ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ
реклама
ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи Коляда Олег Николаевич УДК 616-001.26-022.6-092-08:612.017]-092.9 ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ ПРИ ИНФЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ НА ФОНЕ НИЗКОДОЗОВОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ специальность 14.03.04 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель докт. мед. наук., профессор Н. А. Клименко Харьков 2012 г. 1 СОДЕРЖАНИЕ Стр. 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 7 1. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКУЮ РАДИАЦИИ РЕАКТИВНОСТЬ НА (ОБЗОР 15 ЛИТЕРАТУРЫ) Раздел 1.1. Воспаление и иммунологическая реактивность 15 Раздел 1.2. Влияние радиации на иммунологическую реактивность и антиинфекционный иммунитет Раздел 1.3. Принципы коррекции нарушений иммунологической реактивности 24 45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 66 Раздел 3.1 Влияние фракционированного тотального низкодозового рентгеновского облучения на показатели иммунологической 66 реактивности. Подраздел 3.1.1. Содержание цитокинов, отвечающих за поляризацию Th1/Th2-специфического иммунного ответа, в сыворотке крови. Подраздел нейтрофилов. 3.1.2. Фагоцитарная активность макрофагов и 66 68 2 70 Подраздел 3.1.3. Активность комплемента и уровень ЦИК в сыворотке крови. Раздел 3.2. Нарушения иммунологической реактивности под влиянием предварительного фракционированного тотального низкодозового рентгеновского облучения при остром экспериментальном 72 генерализованном кандидозе. Подраздел 3.2.1. Содержание цитокинов, отвечающих за поляризацию Th1/Th2-специфического иммунного ответа, в сыворотке крови. Подраздел 3.2.2. Фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов. 72 75 Подраздел 3.2.3. Активность комплемента, уровень ЦИК, титр специфических иммуноглобулинов к C.albicans в сыворотке крови и 77 степень контаминации внутренних органов. Раздел 3.3 Корригирующая эффективность метилглюкамина акридонацетата и дипептида глутамил-триптофана в отношении иммунологической реактивности облученных крыс с острым 81 экспериментальным диссеминированным кандидозом. Подраздел 3.3.1. Влияние метилглюкамина акридонацетата и глутамил-триптофана на концентрацию сывороточных цитокинов. Подраздел 3.3.2. Влияние метилглюкамина глутамил-триптофана на активность фагоцитов. акридонацетата и 82 85 3 Подраздел 3.3.3. Влияние метилглюкамина акридонацетата и глутамил-триптофана на комплементарную активность, содержание ЦИК, титр специфических иммуноглобулинов к C.albicans в 88 сыворотке крови и степень контаминации внутренних органов. ГЛАВА 4. АНАЛИЗ И ОБОБЩЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………………………………….. 94 ВЫВОДЫ………………………………………………………………….. 132 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ… 134 4 АЭС СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Атомная электростанция FDA Food and Drug Administration ЦИК Циркулирующие иммунные комплексы TGF-β Фактор роста опухоли – β IL-10 Интерлейкин – 10 IFN-γ Интерферон – γ IL-4 Интерлейкин – 4 IL-12 Интерлейкин – 12 IL-6 Интерлейкин – 6 IL-27 Интерлейкин – 27 TNF Фактор некроза опухоли IL-1 Интерлейкин – 1 GM-CSF Фактор стимулирующий колонии макрофагов Th17 Т – лимфоциты – хелперы 17 Th1 Т – лимфоциты – хелперы 1 порядка Th2 Т – лимфоциты – хелперы 2 порядка Treg Регуляторные Т – лимфоциты CD Кластер дифференцировки IgA Иммуноглобулин А IgМ Иммуноглобулин М IgG Иммуноглобулин G IgЕ Иммуноглобулин Е CARS Синдром компенсаторного противовоспалительного ответа NK Натуральные киллеры Зв Зиверт 5 РНК Рибонуклеиновая кислота ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота Gy Грей TCR Рецептор Т – клеток ЛПС Липополисахарид ДК Дендритные клетки TLR Toll – подобные рецепторы NOS Синтаза оксида азота CR Рецептор комплемента 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Ряд аварий на АЭС, таких как Чернобыльская, АЭС на Трехмильном Острове в Пенсильвании и недавняя катастрофа на Фукусиме, а также постоянная угроза подрыва «грязных» бомб террористическими организациями привели к тому, что уровень тревожности в обществе в связи с риском радиационного заражения резко повысился. В настоящее время общественность обеспокоена развитием ядерной энергетики в мирной и военной крупномасштабным отрасли, что послужило исследованиям предпосылкой генетических к последствий радиационного облучения. Большая часть исследований, выполненных в США, Великобритании и Германии, были направлены на изучение последствий воздействия низкодозового радиационного облучения инбредных линий мышей для оценки генетического риска. Несмотря на то, что эти исследования не увенчались полным успехом, они стали основой для дальнейших исследований в области генетики, трансплантологии и т.д. [1-5]. После принятия проекта закона о биологической защите с 2004 года в США было запущено ряд программ под руководством Национального Института Аллергии и Инфекционных болезней (NIAID) и Национального Онкологического института (NCI), направленных на разработку средств для профилактики и снижения тяжести последствий лучевого поражения, которые проводятся на моделях животных [4]. С самого начала проведения подобных исследований стала очевидна необходимость создания стандартизованных экспериментальных моделей на животных для сравнения эффективности препаратов, разрабатываемых для профилактики и лечения радиационных поражений, согласно требованиям FDA. В инструкции FDA подробно описываются показатели, которые 7 указывают на эффективность новых препаратов в тех ситуациях, когда исследования на людях не являются возможными [5]. Кроме того, следует помнить, что воздействие радиации в дозах, превышающих всемирно признанные стандарты допустимого, возможно и при определенных формах занятости. К таковым, например, относятся участие в космических полетах, производство самолетов, работа на АЭС, а также в медицинских учреждениях, где используются источники облучения [2,3]. Расширение области использования современного медицинского оборудования, в котором используется ионизирующее излучение, ведет к увеличению риска радиационных поражений, составляющих патогенетическую основу развития аутоиммунных, онко- и инфекционных процессов [6-9]. Индукция достаточно иммунологического баланса выраженного и в ограничения сторону длительного сдвига активности специфического ответа может приводить к повышению чувствительности к инфекции [10-12]. Так, многочисленные исследования указывают на то, что воздействие ионизирующего излучения является мощнейшим неблагоприятным фактором, который влияет на быстро пролиферирующие клетки организма, в первую очередь иммунной и кроветворной систем [13, 14]. На сегодняшний день влияние ионизирующего излучения также можно рассматривать как воздействие, приводящее к активации клеток, что может запускать апоптоз, дифференцировку или активировать в клетках экспрессию генов, в том числе обладающих радиопротективными свойствами, направленными на ослабление повреждающих эффектов [15-17]. В зависимости от дозы и типа ионизирующего излучения эффекты на функциональную активность клеток могут быть различны. Это позволяет по8 новому взглянуть на влияние радиации на клетки и организм в целом. Влияние радиации на клетки может быть связано либо с прямым взаимодействием радиации с молекулами-мишенями, либо с опосредованным воздействием за счет образования свободных радикалов окисления, а также других изменений биохимических процессов, и распространяться за счет биологических медиаторов, в том числе цитокинов. Повышение уровней этих цитокинов, в конечном итоге, и приводит к изменению баланса цитокинов T-хелперов 1-го и 2-го типов, Тreg, что обусловливает особенности иммунопатогенеза радиационного поражения [11, 13, 18-20]. По современным представлениям, индукция цитокинов в качестве защитного или патологического механизма является прямым ответом на присутствие микроорганизмов [13, 19, 21-25]. С другой стороны, бактерии содержат и образуют большое количество разнообразных молекул, которые могут селективно индуцировать синтез как провоспалительных, так и иммуномодулирующих/ противовоспалительных цитокинов. Кроме того, они способны изменять уже существующую продукцию за счет стимуляции высвобождения различных цитокинов клетками организма [22-25]. Исследование патогенеза микробных инфекций, в особенности сепсиса, требует знания тонких физиологических взаимодействий между клетками, тканями и органами. Резистентность к инфекции зависит от сложной сети взаимодействующих сигнальных систем, которые включают в себя врожденный и адаптивный иммунные ответы. Патофизиологические механизмы этих взаимодействующих систем изменяются радиацией. Такие исследования могут привести к улучшению оценки состояния организма в ходе инфекционного процесса и эффективности терапевтического вмешательства, поэтому возникла потребность в оценке иммунотропных эффектов на течение и прогноз инфекционного процесса [26-31]. 9 Определенным образом изменяя состояние иммунитета, можно достичь выраженного ослабления воздействия ионизирующей радиации. В настоящее время в арсенале иммунологов имеются достаточно перспективные способы для снижения неблагоприятного воздействия лучевых поражений. Достаточно выраженным радиопротективным действием обладают некоторые препараты, получаемые из центрального органа иммунитета – тимуса, тимические гормоны, а также некоторые другие иммуноактивные средства [27, 28, 32-34]. Таким образом, возникает необходимость в проведении исследований комбинированного влияния небольших доз радиации и инфекции на организм. Определение оптимальных уровней продукции цитокинов для сопротивления бактериальной инфекции поможет в разработке потенциальных терапевтических стратегий для лечения инфекционных заболеваний на фоне радиационного повреждения. Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационное исследование выполнено согласно комплексному плану научных исследований ХНМУ МЗ Украины и является самостоятельным фрагментом в рамках научных направлений университета «Изучение общих закономерностей патологических процессов и разработка способов их коррекции» и кафедры патологической физиологии – общая патология воспаления. Комплексная тема кафедры: «Межклеточные взаимодействия в патогенезе воспаления» (номер государственной регистрации 0109U001742, 2009-2011 гг.). Автор является исполнителем исследований, которые относятся к теме диссертации. Цель исследования: выявить механизмы формирования радиационно-индуцированных изменений иммунологической реактивности при инфекционном процессе и патогенетически обосновать принципы их коррекции. 10 Для достижения цели поставлены следующие задачи: 1. Исследовать воздействие тотального низкодозового фракционированного рентгеновского облучения на динамику показателей цитокинового профиля, которые характеризуют состояние поляризации иммунного ответа (Th1/Th2), и других параметров иммунологической реактивности (фагоцитоз, активность комплемента, уровень ЦИК). 2. Изучить динамику параметров иммунологической реактивности на модели острого генерализованного кандидозного сепсиса. 3. Выяснить характер патогенетического влияния радиационно- индуцированных изменений иммунологической реактивности на течение инфекционного процесса на модели острого генерализованного кандидозного сепсиса. 4. дипептида Исследовать влияние метилглюкамина акридонацетата глутамил-триптофана на иммунологическую и реактивность облученных крыс на модели острого генерализованного кандидозного сепсиса. 5. Дать сравнительную характеристику эффективности иммунотропных препаратов для коррекции радиационно-индуцированных нарушений антиинфекционной резистентности. Объект исследования – патогенез и коррекция радиационноиндуцированных изменений иммунологической реактивности. Предмет исследования – механизмы иммунологической реактивности при инфекционном процессе в облученном организме: продукция цитокинов TGF-β, IL-10, IFN-γ и IL-4, фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов, активность системы комплемента, образование ЦИК и коррекция нарушений. 11 Методы исследования – патофизиологические, иммунологические, иммуноферментные, микробиологические, фармакологические, статистические. Научная новизна полученных результатов. Впервые показано, что фракционированное тотальное облучение приводит к системному росту уровней TGF-β и IL-10, что создает условия для угнетения эффекторных механизмов иммунологической реактивности, проявляющегося снижением уровней сывороточных цитокинов IFN-γ, IL-4, угнетением поглотительной активности фагоцитов, повышением уровня ЦИК и снижением комплементарной активности сыворотки крови. На модели кандидозного сепсиса в облученном организме получены новые данные, свидетельствующие о депрессивном воздействии выбранного режима облучения на противоинфекционную защиту, так как гораздо более высокие уровни ЦИК по сравнению с необлученными животными связаны с нарушением функции элиминации со стороны фагоцитарных клеток и системы комплемента. Впервые показано, что углубление дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов в условиях острого диссеминированного кандидоза может быть одним из ключевых показателей дестабилизации деятельности иммунной системы. Получены данные о новых механизмах положительного влияния дипептида глутамил-триптофана на течение инфекционного процесса, связанных со стимуляцией моноцитарно-макрофагального звена иммунитета и противовоспалительным действием препарата, которое обеспечивало восстановление способствовал баланса IFN-γ/IL-10. формированию более Дипептид глутамил-триптофан эффективного специфического гуморального ответа на антигены Candida albicans. У крыс, которым вводили дипептид глутамил-триптофан, снижалась степень обсемененности внутренних органов и процент животных с генерализованной формой 12 инфекционного процесса. О положительном влиянии иммуностимулятора на течение инфекционного процесса свидетельствует отсутствие летальности у облученных животных. Практическое значение полученных результатов. Диссертационная работа относится к фундаментальным исследованиям. Полученные данные о радиационно-индуцированных изменениях иммунологической реактивности на модели острого генерализованного кандидоза расширяют и углубляют существующие представления о механизмах данного процесса, что будет способствовать совершенствованию патогенетической терапии. Показано, что одним из патогенетических принципов коррекции нарушений иммунологической реактивности при инфекционном процессе на фоне облучения может быть использование иммуномодуляторов, нормализующих цитокиновый баланс. Продемонстрирована возможность и целесообразность использования иммуностимулятора дипептида глутамил-триптофана для коррекции нарушений иммунологической реактивности при инфекционном процессе на фоне низкодозового рентгеновского облучения. Получен патент Украины на полезную модель «Способ получения модели генерализованного кандидоза». Результаты работы внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс на кафедрах патологической физиологии Харьковского национального медицинского университета, Крымского государственного медицинского университета им. С. И. Георгиевского, Луганского государственного медицинского университета МЗ Украины и Сумского государственного университета МОНМС Украины. Личный вклад диссертанта. Автором самостоятельно разработаны план работы и методология проведения исследований, проведен патентноинформационный поиск по теме, выполнены эксперименты, обработка и 13 изучение полученных в ходе эксперимента данных с использованием иммунологических, иммуноферментных, микробиологических методов исследования, проведена статистическая обработка, анализ и обобщение полученных результатов, сформулированы основные положения и выводы, написаны все разделы диссертации. Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на научно-практической конференции «Щорічні терапевтичні читання: роль медичної науки в рішенні проблем внутрішніх хвороб» (Харьков, 2007), IX украинской научно-практической конференции «Актуальні питання клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації» (Киев, 2007), V пленуме научного общества патофизиологов Украины, посвященном 110-летию со дня рождения Н.Н. Горева (Луганск, 2010), Всеукраинской научно-практической конференции «Медична наука – 2011» (Полтава, 2011), XV съезде украинского научномедицинского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов им. Д.К. Заболотного «Проблеми та еволюція епідемічного процесу і паразитарних систем провідних інфекцій сучасності» (Харьков, 2011), межвузовской конференции молодых учених и студентов «Медицина третього тисячоліття» (Харьков, 2011), 6-м Конгрессе патофизиологов Украины «Від експериментальних досліджень до клінічної патофізіології» (Ялта, 2012). Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 – статьи в специализированных журналах, входящих в перечень, утвержденный ВАК Украины, 2 патента на корисну модель, 7 – тезисы докладов. 14 ГЛАВА 1. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИИ НА ИММУНОЛОГИЧЕСКУЮ РЕАКТИВНОСТЬ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) Раздел 1.1. Воспаление и иммунологическая реактивность Воспаление представляет собой эволюционно установившийся комплекс реакций организма в ответ на повреждение тканей, во многом совпадающий с иммунологическими функциями. Общепринятое понятие иммунитета – это способ защиты от генетически чужеродной информации, как экзо-, так и эндогенного природы. С одной стороны, иммунная система – эффекторная система, выполняющая свои гомеостатические функции, направленные на поддержание антигенного гомеостаза через элиминацию макромолекул, несущих отпечаток генетически чужеродной информации. С другой стороны, это регуляторная система надзора за морфогенезом, физиологическими и биохимическими процессами организма тесно связанная с нервной и эндокринной системами, что обуславливает ее повсеместное «участие» в патогенезе основных заболеваний [37 – 44]. В настоящее время наиболее перспективными направлениями патофизиологии воспаления и иммунологии являются выяснение механизмов межклеточных взаимодействий, исследование медиаторных систем, участвующих в патогенезе воспалительного процесса и иммунном ответе, взаимосвязей между воспалением и механизмами иммунологической защиты, а также интегративное участие в них отдельных гомеостатических систем организма [45-48]. Многочисленные исследования свидетельствуют, что при всем многообразии характеристик воспалительного процесса, продолжительность последнего, его интенсивность и. т. д. следует связывать с соотношением между собой продукции про- и антивоспалительных 15 цитокинов, с экспрессией мембранных форм цитокиновых рецепторов и уровнем растворимых форм последних в крови и тканевой жидкости, играющих существенную роль в механизмах реализации биологических эффектов цитокинов [49-52]. Цитокины – большая группа регуляторных белков, осуществляющих передачу сигналов через контакт со специфическими рецепторами на поверхностях клеток и обладающих плейотропизмом, взаимозаменяемостью, отсутствием антигенной специфичности; участвующих в развитии местных защитных реакций с привлечением различных типов клеток; осуществляющих взаимосвязь между специфическими и неспецифическими факторами защиты организма и обеспечивающих взаимодействие систем организма – иммунной, кроветворной, эндокринной, нервной [50-52]. