Начало формы УДК 01.01.01.02.М16 УЛТАНБЕКОВА Г.Д

УДК 01.01.01.02.М16
УЛТАНБЕКОВА Г.Д., МУКАШЕВ Н.З., АЛИБЕКОВА Ш.Б., САДАНОВ А.К.
ПРОИЗВОДСТВО БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НИТРАГИНА ДЛЯ КУЛЬТУРЫ СОИ
(Институт Фармацевтической биотехнологии МОН РК)
В статье приведены результаты исследований и получения экологически чистой
продукции при применении препарата нитрагина для культур разных штаммов сои и
люцерны. Приводятся опытные показатели прироста биомассы в динамике при их
культивировании на ферментационной среде разных штаммов.
Интенсивное возделывание сельскохозяйственных культур обедняет почву азотом,
отчуждаемым с урожаем. Однако бобовые, не только не обедняют почву, а наоборот,
повышают ее плодородие. Поэтому с давних времен в сельском хозяйстве практиковалось
восстановление и улучшение почв путем выращивания на них бобовых растений, способных
накапливать азот [1].
Сразу после открытия явления симбиотрофной фиксации молекулярного азота возникла
мысль использовать клубеньковые бактерии для практических целей. Сначала для этого
применяли почву, на которой выращивались бобовые культуры. Такую почву разбрасывали
(2-4 т/га) на площадях, предназначенных для посева бобовых, где они ранее не
выращивались. Более эффективным оказался другой метод: с корней бобовых собирали
клубеньки, подсушивали и тонко размельчали. Таким материалом (с добавлением талька,
бентонита) обрабатывали семена бобовых растений перед посевом. В препаратах
содержались различные по азотфиксирующей активности бактерии, не считая посторонних
микроорганизмов. В 1896г. в Германии Ноббе и Гильтнер изготовили коммерческий препарат,
содержащий смесь клубеньковых бактерий для девятнадцати видов бобовых. Препарат,
получивший название "нитрагин", которое сохранилось до настоящего времени, повышал
урожайность бобовых, что привлекло к нему внимание во всем мире [2, 3, 4].
Учитывая высокую эффективность применения нитрагина для бобовых культур в сельском
хозяйстве и недостаточную изученность условий, способствующих наиболее активной
азотфиксации бобовыми мы поставили цели:
а. Изучить новое в технологии способ получения сухого нитрагина.
б. Изучить влияние нитрагина на культуры сои в условиях орошаемой зоны юга Казахстана.
Исследования проводились в институте фармацевтической биотехнологии МОН РК в г.
Степногорск.
Получения сухого нитрагина основанный на современной глубинной ферментации клубеньковых бактерий с последующим лиофильным высушиванием. Лиофильное высушивание
микробов широко используется в практике приготовления сухих вакцин. Приготовления сухого
нитрагина готовится по рекомендации совместной разработки ВНИИ БАКПРЕПАРАТ и
ВНИИСХМ 1982г.
Технологическая схема состоит из нескольких этапов:
Результаты исследований
Посевы зернобобовых последнее время, значительно возросли, и производство не в состоянии обеспечить почвенным нитрагином все площади под бобовыми культурами. В связи с
этим возникла необходимость в разработке способа получения нитрагина в сухом виде.
В особенности при изготовлении сухих вакцин, широкое распространение получило высушивание бактерий под вакуумом в замороженном состоянии – метод лиофилизации. Этот
метод позволяет высушивать микробы с меньшими потерями и сохранять их основные
свойства.
Наш институт впервые выпускали опытные партии сухого нитрагина. Использовали вместо
бобового отвара кукурузный экстракт. Это среда употреблялось при глубинной ферментации
изготовлении опытные партии сухого нитрагина.
Среды кг/л следующего состава: Кукурузный экстракт - 4,8, Техническая глюкоза - 8,0,
(NH4)2S04 - 0,4, K2НP04 - 0,4, NaCl - 0,1, MgS04-7H20 - 0,16, Мел - 0,8, рН - 6,1-6,2.
Прирост биомассы клеток изучали в основном на этой среде. В процессе изготовления сухого
нитрагина перед лиофильным высушиванием важно было учесть не только накопление
биомассы но необходимо было чтобы клетки были устоичивыми к обезвоживанию.
Устоичивость будет зависеть от того в какой период роста и развития культура будет
поступать высушивания. Показатели при роста биомассы и динамика на ферментационной
среде показано в таблице № 1 и № 2.
Таблица 1. Показатели прироста биомассы сои и люцерны в динамике на ферментационной
среде (опыт 1) (млн/мл).
Засев ферментационной среды производили суспензией клеток смывом с косяка 5 мл
дистиллированной воды (маленький косяк). Доза засева - 2 мл в колбу, содержащую 30 и 50
мл среды. Культивировали при +250С 72-96 часов на качалке (режим 220 об/мин).
Таблица 2. Показатели прироста биомассы сои и люцерны в динамике на ферментационной
среде (опыт 2) (млн/мл).
По полученным данным, культура старшего возраста менее чувствительны к высушиванию,
как и вообще ко всем неблогоприятным условиям. Клетки молодой культуры особенно
чувствительны ко всем вредным воздействиям.
Наработка КЖ нитрагина по технологической цепочке на колбах.
