СД.Ф.11 МУ CР Методы биохимических исследований (0.5Mб, doc)
реклама
Министерство образования и науки Российской Федерации Сибирский федеральный университет МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Методические указания к самостоятельной работе Красноярск СФУ 2012 УДК 577.1 ББК 28.072 М 545 Составитель О.А.Гусейнов М 545 Методы биохимических исследований: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост О.А Гусейнов. – Красноярск: Сибирский федеральный университет, 2012. – 48 с. В пособии представлены методические указания для самостоятельной работы студентов по следующим темам биохимических исследований: основные принципы исследований в биохимии, гельфильтрация, разделение белков, общие принципы хроматографии, электрофорез, выделение и спектрометрический анализ ДНК, рестриктный анализ ДНК и полимеразная цепная реакция. Предназначено для студентов специальности 020208.65 – «Биохимия». Предложенные методические указания могут быть использованы преподавателями высшей школы при обучении студентов методам биохимических исследований. УДК 577.1 ББК 28.072 © Сибирский федеральный университет, 2012 2 ВВЕДЕНИЕ В курсе «Методы биохимических исследований» изучаются теоретические и практические основы биохимических методов исследований с фокусом на последние достижения науки, современные методы исследования, использование современного лабораторного оборудования. Курс предназначен для студентов четвертого курса очной формы обучения направления 020200 – биология. Главная цель дисциплины – ознакомление с важнейшими принципами и методическими приемами экспериментальной биохимии. Предлагаемые методические указания для самостоятельной работы будут содействовать глубокому усвоению студентами учебного материала, формированию теоретических основ для проведения экспериментальных работ. Особое внимание обращается на проблему выделения изучаемых соединений из живых организмов в индивидуальном виде. Самостоятельная работа студентов по курсу «Методы биохимических исследований» включает изучение теоретического материала: работу с научной, учебной, методической и справочной литературой, изучение лекционного материала; подготовку презентаций и написание реферата. В методических указаниях приведены вопросы для самостоятельной проработки теоретического материала и темы для написания реферата. Приводится список литературы, необходимой для самостоятельной подготовки. Самостоятельная работа способствует развитию у студента таких навыков, как выбор и решение поставленной задачи, сбор и аналитическое изучение опубликованных результатов, умение выделить главное и сделать обоснованное заключение. Самостоятельная работа способствует развитию у студентов навыков творческого исследования, литературного редактирования. В результате изучения дисциплины «Методы биохимических исследований» обучающиеся должны знать: - основные методологические принципы научного исследования; - принципы работы с современным биохимическим лабораторным оборудованием; уметь: - работать с биологическим материалом; - оценивать и обрабатывать полученные экспериментальные результаты; - выбирать оптимальные методы достижения поставленных целей; владеть: - приемами и навыками работы с современным биохимическим оборудованием; 3 - способами и технологиями защиты от вредных факторов профессиональной среды. Систематическое усвоение программы практикума и лекционного курса обеспечивает фундаментальную теоретическую и практическую подготовку студентов, позволяющую им впоследствии самостоятельно работать в биохимических лабораториях самого различного профиля. 4 ПЕРЕЧЕНЬ ИЗУЧАЕМЫХ ТЕМ: 1. Основные принципы исследований в биохимии. 2. Разделение макромолекул методом гель-фильтрации 3. Выделение, очистка и определение гомогенности белков. 4. Общие принципы хроматографии, классификация методов хроматографии. 5. Основы электрофореза. 6. Выделение и очистка ДНК. 7. Свойства молекул ДНК. 8. Полимеразная цепная реакция. ГРАФИК Самостоятельной работы студентов по дисциплине «Методы биохимических исследований» образовательной программы направления 020208.65 Биология Института фундаментальной биологии и биотехнологии 4 курса на 7 семестр 1 ВЗ 2 3 4 Недели учебного процесса семестра 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ВЗ ЗП ЗП ВРФ ВРФ ВРФ ВЗ ВЗ ЗП ВЗ ЗП ВЗ ЗП 14 ВЗ ЗП 15 ВЗ ЗП ЗРФ 16 ЗРФ ЗП ЗРФ Условные обозначения: ВЗ – выдача темы для самостоятельного изучения; ЗП – защита презентации; РФ – реферат; ВРФ – выдача темы реферата; ЗРФ – защита реферата. 5 ТЕМА 1. Основные принципы исследований в биохимии. Указания к изучению темы. В основе биохимических методов исследования лежит выделение индивидуальных веществ из биологических источников, фракционирование, анализ, изучение структуры и свойств отдельных компонентов живого вещества. Методы биохимии преимущественно формировались в 20 веке; наиболее известными являются хроматография, изобретённая М.С. Цветом в 1906 г., центрифугирование (Т. Сведберг, 1923 г.), электрофорез (А. Тизелиус, 1937 г.), полимеразная цепная реакция (К. Муллис, 1983 г.). За изобретение последних трех методов их авторы получили Нобелевские премии. С конца 20 века в биохимии всё шире применяются методы молекулярной и клеточной биологии, в особенности искусственная экспрессия и исследование генов в модельных клетках и целых организмах. Определение структуры всей геномной ДНК человека выявило приблизительно столько же ранее неизвестных генов и их неизученных продуктов, сколько уже было известно к началу 21 века благодаря полувековым усилиям всего человечества. Оказалось, что традиционный химический анализ и очистка ферментов из биомассы позволяют получить лишь те белки, которые в живом веществе присутствуют в сравнительно большом количестве. Не случайно основная масса ферментов была открыта биохимиками в середине 20 века и к концу столетия распространилось убеждение, что все ферменты уже открыты. Данные геномики опровергли эти представления, но дальнейшее развитие биохимии требовало изменения методологии. Искусственая экспрессия ранее неизвестных генов предоставила биохимикам новый материал для исследования, часто недоступный традиционными методами. В результате возник новый подход к планированию биохимических исследований, который получил название обратная генетика. Эта методология предоставляет биохимикам шанс изучать функции продуктов уже известных генов, в то время как ранее наука шла по пути определения структуры генов, кодирующих уже известные ферменты. Необходимо выделить следующие проблемы выделения в индивидуальном виде структурных элементов из живых организмов: 1) Исходный материал (биомасса) состоит из сотен и даже тысяч разных соединений. Разделение такой смеси довольно сложно, мало того, многие индивидуальные компоненты смеси построены довольно однотипно. В связи с этим они мало различаются между собой по физико-химическим характеристикам, например по способ-ности к сорбции на определенном 6 типе сорбента или растворимости, подвижности в электромагнитном поле и так далее. 2) Работа с биологическими объектами зачастую сопровождается необходимостью манипулировать с очень небольшими количествами первоначального вещества. При ничтожно малом количестве исходного материала методы детекции должны быть крайне чувствительными. Такими методами и являются спектрофотометрические методы, основанные на измерении по-глощения видимого или УФ света, люминесцентные, основанные на изменении флуоресценции, био- и хемилюминесценции, радиохимические методы, основанные на изменении радиоактивности изучаемых объектов. 3) Многие клеточные соединения обладают очень низкой устойчивостью вне клетки. Часто задача состоит в том, чтобы выделить соединение в нативном, т.е. сохраняющим биологическую активность, состоянии. Между тем многие компоненты клеток при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены явлению денатурации, которая приводит к потере биологической активности. Кроме того, в клетках имеются ферменты способные разрушить те или иные вещества, в первую очередь нуклеиновые кислоты и белки. 