических процессов. Образование каждой новой пептидной связи сопровождается расщеплением четырёх высокоэнергетических фосфатных связей. Две из них расходуются на то, чтобы нагрузить аминокислотой молекулу тРНК, а две – на сам синтез в двух циклических реакциях, протекающих на рибосоме: при связывании аминоацил-тРНК на 1-м этапе цикла и при транслокации рибосомы на 3-м этапе. В процессе терминации особый белок, называемый фактором освобождения, связывается с любым стоп-кодоном (УАА, УАГ или УГА), достигшим Ат-участка рибосомы. Это связывание изменяет активность соседней пептидилтрансферазы. Фрагмент с такой изменённой активностью присоединяет теперь к пептидил-тРНК не свободную аминогруппу аминокислоты, а молекулу воды. Вследствие этого карбоксильный конец растущей полипептидной цепи отделяется от тРНК. А поскольку растущий полипептид удерживается на рибосоме только посредством его связи с молекулой тРНК, завершённая белковая цепь оказывается свободной и, отделившись от рибосомы, поступает в цитоплазму. Новосинтизерованные белки обычно становятся активными сразу же после отделения от рибосомы , поскольку в основном процесс укладки полипептидных цепей осуществляется во время их синтеза. При физиологических условиях активно транслируемая мРНК находится в полирибосомах, или полисомах, образованных несколькими рибосомами, которые расположены на одной молекуле мРНК на расстоянии 80 нуклеотидов друг от друга. Лекция №6. Тонкое строение гена. Генетический контроль регуляции генной активности. Структура и функции гена. В настоящее время ген определяют как структурную единицу генетической информации, далее неделимую в функциональном отношении. Ген представлен участком молекулы ДНК (реже РНК). Понятие «ген» как дискретной единицы ввел В.Л.Иоганнсен (1909). Первая успешная попытка конкретизации представлений о гене принадлежит Т.Х.Моргану, который один из своих классических трудов назвал «Теория гена» (1926). Представления школы Т.Х Моргана о гене можно представить следующим образом. Гены находятся в хромосомах и представляют собой далее неделимые единицы мутации, рекомбинации и функции. Ген – это: 1) Единица мутации, т.е. ген изменяется как целое; 2) Единица рекомбинации, т.е. кроссинговер никогда не наблюдали в пределах гена; 3) Единица функции, т.е. все мутации одного гена нарушают одну и ту же генетическую функцию, что выражается в их некомплементарности у особей F1 при попарном скрещивании мутантов. Лекция №7. Генетический код. Цель лекции: Изучить важнейшие свойства генетического кода. 3.2 Генетический код Генетический код – это система расположения пар нуклеотидов в молекуле ДНК, контролирующая последовательность расположения аминокислот в молекуле белка. Сами гены не принимают участия в синтезе белка. Посредником между геном и белком является информационная РНК. Ген – матрица для молекулы информационной РНК. Три нуклеотида в иРНК как и отрезок молекулы ДНК составляют триплет, или кодон. Каждый из них соответствует определённой аминокислоте, включающейся в синтезируемую полипептидную цепочку. Главные черты генетического кода можно вкратце сформулировать следующим образом: 1. Кодом, определяющим включение аминокислоты в полипептидную цепь, служит триплет оснований в полинуклеотидной цепи ДНК. 2. Код универсален: одни и те же триплеты кодируют одни и те же аминокислоты у всех организмов. У всех живых организмов имеются одни и те же 20 аминокислот и одни и те же пять азотистых оснований (А, Г, Т, Ц и У). 3. Код является вырожденным (множественным): данная аминокислота может кодироваться более чем одним триплетом. Вырожденным называют код, в котором число аминокислот меньше числа кодонов. Вырожденность кода нельзя рассматривать как излишество. Она имеет существенное значение для повышения устойчивости систем хранения и передачи генетической информации к различным повреждающим и мутационным последствиям, а также для регуляции синтеза белков. В общем наименьшее влияние на смысл кодона оказывают замена третьего основания, несколько большее – замены первого и наибольшее – замены второго основания. 4. Код неперекрывающийся: например, последовательность мРНК, начинающаяся с нуклеотидов АУГАГЦГЦА, не считывается как АУГ/УГА/ГАГ…(перекрывание по двум основаниям) или АУГ/ГАГ/ГЦГ… (перекрывание по одному основанию). 