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом, действуя в обоих направлениях. Типичным примером являются макрофаги, активированные IFN-γ. Они выполняют функции эффекторной клетки в защитных и повреждающих реакциях клеточного иммунитета. В то же время макрофаги синтезируют и секретируют широкий спектр цитокинов, обладающих эффекторной и регуляторной активностью, разрушительных ферментов и супероксидных радикалов. Показано, что при отсутствии должного контроля синтез провоспалительных цитокинов, основными из которых являются IL-12 и IFN-γ, ведет к гиперактивации иммунной системы с иммунопатологическими последствиями. Синтез IL-12 и IFN-γ, в свою очередь, контролируется клетками, продуцирующими IL-10 и трансформирующий фактор роста - β (TGF-β) [53-55]. Основным из противовоспалительных цитокинов является IL-10, синтез которого чаще всего связывается с макрофагами, однако, его синтезируют и многие другие клетки, в том числе дендритные клетки (ДК), 16 T-клетки, В-клетки, нейтрофилы, эозинофилы и тучные клетки [56]. Синтез IL-10 регулируется рядом цитокинов, включая IL-12 [57], IL-6 [58], TGF-β [59] и IL-27 [60, 61]. Влияние IL-10 на клетки-мишени хорошо изучено и осуществляется через рецептор IL-10 (IL-10R), димер, состоящий из α и β субъединиц. Большинство этих контрольных механизмов индуцируется самим IL-10 за счет петли отрицательной обратной связи [62]. Тонкий баланс про- и противовоспалительных сигналов определяется интенсивностью экспрессии IL-10 и его синтезом. Действие IL-10 приводит к угнетению синтеза провоспалительных цитокинов, включая IFN-γ, TNF, IL-1, IL-2 и GM-CSF, а также ряд хемокинов [63]. Поэтому, после генерации провоспалительного иммунного ответа, IL-10 служит для подавления воспаления, деструктивного для хозяина, тем самым ограничивая повреждение тканей. Однако иммуносупрессивные свойства IL10 могут использоваться патогенами, что приводит к снижению воспалительных и антигенспецифичных реакций, которые, как правило, необходимы для контроля или элиминации инфекции [55, 63]. Наряду с IL-10 регуляторным цитокином, ингибирующим воспаление, является TGF-β, продуцирующийся всеми типами лейкоцитов и влияющий на все типы клеток [64-68]. При отключении гена этого цитокина у мышей наблюдается гиперлимфопролиферация и развитие чувствительности к полиорганным аутоиммунным расстройствам [69]. Нарушение синтеза TGF-β или передачи дифференцировке сигналов Th1, этого Th2, цитокина Th17 [70]. приводит Сходным к спонтанной образом мыши, экспрессирующие доминантный отрицательный рецептор TGF-β (TGFβRIIDN), способны к спонтанной дифференцировке Th - клеток и у них развивается аутоиммунное воспаление, к примеру – воспалительное заболевание кишечника [70, 71]. 17 В последние годы открыт новый подтип клеток – Th17, которые играют негативную роль в развитии аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Эти клетки отличаются от Th1 и Th2 по продуцируемому ими цитокиновому профилю, функциями и особенностям дифференцировки [72]. Известно, что для дифференцировки Th1 и Th2 требуется присутствие таких цитокинов, как IFN-γ, IL-12 и IL-4. При этом оптимальная дифференцировка данных подклассов клеток требует отсутствия ингибирующих факторов, таких как факторы, нейтрализующие антитела к конкретным антигенам (к IL4 – при дифференцировке Th1 и к IL-12 – при дифференцировке Th2), что было доказано в эксперименте [70-72]. Влияния цитокинов IL-6 и TGF-β на физиологические процессы организма противоположны, и, что примечательно, TGF-β способен ингибировать многие иммунологические функции, включая синтез и нормальное функционирование IL-6. Исследования показали, что in vitro IL-6 отвечает за дифференцировку Th17 только в том случае, когда механизмы дифференцировки Th1 и Th2 не активны, в частности, в присутствии TGF-β [73]. Кроме того, подобные результаты были получены при блокировке данных механизмов на генетическом уровне путем удаления ключевых транскрипционных факторов. Данный вывод подкрепляется и полученными результатами, согласно которым у мышей с нарушениями дифференцировки Th1 и Th2 нарушение передачи сигналов с рецептора TGF-β не повлияло на дифференцировку Th17. Таким образом, дифференцировка Th17 может быть достигнута в условиях отсутствия TGF-β, при том, что также будут отсутствовать цитокины, продуцируемые Th1 и Th2 [72, 73]. Развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита зависит от Th17 [73, 74]. Данные исследования показывают, что условием, предрасполагающим к блокировке дифференцировки Th17, является 18 активность Th1 или Th2 клеток, а блокировка Th17, в свою очередь, влияет на резистентность мышей линии BALB/c к ЭАЭ [ 74]. IL-6 также плейотропностью и представляет собой участвующий во цитокин, многих обладающий аутоиммунных и воспалительных реакциях [75]. Кроме того, IL-6 ограничивает супрессорные функции клеток Treg, что в свою очередь может стимулировать генерацию адаптивного иммунного ответа [ 76]. Животные с нарушением работы IL-6 неспособны развивать эффективный адаптивный иммунный ответ и резистентны к ряду аутоиммунных заболеваний [77]. Нейтрализация IL-6 или блокада его рецепторов путем введения антител снижает интенсивность воспаления при ряде аутоиммунных синдромов. Стратегии лечения, основанные на управлении синтезом IL-6, в настоящее время находятся на второй стадии клинических испытаний [78]. В заключение можно отметить, что полученные данные указывают на участие TGF-β в дифференцировке Th17, однако влияние данного цитокина на этот процесс косвенное – за счет блокировки Th1 и Th2 [67]. С другой стороны, некоторыми исследователями было обнаружено, что TGF-β играет ключевую роль в дифференцировке Th17 человека в популяциях наивных CD4+ T клеток [79]. Тем не менее, точная роль TGF-β в молекулярном управлении дифференцировкой Th17 установлена не была. Исследования показали, что Th-клетки мышей, у которых отсутствуют дифференцировочные механизмы как для Th1, так и для Th2 (мыши генотипа Stat-6-/-T-bet-/-), не нуждаются в присутствии TGF-β для нормальной дифференцировки Th17. Действительно, отсутствие Th1 и Th2 у мышей линии BALB/c приводило к формированию энцефалогенных Th17. TGF-β не являлся обязательным элементом при дифференцировке Th17 в отсутствие Th1 - и Th2 - клеточных реакций, при том, что присутствие IL-6 было необходимо. Таким образом, ингибирование IL-6 или блокада передачи соответствующих 19 сигналов нарушает процесс дифференцировки патогенных Th17 - клеток, что потенциально может находить применение в клинике для лечения аутоиммунных заболеваний. Схемы лечения, основанные на управлении синтезом IL-6, уже проходят клинические испытания у пациентов с рядом тяжелых аутоиммунных воспалительных синдромов [78, 79]. Одним из цитокинов профиля Th2 является IL-4. Продукция IL-4 Th2 клетками на местном уровне ведет к сильной клональной пролиферации и экспансии активированных В - клеток. IgM-синтезирующие клетки созревают в присутствии IL-4 и IL-5, а продуценты IgG созревают в результате воздействия IL-4, IL-5, IL-6 и IFN-γ. В присутствии TGF-β происходит переключение на синтез IgA при участии IL-5. Под влиянием IL4 образовавшийся клон может дифференцироваться и созревать в IgEсинтезирующие клетки [80]. Даже в ответе на присутствие тимуснезависимых антигенов, которые непосредственно активируют Влимфоциты, эти клетки нуждаются в цитокинах для эффективной пролиферации и продукции иммуноглобулинов. IL-4 в большинстве случаев выступает в качестве антагониста IFN-γ при воздействии на макрофаги, Тхелперы, В-лимфоциты. Прежде всего, IL-4 ингибирует выработку макрофагами провоспалительных цитокинов – TNF-α, IL-1 и IL-12, синтез которых индуцируется и стимулируется IFN-γ [81]. Параллельно IL-4 ингибирует продукцию супероксидных радикалов и нарушает ответ макрофагов на действие отдельных подклассов иммуноглобулинов, изменяя экспрессию соответствующих рецепторов. Синергистами IL-4 в подавлении IFN-γ–индуцибельных свойств макрофагов являются другие противовоспалительные цитокины – IL-10 и IL-13, TGF-β. Кроме того, описан ряд позитивных эффектов IL-4, в частности, повышение экспрессии на макрофагах адгезивных молекул HLA II [49- 51, 81-83]. 20 Keijzer et al. изучили ряд аспектов влияния IL-4 на процесс фагоцитоза, которые могут частично объяснить снижение киллинговой активности фагоцитарных клеток при переключении профилей Т-хелперов под воздействием патогенов, способных избегать защитных действий иммунной системы [80]. IL-4 способен индуцировать альтернативную активацию макрофагов, запуская формирование их фенотипа, существенно отличающегося от классической активации за счет IFN-γ. В частности, для макрофагов, активированных IL-4, характерен усиленный синтез цитокинов и хемокинов под воздействием липополисахаридов, а также повышенный уровень эндоцитоза [82]. Напротив, влияние IL-4 на процесс фагоцитоза противоречиво, так как со стороны макрофагов под влиянием IL-4 наблюдается как усиленная, так и сниженная фагоцитарная активность [83, 84]. Это противоречие может объясняться наличием множества форм фагоцитоза, для которых характерна активация определенных рецепторов, что приводит к разнообразным межмолекулярным взаимодействиям [84]. Регуляция цитокинами процессов воспаления и иммунного ответа является необходимой для развития адекватных защитных реакций организма на внедрение патогена, при этом нарушение регуляции может быть условием развития заболеваний. Недостаточная или чрезмерная продукция цитокинов ведет к развитию достаточно тяжелых патологических явлений в организме [85 - 87]. Эффективная регуляция про- и противовоспалительных воздействий, как компонентов единой защитной системы организма, определяет исход острого воспаления. Происходит либо разрешение воспаления и выздоровление организма, либо развивается недостаточность защитных систем и хронизация воспаления [88]. 21 Все указанные эффекторные функции осуществляются до тех пор, пока стимулирующая патогенная структура не подвергается разрушению и элиминации, после чего противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 и TGF-β, индуцируют прекращение неспецифического иммунного ответа и активацию репарации тканей. В тех случаях, когда названные иммунные эффекторные функции оказываются недостаточными или несостоятельными, наблюдается продолжение воспалительной реакции. Однако продукция цитокинов не может продолжаться бесконтрольно, поскольку гиперпродукция цитокинов служит причиной развития ряда осложнений воспаления, в частности, септического шока [89]. В целом, цитокины в низких концентрациях необходимы для правильного формирования очага воспаления; более высокие дозы вызывают развитие системных проявлений воспалительной реакции; патологически высокие концентрации приводят к развитию септического шока и гибели организма [89]. Bone в 1996 г. предложил использовать термин CARS (синдром компенсаторного противовоспалительного ответа – compensatory antiinflammatory response syndrome). В систему CARS входит группа противоспалительных медиаторов (IL-10, IL-4, TGF-β) и растворимых ингибиторов (TNF, IL-1, IL-IRA). При адекватном ответе CARS противодействуют SIRS и приводит к восстановлению гомеостаза. В то же время, при чрезмерно выраженном и/или пролонгированном CARS происходит развитие иммунодепрессии, что проявляется хронизацией или диссеминацией инфекции, присоединением нозокомиальной микрофлоры, нарушением процесса репарации, утяжелением эндотоксикоза и формированием поздней полиорганной недостаточности [90]. Накоплены убедительные доказательства того, что наиболее чувствительным индикатором внешнего, в том числе экологического, 22 влияния на организм человека является состояние иммунной системы, которая поддерживает как антигенный гомеостаз в организме, так и обеспечивает регуляцию процессов пролиферации и дифференцировки клеточных элементов в гемо- и иммунопоэзе. Эта система является важной в формировании реакции организма на внешнее воздействие. Например, такие воздействия, как химическое, физическое, в том числе и радиационное, вызывают повреждение клеток разных тканей организма [3, 40]. Регуляция этих процессов обеспечивается через продукцию иммунокомпетентными клетками регуляторных молекул – цитокинов, которые образуют иммунологических цитокиновую реакций, так сеть, и регулирующую процессы развитие пролиферации как и дифференцировки клеток. Изменения в экспрессии и продукции цитокинов часто являются маркером воздействия неблагоприятных факторов на иммунную систему, посредством которых иммунная система реализует свою реакцию на воздействие внешних факторов [91, 92]. При реализации ответа на некий чужеродный антиген процесс воспаления проходит две стадии своего развития в виде локального и системного острофазовых ответов, при том, что между ними имеются элементы взаимозависимости и взаиморегулируемости. При этом остроту процесса определяет, скорее всего, формирование системного ответа, когда реализуется функциональная активность иммунной системы. По всей вероятности, динамику любого заболевания следует рассматривать с точки зрения динамического взаимодействия эффекторных звеньев иммунной системы, участие которых в патологических процессах обусловлено наличием антигенного раздражителя и индуцированной им выработкой каскада различных цитокинов. К сожалению, в настоящее время методологически функциональную достаточно активность сложно в полной иммунокомпетентных мере оценить клеток-эффекторов. 23 Прежде всего, это касается клеток-эффекторов реакций гиперчувствительности замедленного типа, специфических Т-киллеров, и, во многих случаях, антителообразующих клеток, секретирующих специфические антитела. В то же время, на сегодняшний день, мы имеем возможность оценивать экспрессию генов, кодирующих продукцию интерлейкинов, которые, с одной стороны, продуцируются разными субпопуляциями Т-хелперов (Th1 и Th2), а с другой – осуществляют регуляцию различных эффекторных популяций иммунокомпетентных клеток: Th1 – эффекторов гиперчувствительности замедленного типа, Th2 – антителопродуцентов. Накопилось достаточно много литературных данных, указывающих на то, что динамика заболевания с иммунопатогенетической основой, его хронизация, благополучный или летальный исход во многом связаны с функциональной активностью клеток-эффекторов, находящихся под управлением Т-хелперов. При этом, с одной стороны, проясняется иммунопатогенетическая основа динамики заболевания, а с другой стороны – намечаются пути целенаправленной иммунопатогенетической терапии таких заболеваний [85, 91- 93]. Раздел 1.2. Влияние радиации на иммунологическую реактивность Проблему воздействия радиации на иммунологическую реактивность, также как и на весь организм, следует рассматривать в нескольких аспектах. С одной стороны, радиация как физический фактор оказывает влияние на гомеостатические системы дозозависимым образом: от стимулирующего влияния при малых дозах до практически полного подавления функциональной активности данной системы при больших дозах [18, 93-96]. Такое четкое разделение эффектов, прежде всего, касается ионизирующего 24 излучения, действие которого было однократным или реализовывалось в течение определенного короткого периода времени, когда доза облучения может быть подсчитана достаточно точно. Естественно, здесь имеются различные факторы, которые могут оказывать влияние на выраженность эффекта радиации на иммунную систему: 1. Время действия излучения относительно фаз иммунного ответа, где индуктивная фаза иммунного ответа более чувствительна к действию радиации, чем продуктивная, когда эффект от воздействия гораздо сильнее при его осуществлении до иммунизации, чем после; 2. Возраст организма с большей чувствительностью на ранних стадиях онтогенеза; 3. Потенцирующий эффект действия облучения на иммунную систему таких факторов, как стресс, инфекция [1, 95-97]. Другой подход к решению проблемы должен быть в случае длительного действия на организм, когда происходит воздействие на его иммунную систему малых доз ионизирующего излучения и затруднительно точно определить суммарную дозу облучения [2, 3, 98]. В целом, последствия воздействия на организм ионизирующего излучения в клиническом плане следует рассматривать с двух сторон. С одной стороны – это классическая лучевая болезнь с характерными для нее симптомами и формами: острой и хронической. С другой стороны – все те клинические синдромы, те заболевания, которые, так или иначе, трактуются как результат действия на организм радиации. Ведущее место здесь занимают онкологические заболевания, где первое место, по-видимому, принадлежит раку щитовидной железы и гемобластозам. Однако имеющиеся данные свидетельствуют также и о росте злокачественных новообразований различной локализации в районах, неблагоприятных по радиационной обстановке. Также отмечается увеличение числа хронических 25 воспалительных и аллергических заболеваний различной органной локализации [2, 3, 98-100]. Вопрос о специфической роли облучения как индуцирующего начала развития данных патологических состояний имеет социальную, фундаментальную и прикладную значимость. В этой же связи изменение любого показателя функции, например, иммунологической реактивности, следует рассматривать с двух сторон: является ли данное изменение специфическим для действия радиации и каков механизм действия излучения на данный показатель иммунной системы, которая является одной из главных мишеней негативного влияния ионизирующего излучения на организм [2,3, 98-100]. Отсутствие четких данных не позволяет определить преимущество того или иного механизма в процессе формирования недостаточности клеточного звена иммунной системы в отдаленные сроки после длительного воздействия ионизирующего излучения. Скорее всего, каждый из них имеет право на существование. Что касается снижения функциональной активности Th1-клеток, то несомненно одно: повышение частоты опухолевых и вирусных заболеваний, увеличение склонности к проявлению аллергических процессов свидетельствуют о выраженной чувствительности Th1 к негативному влиянию на них всего комплекса факторов, возникающих в организме в результате воздействия ионизирующего излучения. Отсюда тактика иммуномодулирующей терапии, которая должна быть направлена на коррекцию, очевидно, именно этой субпопуляции регуляторных клеток [95]. Не следует также забывать, что в ходе лечения онкологических заболеваний используется радиотерапия с возможным повреждающим эффектом радиации в отношении нормальных клеток организма. Известно, что при воздействии ионизирующего излучения нарушения организма касаются, прежде всего, критических органов и систем, в первую 26 очередь, иммунной системы (клеточного и гуморального иммунитета), а также иммунитета слизистых оболочек. Поэтому исследование воздействия ионизирующего облучения на состояние иммунной системы представляет особую важность [93]. В последние годы в исследованиях отечественных и зарубежных ученых в этой области можно выделить два основных направления. Первое направление – изучение отдаленных последствий аварий на АЭС. Другим направлением исследований является изучение закономерностей воздействия ионизирующего излучения на иммунологичекую реактивность экспериментальных животных. Медико-социальные последствия аварии на ЧАЭС отражены в монографии Н.