4). При изучении активности многих ферментов, в процессе их работы, они могут необратимо денатурировать. Учитывая существующие проблемы при выделении и исследовании клеточных компонентов и разработаны соответствующие щадящие биохимические методы выделения отдельных компонентов. Например, при выделении лабильных (легко денатурируемых) белков, необходимо использовать низкие температуры, буферы, не влияющие на нативность данного белка и специальные добавки-стабилизаторы. 7 Литература к теме 1: 1. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. 2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007. 3. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия : краткий курс с упражнениями и задачами. 3-е изд., Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2005. 4. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск, 2005. 5. Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005. 6. Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005. 7. Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004. 8. Клиническая биохимия / под ред. В. А. Ткачука. – М. : ГЭОТАР-МЕД, 2004. 9. Мюльберг, А. А. Фолдинг белка : учеб. пособие / А. А. Мюльберг. – СПб. : Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. 10.Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 11.Запруднова Е.А. Практикум по биохимии / Е. А. Запруднова, А. Г. Гладилкина ; Владим. гос. ун-т. – Владимир: Изд-во Владим. гос. ун-та, 2011. 12.Вавилова Т.П.,Евстафьева О.Л.,Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009. Вопросы для самоконтроля. 1. Перечислите проблемы выделения в индивидуальном виде компонентов из живых организмов. 2. Что понимают под нативностью белков и нуклеиновых кислот? 3. Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, заряд белковых молекул, оптические свойства, растворимость, денатурация. 4. Каковы основные принципы выделения и очистки белков? 5. Физико-химические свойства нуклеиновых кислот: молекулярная масса, заряд молекул, оптические свойства, растворимость, денатурация. 6. Каковы основные принципы выделения и очистки нуклеиновых кислот? 8 ТЕМА 2. Разделение макромолекул методом гель-фильтрации. Указания к изучению темы. Метод гель-фильтрации занимает особое положение в обширной семье методов колоночной хроматографии. В нем используется весь набор хроматографической аппаратуры, но принципиальное отличие от всех остальных членов этого семейства состоит в том, что разделяемые при гель-фильтрации молекулы не сорбируются внутри гранул и вообще ни физически, ни химически не взаимодействуют с их материалом. Весь процесс фракционирования основывается только на соотношении размеров молекул фильтруемой смеси и пор в гранулах. Термин «гранулы» расшифровывается, как малые частицы сферической формы, изготовленные из пористого материала. Подадим сверху на эту колонку,заполненную гранулами, ток раствора, в котором сосуществуют молекулы разного размера. Он будет свободно протекать между гранулами — вниз к выходу из колонки. Если крупные молекулы настолько велики, что совершенно не проникают в пределы гранул (поры для них слишком малы), то эти молекулы вместе с током раствора без задержки будут двигаться к выходу из колонки. Пусть мелкие молекулы настолько малы, что все ячейки внутри гранул будут для них легкодоступны. Тогда (если скорость протекания раствора не слишком велика) эти малые молекулы в результате диффузии быстро займут весь объем жидкости во внутренних ячейках гранул. Конечно, диффузия будет идти и в обратном направлении так, что концентрация малых молекул в гранулах и в свободной жидкости между ними поначалу окажется одинаковой. Однако вскоре малые молекулы, которые окажутся вне гранул, током раствора продвинутся немного вниз по колонке. Здесь они встретят слой еще «пустых» гранул и будут диффундировать внутрь них. В то же самое время в слое, откуда эти молекулы ушли, нарушится равновесие диффузии и малые молекулы из гранул станут преимущественно выходить наружу, в раствор (элюент). Процессы эти будут происходить в течение всего хода элюции. За это время каждая из мелких молекул успеет (и не один раз) побывать в каких-нибудь гранулах и выйти из них. Для слоя мелких молекул в целом это будет означать большую потерю времени с точки зрения продвижения этого слоя вниз к выходу из колонки. В результате слой мелких молекул сильно отстанет от слоя крупных молекул. 9 Для молекул среднего размера некоторые ячейки близ поверхности гранул окажутся доступными. Они туда будут «заходить». Но диффундировать глубоко внутрь гранул им, как правило, не удастся, они быстрее будут выходить наружу и равновесие диффузии будет в пользу свободной жидкости между гранулами. Поэтому молекулы среднего размера в целом, как слой, будут двигаться вниз по колонке быстрее, чем мелкие молекулы, но все же значительно медленнее, чем крупные. Колоночная гель-фильтрация широко применяется для решения двух основных задач: 1. Быстрого освобождения крупных молекул от находящихся в том же растворе солей или низкомолекулярных предшественников синтеза: 2. Фракционирования (разделения) смеси макромолекул не очень значительно различающихся по своим размерам. Например, различных белков. Здесь следует использовать длинные (1-1,5 м) колонки, диаметром не более 1 см. Следует загружать их объемом исходного препарата, составляющем не более 1-2% от объема колонки. Если смесь содержит 2-3 компонента, то их нередко удается разделить полностью — они выходят в виде довольно широких, но не перекрывающихся друг с другом пиков. Литература к теме 2: 1. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. 2. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия : краткий курс с упражнениями и задачами. 3-е изд., Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2005. 3. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 10 Вопросы для самоконтроля. 1. Что представляют из себя молекулярные сита? 2. В чем заключается принцип метода гель-фильтрации? 3. В чем состоит принципиальное отличие метода гельфильтрации от прочих методов колоночной хроматографии? 4. На чем основывается процесс фракционирования молекул при гель-фильтрации? 5. Какие гель-матрицы применяются для гель-фильтрации? 6. Дайте характеристику гелей на основе декстрана. 7. Каковы особенности гелей на основе сефарозы, сефакрила, биогелей и ультрагелей? 8. Каковы основные параметры гель-фильтрационной колонки? 9. Что называется свободным объемом колонки? 10.Объясните, что называется гель-фильтрационными диаграммами элюирования веществ? 11.Как определить молекулярную массу молекул методом гельфильтрации? 12.Каковы основные принципы выбора типа геля, размеров колонки, условий элюирования? 13.Какова разрешающая способность метода гель фильтрации? 11 ТЕМА 3. Выделение, очистка и определение гомогенности белков. Указания к изучению темы. Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов. Белки - высокомолекулярные соединения, однако сильно отличаются по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. По форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис. Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют "изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково. Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков из природных источников в химически чистом, гомогенном состоянии. Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих: дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран; фракционирование органелл, содержащих те или иные белки; экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние); разделение смеси белков на индивидуальные белки. 12 Белки весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов. Поэтому обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси, неприемлемы для белков. Белки в этих условиях подвергаются денатурации, т.е.теряют существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость и биологическую активность. Биохимиками разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре, с применением щадящих нативную структуру химических реагентов. Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния. Для разрушения биологического материала используют метод попеременного замораживания и оттаивания, обработку клеток ультразвуком и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давление – выделяющийся газообразный азот как бы разрывает «оболочку» клетки. Измельчение тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При выделении белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты – вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами. После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки. Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особые физико-химические свойства. После получения растворов, содержащих смесь белков приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию. Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, содержащий, однако, некоторые низкомолекулярные примеси. Для полного освобождения белков от этих примесей используют методы диализа, гель-хроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. 13 На заключительных стадиях выделения и очистки белков биохимиков интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какомулибо физико-химическому показателю. Для этого необходимо использовать разныме критерии. Наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Литература к теме 3: 1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007. 2. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. 3. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия : краткий курс с упражнениями и задачами. 3-е изд., Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2005. 4. Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2003. 5. Мюльберг, А. А. Фолдинг белка : учеб. пособие / А. А. Мюльберг. – СПб. : Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. 6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 7. Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот ; под ред. А. И Арчакова, М. П. Кирпичникова, А. Е. Медведева, В. П. Скулачева. – М., 2002. 8. Elliott. – Oxford : University Press, 2002. 9. Вавилова Т.П.,Евстафьева О.Л.,Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009. 10.Сова В.В.,Кусайкин М.И. Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2006. 14 Вопросы для самоконтроля. 1. По каким параметрам различаются индивидуальные белки? 2. Для каких целей необходимо получение индивидуальных белков? 3. Почему большинство методов органической химии, применяемых для выделения того или иного вещества из смеси, обычно не подходит для выделения белков? 4. Перечислите стадии поучения индивидуального белка в гомогенном виде. 5. Назовите методы гомогенизации биологических материалов при выделении белка. 6. Какие растворы используются при экстракции белков из гомогенатов? 7. Каким образом нерастворимые фракции отделяют от экстрактов белков? 8. Каковы основные принципы разделения белков? 9. Перечислите методы фракционирования белков. 10.Перечислите диапазон применимости каждого. 11.Назовите преимущества и недостатки имеющихся методов. 12.В чем состоит метод высаливания белков? 13.Опишите принцип метода изоэлектрического фокусирования. 14.Каким образом белковые растворы очищают от низкомолекулярных примесей? 15.Назовите принципы определения гомогенности белка. 16.Назовите методы определения молекулярной массы белка. 17.Как определить молекулярную массу выделенного в чистом виде белка? 18.В чем состоит преимущество определения молекулярной массы белка методом гель-проникающей хроматографии? 15 ТЕМА 4. Общие принципы хроматографии, классификация методов хроматографии. Указания к изучению темы. Общие принципы хроматографии, разработанные в 1903 г. отечественным ученым М. С. Цветом, основаны на способности некоторых химических соединений специфически связываться с адсорбентом, заключенном в колонке. В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие растворители, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают по фракциям. Колоночная хроматография с различными ионообменными смолами, производными целллюлозы и гидроксилапатитом в качестве носителей оказалась очень эффективным средством разделения белков из их смеси. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную. В основе каждого из них лежат. Колоночная хроматография широко применяется не только для разделения белков, но и для разделения многих других веществ, входящих в состав живых организмов. Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве сорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды кремния или алюминия. Адсорбент в виде суспензии с растворителем вносят в стеклянную вертикальную колонку и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку – составляющие части разделяемой смеси сорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты. Сбор фракций осуществляют при помощи коллектора фракций. 16 Распределительная хроматография. В этом случае твердая фаза служит только вместилищем для стационарной жидкой фазы. Часто распределительная хроматографии осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые компоненты, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой и движущейся фазой растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки.Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно и то же вещество, соединяют для его выделения в чистом виде. Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях для разделения пептидов, аминокислот и других веществ. В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями бумаги. Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы. Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производными винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллюлозой. В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как остальные белки беспрепятственно элюируются с колонки. Задержавшиеся на колонке белки снимают с нее, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента. Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография, широко используются в фармакологии, в клинической биохимии, в биотехнологических процессах и производствах: они позволяют определять вещества в нано- и пикограммных количествах. 17 Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков с иммобилизованными на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты, антигены (или антитела), гормоны или рецепторы. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с наполнителем хроматографической колонки, присоединяется только один какой-либо белок из смеси белков. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененными рН или ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность в один прием выделить заданный белок или другой полимер с необходимой степенью чистоты. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Литература к теме 4: Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. Сова В.В.,Кусайкин М.И. Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2006. Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2003. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. Elliott. – Oxford : University Press, 2002. Аффинная хроматография: Методы. Под ред. П.Дин, У.Джонсона, Ф.Мидл. М.: Мир, 1988. 18 Вопросы для самоконтроля. 1. В чем состоят основные принципы хроматографии? 2. Перечислите основные виды адсорбентов, используемых в хроматографии. 3. Назовите основные типы хроматографии, используемые при выделении и очистке белков. 4. Какие физические и химические механизмы лежат в основе абсорбционной хроматографии? 5. Какие физические и химические механизмы лежат в основе распределительной хроматографии. 6. Какие физические и химические механизмы лежат в основе ионообменной хроматографии? 7. Какие физические и химические механизмы лежат в основе афинной хроматографии. 8. Опишите сферы применения разных видов хроматографии. 9. Перечислите современные достижения в науке и технологиях, достигнутые с применением хроматографических методов. 19 ТЕМА 5. Основы электрофореза. Указания к изучению темы. Электрофорез — это перемещение частиц дисперсной фазы в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые был открыт профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества. Он используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии. В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот, а также их фрагментов. Различают множество разновидностей этого метода. Электрофорез белков — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка и определения его молекулярной массы. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли. Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются в различных областях: электрофорез в свободных средах; электрофорез с подвижной границей; зональный электрофорез без поддерживающей среды; капиллярный электрофорез; зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой; электрофорез на фильтровальной бумаге; электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране; электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды; электрофорез белков в ПААГ; электрофроез белков в крахмальном геле; электрофорез белков в агарозном геле. 20 Методы электрофореза белков подразделяются на одномерный и двумерный электрофорез, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков и электрофорез в присутствии детергента. Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез. В начале 70-х годов было показано, что с помощью гельэлектрофореза можно определить длину и чистоту молекул ДНК, а также разделить и выделить нужные фрагменты. Этот метод прост, так как каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты обладает отрицательным зарядом, который под действием приложенного электрического поля заставляет молекулы двигаться к положительному электроду. Чтобы разделить молекулы ДНК, исходя из их размера, электрофорез проводят в гелях. Были разработаны специальные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся всего лишь на несколько нуклеотидов. Поскольку поры в полиакриламидном геле для больших молекул ДНК слишком малы, то для разделения молекул ДНК по размеру были разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарида, выделяемого из морских водорослей). Оба эти метода разделения ДНК (в полиакриламидном геле и агарозном геле) широко используются для аналитических и препаративных целей. В 80-х годах была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять очень большие молекулы ДНК. Обычный гель-электрофорез не позволяет разделить молекулы размером более 20000 пар оснований ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентировываться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они заметно будут отставать. Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК. Он же используется для приготовления агарозного геля. 21 Электрофорез в агарозном геле – стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим в ДНК красителем – бромистым этидием в низкой концентрации. Просматривая прокрашенный гель в ультрафиолетовом свете, можно заметить даже 1 нг ДНК. Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется следующими пятью главными параметрами: размером молекул ДНК, конформацией ДНК, концентрацией агарозы, напряженностью электрического поля, используемым буфером. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Литература к теме 5: Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. Сова В.В.,Кусайкин М.И. Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2006. Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2003. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М. Мир, 1982. Elliott. – Oxford : University Press, 2002. Michaux S., Pallisson J., Garles-Nurit M.-J, Bourg G., Allerdet-Servent A., Ramuz M. Presence of two independent chromosome in the Brucella melitensis 16 M genome // J. Bacteriol. 1993. V. 175. ‹ 3. P. 701–705. 22 Вопросы для самоконтроля. 1. Что понимают под электрофорезом биологических молекул? 2. В каких разделах биологических исследований применяется электрофрорез? 3. Для каких целей в биологии используется электрофорез? 4. Какие физические и химические механизмы лежат в основе электрофореза? 5. Назовите используемые разновидности электрофореза биологических макромолекул. 6. Для каких целей используют электрофорез белковых молекул? 7. Охарактеризуйте методику электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лэммли. 8. Перечислите и охарактеризуйте разновидности и модификации методики электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лэммли. 9. Для каких целей используют электрофорез нуклеиновых кислот? 10.В каких случаях используют электрофорез ДНК в полиакриламидном геле, а в каких случаях в агарозном геле? 11.Охарактеризуйте метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле. 12.Опишите алгоритм проведения гель-электрофореза ДНК. 13.Какими способами можно определить положение различных фрагментов ДНК в гелях после проведения электрофореза? 14.Какими параметрами определяется скорость миграции ДНК в геле при электрофорезе? 23 ТЕМА 6. Выделение и очистка ДНК. Указания к изучению темы. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – одна из важнейших для живых существ молекула, в которой содержится вся генетическая информация о них. Живое существо – это сложная система, а ДНК – это архив, в котором хранятся инструкции по созданию этой системы и ее функционированию. Молекулы ДНК есть в каждой клетке любого организма. Чтобы понять особенности функционирования клеток различных организмов, проводят исследование их ДНК, первым шагом которого является ее выделение и очистка. Впервые ДНК была выделена Ф. Мишером в1869 году. Большая часть нуклеиновых кислот в клетках находится в соединении с белками. Поэтому, кроме разрушения клеточных оболочек гомогенизацией биологического материала, необходимо отделить нуклеиновые кислоты от белков. Этого можно достичь обработкой образца крепким раствором соли, например 10%-ным раствором NaCl. После удаления нерастворимой фазы нуклеиновые кислоты можно осадить из охлажденного до 00 С раствора этанолом или раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок нуклеиновых кислот отделяют центрифугированием, тщательно промывают и высушивают. Часто применяют фенольный метод выделения нуклеиновых кислот, с помощью которого можно получить нативные препараты. Для этого гомогенизированный охлажденный биологический материал заливают водонасыщенным раствором фенола. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют. При этом содержимое центрифужной пробирки разделяется на четыре четко отличающихся друг от друга разных по консистенции и цвету слоя. В верхнем водном слое и подстилающем его вязком слое белого цвета находится основная масса нуклеиновых кислот. В третьем желеобразном прозрачном, желтоватом слое находится фенол с растворенными в нем белками. Четвертый, самый нижний, слой коричневого цвета содержит остатки ткани, денатурированные белки и мизерную примесь нуклеиновых кислот. Процесс выделения нуклеиновых кислот данным методом называют также фенольной депротеинизацией. Освободить препараты, содержащие нуклеиновые кислоты от белка возможно и путем обработки их солевого экстракта двойным объемом смеси хлороформ-изоамиловый спирт. Далее смесь центрифугируют, отделяют верхнюю водную фазу, содержащую нуклеиновые кислоты. Их осаждают двойным объемом охлажденного этилового спирта. 