5. Код специфичен. Нет случаев, когда один и тот же кодон соответствовал бы более чем одной аминокислоте. Можно отметить лишь, что два кодона: один из валиновых – ГУГ и метиониновый – АУГ несут дополнительную нагрузку. Если они находятся в начале считываемой области иРНК, то к ним присоединяется тРНК, несущая формилметионин. Последний всегда стоит в начале строящейся полипептидной цепочки, а по завершении синтеза либо отщепляется целиком, либо отщепляет формильный остаток, превращаясь в обычный метионил. Таким образом, кодоны ГУГ и АУГ служат инициаторами синтеза пептидной цепочки. Если же они не стоят первыми, то не отличаются по функциям от других кодонов, обеспечивая включение валина и метионина соответственно. 6. Важнейшим свойством кода является его однонаправленность. Кодоны имеют смысл, указанный в таблице 5, лишь в том случае, если они транслируются при синтезе белка в одном направлении – от первого основания к последующим. Более того, структура кодовых триплетов такова, что каждый из них является олигонуклеотидом, в котором первое основание расположено у 5′-, а последнее – у 3′- конца. Иначе говоря, в составе и-РНК кодоны всегда направлены своим первым основанием к 5′-концу полинуклеотида. 7. Цистрон – это участок генетической нуклеиновой кислоты, кодирующий первичную структуру одной полипептидной цепи или одной молекулы РНК. Таблица 5 Генетический код 5´-конец (первая буква в кодоне) U C A G Вторая буква в кодоне U C A G 3´-конец (третья буква в кодоне) Фен Фен Лей Лей Сер Сер Сер Сер Тир Тир ----------- Цис Цис ----Трп U C A G Лей Лей Лей Лей Про Про Про Про Гис Гис Глн Глн Арг Арг Арг Арг U C A G Иле Иле Иле Мет Тре Тре Тре Тре Асн Асн Лиз Лиз Сер Сер Арг Арг U C A G Вал Вал Вал Вал Ала Ала Ала Ала Асп Асп Глу Глу Гли Гли Гли Гли U C A G Лекция №8. Молекулярные основы мутации. Эволюция НК. Цель лекции: Изучить молекулярные механизмы и причины мутаций. Дать классификацию мутаций. Рассмотреть эволюцию нуклеиновых кислот. Различают наследственную и ненаследственную изменчивость. Под наследственной понимают способность к изменениям самого генетического материала, а под ненаследственной – способность организмов реагировать на условия окружающей среды, изменяться в пределах нормы реакции, заданной генотипом. Наследственную изменчивость в свою очередь подразделяют на комбинативную и мутационную. Комбинативная изменчивость представляет собой результат рекомбинации генов и перекомбинации хромосом, несущих различные аллели, и выражается в появлении разнообразия организмов – потомков, получивших новые комбинации дискретных единиц генетического материала, уже существовавших у родительских форм. В то же время мутационная изменчивость – это возникновение новых вариантов дискретных единиц генетического материала, прежде всего новых аллелей. Выделяют также онтогенетическую изменчивость – это реализация нормы реакции организма во времени, в ходе его индивидуального развития. Онтогенетическая изменчивость перекрывается с наследственной и ненаследственной изменчивостью. Теория мутаций зародилась в трудах Г.Де Фриза (1901 – 1903) и русского ботаника С.И.Коржинского. В соответствии с определением Г.Де Фриза: мутация представляет собой явления скачкообразного, прерывистого изменения наследственного признака. Основные положения мутационной теории Г.Де Фриза: 1) Мутации возникают внезапно как дскретные изменения признаков. 2) Новые формы устойчивы. 3) В отличие от ненаследственных изменений мутации не образуют непрерывных рядов, не группируются вокруг какого-либо среднего типа. 4) Мутации проявляются по-разному и могут быть как полезными, так и вредными. 5) Вероятность обнаружения мутаций зависит от числа исследованных особей. 6) Сходные мутации могут возникать неоднократно. Классификация мутаций. Существует несколько принципов классификации: А. По характеру изменения генома: 1. Геномные мутации – изменение числа хромосом. 2. Хромосомные мутации, или хромосомные перестройки, – изменение структуры хромосом. 3. Генные мутации – изменения генов. Б. По проявлению в гетерозиготе: 1. Доминантные мутации. 2. Рецессивные мутации. В. По уклонению от нормы или так называемого дикого типа: 1. Прямые мутации. 