В. Васильева и соавторов [2 ]. При обследовании людей, подвергшихся лучевому воздействию вследствие аварии на ЧАЭС, были обнаружены следующие иммунологические и биохимические изменения в крови: снижение содержания концентрации антиоксидантов в крови и повышение свободных радикалов; увеличение числа хромосомных аберраций в лимфоцитах; повышение уровня IgE в крови; увеличение активности NK-клеток и нейтрофилов. У лиц, подвергшихся радиационному воздействию, достоверно снижено содержание CD5+ и CD8+ даже через полгода, но с течением времени содержание этих типов клеток восстанавливается [2]. Были изучены параметры иммунной системы детей в возрасте 16-18 лет, рожденных от отцов – ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в 1986-1987 гг. Отмечено снижение количества CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов, фагоцитарного числа, увеличение показателей спонтанного и индуцированного НСТ-теста [99]. На основании мультивариантного анализа РНК (метод микрочипов), полученной из мононуклеарных клеток внешне здоровых лиц, подвергшихся 27 воздействию ионизирующего облучения в диапазоне доз от 0,18 до 49 мЗв, установлено, что в клетках облученных лиц наблюдался четкий паттерн экспрессии генов таких цитокинов, как рецептора протеинкиназы серина/треонина, рецептора TGF, а также лиганда CD40, в особенности при воздействии доз в диапазоне ≥ 10 мЗв [9]. Cao et al. [93] было исследовано влияние радиации на другой подтип Т клеток – CD4+CD25+, выполняющих регуляторные функции. В ходе эксперимента CD4+CD25+клетки, полученные из мононуклеаров периферической крови здоровых доноров, облучались в дозах 0, 1, 3, 75, 7,5, 15 и 30 Gy. Облучение в низких дозах изменяло экспрессию ряда генов, связанных с функциональной активностью этих клеток. Так, экспрессия генов молекул клеточной адгезии, таких как CD62L, CD45RO и CD152, а также фактора FOXP3, обспечивающего их супрессивные свойства, снижалась уже при облучении в низких дозах. При этом воздействие высоких доз радиации радикально нарушало способность Тreg подавлять пролиферацию аутологичных наивных Т-клеток и подавляло экспрессию TGF-β. Потеря супрессивных свойств регуляторными Т-клетками в результате облучения может быть одни из механизмов, приводящих к развитию онкологических заболеваний, являющихся классическим последствием воздействия радиации [93, 94]. В ранний период после острого облучения организма возникает радиационная гибель лимфоцитов, опустошение лимфоидных органов, развитие лимфопении вплоть до полного исчезновения лимфоцитов из кровотока. Повышение радиочувствительности к интерфазной гибели может возникать при стимуляции Т- и В-клеток антигенами и митогенами. Степень радиочувствительности В-лимфоцитов составляет 1,2 – 1,8 Gy, для лимфоцитов D0 – 2 – 2,5 Gy; для других, медуллярных, тимоцитов устойчивость к облучению составляет 6 Gy и выше [100]. Облучение 28 подавляет вторичную миграцию лимфоцитов в лимфатические узлы, что носит устойчивый характер и сохраняется в течение 3-х месяцев при облучении в дозе 4 Gy. Последствия радиационного повреждения тимуса исчезают к концу месяца после радиактивного воздействия [9, 101]. При облучении в дозах 0,1 – 0,5 Gy наблюдается повышение количества лимфоидных клеток, а также усиление иммунного ответа на тимусзависимые антигены, в более поздние сроки – снижение функций Т- и NK-клеток, гормонов тимуса, повышение титра антител, а иногда и повышение соотношения фракционированное CD4+/CD8+ облучение [89, приводит к 101]. Однократное снижению и численности лимфоидных клеток во всех лимфатических органах на 1-е – 3-и сутки после облучения. Показано также, что в зависимости от схемы облучения при одинаковой дозе изменяется степень выраженности нарушений иммунной реакции и неспецифической резистентности. При однократном облучении в указанной дозе восстанавливается содержание до нормы лейкоцитов через и лимфоцитов несколько дней, в крови а при фракционированном облучении численность этих иммунокомпетентных клеток не восстанавливается в течение 1 месяца [7]. Фракционированное облучение в дозе 0,75 Gy изменяет структуру мембран лимфоцитов и тимоцитов [102]. При сопоставлении влияния трех различных доз (0,1; 0,5; 1 Gy) с различной схемой облучения выяснилось также, что при дозах 0,1 и 0,5 Gy достоверно уменьшается содержание лимфоцитов в очаге воспаления, а по мере повышения дозы угнетаются миграция лимфоцитов и лимфоцитопоэз. У животных, подвергнутых фракционированному облучению, наблюдается двукратное повышение числа циркулирующих лимфоцитов, а также увеличение абсолютного числа Т-клеток [8, 103]. В эксперименте на крысах и мышах изучались состояние костномозгового кроветворения [104] и 29 клеточного иммунитета [105], а также морфофункциональные показатели иммунокомпетентных органов [6, 106, 107] под влиянием радиации. При общих дозах от 1,2 sGy до 2,22 sGy были выявлены следующие изменения: сдвиги в соотношении клеток крови; нарушение процессов красного и белого кроветворения; лейко- и лимфоцитопения; угнетение активности цитотоксических клеток-киллеров; снижение количества клеток, содержащих Fc-рецептор и IgG [6, 9, 108]. В статьях Амвросьева А.П. и соавт. указывается, что облучение зародышей крыс даже в более низкой дозе (0,5 Gy) приводит к значительным нарушениям в развитии различных органов [109, 110]. При облучении эмбрионов мышей на 17-е сутки или новорожденных в дозе 1 Gy снижается заселение периферических органов, а также способность к иммунному ответу на тимусзависимый антиген; при облучении в дозе 2 Gy и выше уменьшается способность клеток вызывать реакцию «трансплантат против хозяина». Авторы указывают также на то, что при облучении в эмбриональный период строма тимуса повреждается сильнее, чем у взрослых особей. Облучение у беременных мышей в дозе 2 Gy на 14-17-е сутки приводит к временному снижению числа тимоцитов у эмбрионов, а также к снижению таких реакций этих клеток, как пролиферативный ответ на митогены, хелперная активность [101]. Установлена бимодальная зависимость эффекта от дозы по таким параметрам, как структурные характеристики мембран клеток и мембранных компонентов, скорость взаимодействия ДНК с ферментами, адсорбция ДНК. Величина низкодозового максимума и дозы, при которой он достигался, зависели от природы изучаемого объекта и мощности дозы. Так, при изучении состояния генома облученных животных наблюдался одинаковый экстремальный характер со сдвигом максимума адсорбции ДНК в сторону меньших доз (1,2 sGy) [4, 111]. В диапазоне доз от 0 до 1 Gy возникает 30 гиперчувствительность клеток к радиации. Для низкоинтенсивного облучения описывается особая реакция клеток на радиационное влияние, при которой клетки скачкообразно переходят на новый режим существования, не зависящий от роста дозы, при этом характерно повышение вероятности повреждения и гибели клеток. Изменения эти стабильны, не исчезают при высоких дозах, а только маскируются сопутствующими дозозависимыми клеточными эффектами, к которым относятся «летальное секторирование», репродуктивная гибель, гибель клеток при делении. Подобные эффекты сопровождаются нарушением деления и морфологии клеток [4, 111]. В исследованиях [112-118] было установлено, что предварительное низкоинтенсивное -облучение не только в классической радиобиологической дозе 1 Gy, но и в промежуточной (0,5 Gy) и в малой (0,1 Gy) дозах влияет на все звенья системы крови при воспалении, а также оказывает иммуностимулирующее влияние на очаг воспаления и на функциональную активность лимфоцитов периферической крови. Оно усиливает нейтрофильную и ослабляет моноцитарную и лимфоцитарную реакции. При низкой интенсивности облучения стимулирующий эффект наблюдается не только в дозе 0,1 Gy, но также и в более высоких дозах: 0,5 Gy и 1 Gy. Также при низкоинтенсивном -излучении на 7-е и 14-е сутки после облучения наблюдается восстановление естественной клеточной динамики воспаления. В этих работах также показаны немедленные и отдаленные эффекты низкоинтенсивного -излучения на реакции системы крови при хроническом воспалении, а также зависимость этих эффектов от дозы облучения, вида клеток и срока воспаления, к которому животные были подвергнуты облучению. Авторами установлено, что дозы 0,5 Gy и 1 Gy вызывают снижение содержания макрофагов, лимфоцитов и фибробластов в очаге воспаления, а доза 0,1 Gy приводит к усилению макрофагальной и фибробластической реакций [103]. 31 При изучении влияния -излучения малой интенсивности на клеточные реакции в лимфоидных органах при хроническом воспалении было установлено, что общее -облучение в дозах 0,1, 0,5 и 1 Gy на фоне хронического воспаления, согласно данным хемилюминисценции, приводит к усилению процессов свободнорадикального окисления в тимусе, причем наиболее эффективной оказывается доза 0,1 Gy, относящаяся к диапазону малых доз. Наряду с этим в селезенке имеет место обратная дозовая зависимость. Это связано, по мнению авторов, с бóльшим содержанием в последней макрофагов, активация которых приводит к «оксидантному взрыву» и сопровождающей ее активации антиоксидантной системы [116]. Экспрессия белка-онкосупрессора р53 в лимфоцитах тимуса и селезенки возрастает с дозой (0,1, 0,5, 1 Gy), причем увеличение экспрессии этого белка при облучении в дозе 0,1 Gy является незначительным. Из этого авторами сделан вывод об отсутствии геном-регулирующей и онкосупрессорной активности белка р53 при действии низкоинтенсивного -излучения в малых дозах [117]. -облучение в указанных дозах с малой мощностью дозы приводит к замедлению акцидентальной трансформации тимуса, характерной для хронического воспаления, а также к усилению пролиферации тимоцитов [118]. Кузьменко с соавт. [119] было показано, что общее количество иммунокомпетентных клеток, содержание циркулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов в результате тотального рентгеновского облучения в дозе 4 Gy у крыс зависят от степени реактивности организма и циркадного цикла. Также было показано, что как минимум нарушения лейкопоэза в результате вышеуказанного воздействия являются только частично обратимыми. Общее содержание лейкоцитов и нейтрофилов не восстанавливалось даже на 30-й день после воздействия. 32 В 2002 году авторами [94, 120] была предпринята попытка систематизировать имеющиеся на тот момент данные, касающиеся изменений ряда параметров имунной системы при воздействии низких доз ионизирующего излучения в зависимости от дозы и особенностей влияния низких и высоких доз радиации. В их исследованиях было проанализировано 52 параметра, которые затем были разделенны на две группы. К первым двадцати параметрам, подавляемым при воздействии низких доз ионизирующей радиации, относятся показатели контроля клеточного цикла и выживаимости, синтеза поверхностных молекул, таких как CTLA-4, цитокинов, уровня сигнальных молекул (цАМФ, протеинкиназа А и фосфолипаза А2, и т. п.). В то же время было выявлено 32 параметра, которые стимулируются при воздействии низких доз радиации. К ним относятся общее количество тимоцитов, спленоцитов, лейкоцитов; захват меченых молекул тимоцитами, пролиферативная реакция спленоцитов в ответ на ConA и ЛПС, активность натуральных киллеров, синтеза цитокинов, экспрессии таких поверхностных молекул, как CD25, СD 71, CD28, CD2, CD48, реакции репарации ДНК, уровня сигнальных молекул – Ca2+, цГМФ, p38, MAP-киназы. Этими же авторами [94, 120] также указывалось, что в целом стимуляция иммунитета низкими дозами радиации представляет собой сложный процесс, компонентами которого являются реакции и обмен сигнальными молекулами между клетками имунной системы. Изменения экспрессии поверхностных молекул и секреции цитокинов сопровождаются индукцией соответствующих генов и экспрессией белков. На мышах было показано, что эти молекулярные изменения, индуцированные низкими дозами радиации, представляют собой уникальный паттерн, существенно отличающийся от развивающегося в результате воздействия больших доз радиации. 33 Также изучается функционирование [94] иммунной влияние системы низких доз через радиации воздействие на на антигенпрезентующие клетки и Т-лимфоциты, и тем самым на межклеточные реакции в пределах иммунной системы, через стимуляцию экспрессии ряда поверхностных молекул и модуляцию синтеза ряда цитокинов. Так, низкие дозы излучения стимулируют экспрессию CD80, CD86, IL-12, p70 макрофагами, а также экспрессию TCR/CD3 и молекул CD2, CD4, CD28 на лимфоцитах. Кроме того, они снижают синтез IL-10 и CTLА-4 Т-клетками. При сопоставлении влияния низкодозовой и высокодозовой радиации на эти структуры можно увидеть, что низкие дозы излучения стимулируют продукцию IL-12, экспрессию CD80 и CD28 на фоне снижения уровня IL-10, что приводит к повышению активности Т-клеток. В то же время, высокие дозы, также на фоне стимуляции экспрессии CD80 и продукции IL-12, приводят к повышению экспрессии CTLA-4 и уровня IL-10, что в свою очередь ведет к подавлению активности Т-клеток [94, 120]. При исследовании влияния низкодозовой радиации на каскады передачи сигнала между компонентами иммунной системы выделен ряд важных в этом отношении каскадов, таких как каскад PKC/Ca2+, приводящий к активации транскрипционных факторов и транслокации NF-κB в ядре. Показано, что низкие дозы радиации снижают содержание цАМФ и соотношение цАМФ/цГМФ в тимоцитах, а также молекул нисходящего каскада PКА. Эти изменения, в свою очередь, связаны с экспрессией CD3/CD28 и активацией фосфодиэстеразы-γ. Изменения в передаче сигналов в совокупности будут влиять на транскрипционные факторы, которые, в свою очередь, будут воздействовать на экспрессию цитокинов – к примеру, будут стимулировать синтез IL-12, IL-1β и TNF-α [94, 120]. Gridley et al. [17, 121] было показано, что наиболее чувствительными к воздействию облучения являются CD4+-Т-клетки. Согласно проведенным 34 модельным экспериментам на мышах линии С57BL5/6, подвергавшихся тотальному воздействию различных видов радиации в дозах, эквивалентных 2-3 Gy, наблюдалось резкое снижение общего количества CD4+-клеток в крови и селезенке. В ходе другого эксперимента, когда мышей облучали в дозах от 0 до 0,10 Gy, было установлено повышение общего уровня лейкоцитов, преимущественно за счет лимфоцитов, и макрофагов в селезенке сразу после облучения (в тот же день). При этом на 21-й день наблюдалась абсолютно противоположная картина: у всех облученных животных общее количество CD4+-лимфоцитов, B клеток, натуральных киллеров было резко снижено, в особенности у животных, облученных в дозе 0,1 Gy. Генетический анализ экспрессии генов в CD4+-клетках селезенки сразу после облучения в дозе 0,1 Гр выявил выраженное повышение экспрессии гена IL27 и транскрипционного фактора cp2. Также наблюдалась тенденция к повышению экспресиии гена рецептора IL-1 и транскрипционного фактора Т-box. Из полученных данных [17], можно сделать вывод, что облучение в низких дозах приводит к развитию дозо- и времязависимых эффектов в CD4+-T-клетках. В настоящее время также активно проводятся исследования, посвященные влиянию радиации на функциональное состояние макрофагов, так как эти клетки играют центральную роль в генерации неспецифического иммунного ответа. В частности, в макрофагах в ответ на активацию различных рецепторов опознавания паттернов через взаимодействие с MAPкиназами осуществляются процессы, связанные с клеточной пролиферацией, дифференцировкой, апоптозом, синтезом цитокинов и NO, а также фагоцитозом [122]. Narang et al. было изучено влияние ионизирующего излучения на две самых важных MAP- киназы – ERK и JNK в перитонеальных макрофагах самцов линии Swiss, облученных в дозе 2 Gy. Было показано, что воздействие радиации приводит к активации обеих киназ, 35 что выражалось в повышении частоты фосфорилирования и нитрования данных ферментов, однако затем активность этих реакций резко падала. Также было установлено, что облучение in vitro культуры макрофагов, полученных от мышей линии C57BL/6, в дозе 4 Gy приводит к повышению уровня аргиназы и снижению синтеза iNOS2, что говорит о переключении макрофагов на противовоспалительный профиль M2. В случае облучения в той же дозе макрофагов мышей линии CBA/Ca происходит активация этих клеток по провоспалительному M1 типу. Процессы активации, наблюдаемые после облучения, также сопровождались активацией ряда сигнальных молекул и инициацией соответствующих сигнальных путей. Авторами [122] высказано предположение, что изменения в экспрессии генов в результате облучения являются не прямым следствием этого типа воздействия, а следствием совокупности косвенных эффектов, возникающих за счет передачи сигналов, генерируемых облученными клетками. Это предположение подтверждается в некоторой степени данными, полученными, согласно которым облучение ионами углерода макрофагов линии RAW 264,7 приводило только к снижению уровня IL-1β и усилению фагоцитарной активности. В то же время, взаимодействие облученных клеток с ЛПС, лигандом Toll-рецепторов, приводило к резкому повышению уровня провоспалительных цитокинов и NO по сравнению с контролями (интактные клетки и нормальные клетки, активированные ЛПС). Эти данные косвенно подтверждают правомерность гипотезы об участии «эффекта очевидца» в патогенезе радиационно-индуцированных нарушений. Liu et al. [94, 120], было установлено, что γ-облучение в дозе 2 Gy существенно ингибирует регуляцию и активацию экспрессии CCR7 и IL-10 за счет ЛПС в дендритных клетках мышей линии C57BL/6. Дендритные клетки (ДК) относятся к антигенпрезентующим клеткам и играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа, а миграция ДК во вторичные 36 лимфоидные ткани также играет важную роль в инициации реакций врожденного и приобретенного иммунитета. Они активируются ЛПС, в результате чего происходит индукция синтеза провоспалительных цитокинов и других медиаторов за счет активации TLR4, что запускает сложную программу фенотипического и функционального созревания, включая рецептор хемокина CCR7. Последний повышает реактивность ДК по отношению к лигандам CCR7, что обеспечивает миграцию ДК из периферических тканей во вторичные лимфоидные органы, такие как лимфоузлы, а также в селезенку, где происходит презентация антигенов Тклеткам и инициируется иммунный ответ. Нарушение нормального синтеза CCR7 приводило к снижению миграции ДК к CCL19 in vitro и in vivo, результатом чего в перспективе была задержка генерации имунного ответа. При этом в другом исследовании [124] было показано, что более низкие дозы ионизирующей радиации (0,02 – 1,0 Gy) приводят к повышению синтеза IL-2, IL-12 и IFN–γ в ДК мышей линий Balb/c и С57BL/6. Также совместное культивирование ДК, подвергшихся воздействию малых доз радиации, с наивными Т-клетками приводило к резкому повышению уровня пролиферации Т-клеток по сравнению с контролем и дифференцировке последних по Th1-типу, по всей видимости, за счет резкого повышения уровня соответствующих цитокинов. В исследованиях Soule et al. на тучных клетках [125] были изучены такие параметры, как активация и выживание тучных клеток мышей и человека in vitro и in vivo, а также динамика высвобождения ими медиаторов, цитокинов и IgE после воздействия облучения в дозах от 2 до 400 sGy. Авторами было установлено, что тучные клетки, действительно, являются резистетными к цитотоксическому воздействию излучения. При этом облучение временно ингибирует FcR-зависимую деградацию метаболитов и синтез цитокинов под воздействием IgE. В частности, за счет такого 37 воздействия резко снижается уровень синтеза и IL-8 колониестимулирующего фактора гранулоцитов и моноцитов (GM-CSF) на фоне повышения уровня TNF-α и IL-6. Также наблюдается резкое повышение уровня гистамина. Последнее обстоятельство может быть одной из причин развития симптомов радиационного повреждения [125]. При этом следует отметить, что радиация нарушает сигнальные каскады, связанные с рецепторами IgE и ряда других медиаторов, в то время как каскады синтеза цитокинов, зависящие от активации TLR, остаются интактными. Также радиация не нарушает способность этих клеток к дегрануляции и фагоцитозу E. coli. В совокупности, полученные исследователями данные подтверждают высокую резистентность этого типа клеток к облучению, однако временные нарушения, вызываемые радиацией, вкупе с воздействием на менее резистентные клетки, могут быть причиной развития радиационно-индуцированных нарушений [126, 127]. В ситуации, когда эпителиальный барьер скомпроментирован, к примеру, после локального облучения желудка, происходит активация иммунных клеток и инициируется рекрутинг провоспалительных клеток, и их количество, за счет миграции, увеличивается на несколько порядков. Когда рекрутинг клеток из других мест, помимо облученного участка, изменяется за счет развития системной супрессии иммунитета, активированные иммунные клетки, в основном нейтрофилы, макрофаги и цитотоксические Т-клетки, атакуют и разрушают близлежащие клетки. Это осуществляется прямо либо опосредованно – за счет высвобождения растворимых факторов, таких как активные метаболиты кислорода и азота, цитотоксические белки, литические ферменты или цитокины [128]. Значимость этих изменений в контексте изменения паттерна экспрессии генов в клетках кишечника и превращения брюшной полости в «воспалительный орган» фактически не изучена [19, 129,130]. 38 В ряде работ высказывалось предположение о том, что ионизирующая радиация индуцирует предпочтительную дифференцировку Th-клеток в Th2клетки в селезенке [129 - 132]. Профили экспрессии специфичных генов в основном коррелировали с количеством воспалительных клеток в слизистой оболочке. В то время как специфичные для нейтрофилов гены характеризовались низким уровнем экспрессии все время исследования, для ряда генов макрофагов была характерна тенденция к корреляции с количеством макрофагов в разные периоды после облучения. И наконец, профили экспрессии генов тяжелой цепи Ig коррелировали с количеством В-клеток слизистой оболочки, а гены рецепторов Т-клеток – с содержанием Т-лимфоцитов в слизистой оболочке кишечника после облучения [127, 133-135]. Воспалительная реакция является классическим следствием воздействия радиации, и предполагается, что она играет ключевую роль в развитии острой и отложенной реакций на воздействие облучения во многих тканях. Инфекция является основной причиной смерти после высокодозного общего радиационного поражения. Как было описано выше, нарушения иммунной системы, вызванные облучением в малых дозах, могут привести к снижению резистентности к инфекции как у непосредственно облученных особей, так и у их потомства, облученного в антенатальном или эмбриональном периоде. При инфицировании непосредственно после облучения кроме повышения чувствительности к бактериальной инфекции имеет место возрастание процента смертности вследствие инфекции [12, 13, 16, 98]. Следует упомянуть, что в случае инфицирования через определённый промежуток времени после облучения, параметры чувствительности к инфекции и смертность сопоставимы с таковыми у контроля [12, 16]. 39 Вследствие сложного характера влияния низкоинтенсивного ионизирующего облучения и большое количество связанных с этим нюансов, необходимо постепенное, систематизированное изучение влияния конкретных доз ионизирующего облучения на состояние иммунной системы и дальнейших последствий подобных нарушений, к примеру, чувствительности к инфекции. Воздействие ионизирующей радиации увеличивает для хозяина риск эндогенных и экзогенных инфекций. Одним из потенциальных источников инфекции являеться оппортунистической грибковая инфекции, инфекция. поэтому Кандидоз развивается, относится к как правило, у иммунокомпрометированных больных. В иммунной защите организма ведущее значение принадлежит врожденному иммунитету, особенно прямой фагоцитоз грибковых клеток нейтрофилами и макрофагами. Кроме клеток врожденного иммунитета, дополнительный защитный эффект оказывается клеточным приобретенным иммунитетом, который в этом случае представлен Th лимфоцитами. Он способствует локализации инфекции, активации других факторов резистентности и уничтожению возбудителя. При этом основную протективную функцию выполняют Т-лимфоциты – эффекторы замедленной гиперчувствительности CD8+ и Т-клетки CD4+ 1 типа [136, 141-150]. Известна важнейшая роль неспецифических факторов, в частности, фагоцитарной системы, в резистентности организма к Candida spp. Макрофаги и нейтрофилы выполняют основную работу по избавлению макроорганизма от Candida spp. Адгезия клеток гриба к фагоцитам может осуществляться непосредственно (только у макрофагов за счет рецепторов на их поверхности), или опосредованно, как у нейтрофилов и других клеток, с участием опсонинов: антител или факторов комплемента. Непосредственное распознавание осуществляется, в основном, за счет маннозосвязывающего рецептора, расположенного на макрофагах. Активация и передача сигнала с 40 маннозосвязывающего рецептора идет при участии ионов Ca++ . Опосредованное опсонинами связывание обеспечивается рецепторами к Fcфрагментам антител и рецепторам комплемента CR1 (многие виды Candida) и СR3. Экспрессия и тех, и других рецепторов повышается под действием цитокинов [147 - 150]. Важная роль окислительного звена защиты доказывается усилением фунгицидной активности макрофагов под действием рекомбинантной миелопероксидазы. Дефицит миелопероксидазы приводит к незавершенности фагоцитоза и считается одним из наиболее важных факторов, предрасполагающих ко всем формам кандидоза [143]. Система оксида азота макрофагов в настоящее время рассматривается как один из основных фунгицидных механизмов. Клетки профессиональных макрофагов располагают высокоактивной "индуцибельной" синтазой оксида азота (iNOS). Индукция этого фермента происходит под влиянием IFN и TNF, угнетение – под влиянием IL-4, IL-10, TGF-β [67]. Деятельность оксида азота заключается в подавлении многих ферментных систем гриба, нарушает гликолиз и дыхательные цепи, взаимодействует с протеинкиназами, расстраивает метаболизм фосфатов и транспортные системы. В итоге это ведет к цитостатическим и гибельным для клеток эффектам. Системы производных кислорода и азота работают во взаимодействии, причем их компоненты могут взаимно подавлять и потенцировать эффекты друг друга [145]. К неокислительным фунгицидным механизмам относят различные протеолитические белки фагоцитов, дефензины, лизоцим и низкую рН в фагосомах [143]. поглощенных дестабилизируют Эти Candida факторы spp., мембраны. препятствуют нейтрализуют Важным фактором жизнедеятельности их вирулентность, защиты является лактоферрин, выделяемый внутри фагоцитов или экскретируемый в кровь и 41 другие биологические жидкости. Лактоферрин связывает железо, отнимая его у грибов. Отмечается существенное усиление функции фагоцитов при добавлении лактоферрина [143]. Активация иммунного ответа макрофагами осуществляется за счет ряда цитокинов: IL-1, IL-6, GM-CSF и TNF, являющихся ростовыми факторами и активаторами для многих популяций клеток, в т. ч. самих макрофагов, и стимулирующих индукцию разных цитокинов и белков острой фазы. Особенно важными считаются два цитокина, IL-10 и IL-12. Доказана способность макрофагального IL-12 к активации Th1 звена клеточного иммунитета и NK-клеток [146], что за счет действия IFN усиливает фунгицидную активность фагоцитов. Влияние IL-10, для которого можно было бы ожидать обратные эффекты, пока не доказано. Несмотря на высокую активность, максимальную специализацию и незаурядные регуляторные способности макрофагов, эти клетки из всех фагоцитов являются наиболее зависимыми от Т-клеточной регуляции и в большей степени чувствительны к ее расстройствам, например, при СПИД [146]. В начале 1990-х гг. группой итальянских исследователей (Bistoni et al.) в эксперименте было показано, что активность Th1-лимфоцитов ассоциируется с улучшением состояния/излечением от кандидоза [145 - 147]. Повышенная активность Th2, преимущественно перед Th1-клетками, напротив, ассоциируется с ухудшением состояния и смертью лабораторных животных. Деятельность Th2-клеток приводит к подавлению активности Th1лимфоцитов, стимулирует антителообразование, в т. ч. продукцию IgA и IgE, угнетает фагоцитоз и фунгицидное действие макрофагов и нейтрофилов. Главная роль Th1-клеток заключается в опосредованной IFN стимуляции ими фагоцитоза, представления антигена фагоцитами, кислородных и NOзависимых фунгицидных механизмов [148], а также секреции опсонинов. Отмечено, что преобладание Th1 или Th2 типов иммунного ответа зависит от 42 длительности течения инфекции и массы инфицирующих клеток. Значение баланса двух подтипов Т-хелперов, возможно, заключается в том, что макроорганизм предпочитает относительно безопасный Th2 (антительный) ответ, а не сильный фунгицидный Th1 (клеточный) иммунный ответ с обширным разрушением тканей в тех случаях, когда он не справляется с массой возбудителей. Переключение на Th2-ответ может происходить и на промежуточных этапах, в целях контроля за избыточной деструктивной деятельностью фагоцитов. CD8+- лимфоциты способны уничтожать макрофагов с незавершенным процессом фагоцитоза и расположенными в цитоплазме клетками гриба. За счет продукции IFN и IL-2 CD8+-лимфоциты стимулируют Th1 и NK-клетки, повышают эффективность фагоцитоза, угнетают Th2-ответ. Кроме того, CD8+-лимфоциты могут оказывать непосредственный фунгицидный эффект, взаимодействуя с клетками C. albicans [149]. При кандидозе вырабатываются антитела. Повышенные титры IgM отмечаются на ранних стадиях инфекции, снижаясь со временем и особенно заметно – при успешной противогрибковой терапии. В эксперименте доказана защитная роль антител класса IgM к маннановой фракции клеточной стенки C. albicans, выполняющей функцию адгезии. Высокий или нарастающий титр IgA, особенно титр секреторных антител (sIgA), отражает активную инфекцию, оказывает прямое фунгицидное действие, препятствовует адгезии, лизису белков макроорганизма через активацию системы комплемента [150-152]. Роль специфических IgG при кандидозе заключается в опсонизации грибковых клеток. Антитела класса IgG к маннанам C. albicans активируют комплемент по классическому пути. Антитела класса IgE к маннановым и белковым антигенам C. albicans обнаруживают и при инфекции, и при носительстве, наиболее часто у лиц с атопической предрасположенностью. 43 Поскольку усиленная продукция IgE отражает активность Тh2-клеток, угнетающую противогрибковый клеточный иммунитет и способствующую развитию инфекции, обнаружение растущего или высокого титра специфического IgE может служить диагностическим и прогностическим показателем [151, 152]. Роль комплемента в защите макроорганизма при глубоком кандидозе представляется несомненной. Однако конкретные механизмы действия комплементарной системы и их взаимодействие между собой и другими факторами иммунитета остаются не уточненными. Вообще, роль комплемента заключается в связывании (прямом по альтернативному пути и опосредованном антителами по классическому пути), с опсонизацией или непосредственным уничтожением, микробов, а также в образовании факторов, обеспечивающих хемотаксис фагоцитов. Антитела класса IgG к маннановым антигенам способны запускать активацию фактора С3 по классическому пути, элиминация опсонизированных клеток C. albicans обеспечивается как CR3, так и другими рецепторами [151, 152]. В последние годы изучается проблема модуляции иммунного ответа, вызванной C. albicans. Были высказаны предположения о возможной индукции клеток-супрессоров с помощью антигенов C. albicans. В качестве клеток-супрессоров предлагались CD8+-лимфоциты-супрессоры или CD4+Th2-клетки, подавляющие активность фагоцитоза с помощью IL-4 и IL-10 [146]. Достоверных доказательств активной кандидной иммуносупрессии, т. е. направленного изменения иммунного ответа в пользу гриба за счет его антигенов в настоящее время нет. Недавние исследования показали, что в ходе регуляции иммунного ответа макрофаги выделяют IL-12 в течение определенного ограниченного периода времени. В последующем активность IL-12 и опосредованных им IFN-зависимых реакций снижается, уступая место IL-4 и IL-10, подавляющим клеточный иммунитет. Подобный 44 механизм может обеспечивать защитное действие, ограничивая по времени (дозируя) выброс макрофагами токсичных и для гриба, и для макроорганизма производных кислорода и азота. С другой стороны, иммуномодуляция может обеспечивать выживание гриба при незавершенном фагоцитозе. Продолжающаяся после неэффективного выброса радикалов антигенная стимуляция ведет к преобладанию реакций Th2-типа, подавляющих дальнейшую фунгицидную активность. Возможность участия специфических антигенов C. albicans, например, фрагментов маннана или белков теплового шока, в модуляции иммунного ответа, а также антигенная мимикрия C. albicans в настоящее время активно изучаются [151, 152]. Представленные в данном обзоре результаты отечественных и зарубежных исследований, направленных на изучение системных и локальных изменений в иммунной системе под воздействием облучения, позволяют расширить наши представления об этих процессах и могут быть предпосылками для разработки подходов с целью коррекции повреждений, вызванных воздействием малых доз ионизирующей радиации. Раздел 1.3. Принципы коррекции нарушений иммунологической реактивности Раскрытие роли иммунологической реактивности в физиологических и патофизиологических процессах создало предпосылки для разработки методов коррекции, основанных на направленной регуляции иммунных реакций, дозировкой и временем введения. Методы регуляции иммунных реакций разделяют на специфические и неспецифические в связи с возможностью влияния иммунотропных препаратов, которые могут одновременно оказывать влияние на звенья специфического и неспецифического иммунного ответа. 