читать - medflorina.info

Карта белка папаина
Т.А.Валуева
Папаин (КФ 3.4.22.2) является одним из протеолитических ферментов, присутствующих в
латексе дынного дерева (Carica papaya L.). Название "папаин" было впервые предложено в
конце 19-го века А.Вюрцем и Е.Бошутом и используется до настоящего времени для
обозначения препаратов латекса.
Фермент содержится во всех частях растения за исключением корней. Неочищенный или
частично очищенный папаин в прошлом был объектом многочисленных исследований.
Однако, позднее было установлено, что сухой латекс дынного дерева, кроме папаина,
содержит целый набор цистеиновых протеиназ, которые разделяются на три главные
группы' собственно папаин, химопапаины А и В (КФ 3.4.22.6) и пептидазы А и В (КФ
3.4.22.6). В последние годы папаин и химопапаины были обнаружены также в латексе из
вегетативных органов (листьев и черешков) дынного дерева. В 1937 г. Болз и др. впервые
получили кристаллический папаин, а в 1941 г. .Янсен и Болз - кристаллический
химопапаин.
Три главные группы ферментов латекса папайи различаются по физико-химическим
свойствам. Так, они характеризуются разными значениями изоэлектрических точек,
которые находятся в зоне рН 9,5, 10,1-10,6 и 11,1 для папаина, химопапаинов и пептидаз,
соответственно. Различаются эти группы ферментов и по содержанию титруемых
свободных SH-групп. Ферменты первой и третьей групп содержат 1 SH-группу на
молекулу белка, ферменты второй группы - 2.
Папаин является наиболее изученным ферментом, хотя на его долю приходится только
около 5: общего содержания растворимого белка латекса дынного дерева. Молек. масса
фермента, определенная Э.Смитом и др. на основании скорости седиментации и
диффузии, равна 20,7 кДа. Эта величина значительно ниже значения, полученного Болзом
и Г.Лайнуивером (27 кДа) осмометрическим методом.
Молекула папаина состоит из одной полипептидной цепи и содержит 212
аминокислотных остатков. Характерной особенностью аминокислотного состава
фермента является отсутствие остатков метионина.
Папаин относительно устойчив в нейтральной и слабощелочной среде, но быстро и
необратимо теряет активность в области кислых значений рН. По сравнению с другими
протеиназами растительного происхождения (например, бромелаином и фицином) папаин
проявляет значительную устойчивость к действию повышенных температур. Фермент
стабилен в лиофилизованном неактивированном состоянии. Потеря активности в водных
растворах происходит медленно, но зависит от температуры хранения. При инкубации в
присутствии активаторов папаин теряет активность в результате автолиза. Впервые
процесс автолиза папаина наблюдали при ионнообменной хроматографии. Медленное
протекание процесса автолиза является причиной того, что даже наиболее активные
препараты фермента оказываются загрязненными низкомолекулярными продуктами.
Молекула папаина обладает высокой устойчивостью к денатурирующим воздействиям.
Так, оптическое вращение папаина существенно не меняется в 6-8 М растворе мочевины
или в 70%-ном метиловом спирте.
Кристаллический папаин обладает, как правило, низкой активностью в отсутствие
активаторов. В роли активаторов могут выступать различные низкомолекулярные тиолы,
цианиды и ряд других веществ, обладающих свойствами восстановителей, например
цистеин, глютатион, тиогликолевая кислота, тиосульфат и боргидрид натрия.
Для получения максимальной активности папаина необходимо одновременное
присутствие восстановителя и веществ, способных связывать ионы металлов. Например,
используют смесь цистеина (0,005 М) с этилентетрауксусной кислотой (0,002 М) или с
версеном (0,001 М). Эта смесь может быть успешно заменена 2,3-меркаптопропанолом,
соединением, которое способно одновременно связывать металлы и действовать как
восстановитель. Максимальная активность папаина в присутствии активаторов
достигается через 5-10 мин.