2. Реверсии. Г. В зависимости от причин, вызывающих мутации: 1. Спонтанные, возникающие без видимой причины. 2. Индуцированные мутации. Д. По локализации в клетке: 1. Ядерные. 2. Цитоплазматические (мутации неядерных генов). Е. По отношению к возможности наследования: 1. Генеративные, происходящие в половых клетках. 2. Соматические, происходящие в соматических клетках. В общем виде можно сказать, что мутации – это наследуемые изменения генетического материала. Нонсенс-мутации – это мутации, затрагивающие одно основание, которые могут вызвать такую замену оснований в одном из триплетов, что образуются нонсенс-кодоны. В этом случае образуется мРНК, соответствующая всему цистрону, но трансляция этой мРНК оборвется на нонсенс-кодоне., и пептид окажется недостроенным. Миссенс-мутации – это мутации, изменяющие смысл информации. При замене оснований происходит преобразование триплета в кодон другой аминокислоты. Мутации со сдвигом рамки – это мутации, обусловленные вставкой или потерей нуклеотида. Мутагены – это основные факторы, вызывающие мутации, классифицируются следующим образом: А. Факторы, способные воздействовать на покоящуюся, нереплицирующую ДНК; репликация может быть необходима лишь для закрепления мутации: 1) модификаторы оснований ДНК, под действием которых не происходит удаления оснований и образования поперечных сшивок цепей ДНК: азотистая кислота и некоторые другие окислители и восстановители, гидроксиламин; 2) химические агенты, способные не только модифицировать, но и отщеплять основания от рибозофосфатного скелета ДНК, а также разрывать полинуклеотидные цепочки: монофункциональные алкилирующие соединения, подкисление, нагревание (40 – 60˚С); свободные радикалы; 3)химические агенты, способные наряду с эффектами, присущими предыдущей группе, образовывать ковалентные мостики между основаниями, сшивки цепей ДНК: бифункциональные алкилирующие соединения, альдегиды, агенты типа митомицина С. Б. Факторы, действующие только при репликации ДНК: 1) аналоги оснований ДНК; 2) агенты, вызывающие при репликации вставку или исключение пары оснований: акридины и др.; 3) локальные флюктуации теплового движения атомов в основаниях ДНК, возникающие при физиологических условиях. В. Факторы, действующие опосредованно – на системы синтеза и репарации ДНК: 1) модификаторы реакций биосинтеза оснований ДНК: уретан, азопроизводные оснований, 6-меркаптопурин, 8-этоксикофеин, азасерин и т.д.; 2) модификаторы ДНК-полимеразы. Г. Факторы комбинированного действия: ингибиторы систем репарации ДНК, повышающие частоту спонтанных мутаций; 1) излучения; могут сочетать эффекты, присущие мутагенам А и В групп; возможно образование делеций (выпадение значительных фрагментов ДНК), а для некоторых видов излучений – хромосомных перестроек; 2) производные нитрозомочевины и нитрозогуанидина, могут сочетать эффекты мутагенов А и В; 3) супермутагены, агенты типа CR – 191 – сочетают эффекты мутагенов групп А и Б; 4) некоторые вирусы – за счет активизации лизосомальных нуклеаз и образования вирусспецифических энзимов, повреждающих ДНК и искажающих синтез оснований. Лекция №9. Молекулярные механизмы переноса и обмена нуклеиновых кислот. Плазмиды. Цель лекции: Изучить молекулярные механизмы переноса и обмена нуклеиновых кислот. Лекция №10. Современные аспекты и задачи генной инженерии. Цель лекции: Рассмотреть аспекты и задачи генной инженерии. 1. Цели и задачи предмета. 1.1 Цель изучения предмета. Выработать у студентов биологическое мышление, аналитический подход к явлениям природы, материалистическое мировоззрение. 1.2. Задачи предмета. Изучить структуру и основные этапы жизнедеятельности клетки, механизмы сохранения передачи наследственной информации, на молекулярном уровне. Курс молекулярной биологии завершает общую биологическую подготовку студентов и позволяет получить объем знаний, необходимых современному учителю биологии для осмысления сложного материала современной биологии. Основные вопросы: 1. Предмет и задачи курса. 2. Животные в составе органического мира. Формы живой материи. Значение животных в природе. 