45 Иммунофармакологические агенты или иммуномодуляторы могут быть разделены для удобства на две группы: иммуносупрессорные препараты и иммуностимулирующие препараты (включая адьюванты), в соответствии с их применением в терапии [46-48]. Необходимость применения иммуностимулирующих средств (иммуномодуляторов) связана не только с патогенетическими особенностями заболеваний, но и с методами их лечения. Антибиотическое актериальное лечение инфекционных болезней, химио- и лучевая терапия опухолей, любые оперативные вмешательства, а также неблагоприятные экологические факторы, в том числе и радиация, приводящие к дальнейшему повреждению структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови, усугубляя вторичную иммунную недостаточность [46-48]. Вовлечение в патологический процесс иммунокомпетентных клеток с последующей активацией выработки ими целого комплекса биологически активных веществ, усугубляющих клеточные и сосудистые нарушения, представляет собой одно из наиболее универсальных звеньев развития воспаления. Поэтому логичной стратегией в патогенетической терапии воспалительных заболеваний вне зависимости от этиологии представляется воздействие на это ключевое звено с целью обратимых стимуляции или подавления избыточной активности моноцитов/макрофагов в острый период болезни [62, 82-84, 146]. При изучении патогенеза различных по этиологии инфекционных воспалительных заболеваний выявлены некоторые наиболее общие и обязательные звенья развития воспалительных реакций. Первыми клеточными элементами, которые сталкиваются с инфекционным агентом после его проникновения через эпителий слизистых и кожных покровов, являются макрофаги, а также другие иммунокомпетентные клетки. Именно 46 от их дальнейшего «поведения» зависят выраженность и характер ответных реакций организма на внедрение возбудителя (46-48). Основной задачей иммунофармакологических исследований является выявление источников наиболее эффективных иммуностимуляторов, адьювантов и иммуносупрессоров. Возникает вопрос – следует ли использовать богатый арсенал эндогенных молекул (в основном пептидов), которые служат в качестве средств, обеспечивающих взаимодействие клеток в иммунной системе, или надо искать иммуномодуляторы (или, как их часто называют, модификаторы биологических реакций) среди практически бесконечного количества природных или синтетических химических соединений, которые могут быть протестированы в лаборатории на наличие у них возможных иммуномодулирующих свойств (26-34). Без сомнения, некоторые эндогенные полипептиды иммунной системы (цитокины и связанные с ними факторы) могут использоваться в различных режимах иммуностимулирующей терапии. К примеру, IFN применяется при хронической инфекции вирусом гепатита B, IL-2 – при лечении метастатической колониестимулирующие восстановление заболеваний, карциномы факторы нейтрофилов включая – клеток (GM-CSF после интенсивную и прямой G-CSF), хемотерапии терапию, кишки, а ускоряющие злокачественных применяемую при трансплантации костного мозга. IL-1α также имеет широкий спектр свойств и используется лейшманиоз, при различных малярия, инфекционных туберкулез, заболеваниях шистосомиаз) и (СПИД, некоторых злокачественных состояниях. С другой стороны, терапевтический потенциал использования цитокинов включает также разнообразные болезни, при которых в патофизиологических процессах задействован ряд цитокинов (TNF, IL-1, -4, -6), – воспалительные, ревматические, СПИД (153-160). В настоящее время разрабатываются антагонисты таких цитокинов, в 47 том числе и специфичные к ним моноклональные антитела, растворимые рецепторы, антагонисты к рецепторам, а также рассматривается вариант иммунокоррекции при помощи антагонистичных к цитокинам олигонуклеотидов [19, 52]. Непосредственное применение цитокинов или их антагонистов, так же как и лечение in vitro иммунными клетками, при котором последние вводятся в кровоток пациента, а также транспорт генов (к примеру, транспорт гена, кодирующего TNF) – все это лишь немногие из стратегий, которые получают все большее распространение. Следует, однако, осознавать, что цитокины плейотропны по своим свойствам и что следует учитывать побочные эффекты наблюдающиеся при антицитокиновой терапии. (которые клинических У могут быть испытаниях здорового человека фатальными), цитокиновой разные или цитокины эффективно взаимодействуют друг с другом, несмотря на их плейотропизм и обилие, но искусственное введение дополнительного количества определенного цитокина может нарушить это равновесие, что объясняет тот факт, что при применении цитокиновой терапии возникают сложные проблемы с дозировкой и временем введения [154 - 160]. Другим терапевтическим подходом является поиск иммуностимулирующих и адьювантных свойств у экзогенных молекул, натуральных (к примеру, бактериального происхождения) либо полу- или полностью синтетических. Спектр возможностей здесь неограничен, и поиск подобных агентов облегчается широким спектром тестов in vitro и in vivo, которые позволяют выявить и проанализировать имеющиеся иммуностимулирующие свойства, такие как повышение сопротивляемости к инфекциям, отторжение пересаженных опухолей, повышение продукции антител либо генерирование реакций гиперчувствительности замедленного типа против разнообразных антигенов [ 153, 158]. 48 Конечно же, следует осознавать, что свойства различных иммуностимулирующих веществ экзогенного происхождения должны, по большому счету, реализовываться за счет их взаимодействий (либо уже выявленных, либо еще требующих прояснения) с системой цитокинов, и, таким образом, противоречий между прямым и непрямым подходом нет. Явным преимуществом экзогенных иммуностимуляторов является то, что, по сравнению с полипептидами иммунной системы, некоторые из них имеют меньшую молекулярную массу, являются синтетическими и обладают легко выявляемыми фармакокинетическими характеристиками, например, циклоферон стимулирует в организме человека выработку собственного интерферона, что способствует защите организма от инфицирования вирусами и другими инфекционными агентами, ингибированию роста злокачественных клеток. Препарат является индуктором смешанного иммунного ответа Th1/Th2, повышает функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, активирует фагоцитоз [153]. Решение проводить биологические и клинические исследования экзогенных иммуностимуляторов может получить еще одно обоснование, если рассмотреть ситуацию иммуносупрессивными с антагонистами препаратами. В то этих время лекарств как – область фармакологической иммуностимуляции все еще на ранней стадии развития, иммуносупрессивная терапия стала частью повседневной практики. Она применяется либо для того, чтобы предотвратить отторжение аллогенных трансплантатов почек, сердца, легких и печени, либо при лечении разнообразных аутоиммунных состояний, таких как ревматоидный артрит, инсулинозависимый диабет, красная волчанка, болезнь Крона, и, возможно, в будущем других состояний [159-161]. За исключением моноклональных антител к маркеру Т-лимфоцитов CD3, все иммуносупрессивные препараты, используемые в медицинской практике либо проходящие клинические 49 испытания, – молекулы экзогенного происхождения или вторичными метаболитами бактерий (как являющиеся циклоспорин, макролиды рапамицин и такролимус, 15-дезоксиспергуалин, микофелонат) (153). В Европе, происхождения к примеру, продаются противоинфекционных некоторые на рынке препараты бактериального исключительно иммуностимуляторов. Эти в качестве бактериальные иммуностимуляторы принимаются либо перорально, либо интраназально. Удивительным представляется тот факт, что эти же препараты проявляют иммуномодулирующие свойства, которые потенциально могут быть полезны при лечении аутоиммунного заболевания – ревматоидного артрита [162]. Из всех бактериальных продуктов, оказывающих стимулирующее влияние на функции иммунной системы за счет взаимодействия с макрофагами, моноцитами и лимфоцитами, наиболее мощными по своему влиянию являются липополисахариды (ЛПС). Они выполняют широкий спектр биологических функций: усиливают резистентность лабораторных животных к бактериальным, вирусным, грибковым и паразитарным инфекциям, вызывают некроз опухолей, причем все эти эффекты сопровождаются повышением продукции и высвобождением разнообразных цитокинов, таких, IL-1, IL-6, TNF, тимические пептиды [27, 162]. Производные нуклеиновых кислот представляют собой другой источник иммуностимулирующих агентов, представленных пиримидинонами, производными гуанозина, производными инозин-5’метилмонофосфата и гипоксантина. Все эти исследования были проведены in vivo, и очень немногие желательные эффекты были продемонстрированы in vitro. Оказывается, что первичными эффекторными клетками, активируемыми пиримидинонами, являются макрофаги и NK-клетки [162]. 50 Ряд описанных выше соединений способен оказывать особый тип иммуностимулирующего влияния, а именно проявлять адъювантную активность. Последняя заключается в способности существенно усиливать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ на твердые или растворимые антигены. Это свойство представляет значительный практический интерес для разработчиков вакцин человека и животных, так как очищенные антигены, входящие в состав вакцин, обладают низким уровнем иммуногенности как таковой. Более того, часть лиц слабо реагирует на определенные виды вакцин, что справедливо для вакцин против гепатита В или вируса гриппа у пожилых людей [46,153]. Существует более мягкий подход, однако он применим только к живым микроорганизмам. Данная методика заключается в создании при помощи генной инженерии линий микроорганизмов, которые экспрессируют ген определенного цитокина, благодаря чему достигается усиление иммунного ответа. Также можно упомянуть работу Dempsey et al., которые показали, что вакцинация мышей рекомбинатным модельным антигеном (лизоцимом куриного яйца), связанным с компонентом C3 системы комплемента, вызывает 10000-кратное усиление гуморального и клеточного иммунных ответов по сравнению с одиночным введением антигена. Это позволяет считать С3, являющийся природным адьювантом системы врожденного иммунитета, способным влиять на развитие приобретенного иммунитета[35, 36].. Строго говоря, гормоны тимуса, а также туфтизин (тетрапептид, полученный от части Fc молекулы иммуноглобулина) относятся к природным эндогенным иммуномодуляторам. Ряд подобных пептидов может быть создан при помощи химического синтеза или же экстрагироваться из тимуса крупного рогатого скота, а затем использоваться в различных 51 областях в клинике. Природа и применение в терапии синтетических пептидов тимуса широко обсуждается в литературе [28, 31, 162-164]. Тимомодулин и тимостимулин представляют собой очищенные экстракты тимуса телят и получили довольно широкое применение в практике, в особенности в Италии. Тимомодулин содержит смесь низкомолекулярных белков (менее 10 ma). Считается, что эти препараты улучшают течение хронических инфекционных заболеваний, таких как хронический бронхит и рецидивирующие педиатрические инфекции (165). Таким образом, иммуностимулирующих одной из препаратов возможных является сфер лечение применения инфекционных заболеваний, особенно в случае лиц, иммунная система которых не функционирует оптимально, в частности, у маленьких детей, пожилых людей и иммуноскомпрометированных пациентов. В этой сфере применяются разнообразные лизаты бактерий (некоторые из них могут выступать в качестве вакцин), химически очищенные бактериальные гликопротеины, экстракты растений и химически синтезированные препараты. Также в этом контексте используются пептиды тимуса тимомодулин и тимостимулин. Тимозин α1 (Тα1) является природным пептидом тимуса. Авторы предположили, что Тα1 может влиять на баланс иммунитета и толерантности, находящийся под контролем ДК и тем самым влиять на формирование клеток Treg. Для этого оценивали влияние Тα1 на образование ДК из клеток костного мозга мышей или предшественников периферической крови человека Полученные ДК оценивались на проявление экспрессии IDO и способность управлять праймингом Th1/Treg in vitro и in vivo против A. fumigatus и аллоантигенов [28, 31- 33, 164 - 168]. Авторы исследовали относительную способность ДК, сформировавшихся в присутствии Тα1, индуцировать антигенспецифический прайминг Th1/Treg в CD4+-T-лимфоцитах селезенки в ответ на конидии 52 Aspergillus. Показано, что Тα1 повышает уровень прайминга CD4 +-T-клеток, синтезирующих IFN-γ/IL-10 клетками костного мозга, а также количество IL10 в присутствии FL-ДК. Блокада активности IDO или снижение количества B220+CD11c+ клеток из популяции костномозговых дендритных клеток, обработанных Тα1, полностью прекращали активацию Treg. Таким образом, можно заключить, что клетки фенотипа CD11c+B220+ являются ключевыми компонентами, обеспечивающими толерогенное влияние Тα1. Блокада IDO 1-метилтриптофаном предотвращала активацию IL-10-синтезирующих клеток, но не имела влияния на клетки, синтезирующие IFN-γ, что указывает на наличие причинно-следственной связи между активностью IDO и праймингом IL-10-синтезирующих клеток [164, 166]. Гистопатологические исследования показали, что у мышей, которым вводили костномозговые ДК, обработанные предварительно Тα1, наблюдалось снижение рекрутинга провоспалительных клеток в легких и локальных воспалительных реакциях по сравнению с мышами, которым вводили обычные костномозговые ДК. Эти данные показывают, что введение дендритных клеток костномозгового происхождения извне связано с развитием тяжелой воспалительной токсичности, уровень которой снижается при обработке донорских клеток Тα1. Также стоит отметить, что при использовании ДК, обработанных Тα1 не только снижалась активность реакции «трансплантат против хозяина», но и увеличивалась сопротивляемость мышей-реципиентов к инфекции, в отличие от животных, которым вводили стволовые и дендритные клетки без дополнительной обработки [164 - 168]. Дипептид L-глутамил-L-триптофан, как и другие пептиды, состоящие из левовращающих малотоксичных изомеров соединений, аминокислот, специфически относится фиксируясь на к числу мембране тимоцита и усиливает трансмем-бранный обмена Са++. Под его влиянием 53 происходит активация систем вторичных посредников. Представленные данные свидетельствуют том, что тимоген не только тимомимети-ческий иммуномодулятор, но в не меньшей степени полифункциональный биорегулятор, выполняющий, как и другие короткие пептиды, функцию стартового сигнала в пептидном регуляторном каскаде. Эти представления позволяют понять способность тимогена одно-временно индуцировать различные эффекты, направленность которых определяется ви-дом клетокмишеней и характером имеющихся повреждений [33, 163 - 168]. Изучение патофизиологических механизмов течения инфекций на фоне радио-индуцированного совершенствованию иммунодефицита оценки состояния могут гомеостаза способствовать организма и эффективности терапевтического вмешательства [2,3,12, 13,29]. В Национальном Институте Аллергии и Инфекционных болезней (NIAID) и Национальном Онкологическом институте (NCI) было запущено ряд программ, которые проводятся на стандартизованных экспериментальных моделях животных для сравнения эффективности препаратов, разрабатываемых для профилактики и лечения радиационных поражений, согласно требованиям FDA [1, 5, 35, 36).4]. Вышеизложенное обуславливает актуальность проведения исследований комбинированного влияния небольших доз радиации и инфекции на организм. Определение оптимальных уровней продукции цитокинов для сопротивления разработке потенциальных бактериальной терапевтических инфекции стратегий поможет для в лечения инфекционных заболеваний на фоне радиационного повреждения. Таким образом, возникает необходимость исследований механизмов формирования радиационно-индуцированных изменений иммунологической реактивности при инфекционном процессе и патогенетически обосновать принципы их коррекции. 54 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проведены на 162 крысах-самцах популяции Вистар массой 180-200 г., которые были разделены на следующие группы: І – облученные крысы (36 особей); II – инфицированные крысы (36); ІІІ – облученные и инфицированные крысы (36); ІV – интактные крысы (6); V – облученные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VI – инфицированные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VIІ – облученные и инфицированные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VIІІ – интактные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); ІХ – облученные крысы, получавшие дипептид глутамилтриптофан (6); Х – инфицированные крысы, получавшие дипептид глутамилтриптофан (6); ХІ – облученные и инфицированные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6); ХІІ – интактные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6). Подопытных животных, которые были выращены в виварии ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины», содержали на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде по десять – двенадцать голов в стандартных металлических клетках. Для устранения влияния сезонных и суточных колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в осенний сезон, в утренние часы. Исследования осуществлялись согласно принципам Хельсинской декларации, принятой Генеральной ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (1964 – 2000 гг.), Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине (1997 г.), соответствующих положений ВОЗ, Международного совета медицинских научных обществ, Международного кодекса медицинской этики (1983 г.), Национальных «Общих этических принципов исследований на животных» (Украина, 2001 г.), которые согласованы с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных 55 животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 18.03.1986). Все болезненные и стрессовые процедуры выполняли под легким эфирным наркозом, умерщвление животных осуществляли путем декапитации с предварительным введением раствора тиопентала натрия. Облучение животных Фракционированное тотальное облучение животных осуществляли в течение трех суток с интервалом 24 ч на рентгеновской диагностической установке РУМ - 17 на протяжении 40 сек. Напряжение было 90 кВ, сила тока 40 мА, алюминиевый фильтр 0,5 мм, кожно - фокусное расстояние 48 см. Суммарная доза – 1,5 Gy (ежедневная – 0,5 Gy). Инфицирование животных Для моделирования инфекционного процесса применяли культуру штамма Candida albicans, который был получен от больного острым гастроэнтероколитом до проведения этиотропной терапии и хранился в музее живых микроорганизмов лаборатории специфической профилактики капельных инфекций ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины». Приготовление микробной суспензии Candida albicans с определенной концентрацией микробных клеток проводили при помощи электронного прибора Densi – La - Meter (Pliva - lachema а.s., Чехия) по шкале Mcfarland согласно инструкции к прибору. С поверхности агаровой среды стерильным изотоническим раствором NaCl смывали суточную тест-культуру и доводили до необходимого для проведения опытов количества единиц оптического стандарта плотности по Mcfarland. Число живых микроорганизмов (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом на 56 питательные среды. Синхронизация культур перед проведением опытов достигалась путем одноразового воздействия низкой температуры (40 С) в течение 30-ти