Природа активаторов, а также отношение папаина к окислительным агентам и веществам,
специфически блокирующим сульфгидрильные группы белков, позволили давно сделать
вывод, что папаин относится к классу цистеиновых протеиназ. По данным Финкеля и
Смита содержание тиоловых групп у неактивного папаина менее 0,5 моля на моль белка и
это же количество определяется при различных способах денатурации фермента. В то же
время в активированном папаине присутствует до 1 моля SH-групп на моль белка. Более
того, существует корреляция между содержанием тиоловых групп в молекуле папаина и
его удельной активностью.
Исследования механизма процесса активации и природы неактивной формы папаина
позволили И.Клейну и Дж Киршу, а также Слайтерман получить убедительные
доказательства того, что основной компонент неактивного папаина представляет собой
смешанный дисульфид белок - цистеин. Активация папаина KCN, вызывающая
освобождение SH-группы, сопровождается образованием эквивалентного количества 2иминотиазолидин-4-карбоновой кислоты. Это соединение образуется в результате
циклизации и-тиоцианаталанина, который синтезируется при взаимодействии цианида с
небелковым остатком цистеина (рис. 1.65). В присутствии кислорода воздуха может
протекать обратная реакция, ведущая к связыванию цистеина с SH-группой активного
центра папаина с образованием неактивного продукта. В 1969 г. Бэрелом и А.Глейзером
было показано, что процесс активации папаина не сопровождается заметными
конформационными изменениями в белковой молекуле.
Все ферменты латекса папайи являются цистеиновыми протеиназами. Они катализируют
реакцию гидролиза белков по пептидным связям'
P -...-P -P CO-NHP'-P'-...-P' + H O
P -...-P -P COOH + NH P'-P'-..-P', где P и P' - остатки аминокислот.
Различные протеиназы латекса папайи обладают сходной специфичностью действия на
белковые субстраты. Они способны гидролизовать практически любые пептидные связи,
за исключением связей, образованных остатками пролина. Предпочтительно
расщепляются связи, в образовании которых в качестве остатка P участвуют глицин,
гидрофобные (лейцин, изолейцин), ароматические (тирозин, фенилаланин) аминокислоты,
а также аспарагиновая, глутаминовая и цистеиновая кислоты. Важное значение при этом
имеет и природа остатков P и P'. Так, при действии на В-цепь окисленного инсулина
пептидная связь между Leu-17-Val-18 гидролизуется только папаином, связь между Arg22- Пдн-23 - только химопапаином и между Leu-15-Tyr-16 - только пептидазой А.
Протеиназы латекса обладают высокой протеолитической активностью в широком
интервале значений рН. При этом папаин и пептидаза А гидролизуют гемоглобин, казеин
и бычий сывороточный альбумин с наибольшей скоростью в зоне рН от 7,2 до 10,
химопапаин проявляет наивысшую активность в зоне рН от 5,0 до 7,0.
Протеиназы латекса папайи способны катализировать гидролиз ряда синтетических
эфиров и амидов аминокислот и пептидов'
R-С(=O)-R' + H O R-С(=O)-OH +HR', где R - остаток ациламинокислоты или ацилпептида,
R' - остаток аминокислоты, спирта или гамма-нитроанилина.
Протеиназы латекса различаются по характеру действия на низкомолекулярные
синтетические субстраты. Из таких субстратов наиболее предпочтительными являются
эфиры и амиды N,альфа-бензоил-L-аргинина. При этом скорость их расщепления
папаином выше, чем химопапаином и пептидазой А. Этиловые эфиры N-ацетил-Lтирозина, N-бензо- ил-L-тирозина и N-бензиол-L-лейцина полностью устойчивы к
действию всех протеолитических ферментов латекса, в то время как амид
бензоилглицина, некоторые производные L-лейцина и карбобензокси-L-глута- мил-Lтирозина медленно гидролизуются только химопапаином. Папаин эффективно
гидролизует п-нитроанилиды пироглутамил-L-фенил- ала- нил-L-R, где R - остаток
лейцина или аланина. Менее эффективно на такие субстраты действует пептидаза А.
