1. Повторение процессов биосинтеза белка. (Просмотр диска).
реклама
1. 2. Повторение процессов биосинтеза белка. (Просмотр диска). Проверочная работа. Репликация ДНК Генетический код Транскрипция Трансляция 3. Генная инженерия Задачи генной инженерии. Современный уровень наших знаний биохимии, молекулярной биологии и генетики позволяет рассчитывать на успешное развитие новой биотехнологии — генной инженерии, т. е. совокупности методов, позволяющих путем операций in vitro (в пробирке) переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Это позволяет преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Цель генной инженерии — не воплощение в реальность мифов о кентаврах (человекоконях) и русалках (человеко-рыбах), а получение клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые «человеческие» белки. Так, с 1980 г. гормон роста человека — соматотропин получают из бактерии Е. coli (кишечной палочки). Соматотропин представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 191 аминокислоты. Он вырабатывается в гипофизе и контролирует рост человеческого тела; его недостаток приводит к карликовости. Соматотропин — единственное средство лечения детей, у которых гормон роста вырабатывается в недостаточном количестве. Соматотропин, синтезированный в клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений. В 1979 г. из 60 млн больных сахарным диабетом во всем мире лишь 4 млн получали препарат инсулина — гормона поджелудочной железы, регулирующего уровень сахара в крови и клетках. Инсулин выделяли из поджелудочных желез забиваемых коров и свиней, что сложно и дорого. С 1982 г. этот гормон получают в промышленных масштабах из бактерий Е. coli, содержащих ген человеческого инсулина. Плазмиды. Каким же образом гены человека были введены в бактериальные клетки? Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы, ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Каждая бактерия, помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-Ю6 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями. Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (удваивающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам. Большая часть таких препаратов, как антибиотики, используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. При действии определенного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они «входят и выходят» из бактерий, используются генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов. Мощным инструментом генной инженерии являются открытые в 1974г. ферменты — рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной, в первую очередь фаговой ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов (так называемые сайты — участки узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра сайта узнавания. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», называемые липкими концами (рис. 52). из разных видов бактерии выделено около 200 различных рестрик-таз, для которых описаны сайты рестрикции Рис. 52. Схема действия рестриктаз. Методы генной инженерии. Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помощью той же рестрикционной эндонуклеазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды. Ферментом лигазой «сшивают» оба куска ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию Е. coli (рис. 53). Все потомки этой бактерии, называемые клоном, содержат в плазмидах чужеродный ген и способны вырабатывать белок, кодируемый этим геном. Весь процесс получения таких бактерий, называемый планированием, состоит из последовательных стадий: 1. Рестрикция — разрезание ДНК человека рестрикционной эндонуклеазой (рестриктазой) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой. 2.Лигирование — включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря «сшиванию липких концов» ферментом лигазой. 3. Трансформация— введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом — так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет отделить их от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высевают на студнеобразную питательную среду, предварительно разведя их так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков — клон. 4. Скрининг — отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченным зондом. Зонд — это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке, образовавшихся из-за радиоактивной метки зонда, позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном (рис. 54). Рис. 53. Схема встраивания гена в плазмиду и введение рекомбинантной плазмиды в бактерию E.coli Рис. 54. Трансформация бактерий и скрининг клонов Рис. 55. Синтез двухцепочечной к-ДНК по матрице и-РНК обратной транскриптазой Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей, некоторые гены не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с вырезания из хромосом случайных фрагментов ДНК, ас целенаправленной получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся копией этого гена, и с помощью фермента — обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК. Затем РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой Н — специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой комплементарной второй цепи ДНК (рис. 55). Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека. С помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК человека или другого организма. Это позволяет изучить первичную структуру клонированного фрагмента, что приближает нас к пониманию организации структуры хромосомы. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то экспериментально можно изучить механизм, регулирующий транскрипцию этого гена, а также наработать нужный белок в том количестве, которое требуется для медицинских или исследовательских целей. Кроме того, клонированный фрагмент ДНК одного организма Можно ввести в клетки другого организма. Уже предпринимаются попытки вводить в те или иные культурные растения гены, обеспечивающие устойчивость к ряду болезней. Не за горами вмешательство в наследственную программу, полученную ребенком от родителя. Станет возможным введение в зародыш на ранних этапах его развития каких-либо недостающих генов и тем самым избавление людей от страданий, связанных с генетическими болезнями. Сегодня накапливаются клонированные фрагменты ДНК человека, ряда сельскохозяйственных животных и растений. Коллекцию разных клонов называют клонотекой, геномной библиотекой или банком генов. Для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс. разных клонов. Процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован. 1. Какие научные открытия используются в генной инженерии? 2. Назовите основные методы генной инженерии. Какие вы видите особенности этих методов и с чем они связаны? 3. Какую плазмиду можно назвать реком-бинантной? Дайте анализ последовательности стадий получения рекомбинантной плазмиды. 4.: Какие перспективы открываются перед генной инженерией?