минут. Приготовление питательных сред осуществлялось согласно ДСТУ 10.444.1 - 84 (СТСЭВ 3833 – 82) «Приготовление растворов, реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе» и в соответствии с инструкциями фирмпроизводителей. Выбор дозы заражения были определены экспериментальным путем, описанным в патенте Украины на полезную модель «Способ получения модели генерализованного кандидоза» [169] и является оптимальной для достижения минимального уровня летальности опытных крыс, что является необходимым для получения модели генерализованного кандидоза. Инфицирование крыс проводили путем внутривенного введения в хвостовую вену 0,5 мл суспензии указанного штамма Candida albicans, с концентрацией микробных клеток 5х106 КОЕ/мл. Животным контрольной группы внутривенно вводили 0,5 мл стерильного изотонического раствора NaCl. Постановка эксперимента После завершения облучения (на 3-и сутки) группа облученных и группа необлученных животных были инфицированы путем внутривенного введения культуры Candida albicans в дозе 2,5х106 КОЕ. Животных декапитировали на 1-е, 2-е, 3-и сутки после инфицирования и на 10-е, 17-е и 28-е сутки после начала облучения. В качестве контроля были интактные крысы, животные с инфекционным процессом без предварительного облучения и облученные крысы без последующего инфицирования. Последним внутривенно вводили 0,5 мл стерильного изотонического 57 раствора NaСl. Наблюдение в группе неинфицированных облученных животных осуществлялось на протяжении 28-ми суток. Наблюдение в группах инфицированных животных осуществлялось на протяжении двух недель после инфицирования. Разработанная модель была использована для оценки возможностей коррекции полученного типа дефекта антиинфекционной реактивности и терапевтической эффективности иммунотропных препаратов с широким спектром возможных биологических эффектов. Учитывая характерные признаки индуцированного нарушения структуры антиинфекционной резистентности (в частности, дисбаланс цитокинов и недостаточный уровень активации иммунокомпетентных клеток периферической крови и перитонеальных макрофагов в ответ на инфекцию), в качестве средств коррекции был выбран препарат, среди фармакологических эффектов которого указана способность влиять на эффективность метилглюкамина процессов фагоцитоза, акридонацетат, и – индуктор препарат, интерферона нормализующий функциональное состояние иммунной системы, – дипептид глутамилтриптофан. Препараты вводили внутримышечно, начиная со следующего дня после инфицирования, один раз в сутки, курсом 5 суток. Разовая доза составляла для метилглюкамина акридонацетат 10 мг/кг и для дипептид глутамил-триптофана 200 мг/кг массы тела в сутки соответственно. Микробиологические методы исследования С целью микробиологического исследования органов крыс (кровь, сердце, печень), последние в асептических условиях препарировали, взвешивали (вес каждой пробы для посева составлял 1 г), затем измельчали в стерильных условиях в биологическом гомогенизаторе, вносили в накопительные среды, инкубировали в течение 18-ти часов при температуре 58 370 С. Для определения количества микроорганизмов 1 г исследуемого материала переносили в асептических условиях в биологический гомогенизатор и растирали, добавляя 1 мл изотонического раствора NaCl, затем готовили ряд последовательных десятикратных разведений. 0,1 мл гомогената из каждого разведения высеивали на элективную агаризованную среду ВСА. Дальнейшее исследование и идентификация изъятых культур микроорганизмов, тинкториальным, которая осуществлялась культуральным, по биохимическим морфологическим, и серологическим свойствам, проводились общепринятыми методами [46-49]. Определение количества микроорганизмов. Концентрацию микроорганизмов в 1 г исследуемого материала определяли путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ/г), с учетом количества посевного материала и разведения, по формуле: 10 NM Х , m где Х – число КОЕ/г исследуемого материала; 10 – постоянный коэффициент при посеве 0,1 мл гомогената; N – количество колоний; m – разведение (в 10, 100, 1000 раз и т. п.). Для удобства полученные результаты выражали в десятичных логарифмах числа микроорганизмов на 1 г исследуемого материала – lg КОЕ/г - и интерпретировали следующим образом [4, 5]: I степень – до 0,5 lg КОЕ/г; ІІ – 0,51-1,5 lg КОЕ/г; ІІІ – 1,51-2,5 lg КОЕ/г; ІV – больше 2,5 lg КОЕ/г. Контроль качества питательных сред проводили согласно рекомендациям фирм-производителей, которые изложены в сертификатах к продукции, а также в соответствии с Информационным письмом МЗ 59 Украины №05.4.1/1670 «Бактериологический контроль питательных сред», Киев, 2000. Иммунологические методы исследования Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови Концентрацию TGF-β в сыворотке крови оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием диагностической иммуноферментной тест-системы R&D Systems, Inc., IL-17 – при помощи тест-системы производства Life Science Inc., IFN-γ – используя тест систему производства PBL Biomedical Laboratories, IL-10 и IL-4 – при помощи диагностических тест-систем производства фирмы Abcam. Принцип метода на примере определения TGF-β заключается в следующем. На первой стадии анализа исследовательские и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизованными антителами. TGF-β, который содержится в образцах, связывается с иммобилизованными антителами (с добавлением буферного раствора). Материал, который не связался, удаляется путем отмывки. TGF-β, который связался с антителами, взаимодействует при инкубации с коньюгатом (поликлональные антитела к TGF-β коньюгированные с пероксидазой хрена). Несвязавшийся коньюгат удаляется путем отмывки. На третьей стадии связавшийся коньюгат №1 взаимодействует при инкубации с коньюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количество связавшегося коньюгата № 2 определяют в цветной реакции с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода 60 и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением раствора стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм на иммуноферментном анализаторе. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству присутствующего в образце TGF-β. Диапазон измеряемых концентраций составляет 0–2000 пг/мл. Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), проводилось стандартным методом преципитации 3,5 % раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) (м.м. 6000) (Applichem Gmb) с последующей спектрометрией, в единицах оптической плотности (е. о. п.) по методике, описанной в монографии [170]. Для этого сыворотку крови крыс разводили изотоническим раствором NaСl в соотношении 1:25. Разбавленную сыворотку смешивали с 3,5 % раствором ПЭГ в соотношении 1:1. Для проведения реакции преципитации пробирки оставляли на 18 часов в холодильнике при температуре 4º С, потом центрифугировали на протяжении 15-ти минут при 1500 об./мин и сливали надосадочную жидкость. Далее осадок растворяли в 2,5 мл 0,1 % NaОН, ресуспендировали и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Пробы замеряли на спектрофотометре при длине волны 280 нм, в качестве контроля использовали 0,1 % раствор NaОН. Уровень ЦИК выражали в МЕ. Определение уровня общего комплемента в сыворотке крови Комплементарную активность сыворотки крови определяли по следующей методике [170]. 61 Подготовка сыворотки для исследования. Забор крови проводили без антикоагулянтов, пробы выстаивались 1 час при комнатной температуре, центрифугировались (10 минут при 1000 g), во время чего отделялась сыворотка. Титрование комплемента. Исследуемая сыворотка разводилась рабочим буфером в отношении 1:2. Разведенную сыворотку в количестве 0,5 мл смешивали с 2,55 мл рабочего буфера, что соответствует разведению 1:12,2. В остальных пробирках готовили ряд разведений в соответствии с таблицей 2.1. Таблица 2.2 Схема титрования комплемента Номера пробирок 1 Разведение 2 3 12,2 15,2 18,5 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24,5 30,5 38,0 47,5 59,5 75 93 0% 100% гемо- гемо- лиза лиза (1: 20) Реагенты (мл) Рабочий Буфер Сыворот-ка 1:12,2 Рабочий Буфер Дист. Вода - 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 1,6 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 - - - - - - - - 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,4 0,4 - - - 0,8 0,8 - - - - 1,2 0,8 0,8 0,8 0,8 смешивают и переносят по 1,6 мл в последующие пробирки Гемолитическая система В пробирку № 12, где должен быть 100 % гемолиз, добавляли следовые количества сапонина. Все пробы инкубировали на водяной бане в 62 течение 45 минут при 37° С. Затем центрифугировали 10 минут при 800 g и измеряли оптическую плотность надосадочной фракции в 11-й пробирке (0% гемолиз). Обработка результатов. Результаты определения оптической плотности корригируют по значению оптической плдотности контроля (пробирки 11 и 12). Рассчитывали процент гемолиза. Для построения графической зависимости использовали логарифмическую бумагу. Значение каждого разведения сыворотки (12,2, 15,2, 18,5 и т. д.) отмечали на оси абсцисс. На оси ординат откладывали соответствующий процент гемолиза. Получаемые точки соединяли и по графику тут же определяли разведение сыворотки, при котором наступает 50% гемолиз. Число гемолитических единиц в 1 мл сыворотки рассчитывали по формуле: СН50/мл=a/x а — фактор первоначального разведения сыворотки (равен 12,2), х—объем сыворотки, вызывающий 50% гемолиз. Определение фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата На протяжении 1-2 минут массировали животному живот. Затем отбирали жидкость из брюшной полости и вносили ее в пенициллиновые флаконы с покровными стеклышками и фосфатно-солевым буфером. Флаконы с жидкостью ставили на один час в термостат при температуре 37º С. Отделение макрофагов от других клеток осуществляли за счет их прилипающей способности к стеклу. Жидкость отбирали, стеклышки промывали изотоническим раствором NaCl и добавляли суспензию латекса в концентрации 3 х 106 мл или культуры Candida albicans с определенной концентрацией микробных клеток по методике, описанной в монографии [170]. 63 Снова выдерживали в термостате при температуре 37º С на протяжении 30-ти минут. Затем стеклышки доставали, промывали, высушивали, фиксировали клетки метанолом и окрашивали по методу Романовского-Гимзы. Определение фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов проводили по подсчету фагоцитарного числа - индекса Райта (ИР) и фагоцитарного индекса - индекса Гамбургера (ИГ). При микроскопическом исследовании окрашенных препаратов подсчитывали 200 макрофагов или нейтрофилов, регистрируя количество фагоцитирующих клеток (фагоцитарное число, ФЧ), а также количество поглощенных ими микробных тел или латексных частиц (фагоцитарный индекс, ФИ). Определение антител к Candida albicans Антитела к Candida albicans выявляли при помощи тест–системы CAND-TECTM. Принцип измерения состоит в том, что частицы латекса одинакового размера, покрытые специфическими антителами к Candida, будут агглютинировать в присутствии антигена Candida. В данном случае чувствительный латекс покрыт кроличьими антителами к Candida. В ходе измерения одновременно идет постановка позитивного и негативного контроля наравне с исследуемой сывороткой для проверки корректной работы системы. Образцы считаются позитивными при наличии агглютинации латекса. Статистические методы Статистическую обработку полученных количественных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Office 2010, а также программы Biostat 2003. Проверку статистических гипотез в 64 группах проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, согласно современным требованиям к проведению анализа медицинских данных. 65 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Раздел низкодозового 3.1 Влияние рентгеновского фракционированного облучения на тотального показатели иммунологической реактивности. В целом, облучение представляет собой сложный процесс организма, в котором задействованы межклеточные реакции в иммунной системе и передача сигналов в иммуннокомпетентных клетках [2, 3, 47, 48]. Подраздел 3.1.1. Содержание цитокинов, отвечающих за поляризацию Th1/Th2-специфического иммунного ответа, в сыворотке крови. Нормальное функционирование иммунной системы возможно только за счет поддержания определенного баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Изменения в экспрессии и продукции цитокинов часто являются маркером воздействия неблагоприятных факторов на иммунологическую реактивность. Посредством цитокинов гомеостатическая система организма реализует свою реакцию на внешнее воздействие. Поэтому исследования экспрессии генов и продукции цитокинов могут дать информацию о состоянии иммунологической реактивности и о патологических процессах, происходящих в иммунной системе и в организме. Сегодня мы имеем возможность оценивать экспрессию генов интерлейкинов, которые, с одной стороны, продуцируются разными субпопуляциями Т-хелперов (Thl и Th2), а с другой – осуществляют регуляцию различных эффекторных популяций иммунокомпетентных клеток: интерлейкины Th1 – эффекторов ГЗТ, Th2 – антителопродуцентов [19, 46, 47, 51]. Целью данного раздела исследования была проверка предположения о том, что системный рост уровней TGF, индуцированный низкими дозами 66 фракционированного рентгеновского излучения, в комплексе с повышением синтеза IL-10, создает условия для поляризации CD4+-T-эффекторных механизмов специфического иммунного ответа в направлении Th1/Th2. В ходе исследования иммунологической реактивности в ответ на фракционированное рентгеновское облучение была проанализирована динамика цитокинового профиля, отвечающего за поляризацию Th1/Th2специфического иммунного ответа (табл. 3.1.1). Таблица 3.1.1 Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели иммунологической реактивности крыс Показатель TGF-β IL-10 IFN-γ IL-4 Ед. изм. пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл Сутки эксперимента 1 2 3 10 Конт17 28 роль M 986,21 1212,41 1347,81 1319,5 829,21 211,1 198,1 m 185 229 275,9 362,4 396,2 18,8 32,3 M 4,7 8,3 5,1 39,91 21,81 3,1 3,1 m 1,2 3,9 2,4 6,6 10,4 1,6 0,6 M 18,8 16,4 10,61 16,1 19,6 23,8 20,3 m 6,7 7,2 6,6 5,3 5,4 7,7 8,5 M 32,6 29,7 29,1 21,11 32,6 33,2 35,8 m 4,7 5,8 6,7 2,6 4,3 5,1 4,2 Примечание: 1 - р<0,05, по сравнению с интакными животными. После облучения в выбранном режиме выраженное и стабильное повышение сывороточного уровня TGF-β наблюдалось на протяжении, по крайней мере, 17-ти суток. Максимальные уровни этого показателя, более чем в 6 раз превышающие его значение у интактных животных (198,1±32,3 пг/мл), отмечены на 3-и и 10-е сутки после облучения (1347,8±275,9 и 1319,5±362,4 пг/мл, соответственно). 67 Кроме того, к параметрам цитокинового профиля, колебания которых были достоверными, принадлежит и уровень IL-10, рост которого зафиксирован на 10-е (37,9±6,56 пг/мл) и 17-е (21,8±10,4 пг/мл) сутки исследования по сравнению со значением у интактных крыс (3,1±0,6 пг/мл). Приведенные выше данные свидетельствуют о наличии условий для угнетения индукции основных эффекторных механизмов (Th 1, Th2). Однако, достоверное снижение уровня одного из маркерных цитокинов Th1лимфоцитов – IFN-γ – наблюдалось лишь на 3-и сутки (10,6±6,6 пг/мл) по сравнению с контрольными значениями (20,3±8,5 пг/мл). Как указывалось, Th2-лимфоциты являются преимущественными продуцентами противовоспалительных цитокинов, к которым относится и IL-4, угнетение продукции которого наблюдалось на 10-е сутки (21,1±5,6 пг/мл против 35,8±4,2 пг/мл в контроле). В конце 4-й недели наблюдения существенных отличий при сравнении с показателями интактных животных не отмечалось. Местная продукция IL-4 Th2-клетками ведет к сильной клональной пролиферации и экспансии активированных В-клеток. Он выступает в качестве антагониста IFN-γ при воздействии на макрофаги, Т-хелперы [19, 47, 48]. Таким образом, существенный интерес представляет изучение в этих условиях клеточных и гуморальных факторов неспецифической иммунологической реактивности [19, 47, 48]. Раздел 3.1.2. Фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов. Для исследования параметров клеточного звена неспецифической реактивности нами были взяты показатели активности фагоцитирующих клеток, динамика которых представлена в таблице 3.1.2, установлено, что 68 после облучения в выбранном режиме фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов на протяжении первой недели наблюдения имела лишь тенденцию к снижению, и только на 10-е сутки достигла достоверной разницы по сравнению с контрольной группой (41,7±3,9% против 52,8±5,1%, соответственно). При этом фагоцитарное число макрофагов достоверно снижалось по сравнению с интактной группой уже на 3-и сутки (3,9±0,3 ед. против 9,5±0,8 ед. в контроле), а минимальный его уровень наблюдался на 10-е сутки (3,2±0,4 ед.) с последующим восстановлением до нормальных значений. Таблица 3.1.2 Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели клеточного звена неспецифического иммунного ответа крыс Показатель ФИ мФ ФЧ мФ ФИ нФ ФЧ нФ Ед. изм. % ед % ед Сутки эксперимента Конт- 10 17 28 роль 46,8 41,71 49,3 51,9 52,8 9,6 4,5 3,9 2,3 4,7 5,1 9,1 8,3 3,91 3,21 7,7 8,5 9,5 m 0,7 1,2 0,3 0,4 1,3 0,9 0,8 M 57,4 55,8 53,61 44,71 57,6 60,4 62,8 m 6,1 8,3 4,4 4,1 5,9 4,2 5,4 M 7,3 6,8 5,71 5,21 7,4 8,3 8,5 m 1,2 2,3 2,3 0,4 1,5 1,3 0,9 1 2 3 M 48,6 43,2 m 4,2 M Примечание: 1 - р<0,05, по сравнению с интактными животными. Что касается фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа нейтрофилов, то здесь динамика была более выраженной. Так, достоверного снижения количество фагоцитирующих нейтрофилов (ФИнф) облученных 69 крыс достигло на 3-и сутки (53,6±4,4%) по сравнению с контролем (62,8±5,4%) и минимума – на 10-е сутки (44,7 ± 4,1 %). Для показателя поглотительной способности нейтрофилов (ФЧнф) была характерна та же динамика: 5,7±2,3 против 8,5±0,9 ед. в группе интактных животных на 3-и сутки и 5,2±0,4 против 8,5±0,9 ед. – на 10-е. К 17-м и 28-м суткам эксперимента значения вышеуказанных показателей также восстанавливались до контрольных. Макрофаги, эффекторных активированные клеток в выполняют функции повреждающих реакциях IFN-γ, защитных и воспалительного процесса. При этом макрофаги синтезируют и секретируют широкий спектр цитокинов, обладающих эффекторной и регуляторной активностью, расщепляющие ферменты и супероксидные радикалы. Регулирующим цитокином для макрофагов является IL-10 – антагонист IFNγ. Его продуцентами могут быть моноциты/макрофаги, T-клетки. Ингибирующим цитокином является и TGF-β, эффекты которого зависят как от его концентрации, так и от присутствия других цитокинов [59]. Раздел 3.1.3. Активность комплемента и уровень ЦИК в сыворотке крови. Для характеристики состояния гуморального звена неспецифической реактивности положены показатели активности системы комплемента сыворотки крови, колебания которой на протяжении всего периода наблюдений имели лишь характер тенденций (были статистически недостоверными) по сравнению с этим показателем у контрольных животных, за исключением 3-х суток (74,3±7,6 гем. ед. против 96,6±8,1 гем. ед.). Как показано в таблице 3.1.3, недостаточный уровень функционирования макрофагов и нейтрофилов отразился и на механизмах 70 элиминации патогена, что проявилось в повышении уровня ЦИК с достоверным максимумом на 3-и (97,8±9,6 МЕ) и на 17-е сутки - 95,0±4,5 МЕ, при 85,0±5,3 МЕ в контрольной группе. Таблица 3.1.3 Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели гуморального звена неспецифического иммунного ответа крыс Показатель ЦИК Сутки эксперимента Конт- 2 3 10 M 91,3 96,2 97,81 95,01 m 10,1 12,6 9,6 4,5 15,3 5,4 5,3 гем. M 85,6 78,9 74,31 94,8 88,9 94,7 96,6 ед. 9,2 17,9 7,6 8,1 10,2 6,9 8,1 m 17 28 роль 1 МЕ Комплемент Ед. изм. 110,51 87,2 85,0 Примечание: 1 - р<0,05, по сравнению с интактными животными. Резюме. Фракционированное рентгеновское облучение приводит к системному росту уровня TGF-β, что, в комплексе с усилением синтеза IL-10, создает условия для угнетения эффекторных механизмов Th1/Th2- специфического иммунного ответа, проявляющегося снижением уровней сывороточных цитокинов IFN-γ и IL-4. Наряду с этим наблюдается нестойкий, носящий преимущественно характер тенденций, дефицит в системе неспецифической иммунной защиты. 