24 Полученные суммарные препараты нуклеиновых кислот можно разделить на фракции, используя такие методы как хроматография, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных системах, ультрацентрифугирование и электрофорез. Высокоэффективным методом разделения нуклеиновых кислот, является ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия. В этом случае высокая ионная сила буферного раствора в центрифужных пробирках способствует разрушению комплексов белков и нуклеиновых кислот, разделение макромолекул происходит на основании их различий в плавучей плотности. Перемещение макромолекул во время центрифугирования происходит до тех пор, пока они не достигнут зоны раствора CsCl с плотностью, равной их плавучей плотности. В этой зоне происходит их концентрирование. Метод центрифугирования в градиенте плотности CsCI в присутствии бромистого этидия используется в генной инженерии для получения плазмид в препаративных количествах. Он позволяет отделять суперскрученные молекулы ДНК от кольцевых и линейных, так как их плавучие плотности заметно различаются из-за разного количества молекул бромистого этидия, интеркалированного в эти топологические изомеры плазмидной ДНК. В целях обычного применения рекомбинантных ДНК, в том числе для молекулярного клонирования, построения рестрикционных карт и секвенирования, разработаны методы минипрепаративного выделения. В одном из них суперскрученные молекулы рекомбинантных плазмидных ДНК легко отделяются от линейных молекул хромосомной и плазмидной ДНК в процессе щелочной денатурации с последующей быстрой нейтрализацией раствора. При этом в основном успевают ренатурировать только суперскрученные молекулы ДНК, так как две их цепи остаются физически связанными друг с другом в процессе денатурации. Образовавшийся комплекс денатурированной ДНК и белков отделяется от плазмидной ДНК центрифугированием. ДНК освобождаются от основной массы РНК переосаждением смеси нуклеиновых кислот в присутствии высокой концентрации LiCl. Также для освобождения препаратов ДНК от примесей РНК часто применяют высокоочищенные препараты РНКаз без примесей ДНКаз. После обработки смеси нуклеиновых кислот РНКазой, белковый компонент смеси удаляется с использованием смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). После последующего центрифугирования ДНК из отобранного верхнего водного слоя можно выделить осаждением охлажденным этанолом или изопропанолом. 25 Вопросы для самоконтроля. 1. Охарактеризуйте роль ДНК в клетках живых организмов. 2. В каком виде находится большая часть нуклеиновых кислот в клетках? 3. Как разъединить нуклеиновые кислоты и белки в гомогенатах биологического материала? 4. Охарактеризуйте фенольный метод выделения ДНК. 5. Опишите хлороформ-изоамиловый метод выделения ДНК. 6. Перечислите способы фракционирования смеси нуклеиновых кислот. 7. Что называется фенольной депротеинизацией? 8. Опишите метод разделения нуклеиновых кислот ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. 9. Перечислите методы минипрепаративного выделения и охарактеризуйте их. 10.Какие приемы применяются для освобождения препаратов ДНК от примесей РНК? 11.Для каких целей используют электрофорез ДНК? 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Литература к теме 6: Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия : краткий курс с упражнениями и задачами. 3-е изд., Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2005. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск, 2005. Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005. Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005. Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – 4-е издание, перераб. и доп. М: изд-во "Агар", 1999. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 26 ТЕМА 7. Свойства молекул ДНК. Указания к изучению темы. В клетках высших эукариот (например, животных или растений) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках бактерий и архей кольцевые или линейные молекулы ДНК прикреплены изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами. Одно- или двухцепочечные молекулы ДНК могут образовывать геном ДНК-содержащих вирусов. С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы и фосфатной группы. В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована. Такую структуру молекулы ДНК принято называть «двойной спиралью». В ДНК встречаются четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей взаимодействуют с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями по принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин — только с цитозином. Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК: матричных (мРНК), рибосомальных (рРНК) и транспортных (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт транслирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков. Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции Каждое основание на одной из цепей связывается с одним определённым основанием на второй цепи. Такое специфическое связывание называется комплементарным. Пурины комплементарны пиримидинам (то есть, способны к образованию водородных связей с ними): аденин образует связи только с тимином, а цитозин — только с гуанином. В двойной спирали цепочки также связаны с помощью гидрофобных взаимодействий, которые не зависят от последовательности оснований ДНК. 27 Комплементарность двойной спирали означает, что информация, содержащаяся в одной цепи, содержится и в другой цепи. Обратимость и специфичность взаимодействий между комплементарными парами оснований важна для репликации ДНК и всех остальных функций ДНК в живых организмах. Так как водородные связи нековалентны, они могут обратимо разрываться и восстанавливаться. Цепочки двойной спирали могут расходиться как замок-молния под действием ферментов или при высокой температуре. Разные пары оснований образуют разное количество водородных связей. АТ связаны двумя, ГЦ — тремя водородными связями, поэтому на разрыв ГЦ требуется больше энергии. Процент ГЦ пар и длина молекулы ДНК определяют количество энергии, необходимой для диссоциации цепей: длинные молекулы ДНК с большим содержанием ГЦ более тугоплавки. В процессе выделения ДНК происходят нарушения ее целостности. Длинные молекулы ДНК рвутся на более мелкие. Часть молекул ДНК теряет двухспиральную структуру. Происходит накопление олигонуклеотидов и мононуклеотидов. Спектры поглощения нуклеотидов расположены в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. У всех нуклеотидов кроме цитидина максимумы поглощения наблюдаются около 260, у цитидина около 270 нм. Коэффициенты молярной экстинкции нуклеотидов зависят от длины волны, свойств растворителя и природы нуклеотида. Так при 259,5 нм при pH 7 аденин имеет коэффициент молярной экстинкции (εмакс) равный 13400 М–1.см–1. Спектр поглощения ДНК обусловлен наложением спектров ее мономеров (нуклеотидов). Максимум поглощения ДНК в водных растворах при физиологических значениях рН наблюдается при 260 нм (λмакс). Однако поглощение ДНК при 260 нм существенно меньше, чем суммарное поглощение ее мономеров. При распаде нативной ДНК до мононуклеотидов происходит увеличение поглощения – гиперхромный эффект (гиперхромизм). Гиперхромным эффектом ДНК называется значительное увеличение оптической плотности раствора эквимолярной смеси свободных нуклеотидов или денатурированной ДНК по сравнению с оптической плотностью раствора нативной ДНК. На основании оценки гиперхромизма возможно определение степени денатурации и ренатурации ДНК. Гиперхромизм в применении к спектру полимера предполагает, что удвоенная мощность осциллятора перехода в мономере больше, чем полная мощность осциллятора соответствующего перехода в димере. 28 Нуклеотиды, входящие в состав двухцепочечной молекулы ДНК, поглощают ультрафиолет в той же области, что и свободные нуклеотиды, однако интенсивность поглощения двухцепочечной молекулы ДНК меньше, чем в случае эквивалентного количества свободных нуклеотидов. Это обусловлено взаимодействием пар оснований в структуре двойной спирали. Интенсивность поглощения около 260 нм в спектре ДНК резко изменяется при нагревании выше некоторой критической температуры, величина которой зависит от свойств исследуемой ДНК. При достижении этой критической температуры поглощение возрастает приблизительно на 40 % в температурном интервале, составляющем всего лишь несколько градусов. Это можно объяснить тем, что в денатурированном состоянии ароматические кольца могут свободно вращаться, в связи с чем взаимная ориентация дипольных моментов переходов соседних групп исчезает. В меньшей степени уменьшение оптического поглощения по сравнению с мономерными компонентами характерно для всех полинуклеотидов и олигонуклеотидов, для которых не характерны необратимые изменения при обычных условиях денатурации. При увеличении длины цепи олигонуклеотида гиперхромизм быстро достигает предельного значения у цепочки в 5-6 остатков. Это было показано и при изучении синтетических олигонуклеотидов. Гипохромизм важен не только сам по себе, как чрезвычайно интересное оптическое явление.