3. Основные дисциплины, изучающие животные организмы. Краткие сведения из истории зоологии. Основные принципы классификации. Охрана животного мира 1. Предмет и задачи курса. РАЗДЕЛ 3. Методические указания для проведения лабораторных занятий. Лабораторная работа № 1 Тема: Знакомство с устройством микроскопа. Подцарство Простейшие – Protozoa. Тип Саркомастигофора – Sarcomastigophora. Строение саркомастигофор на примере амебы протея - Amoeba proteus и эвглены зеленой – Euglena viridis. Цель занятия: Знакомство с устройством микроскопа. Дать основные понятия постоянным и временным препаратам. Усвоить технику приготовления временных препаратов. Ознакомить с морфологическими особенностями и жизненными циклами основных представителей типа Саркомастигофоры. Задание: Ознакомиться со строением амебы протея и эвглены зеленой, сделать рисунки. Форма тела, дифференцировка протоплазмы и движение амебы протея и эвглены зеленой. Пресноводные раковинные корненожки арцеллы и диффлюгии и морские корненожки фораминиферы. Паразитические жгутиконосцы. Материал и оборудование: Микроскопы. Живые представители амебы и эвглены (временные и постоянные микропрепараты). Диффлюгия, фораминиферы, трипанасомы, лямблия, лейшмания – постоянные микропрепараты. Таблицы по основным представителям. Методические рекомендации. Краткие правила микроскопирования. 1. Подготовка микроскопа 1) Поставить микроскоп слева у заднего края стола. Во время работы микроскоп не передвигать. 2) Привести микроскоп в исходное положение: а) конденсор поднять до уровня предметного столика и совместить отверстие столика и верхнюю линзу конденсора. б) объектив малого увеличения (8) поставить над столиком на расстоянии 1 см. в) полностью открыть диафрагму. г) при пользовании настольной лампой, в кольцо конденсора вложить матовый светофильтр. д) ярко и равномерно осветить вогнутым зеркалом поле зрения. 2. Рассматривание микропрепарата 1) Готовый микропрепарат рассмотреть невооруженным глазом и протереть марлей. 2) Положить препарат на предметный столик под объектив (8) покровным стеклом вверх и закрепить клеммами. 3) Пользуясь макрометрическим винтом, добиться четкого изображения и осмотреть весь препарат, передвигая его рукой. В окуляр смотреть левым глазом, правый глаз следует держать открытым. 4) Выбрать участок препарата, который подлежит изучению при большом увеличении и передвинуть его точно в центр поля зрения. 5) Поворотом револьвера поставить объектив большого увеличения (40). 6) Немного прикрыть диафрагму и опустить конденсор, при этом четкость изображения увеличивается. 7) Пользуясь микрометрическим винтом, добиться резкого изображения. Микрометрический винт вращать только на себя и не более чем один оборот. Опускать объектив можно только под контролем глаза, смотря сбоку, а не в окуляр. 8) Передвигать препарат при большом увеличении нужно не рукой, а предметным столиком (если он подвижный). 9) По окончании работы перевести микроскоп на малое увеличение и только после этого снять препарат с предметного столика. 10) Отставить микроскоп и накрыть чехлом. Примечание: 1. Нельзя касаться пальцами линз оптики микроскопа, это их сильно загрязняет. 2. При переноске микроскопа нужно его поддерживать за подошву, во избежание порчи механизма наводки. Методические рекомендации дл изучения простейших в лабораторных условиях. 1. Изучить под микроскопом амёбу. Найти ядро, псевдоподии, сократительную и пищеварительную вакуоли. Зарисовать. 2. Рассмотреть и зарисовать диффлюгию. Обратить внимание на форму и строение раковины. Отметить устье раковины. Сравнить раковины арцеллы и диффлюгии. 3. Рассмотреть под микроскопом различные раковины фораминифер. Найти устье, поры, у многокамерных - центральную камеру. Обратить внимание на расположение последующих камер, отметить многообразие форм. 4. Изучить строение эвглены под малым увеличением микроскопа на постоянном препарате. Обратить внимание на форму тела. Отметить хроматофоры. На основе препарата и таблицы найти пелликулу, жгутик, стигму, ядро, сократительную вакуоль, резервуар сократительной вакуоли, парамиловые зерна. Зарисовать. 5. Рассмотреть строение вольвокса. Найти в колонии вегетативные и генеративные клетки. 6. Найти на готовом препарате среди эритроцитов трипаносому. Обратить внимание на форму тела, жгутик, ундулирующую мембрану, кинетопласт. Зарисовать. 