Первичная структура папаина приведена на рис. 1.66. Шесть из семи содержащихся в
молекуле остатков Cys участвуют в образовании трех дисульфидных мостиков, которые
соединяют остатки полуцистина в положениях 22-63, 56-93 и 153-200. Единственная
сульфгидрильная группа принадлежит остатку цистеина, расположенному в положении
25. Этот остаток является частью каталитического центра фермента.
Трехмерная структура папаина была установлена с помощью рентгеноструктурного
анализа с разрешением в 2,8 А (рис. 1.67).
Существенный интерес представляют экспериментальные данные о сохранении
ферментативной активности у кристаллов папаина, выращенных в метиловом спирте и
помещенных затем в 20%-ный раствор Na SO . Эти данные в совокупности с
отмечавшимся выше сходством оптических свойств папаина в водном растворе и в 70%ном метиловом спирте позволили сделать важный вывод о том, что конформация
молекулы папаина в белковых кристаллах близка к конформации в водном растворе.
Молекула фермента имеет близкую к сферической форму с размерами 36 х 48 х 36 А и
состоит из двух доменов, обозначенных как L- и R-домены. Домены разделены глубоким
"желобом", на поверхности которого находится активный центр фермента. Оба домена
содержат практически одинаковое число аминокислотных остатков. Так, L-домен
включает остатки с 12 по 112 и с 208 по 212, а R-домен - остатки с 1 по 11 и с 113 по 207.
Положение одного домена относительно другого поддерживается с помощью трех
отрезков полипептидных "хребтов", пересекающих основание "желоба", и множеством
водородных связей, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями
боковых групп аминокислотных остатков полипептидной цепи. В L-домене присутствуют
три отрезка альфа-спирали, охватывающие остатки 26-41, 50-56 и 69-78, в R-домене - один
короткий отрезок альфа-спирали (остатки 163-172) и небольшой фрагмент бета-структуры
(остатки 163-172). Центральная область R-домена представляет собой гидрофобное ядро,
в котором 12-14 остатки Leu, Val и Phe взаимодействуют между собой.
В целом спирализованные участки в молекуле папаина охватывают около 20% всех
аминокислотных остатков, входящих в состав белковой молекулы. Это значение
согласуется с содержанием альфаспиральных участков, рассчитанным на основании
результатов измерения дисперсии оптического вращения. В молекуле папаина
присутствуют пять внутримолекулярных солевых мостиков, образованных
гуанидиновыми группами остатков аргинина и карбоксильными группами остатков
дикарбоновых аминокислот. Один такой мостик располагается внутри молекулы, а четыре
- на ее поверхности.
Каталитический участок папаина длиной 2 нм и глубиной 5 А находится на поверхности
"желоба" между двумя доменами. Расположение аминокислотных остатков в районе
активного центра папаина приведено на рис. 1.68. Остаток СySH-25 локализуется на
"желобе" в N-концевой области самой длинной центральной альфаспирали между
остатками 24-42. К боковой цепи СySH-25 примыкает атом азота N имидазольного кольца
His-159. Имидазольная группа His-159 удалена от тиоловой группы CySH-25 на
расстояние, не превышающее 5 А, что позволило прийти к заключению о взаимодействии
между атомом серы остатка CySH-25 и атомом азота, N , His-159 за счет сил Ван-дерВаальса. Другой атом азота, N , имидазольной группы His-159 связан водородной связью с
кислородом, O , боковой цепи остатка Asn-175. Таким образом, в каталитическом
активном центре молекулы папаина существует триада CySH...His...Asn, напоминающая
триаду Ыук...His...Asp, присутствующую в активном центре сериновых протеиназ.