Этот феномен, дает нам в руки простой и удобный метод, который можно использовать в химии нуклеиновых кислот для качественной и количественной оценки процессов денатурации, ренатурации, обратимого образования гомополимерных комплексов или образования гибридных спиралей ДНК – РНК. Он также применяется для установления генетической связи между ДНК из различных организмов или из различных клеток одного и того же организма. Все, что требуется для проведения такой оценки - это спектрофотометр или какой-нибудь другой прибор, с помощью которого можно измерять поглощение света в области 260 нм. Гиперхромизм является признаком денатурации (переход от двухспиральной структуры ДНК к односпиральной). Поэтому изучение гиперхромного эффекта является критерием качества препаратов ДНК. Качественное изучение свойств ДНК возможно лишь при использовании высокоочищенных образцов. Препарат ДНК считается чистым, если отношение 260 нм/280 нм составляет 1,8–2,0 и отношение 260 нм/230 нм составляет 1,8 – 2,2. Меньшие значения этих отношений характерны для загрязненных образцов ДНК. Поглощение при 320 нм характерно при наличии в растворе частичек пыли. 29 Вопросы для самоконтроля. Как устроен геномный аппарат в клетках высших эукариот? Как устроен геномный аппарат в клетках прокариот? Что представляет собой ДНК с химической точки зрения? Что понимается под комплементарностью двойной спирали ДНК? 5. Какие физические и химические процессы могут происходить в процессе выделения ДНК? 6. Чем отличаются от исходного образца ДНК денатурированная и ренатурированная ДНК? 7. Какие процессы влияют на спектры поглощения ДНК? 8. Как нативность ДНК связана со спектрами ее поглощения? 9. В чем состоит гиперхромнный эффект ДНК? 10.Какие задачи можно решать используя абсорбционную спектроскопию ДНК? 11.Каким образом с помощью абсорбционной спектроскопии можно решать задачи установления генетической связи между ДНК из различных организмов? 1. 2. 3. 4. Литература к теме 7: 1. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. 2. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск, 2005. 3. Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005. 4. Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005. 5. Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004. 6. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – 4-е издание, перераб. и доп. - М: изд-во "Агар", 1999. 7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 8. Dahm R (2005). «Friedrich Miescher and the discovery of DNA». Dev Biol 278 (2). 9. Thanbichler M, Wang S, Shapiro L (2005). «The bacterial nucleoid: a highly organized and dynamic structure». J Cell Biochem 96 (3). 30 ТЕМА 8. Полимеразная цепная реакция. Указания к изучению темы. ДНК – молекула, в которой закодирована наследственная информация любого организма в виде последовательности генов. Эта информация регулирует жизнедеятельность клеток, из которых состоят все организмы. Структура и работа самих клеток определяется различными видами белков, в том числе и ферментами. Информация гена записана в виде последовательности из четырех типов нуклеотидов Это аденин (A), гуанин (Г) (относящиеся к пуринам) и тимин (T), цитозин (Ц) (относящиеся к пиримидинам). Молекула ДНК обычно состоит из двух нитей, которые обвивают друг друга в виде спирали. Это знаменитая двойная спираль, за открытие которой Уотсон и Крик в 1962 году получили Нобелевскую премию. При делении клетки происходит удвоение ДНК – репликация, во время которой обе нити ДНК расходятся. Каждая из них становится матрицей, на которой фермент ДНК-полимераза по принципу комплементарности достраивает вторую нить нуклеиновой кислоты, двигаясь от 5'-конца нити ДНК к ее 3'концу, где цифры 5 и 3 обозначают положение атомов углерода в нуклеотиде. Однако ДНК-полимераза не способна инициировать процесс репликации, она лишь добавляет нуклеотиды к уже имеющемуся небольшому двунитевому участку - праймеру (затравке). Синтез праймеров обеспечивается другим ферментом – праймазой, после чего ДНК-полимераза начинает перемещаться вдоль матрицы, добавляя и соединяя нуклеотиды. Сворачивание двунитевой молекулы ДНК в спираль происходит автоматически. ДНК, несущая в себе оригинальную копию генетической информации, считается неприкосновенной и не используется как непосредственный источник инструкций для управления клеткой и построения необходимых ей белков. Рабочие копии генов состоят из другой нуклеиновой кислоты – РНК (рибонуклеиновой кислоты). Это РНК-посредник, или мРНК. РНК отличается от ДНК тем, что несет в себе сахар рибозу, а тимин (T) заменяется родственным ему урацилом (У). К тому же, РНК обычно однонитевая. И по этой информации, передающейся от ДНК через мРНК, специальный аппарат клетки – рибосома - строит белки. В современном мире развитие науки напрямую связано с развитием методов исследования. В 1983 годов американский ученый Кэри Мюллис изобрел полимеразную цепную реакцию, получив впоследствии за это Нобелевскую премию. 31 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод ферментативного получения большого количества копий (ампликонов) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити). При этом происходит копирование только необходимого участка ДНК, так как только он соответствует заданным условиям. И только в том случае, если этот фрагмент присутствует в исследуемом образце. Для протекания этой реакции необходимы три основных компонента. Во-первых, служащая матрицей молекула ДНК, содержащая исследуемый фрагмент. Во-вторых, ДНК-полимераза и нуклеотиды, используемые ДНК-полимеразой для синтеза ДНК. В-третьих, два праймера ПЦР – два коротких сегмента однонитевой нуклеиновой кислоты, комплементарных началу и концу исследуемого фрагмента ДНК (обычно длиной 15-20 оснований). Присоединяясь к этому фрагменту, праймеры инициируют запуск синтеза ДНК. ДНК-полимераза начинает добавлять последующие звенья. Праймеры в настоящее время можно синтезировать с помощью автоматизированного аппарата, задав программу требуемой последовательности нуклеотидов. Реально метод ПЦР осуществляет естественную репликацию ДНК, только в пробирке, повторяющуюся много раз и столько, сколько это необходимо для исследования. Метод включает следующие этапы. Сначала происходит расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующая комплементарная достройка обеих с помощью специального фермента (полимеразы). Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных "стартовых блоках" - коротких двунитевых участках. Для проведения такого процесса используют две генетические маркеры - праймеры, которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры - это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (10-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры чуть ниже 1000 С. ДНК денатурирует и комплементарные нити ДНК расходятся. Далее к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяются праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые - "стартовые блоки". Праймеры присоединяются в направлении с 3 , - конца цепочки ДНК, по одному на каждую цепь, поэтому достраивание новой цепи ДНК в последующих циклах происходит в ограниченном праймерами участке ДНК. 32 Следующая стадия заключается в наращивании новой цепочки ДНК посредством присоединения имеющихся в реакционной смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Процесс наращивания начинается от праймеров и осуществляется при помощи фермента - ДНК-полимеразы при температуре около 72 С (специфические бактериальные ферменты полимеразы, устойчивые к высоким температурам). Полимераза осуществляет синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей после нового прогрева. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть полимеразная цепная реакция (ПЦР). Процедура ПЦР включает несколько высокотемпературных этапов, поэтому и используются термостабильные ДНК-полимеразы. В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов - присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса - синтез цепей ДНК. Термостабильные полимеразы выделяются из термостойких бактерий, живущих в горячих источниках при температурах до 90°С. Чаще всего это Taq-полимераза бактерий Thermus aquanticus, Tth-полимераза (Thermus thermophilus), Pwoполимераза (Pyrococcus woesei). В настоящее время при проведении ПЦР часто используются смеси полимераз с различными свойствами, включая искусственно полученные модификации природных ферментов. Так как процесс ПЦР требует постоянной смены циклов с несколькими разными температурами, современные аппараты для ПЦР – амплификаторы - работают в режиме быстрого изменения температуры реакционной смеси по заданной программе и способны амплифицировать фрагмент ДНК длиной от 100 до 3000 пар оснований в течение нескольких часов, начиная с микрограмма ДНК. Однако амплификаторы могут начать процесс и с миллионной доли микрограмма. Помимо простого увеличения числа копий ДНК ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом: введение мутаций, изменение оснований, сращивание фрагментов. 33 Вопросы для самоконтроля. Что такое ПЦР? Суть метода. История разработки современной методики ПЦР. Что нового предложил Мюллис? Какие усовершенствования в методике были сделаны в1986 году? 5. Назовите алгоритм проведения ПЦР. 6. Участки какой длины можно амплифицировать, используя ПЦР? 7. Перечислите компоненты реакции ПЦР. 8. Как действует добавление пирофосфатазы на выход ПЦР? 9. Что называется праймером ПЦР? 10.Что называется амплификатором? 11.Каким образом можно сделать вывод об успешности проведения ПЦР? 12.Что называется ампликоном? 13.Сколько циклов обычно выполняется при проведении ПЦР? 14.Из каких стадий состоит цикл ПЦР? 15.В каких сферах деятельности используется ПЦР? 16.В чем состоит ПЦР-диагностика при определении возбудителя заболевания? 17.В чём преимущества ПЦР как метода диагностики? 1. 2. 3. 4. 34 Литература к теме 8: 1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007. 2. Ельяшевич М.А. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2009. 3. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. 4. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск, 2005. 5. Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005. 6. Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005. 7. Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004. 8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. 9. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. — М.: Наука, 2005. — В 2 т. 10.Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. 11. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. 12.Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis. Genomics, 98(2). 35 Указания по написанию реферата. Одной из форм самостоятельной работы студентов является написание реферата. Реферат – краткое описание рецензируемых текстов с набором ключевых понятий и основных положений. Работа над рефератом способствует повышению общей и профессиональной эрудиции студентов. Реферирование может быть посвящено отдельной проблеме или содержать обобщение разных точек зрения по определенной теме. Автор реферата определяет свое отношение к рассматриваемым научным позициям, взглядам или определениям, принадлежащим различным авторам. Реферат должен представлять собой научную ценность, поэтому подход студента к написанию реферата должен иметь исследовательский характер. При подготовке реферата следует использовать монографии, обзоры и оригинальные научные статьи. Выполнение реферативных работ осуществляется в несколько этапов: выбор темы, составление плана, проработка литературных источников с их анализом, написание и защита реферата. Тема реферата выбирается из рекомендованного списка или по предложению студента (с согласия преподавателя). Рекомендуемый объём реферата – около 20 страниц компьютерного набора через 1,5 интервала. Высота букв (кегль) – 14. Текст должен быть напечатан на одной стороне стандартного листа белой бумаги формата А4 (210 х 297 мм). Страницы должны иметь поля: левое – 30 мм; верхнее – 25 мм; правое – 15 мм; нижнее – 20 мм. Страницы нумеруются вверху (от центра). К реферату прилагается презентационный материал, включающий около 10 слайдов. Структура реферата и правила оформления рисунков, схем, цитируемой литературы аналогичны требуемым для курсовых и дипломных работ. 36 Темы рефератов для самостоятельной работы студентов 1. Проблемы выделения в индивидуальном виде компонентов из живых организмов. 2. Нативность белков и нуклеиновых кислот. 3. Физико-химические свойства белков. 4. Основные принципы выделения и очистки белков. 5. Физико-химические свойства нуклеиновых кислот. 6. Основные принципы выделения и очистки нуклеиновых кислот. 7. Принцип метода гель-фильтрации. 8. Определение молекулярной массы молекул методом гель-фильтрации. 9. Разрешающая способность метода гель фильтрации. 10.Растворы используемые при экстракции белков. 11.Основные принципы разделения белков. 12.Метод высаливания белков. 13.Метод изоэлектрического фокусирования. 14.Очистка белковых растворов от низкомолекулярных примесей. 15.Принципы определения гомогенности белка. 16.Методы определения молекулярной массы белка. 17.Определение молекулярной массы белка методом гель-фильтрации. 18.Основные принципы хроматографии. 19.Основные типы хроматографии, используемые при выделении и очистке белков. 20.Физические и химические механизмы лежащие в основе абсорбционной хроматографии. 21.Области применения разных видов хроматографии. 22.Электрофорез биологических молекул. 23.Физические и химические механизмы лежащие в основе электрофореза. 24.Разновидности электрофореза биологических макромолекул. 25.Гель-электрофореза ДНК. 26. Гель-электрофореза белков 27.Разделение нуклеиновых кислот и белков в гомогенатах биологического материала. 28.Методы выделения ДНК. 29.Методы очистки ДНК. 30.Физические и химические процессы, происходящие в процессе выделения ДНК. 31.Отличия нативной, денатурированной и ренатурированной ДНК. 32.Гиперхромный эффект ДНК. 37 33.Задачи, которые можно решать используя абсорбционную спектроскопию ДНК. 34.Принципы метода ПЦР. 35.История разработки современной методики ПЦР. 36.Алгоритм проведения ПЦР. 37.Области применения ПЦР. 38.Преимущества ПЦР как метода диагностики. Список рекомендуемой литературы 1. Ельяшевич М.А. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2009. 2. Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007. 3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007. 4. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск, 2005. 5. Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005. 6. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. — М.: Наука, 2005. — В 2 т. 7. Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005. 8. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. 9. Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004. 10.Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2003. 11.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. 12.Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 13.Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот ; под ред. А. И Арчакова, М. П. Кирпичникова, А. Е. Медведева, В. П. Скулачева. – М., 2002. 14.Elliott. – Oxford : University Press, 2002. 15.Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 38 16.Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – 4-е издание, перераб. и доп. М: изд-во "Агар", 1999. 17.Аффинная хроматография: Методы. Под ред. П.Дин, У.Джонсона, Ф.Мидл. М.: Мир, 1988. 18.Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М. Мир, 1982. 19.Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. 39 Перечень примерных контрольных вопросовк зачету по курсу «Методы биохимических исследований» 1. Перечислите проблемы выделения в индивидуальном виде компонентов из живых организмов. 2. В чем состоит функциональная роль буферных систем организма? 3. Как готовят буферные растворы? 4. От чего зависит рН буферных растворов? 5. Как влияют на рН буферных растворов их разведение, а также добавление в раствор кислоты или щелочи? 6. Что понимают под нативностью белков и нуклеиновых кислот? 7. Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, заряд белковых молекул, оптические свойства, растворимость, денатурация. 