7. Изучить и зарисовать строение опалины. Отметить ядра, жгутики. Вопросы для контроля: 1. Особенности строения цитоплазмы амебы протея и эвглены зеленой. 2. Морфологические особенности строения саркодовых и жгутиковых. 3. Размножение и развитие амебы протея и эвглены зеленой. 4. Паразитические саркодовые и жгутиковые. 5. Питание представителей класса саркодовых и жгутиковых. 6. Что такое органеллы? По какому принципу они разделяются на постоянные и непостоянные? 7. От чего зависит постоянство формы тела простейшего? 8. Как можно объяснить механизм образования псевдоподий? Типы псевдоподий. 9. Как происходит размножение фораминифер? 10. Что такое фагоцитоз, пиноцитоз? 11. Как у саркодовых образуется раковина? 12. Строение и функции жгутика. 13. Какой из способов питания простейших считается наиболее древним и почему? 14. Что такое автотрофное питание и какие органеллы его обеспечивают? 15. У каких из рассмотренных животных отсутствует сократительная вакуоль и почему? 16. Какие признаки сходства вольвокса с многоклеточными животными. Литература: 1. Натали В.Ф. Зоология беспозвоночных. М. Просвещение, 1975. С. 2. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. -М., 1981. 3. Зеликман А.Л. Практикум по зоологии беспозвоночных. М. Высшая школа, 1969. С. 14-24. 4. Фролова Е.Н., Щербина Т.В., Михина Т.Н. Практикум по зоологии беспозвоночных. М. Просвещение, 1985. Лабораторная работа № 2 Тема: Подцарство Простейшие – Protozoa. Тип Инфузории – Infusoria (Ciliata). Тип Споровики - Sporozoa Цель занятия: Ознакомиться с морфологическими особенностями и жизненными циклами основных представителей типа Инфузории и Споровики. Задание: Ознакомиться со строением инфузорий на примере инфузории туфельки. Ознакомиться со строением споровиков на примере грегарин, сделать рисунки. Форма тела инфузории и послойная дифференцировка цитоплазмы. Основные классы и отряды инфузорий. Строение грегарин. Жизненный цикл грегарин. Жизненный цикл кокцидии Eimeria magna. Жизненный цикл кровеспоровиков (малярийного плазмодия). Материал и оборудование: Микроскопы. Живые представители инфузории (временные и постоянные микропрепараты). Грегарины, кокцидии, кровеспоровики – постоянные микропрепараты. Таблицы по основным представителям. Методические рекомендации: 1. Кормление инфузории краской кармин. В культуру инфузории за 10-20 минут до начала занятия внести краску кармин. 2. Рассмотреть в капле движущихся инфузорий. Обратить внимание на форму тела и характер движения. Под малым, а затем под большим увеличением микроскопа наблюдать заглатывание инфузориями кармина и образование пищеварительных вакуолей, смену окраски содержимого вакуолей в результате изменения реакции среды в них. 3. Остановить инфузорий при помощи волокон ваты или фильтровальной бумаги, отсасыванием воды из-под покровного стекла. Рассмотреть остановленных инфузорий при малом и большом увеличении микроскопа. Рассмотреть ядра, сократительные вакуоли, их приводящие каналы, нити, предротовую впадину. Обратить внимание на движение взвешенных частиц вокруг туфельки, происходящее в результате колебания ресничек и движения плазмы. Зарисовать строение инфузории, отметив разную окраску (и причину этого) сократительных вакуолей. 4. Изучение раздражимости инфузорий под влиянием соли. На предметное стекло на расстоянии 1-2 см одна от другой нанести 2 капли воды, в одну из которых добавить культуру инфузорий. На край капли с инфузориями поместить кристаллы соли. Капли соединить "мостиком". Пронаблюдать движение инфузорий в пресную воду. Из опыта сделать выводы о способности инфузорий реагировать на воздействие среды. Зарисовать. 5. Приготовить временные микропрепараты по каждой культуре. 6. Изучить движение, форму тела, расположение ресничек. 7. Зарисовать всех рассмотренных инфузорий. 8. Провести сравнение и отметить основные принципы классификации инфузорий. 9. Зарисовать 2-3 ооцисты. Найти и зарисовать макрогаметы эймерии. 10. Рассмотреть и зарисовать грегарину. Отметить ядро, эпимерит, протомерит, дейтомерит, пелликулу. 