71 Раздел 3.2. Нарушения иммунологической реактивности под влиянием предварительного низкодозового фракционированного рентгеновского облучения тотального при остром экспериментальном генерализованном кандидозе. Описанные в фракционированного указывают на предыдущем тотального признаки разделе результаты рентгеновского скрытой влияния облучения функциональной на крыс недостаточности неспецифической реактивности иммунной системы, что при дополнительной функциональной нагрузке, генерализованном в нашем кандидозном случае сепсисе, – экспериментальном может усиливать дефект антиинфекционной резистентности в различной степени выраженности. Внутривенное введение штамма C. albicans (ATCC 885 - 653) в сублетальной дозе (2,5х106 КОЕ/мл) интактным крысам линии Вистар обеспечивало развитие персистенцией септического возбудителя во состояния внутренних с диссеминацией органах. и Элиминация возбудителя, по результатам бактериологического исследования внутренних органов, наблюдалась на протяжении 5-ти – 7-ми суток с момента инфицирования. Уровень летальности при этой модели не превышает 3%. Раздел 3.2.1. Содержание цитокинов, отвечающих за поляризацию Th1/Th2-специфического иммунного ответа, в сыворотке крови. В результате иммунологических микробиологических, исследований нами были серологических получены и результаты, представленные в таблицах 3.2.1 – 3.2.5. Исследование показателей сывороточного цитокинового профиля (табл. 3.2.1) позволило продемонстрировать определенные отличия в процессах индукции Th-эффекторных механизмов формирования специфического иммунного ответа. 72 Таблица 3.2.1 Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на уровень сывороточных цитокинов у крыс на модели острого диссеминированного кандидоза Показатель Сутки эксперимента Ед. изм Группы 1 2 II пг / мл III M 95,8 m 25,2 II пг/ мл IL-10 пг/ мл IL-4 17 пг/ мл III 176,4 91,7 1 28 426,2 212,8 49,6 130,41 11,7 24,9 127,21; 1 роль 1 181,7 23,8 7,5 48,9 16,4 4,5 1; 116,6 85,61; 63,8 20,3±8,5 2 2 30,9 2 67,41;2 34,9 9,1 149,91 215,81 273,61 2 1 1 35,7 2,21; 49,3 47 42,9 M 2,41;2 3,11 1,81 17,71;2 4,12 1,1 6,31 1,9 0,3 10,7 17,6 0,4 18,91 14,1 2,6 16,41 3,6 3,4 11,11 4,6 M 90,51 99,11 148,31 102,11 88,41 m 12,2 16,4 2,5 M 51,41;2 85,61;2 92,11;2 57,91;2 2 8,9 3,7 17,7±4,1 241,3 89,3 27 10,5 1;2 23,9 26,3 51,81; 14,7 18,7 m M III m II 5,6 M 83,31 m II 19,7 M 79,51 m III 1 M 47,71;2 78,71;2 99,51;2 m IL-17 10 (M±m) 1 IFN-γ 3 Конт- 2 0,9 5,7 2,4 62,3 3,1±0,6 1 3,6 6,6 35,8±4,2 1; 82,7 79,3 2 1;2 m 14,5 6,4 10,3 3,3 2,5 7,1 1 Примечания: – достоверность отличий от интактной группы животных; 2 – достоверность отличий от группы животных, не подвергавшихся облучению. Уровень IFN-γ у необлученных инфицированных крыс (II группа) прогрессивно возрастал на протяжении первой недели. На 1-е сутки он 73 составлял 95,8±25,2 пг/мл, на 2-е – 176,4±91,7 пг/мл, на 3-и – 426,2±212,8 пг/мл. На 10-е сутки он снижался до 181,7±48,9 пг/мл, на 17-е – восстанавливался до нормы – 23,8±16,4 пг/мл, а на 28-е сутки был ниже нормы – 7,5±4,5 пг/мл против 20,3±8,5 пг/мл. У облученных и инфицированных крыс повышение уровня IFN-γ было менее выражено, но он оставался статистически достоверно больше значений контрольной группы (интактных крыс) (табл. 3.2.1). У необлученных животных рост уровня IL-17 зафиксирован уже в первые трое суток после инфицирования. На 1-е сутки он составлял 79,5±5,6 пг/мл, на 2-е – 130,4±11,7 пг/мл, на 3-и – 127,2±34,9 пг/мл. В последующем он снижался: на 10-е сутки – до 67,4±9,1 пг/мл, на 17-е – до 51,8±8,9 пг/мл. На 28-е сутки он составлял 14,7±3,7 пг/мл при норме 17,7±4,1 пг/мл. У облученных крыс продукция IL-17 оставалась на более высоком уровне на протяжении, по крайней мере, четырнадцати суток после инфицирования. На 1-е сутки уровень цитокина в сыворотке крови составлял 83,2±18,7 пг/мл, на 2-е – 149,8±27 пг/мл, на 3-и – 215,7±49,3 пг/мл, на 10-е – 273,5±47 пг/мл, на 17-е – 241,2±42,9 пг/мл. Значения показателя оставались высокими и на 28-е сутки – 89,2±35,7 пг/мл. Уровень IL-10, который, по данным многих исследований [59-63], положительно коррелирует со степенью тяжести течения системного кандидоза, у облученных животных заметно возрастал после инфицирования. На 2-е сутки он составлял 10,7±17,6 пг/мл, на 3-и – 18,9±14,1 пг/мл, на 10-е – 16,4±3,6 пг/мл, на 17-е – 11,1±4,6 пг/мл, с восстановлением до нормы на 28-е сутки – 5,7±2,4 пг/мл против 3,1 ± 0,6 пг/мл у интактных крыс. В то же время у необлученных животных повышение этого показателя наблюдалось лишь на 10-е сутки после инфицирования – 17,7±2,6 пг/мл – и фактически совпадало с периодом клинической ремиссии. 74 Что касается динамики IL-4, то у необлученных животных на фоне кандидозного сепсиса его уровень также прогрессивно нарастал на протяжении первой недели с максимальными значениями на 3-и сутки – 148,3±16,4 пг/мл – и на 10-е – 102,1±2,5 пг/мл. У облученных крыс рост уровня IL-4 был менее выраженным: на 3-и сутки он составлял 92,1±10,3 пг/мл, на 10-е – 57,91±3,3 пг/мл. Раздел 3.2.2. Фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов. У необлученных крыс при генерализованнм кандидозном сепсисе (II группа) наблюдалась стремительная стимуляция фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов по сравнению с интактной группой на протяжении 17-ти суток эксперимента, достигая максимума для ФИмф на 3-и сутки (91,2±11,1%), а для ФЧмф – на 17-е (15,7±1,6 ед.). У облученных и инфицированных животных (III группа) наблюдалось уменьшение процента активных макрофагов с первых же суток наблюдения по сравнению с необлученными инфицированными крысами (II группа). Еще более заметными были изменения со стороны поглотительной способности макрофагов, показатели которых были ниже показателей не только группы сравнения (II группы) (4,2±0,7 ед. против 11,3±2,6 ед.), но и интактных животных (4,2±0,7 ед. против 9,5±0,8 ед.) (табл. 3.2.2). Аналогичная динамика прослеживалась и для функциональной активности нейтрофилов. Наблюдалось закономерное нарастание как поглотительной активности фагоцитов, так и количества фагоцитирующих клеток при диссеминированном кандидозе у необлученных крыс в течение первых 10-ти дней, достигая максимума на 3-и сутки для ФИнф (83,4±8,1 против 79,7±8,2%), а для ФЧнф – на 17-е (14,1±1,7 ед. против 11,4±1,3). 75 Таблица 3.2.2 Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели неспецифической иммунологической реактивности крыс на модели острого диссеминированного кандидоза Показатель Ед. изм Группы II ФИ Мф % III ФЧ нФ ед. 3 10 17 M 69,61 m 7,2 75,41 8,3 91,21 11,1 74,71 7,1 M 37,41;2 53,22 57,12 55,82 6,9 7,4 4,6 M 11,3 12,51 14,81 13,41 m 2,6 1,8 2,3 1,5 M 4,21;2 5,91;2 6,81;2 7,41;2 m 0,7 M 69,81 II m 3,5 M 61,82 III m 7,3 M 10,81 II m 1,6 1,2 76,81 8,5 70,71 6,6 13,31 1,8 1,5 83,41 8,1 79,71 8,2 14,11 1,7 0,6 73,41 6,5 65,42 5,6 12,41 1,4 10,11;2 11,41;2 7,21;2 III % 2 5,6 ед. ФИ нФ 1 m II ФЧ мФ Сутки эксперимента III M 9,8 28 Контроль (M±m) 57,8 40,31 6,1 4,3 52,8±5,1 49,7 47,32 2 5,4 15,7 1 1,6 7,91; 2 4,7 9,1 0,8 9,5±0,8 8,21 0,9 0,6 69,5 58,1 6,8 5,7 62,8±5,4 62,2 51,41 6,4 5,5 9,2 8,8 1,1 0,7 8,5±0,9 10,4 9,3 1 m 1,2 1,0 1,3 0,7 0,7 0,5 Примечания: 1 – достоверность отличий от интактной группы животных; 2 – достоверность отличий от группы животных, не подвергавшихся облучению. * - р<0,05; ** - р<0,01. 76 Относительная недостаточность активации фагоцитоза нейтрофилов, которая наблюдалась у облученных и инфицированных животных (III группа) относительно аналогичных показателей у необлученных инфицированных крыс (II группа), достигала статистически достоверных значений на 10-е сутки. При этом ФИнф составлял 65,4±5,6% и 73,4±6,5% соответственно. Раздел 3.2.3. Активность комплемента, уровень ЦИК, титр специфических иммуноглобулинов к C. albicans в сыворотке крови и степень контаминации внутренних органов. Для характеристики состояния гуморального звена неспецифической реактивности положены показатели активности системы комплемента уровень циркулирующих иммунных комплексов, специфических антител и показатели степени обсемененности внутренних органов C. albicans. У необлученных животных (табл. 3.2.3) с диссеминированным кандидозным сепсисом (II группа) наблюдалось нарастание уровня ЦИК со 2-х суток (97±8,8 МЕ) и на протяжении всего периода наблюдения. У облученных и инфицированных крыс (III группа) наблюдалось статистически значимое различие по сравнению с показателями группы сравнения с максимальными значениями на 10-е (154±7,1 МЕ) и 17-е (166±15,7 МЕ) сутки, что, по-видимому, связано с нарушением функции элиминации со стороны фагоцитарных клеток и системы комплемента. Так, на 10-е сутки в облученных и инфицированных животных содержание ЦИК составляло 154±7,1 МЕ при 131±8,4 МЕ у необлученных инфицированных крыс и 85±5,3 МЕ у интактных. Комплементарная активность сыворотки крови снижалась в обеих группах инфицированных животных, по-видимому, за счет усиленного потребления для инактивации циркулирующих иммунных комплексов, а 77 также элиминации патогена по альтернативному пути. Минимальные значения активности комплемента наблюдались на 10-е сутки эксперимента и составляли 39,8±2,9 гем. ед. в группе облученных животных с кандидозным сепсисом по сравнению с 58,8±4,7 гем.ед. у необлученных инфицированных крыс при 96,6±8,1 гем.ед. у интактных (табл. 3.2.3). Таблица 3.2.2 Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на уровень циркулирующих иммунных комплексов и систему комплемента крыс на модели острого диссеминированного кандидоза Показатель Ед. Груп- изм пы II ЦИК МЕ III Комплемент II гем. ед. III Сутки эксперимента 1 2 3 10 M 88 971 1101 1311 m 9,3 8,8 10,5 8,4 M 1051;2 1291;2 1451;2 1541;2 m 9,8 11,6 14,9 7,1 M 91,4 74,31 62,61 58,81 m 8,7 7,8 6,9 4,7 M 78,1 m 1;2 8,1 63,5 1;2 6,6 54,4 1;2 5,4 39,8 1;2 2,9 Конт17 142 1 13,2 166 1;2 15,7 68,7 1 7,8 28 роль (M±m) 1051 9,4 85±5,3 1491;2 16,9 89,4 9,4 96,6±8,1 48,5 69,71; 1;2 2 5,6 7,7 78 Примечания: животных; 2 – 1 – достоверность отличий от интактной группы достоверность отличий от группы животных, не подвергавшихся облучению. У облученных крыс наблюдалась 100% генерализация инфекционного процесса как на 7-е сутки, так и на 14-е сутки (табл. 3.2.4). Уровень элиминации возбудителя, о котором судили по отсутствию положительной динамики степени обсеменения внутренних органов, свидетельствует об усугублении клинического течения инфекции, индуцированном фракционированным облучением, и даже наблюдалась летальность в данной группе животных. Таблица 3.2.4 Результаты бактериологического исследования течения кандидозного сепсиса у облученных и необлученных крыс % животных с различной Группы животных ІI (n=6) III (n=6) Сутки % животных с степенью обсеменения генерализованной внутренних органов формой (КОЕ log2/г-1) 1-20 21-50 51-100 >100 7 дней 100 0 0 0 100 14 дней 66,71 0 0 25 75 7 дней 100 0 0 0 100 14 дней 100 0 0 0 100 Примечание: 1 - р≤0,05 по сравнению с интактными животными; 79 При исследовании уровня специфических антител к Candida albicans было установлено, что на седьмые сутки инфекции титры специфических антител были вчетверо ниже у облученных крыс III группы, чем у необлученных животных II группы, – 1:20 против 1:80, на четырнадцатые сутки различия в титрах антикандидозных антител были вдвое (табл. 3.2.5). Таблица 3.2.5 Сравнительный анализ динамики нарастания титров специфических антител к Candida albicans у облученных и необлученных крыс Титры Необлученные, ІI Облученные, ІІI антител Группа Группа 7 сутки 1:80 1:20 14 сутки 1:160 1:80 Таким образом, при декомпенсация нарастала. инфекционном процессе неспецифической По-видимому, реактивности усугубление у функциональная облученных имеющегося крыс дисбаланса в цитокиновом соотношении IFN-γ/IL-4 привело к негативным последствиям – диссеминации инфекции и ухудшению клинической картины. Резюме. У необлученных животных при кандидозном сепсисе концентрации цитокинов IL-4 и IFN-γ прогрессивно нарастали на протяжении первой недели, что соответствует параметрам обычного развития инфекционного процесса. Напротив, у облученных крыс их рост был менее выраженным, что, вероятно, указывает на депрессивное воздействие выбранного режима облучения на противоинфекционную защиту. У инфицированных облученных крыс наблюдались гораздо более высокие уровни циркулирующих иммунных комплексов по сравнению с 80 необлученными животными, что, по всей видимости, связано с нарушением функции элиминации со стороны фагоцитарных клеток и системы комплемента. Раздел 3.3 Корригирующая эффективность метилглюкамина акридонацетата и иммунологической дипептида глутамил-триптофана реактивности облученных в отношении крыс с острым экспериментальным диссеминированным кандидозом. Учитывая отсутствие у облученных животных признаков достаточной активации моноцитарно-макрофагальной системы и усугубление дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов в ответ на кандидозную инфекцию, для коррекции выявленных нарушений антиинфекционной резистентности, индуцированных фракционированным облучением, были выбраны препараты – метилглюкамина акридонацетат и дипептид глутамилтриптофан. Метилглюкамина акридонацетат является низкомолекулярным индуктором α-, β- и γ-интерферонов в органах и тканях, богатых лимфоидными элементами. Этот препарат обладает широким спектром биологической активности, что используется для повышения эффективности терапии хронических инфекционных заболеваний, однако, конкретные механизмы реализации его иммунотропного потенциала изучены недостаточно. Суточная доза препарата в наших исследованиях составляла 10 мг/кг массы тела. В качестве иммуномодулятора сравнения использовали дипептид глутамил-триптофан – синтетический аналог тимотропных препаратов зобной железы, который способствует дифференцировке CD4 +-лимфоцитов и нормализует соотношение их эффекторных и регуляторных популяций. 81 Кроме того, препарат имеет радиопротекторные свойства и способность угнетать развитие свидетельствующее о серотонинового и его эффективности возможной гистаминового в отека, условиях гиперергического воспаления, индуцированного длительной поляризацией адаптивного иммунного ответа. Суточная доза препарата в наших исследованиях составляла 1 мкг/кг массы тела. Раздел дипептид 3.3.1. Влияние метилглюкамина глутамил-триптофана на акридонацетата концентрацию и сывороточных цитокинов. Результаты исследования влияния метилглюкамина акридонацетата на уровень сывороточных цитокинов при коррекции патогенетических нарушений течения инфекции Candida albicans сведены в таблице 3.3.1 Таблица 3.3.1 Влияние метилглюкамина акридонацетата на уровень сывороточных цитокинов при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс Группы IFN-γ, пг/мл IL-17, пг/мл IL-10, пг/мл IL-4, пг/мл IFN-γ/ IL-10 V I M 28,43 16,1 VI II VII III VIII IV 282,33 181,7 252,33 116,6 44,33 20,3 30,9 4,7 m 10,1 5,3 17,8 48,9 22,5 M 30,4 42,2 40,5 67,4 218,23 273,5 30,63 17,7 m 12,6 5,6 30,4 9,1 32,5 47,2 9,5 4,1 M 45,4 37,9 11,2 17,7 23,13 16,4 2,0 3,1 m 8,9 7,8 2,6 5,6 3,6 1,3 0,6 M 29,7 21,1 122,3 102,1 72,23 57,9 41,2 35,8 m 10,2 2,6 22,5 2,5 7,3 3,3 5,1 4,2 0,6 0,4 25,2 10,3 10,9 7,1 22,2 6,6 6,6 8,5 82 Примечание: 3 - р<0,05, по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции. К однозначно негативным последствиям применения метилглюкамина акридонацетата у облученных животных нужно отнести усуглубление имеющегося дисбаланса в цитокиновом профиле: соотношение IFN-γ/ІL-10 у инфицированных животных (группа VIІ) возросло с 7,1 до 10,9, за счет умеренного увеличения уровня IL-10 – до 23,1±5,6 пг/мл против 16,4±3,6 пг/мл в контроле (в 1,4 раза)– и повышения уровня IFN-γ до 252,3±22,5 пг/мл по сравнению со 116,6±30,9 пг/мл у контрольных животных (т.е.