8. Каковы основные принципы выделения и очистки белков? 9. Физико-химические свойства нуклеиновых кислот: молекулярная масса, заряд молекул, оптические свойства, растворимость, денатурация. 10.Каковы основные принципы выделения и очистки нуклеиновых кислот? 11.Что представляют из себя молекулярные сита? 12.В чем заключается принцип метода гель-фильтрации? 13.На чем основывается процесс фракционирования молекул при гельфильтрации? 14.Какие гель-матрицы применяются для гель-фильтрации? 15.Каковы основные параметры гель-фильтрационной колонки? 16.Что называется свободным объемом колонки? 17.Объясните, что называется гель-фильтрационными диаграммами элюирования веществ? 18.Как определить молекулярную массу молекул методом гельфильтрации? 19.Каковы основные принципы выбора типа геля, размеров колонки, условий элюирования? 20.Какова разрешающая способность метода гель фильтрации? 21.Перечислите основные этапы гель-фильтрации белков. 22.Для каких целей необходимо получение индивидуальных белков? 23.Почему большинство методов органической химии, применяемых для выделения того или иного вещества из смеси, обычно не подходит для выделения белков? 24.Перечислите стадии поучения индивидуального белка в гомогенном виде. 40 25.Назовите методы гомогенизации биологических материалов при выделении белка. 26.Какие растворы используются при экстракции белков из гомогенатов? 27.Каким образом нерастворимые фракции отделяют от экстрактов белков? 28.Каковы основные принципы разделения белков? 29.Перечислите методы фракционирования белков. 30.Перечислите диапазон применимости каждого метода фракционирования белков. 31.Назовите преимущества и недостатки имеющихся методов фракционирования белков. 32.На чем основано разделение белков путем их осаждения? 33.Какие реактивы применяют для разделения белков путем их осаждения? 34.На чем основан принцип фракционирования белков сульфатом аммония 35.Перечислите достоинства и недостатки разных способов разделения белков путем их осаждения. 36.Каковы основные этапы фракционирования белков сыворотки крови сульфатом аммония? 37.Перечислите основные этапы фракционирования белков сыворотки крови этанолом. 38.Опишите принцип метода изоэлектрического фокусирования белков. 39.Каким образом белковые растворы очищают от низкомолекулярных примесей? 40.Назовите принципы определения гомогенности белка. 41.Назовите методы определения молекулярной массы белка. 42.В чем состоят основные принципы хроматографии биологических молекул? 43.Назовите основные типы хроматографии, используемые при выделении и очистке белков. 44.Какие физические и химические механизмы лежат в основе абсорбционной хроматографии белков? 45.Какие физические и химические механизмы лежат в основе распределительной хроматографии белков. 46.Какие физические и химические механизмы лежат в основе ионообменной хроматографии белков? 47.Какие физические и химические механизмы лежат в основе афинной хроматографии белков. 48.Опишите сферы применения разных видов хроматографии белков. 41 49.В каких разделах биологических исследований применяется электрофрорез? 50.Для каких целей в биологии используется электрофорез? 51.Какие физические и химические механизмы лежат в основе электрофореза? 52.Назовите используемые разновидности электрофореза биологических макромолекул. 53Для каких целей используют электрофорез белковых молекул? 54.Охарактеризуйте методику электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лэммли. 55.Перечислите и охарактеризуйте разновидности и модификации методики электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лэммли. 56.На чем основано электрофоретическое разделение ДНК? 57.Для каких целей используют электрофорез ДНК? 58.В каких случаях используют электрофорез ДНК в полиакриламидном геле, а в каких случаях в агарозном геле? 59.Охарактеризуйте метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле. 60.Опишите алгоритм проведения гель-электрофореза ДНК. 61.Какими способами можно определить положение различных фрагментов ДНК в гелях после проведения электрофореза? 62.Какими параметрами определяется скорость миграции ДНК в геле при электрофорезе? 63.Как разъединить нуклеиновые кислоты и белки в гомогенатах биологического материала? 64.Охарактеризуйте фенольный метод выделения ДНК. 65.Опишите хлороформ-изоамиловый метод выделения ДНК. 66.Перечислите способы фракционирования смеси нуклеиновых кислот. 67.Опишите метод разделения нуклеиновых кислот ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. 68.Перечислите методы минипрепаративного выделения и охарактеризуйте их. 69.Какие приемы применяются для освобождения препаратов ДНК от примесей РНК? 70.Перечислите основные этапы выделения ДНК из биомассы бактерий. 71.Каких проблем следует избегать при выделении ДНК? 72.В чем состоит принцип определения концентрации ДНК спектрофотометрическим методом? 73.Каковы спектрофотометрические критерии чистоты препаратов ДНК? 42 74.Перечислите основные этапы очистки препаратов ДНК. 75.Как определить концентрацию и качество исходного нативного образца ДНК? 76.Чем отличаются от исходного образца ДНК денатурированная и ренатурированная ДНК? 77.Какие процессы влияют на спектры поглощения ДНК? 78.В чем состоит гиперхромнный эффект ДНК? 79.Какие задачи можно решать используя абсорбционную спектроскопию ДНК? 80.Для каких целей в биохимии используются эндонуклеазы рестрикции? 81.На чем основаны принципы использования эндонуклеаз рестрикции? 82.Каковы оптимальные условия реакций рестрикции? 83.Какие буферы используются для проведения реакций рестрикции? 84.Какие задачи необходимо решать при проведении рестрикционного анализа ДНК? 85.Перечислите основные этапы проведения рестрикционного анализа ДНК. 86.Какие операции нужно совершить после для проведения реакций рестрикции? 87.Как оценить размер полученных рестриктов? 88.Как оценить качество рестрикции (полноту расщепления пробы)? 89.Какую информацию можно получить при расщеплении ДНК определенной молекулярной массы двумя рестриктазами одновременно? 90.В чем состоит проблема при использовании метода расщепления ДНК двумя рестриктазами одновременно? 92.Охарактеризуйте суть метода ПЦР. 93.Каков алгоритм проведения ПЦР. 94.Участки какой длины можно амплифицировать, используя ПЦР? 95.Перечислите компоненты реакции ПЦР. 96.Что называется праймерами при проведении ПЦР? 97.Каким образом можно сделать вывод об успешности проведения ПЦР? 98.Что называется ампликонами? 99.Из каких стадий состоит цикл ПЦР? 100.В чём состоят достоинства метода ПЦР? 43 Оглавление Введение Перечень изучаемых тем График Тема 1. Основные принципы исследований в биохимии Литература к теме 1 Вопросы для самоконтроля Тема 2. Разделение макромолекул методом гель-фильтрации Литература к теме 2 Вопросы для самоконтроля Тема 3. Выделение, очистка и определение гомогенности белков Литература к теме 3 Вопросы для самоконтроля Тема 4. Общие принципы хроматографии Литература к теме 4 Вопросы для самоконтроля Тема 5. Основы электрофореза Литература к теме 5 Вопросы для самоконтроля Тема 6. Выделение и очистка ДНК Литература к теме 6 Вопросы для самоконтроля Тема 7. Свойства молекул ДНК Литература к теме 7 Вопросы для самоконтроля Тема 8. Полимеразная цепная реакция Литература к теме 8 Вопросы для самоконтроля Указания по написанию реферата Темы рефератов Список рекомендуемой литературы Перечень примерных контрольных вопросов к зачету 44 3 5 5 6 8 8 9 10 11 12 14 15 16 18 19 20 22 23 24 26 26 27 30 30 31 34 35 36 37 38 40 Учебное издание МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Методические указания к самостоятельной работе Составитель: Гусейнов Олег Аладдинович Подготовлено к публикации редакционно-издательским отделом БИК СФУ Подписано в печать 20 мая 2012 г. Формат 60х84/16. Бумага офсетная. Печать плоская. Усл. печ. л. (3). Тираж 100 экз. Заказ 6531 45 Редакционно-издательский отдел Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79 Тел/факс (391) 206-21-49. E-mail rio@sfu-kras.ru http://rio.sfu-kras.ru Отпечатано Полиграфическим центром Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а 46