11. На готовом препарате при использовании масляной иммерсии найти плазмодий на стадии кольца, отметить ядро плазмодия. Зарисовать стадии шизонта и макрогамонта. МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИНФУЗОРИИ-ТУФЕЛЬКИ Для приготовления культуры инфузории-туфельки необходимо приготовить питательную среду. Питательная среда готовится следующим образом: Мелко нарезанное луговое сено залить водой (речной, прудовой), которая должна на 1-2 см выступать над сеном. Приготовленный сенной настой оставить на несколько дней открытым с тем, чтобы в нем развелись бактерии, которыми питаются инфузории. Для заражения к нему добавляют около стакана воды, взятой с некоторым количеством или из придонного слоя водоема (пруд, лужа), богатого гнилыми растительными остатками, поблизости от поверхности воды. Для поддержания культуры следует 1-2 раза в месяц добавлять по капле молока. Вопросы для контроля: 1. Особенности строения цитоплазмы инфузории. 2. Морфологические особенности строения типа Инфузории и Споровиков. 3. Размножение и развитие инфузории туфельки. 4. Что такое энергида? Каких простейших можно отнести к полиэнергидным, каких - к моноэнергидным? 5. Как усложняются органеллы пищеварения у инфузорий? 6. Чем различаются механизмы движения ресничек и жгутиков? 7. Что такое ядерный дуализм? 8. Чем отличается половое размножение от бесполого? 9. Чем отличается конъюгация от копуляции? 10. На каком этапе конъюгации происходит мейоз ядра? 11. Какие особенности строения инфузорий лежат в основе их классификации? 12. Какой инфузории свойственна регенерация? 13. Что служит пищей инфузориям? 14. Как осуществляется конъюгация у прикрепленных инфузорий? 15. Жизненный цикл развития споровиков. 16. Что такое инвазия? 17. Что такое метагенез? 18. У каких споровиков жизненный цикл протекает со сменой хозяина? 19. В чем состоит сущность шизогонии, гаметогонии, спорогонии? 20. Что такое ооциста? Что такое спора? Литература: 1. Натали В.Ф. Зоология беспозвоночных. М. Просвещение, 1975. С. 2. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. -М., 1981. 3. Зеликман А.Л. Практикум по зоологии беспозвоночных. М. Высшая школа, 1969. С. 24 – 44. 4. Фролова Е.Н., Щербина Т.В., Михина Т.Н. Практикум по зоологии беспозвоночных. РАЗДЕЛ 4. Методические рекомендации по СРСП. Тема № 1. Тип Микроспоридии. Тип Миксоспоридии Цель занятия: Дать общую характеристику типам Микроспоридии, Миксоспоридии. Задания: 1. Особенности организации и жизненного цикла. 2. Заболевания, вызываемые представителями типов Микроспоридии и Миксоспоридии Вопросы для контроля: 1. Миксоспоридии – тканевые паразиты рыб. 2. Вегетативные и генеративные ядра плазмодиев. 3. Жизненный цикл миксоспоридиев. 4. Классификация типа, основные представители классов. 5. Микросопридии – внутриклеточные паразиты насекомых и некоторых других беспозвоночных животных. 6. Строение споры микроспоридиев. 7. Размножение миксо – и микроспоридиев. 8. Хозяйственный ущерб наносимый представтелями миксо- и микроспоридиев. Форма отчетности: защита лабораторной работы, рисунок в альбоме. Методические рекомендации к выполнению: 1. Рассмотреть строение споры миксоспоридиев и микроспоридиев и зарисовать. 2. Зарисовать жизненный цикл миксоспоридии Myxozoa. Материалы и оборудование: Микроскопы. Представители микроспоридиев и миксосопридиев (постоянные микропрепараты). Таблицы по основным представителям. Список литературы: 1. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. -М., 1981. 2. Курс зоологии. Зоология беспозвоночных. В 2-х томах. -М., 1961,1966. 3. Жизнь животных. Под ред. Л.А. Зенкевича. Беспозвоночные. Т. 3. М.: Просвещение, 1968. - 576 с. РАЗДЕЛ 5. Методические рекомендации по СРС. Тема № 1. Тип Микроспоридии. Цель занятия: Дать общие представления по микроспоридиям и вызываемыми ими болезнями. Задания: 1. Общие особенности строения и развития. Подразделения на классы. 2. Нозематозы пчел и тутового шелкопряда. Форма отчетности: тесты Методические рекомендации: 1. Дать описание общим особенностям строения микросопридий. 2. Дать описание болезням, вызываемыми микроспоридиями Список литературы: 1. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. -М., 1981. 2. Курс зоологии. Зоология беспозвоночных. В 2-х томах. -М., 1961,1966. 3. Натали В.Ф. Зоология беспозвоночных. - М., 1981. 4. Жизнь животных. Под ред. Л.А. Зенкевича. Беспозвоночные. Т. 1. М., 1968, Просвещение.