Посевной материал нарабатывали культивированием штаммов на Пн с 50 мл среды, доза
засева – 1 петля на колбу, при 300С на качалке (режим 220 об/мин) 24 часа. 2 мл посевного
материала засевали 30 мл среды ФН. Ферментацию проводили при 300С на качалке с 220
об/мин, 48 часов. Полученные данные представлены в таблице 3.
Таблица 3. Показатели результатов ферментации.
Наработка посевного материала для ферментации 2/2.
Готовили стерильный посевной материал клубеньковых бактерий сои и люцерны в объеме
1200 мл с титром клеток 4,1Ч109 кл/мл. (млн/мл).
Операцию по наработке кж клубеньковых бактерий сои проводили в ферментере
ўўElectroluxўў вместимостью 130 л с мешалкой.
Ферментацию вели на среде следующего состава (г/л): Кукурузный экстракт - 6,0, Глюкоза 10,0, NaCl - 0,2, K2HPO4 - 0,5, (NH4)2SO4 - 0,5, MgSO4*7H2O - 0,2, Вода водопроводная до 1000 мл, рН - 6,85.
Питательную среду готовили в ферментере и стерилизовали при температуре 1210С в
течение 30 минут. Объем загрузки составил 50л.
Режим культивирования: температура (25+1)0С, режим работы мешалки в минуту –450
об/мин; расход технологического воздуха-50л/мин; давление в аппарате-0,02-0,04Мпа.
В процессе культивирования клубеньковых бактерий сои были сняты кинетические
характеристики, построены кривые изменения параметров. Данные приведены в таблице 4.
Операцию закончили на 35 часу роста. Титр клеток в конечной пробе составил 5,2х109 кл/мл.
Наработка опытно-промышленной партии.
Концентрирование, сушку и нормализацию опытно промышленной парти №1 проводили по
следующей схеме:
1. Концентрирование на центрифуге S70D при g=3000 об/мин t=45 мин;
2. Высушивание на лиофильной сушилке LZ-9 с градиентом температур Т=-45+280С.
3. Усреднение партии до необходимого титра каолином.
Таблица 4. Кинетические характеристики клубеньковых бактерии Rh-7.
Нами была наработана партия культуральной жидкости с содержанием клубеньковых
бактерий 5,2х109 в миллилитре культуральной жидкости, объемом V=48 литров, с
содержанием сухих веществ -1,467%. Вес сконцентрированных клеток клубеньковых бактерий
составил 403 грамма. В качестве защитной среды добавили 80,6 грамма мелассы и
смешанную пасту с защитной средой заморозили перед сушкой до Т=-500С. Высушенный
продукт весом 216 грамм измельчили, добавили 4500 мл дистиллированной воды и 4500
грамма каолина. Титр готовой пасты 15х109 кл/мл. Полученные результаты отражены в
таблице 5.
Таблица 5. Результаты постадийной обработки слива 2/2.
Таким образом, сухой нитрагин обладает хорошей прилипаемостью к семенам (семена
необходимо смачивать водой, перемешивать с нитрагином и затем подсушивать) обработку
семян легко механизировать, что значительно расширяет возможности его применения. Была
наработана опытная партия нитрагина в опытно – производственных условиях института
фармацевтической биотехнологии со стандартным содержанием клубеньковых бактерий
5,2х109 кл/г и передана на испытание в хозяйства Алматинской области.
ЛИТЕРАТУРА
1. Доросинский Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л., 1970.
2. Хотянович А.В., Позднякова А.И. Производство торфяных препаратов клубеньковых
бактерии // Труды ВНИИ сельхоз. Микробиология. М., 1980. Т.50.
3. Хотянович А.В., Чиканова В.М.,Бочаров В.В. Эффективность различных методов
инокуляции бобовых растений препаратов клубеньковых бактерий // Прикл. Биох. и микроб.
М., 1982. Т.18. Вып. 4.
4. Аркадьева З.А., Безбородов А.М., Блохина И.Н. и др. Промышленная микробиология. М.,
Высшая школа, 1989. С.586-598.
***
ʼï æûëäûº çåðòòåóëåðäi ”ê¼ðñåòóiíøå, ò¾éíåêòi áàêòåðèÿëàðäû” æàñàë¹àí ïðåïàðàòòàð
áåëñåíäi æà¹äàéäà ¹àíà ¸ñåðëi áîëàäû.
Êîíöåíòðëi ò¾éíåêòi áàêòåðèÿëàðäûн ”æàñóøàëàðûíûн” ñàëìà¹û 403 ãð. áîëäû. ²îðåêòiê ºîð¹àíûø
îðòà ðåòiíäå ìåëàññà ºîñûëäû, àðàëàñºàí ºîñïàíû º½ð¹àòàð àëäûíäà –500Ñ ì½çäàòòûº æ¸íå 216 ãð.
º½ð¹àòûë¹àí ¼íiìäi ½ñàòûï î¹àí ñó æ¸íå êàîëèí ºîñòûº. Îñûíäàé æîëìåí ñîÿíûн ”ò¾éíåêòi
áàêòåðèÿëàðûíан” çåðòòåó ñòàíäàðòòû ïðåïàðàòû 5,2õ109 êë/ã äàéûíäàëäû.
***
As shown by investigations of many years the preparations, which made from tube bacterias,
effective only in active condition. Weight of concentrated cell tube bacterias 403 gr. As a defensive
ambience was add melassa, befor dry of mixed coded fo 500c and add water and coalin/ With this
way was prepeared a preparation of standard 5,2·109 cg/g for imnestigation of tuber bacterias.