По мнению Э.Бекера и Дж.Дрента у цистеиновых протеиназ водородная связь между
остатками His-159 и Asn-175, защищенная от внешнего воздействия растворителя
индольным кольцом Trp-177, выполняет ориентирующую роль. Так, при изучении
структуры различных форм папаина (неактивной, инактивированной, но сохраняющей
способность активироваться, и активной) с использованием методов
рентгеноструктурного анализа было показано, что имидазольное кольцо His-159 может
менять свою ориентацию в ответ на изменения положения атома серы CySH-25. В
молекуле неактивного папаина, тиоловая группа которого окислена до SO или SO , атом
серы локализуется на расстоянии 2 А ниже плоскости, в которой располагается
имидазольное кольцо His-159. В молекуле инактивированного, но способного
активироваться, папаина атом серы расположен выше плоскости имидазола этого остатка
гистидина, и имидазольное кольцо может вращаться под углом 30 относительно связи С С полипептидной цепи. Угол вращения имидазольного кольца в том случае, когда в
молекуле фермента полностью восстановлена SH-группа, не удалось установить. Однако,
как предполагают Л.Полгар и Дж.Дрент, вполне возможно, что у активированного
папаина электронные плоскости атома серы и имидазольного кольца пересекаются.
В формировании субстратсвязывающего участка активного центра папаина участвует
остаток Gln-19, амидная группа боковой цепи которого образует водородную связь с
кислородом Ser-176. С другой стороны этого остатка находится "карман", образованный
боковыми цепями остатков Tyr-67, Pro-68, Trp-69, Phe-207, Val-157 и Ala-163. Такой
карман служит для связывания неполярной боковой цепи молекулы субстрата.
Стенки "желоба", в котором расположен активный центр папаина, с одной стороны
составляют боковые цепи остатков Trp-177 и His-159, а с другой - полипептидные цепи
остатков 22-24 и 64-67. При этом карбоксильная группа остатка Asp-64 и -NH- и -C=O
группы остатка Gly- 66, а также -С=O группа остатка Asp-158 выступают в пространство
"желоба" и обладают потенциальной способностью взаимодействовать с боковыми
цепями субстрата.
Единственной заряженной группой, расположенной в пределах 10 А от CySH-25б
является карбоксильная группа остатка Asp-158, локализованная от него на расстоянии 7
А. Степень участия этой группы в каталитическом акте до настоящего времени остается
невыясненной.
Как и у сериновых протеиназ, реакция цистеиновых ферментов с субстратом представляет
собой трехступенчатый процесс, включающий образование соединения типа ацилфермент в качестве промежуточного соединения. Образование соединения типа ацилфермент было экспериментально показано еще в 1964 г. Бендером и Г.Лоу в реакциях,
катализируемых папаином и фицином. Так, в процессе гидролиза N-трансциннамоилимидазола папаином образуется трансциннамоилпапаин, спектральная
характеристика которого соответствовала соединению типа тиолового эфира. В качестве
субстрата для фицина использовали метилтиогиппурат (тиоловый эфир). В ходе
ферментативной реакции наблюдали образование дитиолового эфира, который
характеризуется максимумом поглощения при 305 нм. Таким образом, в процессе
реакций, катализируемых цистеиновыми протеиназами, происходит ацилирование SHгруппы активного центра. Соединения типа ацил-папаин могут быть устойчивыми при
умеренно кислых значения рН. В частности, трансциннамоилпапаин был препаративно
выделен Бендером и Брубахером.
В настоящее время предложен следующий механизм действия папаина (рис. 1.69).
Показано, что SH-группа CySH-25 имеет значение рК 4,0, а имидазольная группа His-159 pK 8,5, и эти остатки находятся в активном ферменте в кислой форме в виде ионной пары
S /H Im. Гистидин в процессе ферментативной реакции протонирует карбонильный
углерод гидролизуемой связи, тогда как цистеин отдает протон на отщепляемую группу
молекулы субстрата и атакует карбонильный углерод субстрата с образованием тиолового
эфира. Образовавшийся тиоэфир может гидролизоваться в результате нуклеофильной
атаки OH группы молекулы воды.
Постоянным источником противоречий в исследованиях механизма действия папаина
является интерпретация роли карбоксильной группы Asp-158. Вначале предполагали, что
влияние этой группы обеспечивает низкое значение рК SH-группы остатка CySH-25. По
данным рентгено- структурного анализа показано, что карбоксильная группа Asp-158
связана водородной связью с -NH-группой остатка Ala-136, расположенного в главной
цепи молекулы. Эта группа оказывается удаленной от каталитического участка на
расстояние 7,5 А от CySH-25 и 5,5 A от His-159, что затрудняет прямое включение
карбоксильной группы