в 2,2 раза). У неинфицированных животных (V группа) этот эффект был менее заметным: соотношение IFN-γ/IL-10 возросло с 0,4 до 0,6 за счет повышения уровня IFN-γ до 28,4±10,1 пг/мл с 16,1±5,3 пг/мл у крыс без иммунокоррекции. Кроме того, возрастал уровень IL-4 у инфицированных крыс, получавших метиглюкамина акридонацетат (72,2±7,3 пг/мл против 57,9±3,3 пг/мл в контроле), при том, что у животных без коррекции он составлял 21,1±2,6 пг/мл против 29,7±10,2 пг/мл. Это, очевидно, только содействовало углублению дисбаланса в цитокиновом профиле. При этом ожидаемого уровня стимуляции функций фагоцитов у инфицированных облученных животных не наблюдалось. При изучении действия оппозитного иммуномодулятора - дипептид глутамил-триптофана мы получили данные, указывающие на то, что к наиболее существенным положительным изменениям в иммунном статусе облученных животных на фоне его введения (табл. 3.3.2) можно отнести наличие тенденции к уменьшению дисбаланса в цитокиновом профиле, более выраженное у облученных животных с генерализованным сепсисом: соотношение IFN-γ/IL-10 у инфицированных животных уменьшилось с 7,1 до 6,1, за счет увеличения уровня IL-10 до 30,1±12,6 пг/мл против 16,4±3,6 пг/мл 83 в контроле и умеренного повышения уровня IFN-γ – до 182,2±8,9 пг/мл против 116,6±9,6 пг/мл в контроле. Аналогичный эффект наблюдался и у необлученных животных: соотношение IFN-γ/IL-10 уменьшилось с 10,3 до 5,8 за счет достоверного повышения уровня IL-10 к 35,3±2,2 пг/мл от 17,7±2,1 пг/мл в контроле и умеренного повышения уровня IFN-γ до 203,6±5,1 пг/мл со 181,7±4,1 пг/мл в контроле. Таблица 3.3.2 Влияние дипептида глутамил-триптофана на уровень сывороточных цитокинов при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс Группы IX I X II XI III XII IV M 32,13 16,1 203,1 181,7 182,23 116,6 30,2 20,2 15,6 5,3 15,6 48,9 8,9 30,9 15,8 8,5 M 20,33 42,2 45,3 67,4 103,4 273,5 14,5 17,7 5,6 23,4 9,1 32,6 47,2 5,9 4,1 M 50,4 37,9 35,33 17,7 30,13 16,4 7,23 3,1 IFN-γ, пг/мл m IL-17, пг/мл m 17,6 IL-10, пг/мл m 15,6 6,6 10,4 2,6 12,6 3,6 1,3 0,6 M 15,2 21,1 89,2 102,1 41,23 57,9 20,5 35,8 m 6,7 2,6 15,4 2,5 15,9 3,3 16,4 4,2 0,6 0,4 5,8 10,3 6,1 7,1 4,2 6,5 IL-4, пг/мл IFN-γ/ IL-10 Примечание: 3 - р<0,05, по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции. 84 Кроме того, у облученных и инфицированных животных, лечение дипептидом глутамил-триптофаном привело к уменьшению уровня IL-4 – 41,2±3,3 пг/мл против 57,9±3,7 пг/мл в контроле, у инфицированных животных без предварительного облучения – 89,2±3,8 пг/мл против 102,1±3,1 пг/мл, что, очевидно, свидетельствует о противовоспалительном эффекте препарата. Что касается продукции IL-17, то наблюдалось ее уменьшение у животных ХІ группы до 211±0,3 пг/мл против 273,5±3,9 пг/мл в контроле, (p < 0,05). Раздел 3.3.2. Влияние метилглюкамина акридонацетата и глутамил-триптофана на активность фагоцитов. При исследовании влияния метилглюкамина акридонацетата на показатели неспецифической иммунологической реактивности при инфекции Candida albicans мы получили результаты, приведенные в таблице 3.3.3. Таблица 3.3.3 Влияние метилглюкамина акридонацетата на показатели неспецифической реактивности при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс Группы ФИмф, % ФЧмф ФИнф, % ФЧнф V I VI II VII III VIII IV M 49,33 41,7 77,5 74,7 65,43 55,8 51,3 52,8 m 4,3 3,9 6,8 7,1 5,6 4,6 5,4 5,1 M 5,13 3,2 15,13 13,4 8,43 7,4 7,8 9,5 m 1,7 0,4 1,6 1,5 0,9 0,6 0,7 0,8 M 52,13 44,7 77,5 73,4 61,3 65,4 71,3 62,8 m 5,3 4,1 6,9 6,5 5,5 5,6 8,4 5,4 M 6,43 5,2 10,53 12,4 6,4 7,4 9,8 8,5 m 0,5 0,4 1,2 1,4 0,8 0,7 0,8 0,9 85 Примечание: 3 р<0,05, - по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции. У облученных акридонацетат, на животных, 7-е сутки которым после вводили метилглюкамина инфицирования наблюдалось статистически достоверное повышение уровня активации макрофагов: ФИ макрофагов был увеличен до 49,3±4,3% по сравнению с 41,7±3,9% у животных без иммунокоррекции, а ФЧмф у животных исследуемой группы было 5,1±1,7 ед. против 3,2±0,4 ед. у крыс контрольной группы. Влияние активность метилглюкамина макрофагов акридонацетата выражалось в на фагоцитарную статистически недостоверной тенденции к увеличению у необлученных и достоверном росте у крыс VII группы. Для необлученных крыс (VI группа) ФИмф составлял 77,5±6,8% против 74,7±7,1 % в контроле, ФЧмф – 15,1±1,6 ед. против 13,4±1,5 ед. Для облученных крыс (VIІ группа) ФИмф составлял 65,4±5,6% против 55,8±4,6% в контроле, ФЧмф - 8,4±0,9 ед. против 7,4±0,6 ед. Достоверное повышение фагоцитарной активности нейтрофилов под влиянием метилглюкамина акридонацетата было выявлено лишь у облученных крыс, не подвергавшихся инфицированию: ФИ нф – 52,1±5,3% против 44,7±4,1% в контроле, а ФЧнф – 6,4±0,5 ед. против 5,2±0,4 ед. В обеих группах инфицированных животных под влиянием метилглюкамина акридонацетата фагоцитарная активность нейтрофилов имела статистически недостоверную тенденцию к увеличению. У крыс с диссеминированным кандидозным сепсисом, получавших метиглюкамина акридонацетат, ФИнф составлял 77,5±6,9% против 73,4±6,5% у группы сравнения, а ФЧнф – 10,5±1,2 ед. против 12,4±1,4 ед. Аналогично, для облученных и инфицированных животных, леченных метилглюкамина акридонацетатом, 86 ФИнф составлял 61,3±5,5% против 65,4±5,6% в контрольной группе, ФЧнф – 6,4±0,8 ед. против 7,4±0,7 ед. При введении дипептид глутамил-триптофана фагоцитарная активность макрофагов статистически достоверно повышалась именно у облученных животных, которые имели наиболее низкий исходный уровень этого показателя. У облученных крыс без генерализованного сепсиса ФИмф составлял 54,7±4,2% против 41,7±3,9% в группе сравнения, ФЧмф - 7,1±0,8 ед. против 3,2 ± 0,4ед.; у облученных животных с инфекционным процессом ФИмф был 64,7±5,8% против 55,8±4,6%; ФЧмф – 10,3±1,1 ед. против 7,4±0,6. Аналогичный, но менее выраженный эффект стимуляции был у инфицированных необлученных животных: ФИмф составлял 85,8±7,9% против 74,7±7,1%, а ФЧмф – 16,5±2,1 ед. против 13,4±1,5 ед. (табл. 3.3.4). Таблица 3.3.4 Влияние дипептида глутамил-триптофана на показатели иммунологической реактивности при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс Группы ФИ, мф, % ФЧ, мф ФИ, нф, % ФЧ, нф IX I 54,73 41,7 M X II XI III XII 77,6 52,8 85,83 74,7 64,73 55,8 IV m 4,2 3,9 7,9 7,1 5,8 4,6 5 5,1 M 7,13 3,2 16,53 13,4 10,33 7,4 7,2 9,5 m 0,8 0,4 2,1 1,5 1,1 0,6 1,5 0,8 54,83 44,7 79,8 72,4 74,73 65,4 77,6 62,8 M m 4,5 4,1 6,3 7,1 7,8 5,6 5,0 5,4 M 6,13 5,2 14,3 12,4 10,33 7,2 7,2 8,5 m 0,7 0,4 2,4 1,2 1,1 0,7 1,5 0,9 Примечание: 3 - р < 0,05, по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции. 87 Дипептид глутамил-триптофан оказывал достоверное стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов во всех исследованных группах, кроме инфицированных необлученных крыс, которые имели наиболее высокий исходный уровень этого показателя. У облученных крыс, подлежавших коррекции глутамил-триптофаном, ФИнф составлял 54,8±4,5% против 44,7±4,1% в группе сравнения, ФЧнф – 6,1±0,7 ед. против 5,2±0,4 ед.; в группе инфицированных животных, предварительно не облученных, ФИнф был 79,8±6,3% против 72,4±7,1%, ФЧнф – 14,3±2,4 ед. против 12,4±1,2 ед.; у облученных и инфицированных крых ФИнф составлял 74,7±7,8% против 65,4±5,6%, ФЧнф – 10,3±1,1 против 7,2±0,7. Раздел 3.3.3. Влияние метилглюкамина акридонацетата и глутамил-триптофана на комплементарную активность, содержание ЦИК и титр специфических иммуноглобулинов к C. albicans в сыворотке крови и степень контаминации внутренних органов. Недостаточность достигнутого уровня стимуляции фагоцитарных функций подтверждается и стабильностью в концентрации ЦИК в обеих группах инфицированных животных. Так, концентрация ЦИК у всех крыс, учавствовавших в эксперименте, была достоверно выше по сравнению с интактными животными. У животных с кандидозным сепсисом без предварительного облучения, на фоне введения метилглюкамина акридонацетата, наблюдалось статистически недостоверное снижение ЦИК до 125,2±9,5 МЕ против 131,0±8,4 МЕ у животных без иммунокоррекции. У аналогичных, но предварительно облученных животных – уровень ЦИК составлял 148,4±11,0 МЕ против 154,0±7,1 МЕ в группе сравнения (табл. 3.3.5). 88 Таблица 3.3.5 Влияние метилглюкамина акридонацетата на показатели ЦИК и системы комплемента при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс Группы ЦИК, МЕ V I VI II VII III VII1 IV M 91,3 95,0 125,2 131,0 148,4 154,0 93,5 85,0 m 2,6 4,5 8,4 11,0 7,1 9,2 5,3 9,5 Комплемент, гем. M 89,7 94,8 67,23 58,8 45,63 39,8 101,4 96,6 Ед. 8,1 4,7 3,5 2,9 9,3 m 6,9 Примечание: 3 - р<0,05 5,7 по сравнению с животными, 8,1 не подвергавшихся иммунокоррекции. Метилглюкамина акридонацетат оказал негативное влияние и на активность комплемента в сыворотке крови в условиях сепсиса, как у животных, подвергшися предварительному облучению (45,6±3,5 гем. ед.), так и не подвергшихся (67,2±5,7 гем. ед.) (против 96,6±8,1 гем. ед. у интактных животных). На фоне введения дипептида глутамил-триптофана статистически достоверно снижалось количество циркулирующих иммунных комплексов в обеих группах инфицированных животных: 100,0±8,1 МЕ против 131,0±8,4 МЕ в Х группе и 123,8±9,7 МЕ против 154,0±7,1 МЕ в ХІ группе. В этих же группах наблюдалось повышение комплементарной активности сыворотки крови: 78,5±6,8 гем. ед. против 58,8±4,7 гем. ед. в Х группе и 61,5±6,3 гем. ед. против 39,8±2,9 гем. ед. в ХІ группе животных (табл. 3.3.6). 89 Таблица 3.3.6 Влияние дипептида глутамил-триптофана на показатели иммунологической реактивности при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс Группы IX I X II XI III XII IV ЦИК, M 84,3 91,7 100,03 131,0 123,83 МЕ m 7,4 4,5 8,1 8,4 9,7 7,1 7,4 Комплемент, M 98,4 94,8 78,53 58,8 61,53 39,8 94,2 96,6 гем.ед. 8,7 8,1 6,8 4,7 6,3 2,9 7,0 m Примечание: 3 154,0 90,8 85,0 6,3 8,1 - р < 0,05 по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции. Эффекторное звено системной противокандидозной защиты обеспечивается не только за счет активации фагоцитов, но и за счет стимуляции синтеза защитных антител (табл. 3.3.7). Таблица 3.3.7 Сравнительный анализ динамики нарастания титров специфических антител к Candida albicans у животных, которым вводили метилглюкамина акридонацетат и дипептид глутамил-триптофан Титры Антител 7 сутки Необлученные Облученные ІI VI Х ІІI VII ХІ группа группа группа группа Группа группа 1:80 14 сутки 1:160 1:80 1:160 1:20 1:40 1:80 1:640 1:1280 1:80 1:160 1:640 90 На 7-е сутки инфекционного процесса титры специфических антител были вчетверо ниже у облученных крыс III группы (1:20) против (1:80) у необлученных животных II группы, на 14-е сутки различия в титрах антикандидозных антител были вдвое. При этом у облученных животных введение метилглюкамина акридонацетата стимулировало рост антител в 2 раза как на 7-е, так и на 14-е сутки, а дипептида глутамил-триптофана (группа XI) – на 7-е сутки увеличивало в 2 раза, а на 14-е сутки – в 8 раз. У необлученных крыс при введении дипептида глутамил - триптофана (группа X) на 7-е и 14-е сутки стимуляция происходила в 2 раза. Метилглюкамина акридонацетат в VI группе влияния на титры специфических антител не оказывал. Течение инфекционного процесса оценивалось по результатам бактериологического исследования элиминации возбудителя (КОЕ log2/г-1) (табл. 3.3.8). На фоне введения метилглюкамина акридонацетата у необлученных животных на протяжении 1-й недели инфекционного процесса наблюдалась тенденция к снижению степени обсеменения. На протяжении 2-й недели наблюдалось существенное снижение показателей генерализации процесса (50% животных), а плотность культуры Candida albicans во внутренних органах ни в одной из исследуемых групп на 14-е сутки не превышала 50 КОЕ/г. У облученных животных (VII группа) при 100% генерализации инфекционного процесса на 7-е сутки и высокой степени обсемененности эффект метилглюкамина акридонацетата проявился лишь через 2 недели. При этом он составлял больше 100 КОЕ у 50% животных, меньше 100 КОЕ – у 33,3% и меньше 50 КОЕ – у 16,7%. О положительном влиянии на течение 91 инфекционного процесса используемых иммуностимуляторов свидетельствует отсутствие летальности у облученных животных. Таблица 3.3.8 Результаты бактериологического исследования течения кандидозного сепсиса у крыс, которым вводили метилглюкамина акридонацетат и дипептид глутамил-триптофан % животных с различной Группы животных ІI (n=6) III (n=6) VI (n=6) VII (n=6) Х (n=6) ХІ (n=6) Сутки % животных с степенью обсеменения генерализованной внутренних органов формой КОЕ log2/г-1). 1-20 21-50 51-100 >100 7 дней 100 0 0 0 100 14 дней 66,7 0 0 25 75 7 дней 1003 0 0 0 100 14 дней 100 0 0 0 100 7 дней 100 0 33,3 66,7 0 14 дней 66,7 33,33 66,73 0 0 7 дней 100 0 0 0 100 14 дней 100 0 16,7 33,33 503 7 дней 66,73 253 753 0 0 14 дней 16,73 1003 0 0 0 7 дней 100 0 0 503 503 14 дней 503 33,3 66,7 сравнению с Примечание: 3 - р≤0,05 по 0 животными, не подвергавшихся коррекции. У необлученных животных, которым вводили дипептид глутамилтриптофан (X группа), генерализация инфекционного процесса через неделю наблюдалась в 66,7% случаев. Также существенно снижалась степень 92 обсемененности, которая не превышала 50 КОЕ, по сравнению с животными аналогичной группы, которым вводили метилглюкамина акридонацетат. Через две недели генерализация инфекционного процесса наблюдалась лишь у 16,7% животных, при слабой обсемененности, которая не превышала 20 КОЕ. Эффект от воздействия дипептида глутамил - триптофана наблюдался и у облученных животных (XI группа), у которых в конце 1-й недели инфекционного процесса в 50% случаев снизилась степень обсемененности, а в конце 2-й недели генерализация наблюдалась лишь у 50% животных, со слабой обсемененностью. Однако, по сравнению с необлученными животными, процент крыс с генерализованной формой инфекционного процесса и степень обсемененности внутренних органов были выше. Резюме. Недостаточный уровень стимуляции фагоцитарной активности в ответ на введение метилглюкамина акридонацетата у облученных и инфицированных животных снижает скорость элиминации циркулирующих иммунных комплексов и скорости расхода комплемента на активацию комплексов антиген-антитело (ЦИК) по классическому пути. Положительное влияние дипептид глутамил-триптофана на течение инфекции связано со стимуляцией моноцитарно-макрофагального звена иммунитета и его противовоспалительным действием, которое обеспечивало восстановление баланса IFN-γ/IL-10. Также, дипептид глутамил-триптофан способствовал формированию более эффективного специфического гуморального ответа на антигены Candida albicans, чем метилглюкамина акридонацетат. У крыс, которым вводили дипептид глутамил-триптофан снижались степень обсемененности внутренних органов и процент животных с генерализованной формой инфекционного процесса. О положительном влиянии используемых иммуностимуляторов на течение инфекции свидетельствует отсутствие летальности у облученных животных. 93 РАЗДЕЛ 4. АНАЛИЗ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБОБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Широко известно, что в зависимости от дозы и типа ионизирующего излучения его влияние на функциональную активность клеток может иметь различный характер. Многими авторами было показано, что влияние радиации на клетки непосредственного организма действия может излучения быть на прямым, за счет молекулы-мишени, либо опосредованным – путем образования свободных радикалов вследствие изменения биохимических процессов, в том числе распространяться через биологические медиаторы, в частности цитокины [18, 94, 103, 171-173]. Адекватная работа иммунной системы возможна только при условии поддержания определенного баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Нарушения гомеостаза цитокинового профиля с большой долей вероятности могут указывать на воздействие различных неблагоприятных факторов на иммунологическую реактивность, и, как следствие, изменение ответа на внешнее воздействие [174-179]. Роль исходных уровней цитокинов в ответе на радиационное воздействие на сегодняшний день не совсем ясна, однако, по результатам некоторых исследований, применение нейтрализующих антител против цитокинов у облученных животных показало, что IL-1 и TNF, содержащиеся в крови и тканях мышей, играют определенную роль в системе радиорезистентности. Кроме того, эти же авторы указывают, что гиперпродукция TNF, IL-1 и IL-6 при травме и сепсисе может оказать повреждающее воздействие на метаболические функции и стабильность гемодинамики. Антитела, нейтрализующие негативные последствия сепсиса, IL-6 и TNF-α, смягчают вызванного бактериальными эндотоксинами [13, 18, 19, 180]. 94 Данный факт позволяет по-новому взглянуть на влияние радиации на клетки и организм в целом. По современным представлениям, индукция цитокинов в качестве адаптационного механизма является прямым ответом на экзогенное воздействие. Понимание роли цитокинов в патогенезе различных заболеваний, в том числе и радиационно- индуцированных, создаст предпосылки для разработки улучшенных подходов в терапии патологических процессов, развивающихся на фоне одной из целей предварительного нашего исследования фракционированного было облучения, поэтому изучение рентгеновского воздействия облучения на динамику показателей цитокинового профиля, которые характеризуют состояние поляризации иммунного ответа (Th1/Th2) [4, 18, 33,181]. В результате эксперимента мы получили выраженное и стабильное повышение сывороточного уровня TGF-β, которое наблюдалось с 1-х по 17-е сутки. Уровень цитокина превышал значение у интактных животных от 4 до более чем 6 раз и возвращался к исходным значениям на 28-е сутки (рис. 4.1). TGF-β представляет собой плейотропный цитокин, влияющий практически на все типы клеток и в составе иммунной системы выполняющий, прежде всего, регуляторную ингибирующую функцию [71]. Эти же авторы показывают, что у мышей с отключенным геном TGF-β или же экспрессирующих доминантный отрицательный рецептор TGF-β (TGF-β RIIDN), наблюдается спонтанная дифференцировка Th-клеток и спонтанные мультиорганные аутоиммунные воспалительные процессы. В работе [13] показано, что рост уровня TGF-β повышает вероятность летального исхода у животных, подвергшихся высоким дозам радиационного облучения [182184]. 95 Рис. 4.1. Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на уровень TGF-β и IL-10 в сыворотке крови крыс (пг/мл). При попытке систематизировать данные, касающиеся изменений ряда параметров имунной системы под влиянием ионизирующего излучения в зависимости от дозы, было выявлено [94], что низкие дозы стимулируют продукцию IL-12, CD80 и CD28 на фоне снижения уровня IL-10, что приводит к повышению активности Т-клеток. В то же время высокие дозы на фоне стимуляции продукции CD80 и IL-12 также приводят к повышению экспрессии CTLA-4 и IL-10, что в свою очередь ведет к подавлению активности Т-клеток. Эти изменения, в свою очередь, связаны с влиянием низкодозовой радиации на каскады передачи сигнала между компонентами иммунной системы. При этом выделен ряд важных каскадов, таких как каскад PKC/Ca2+, приводящий к активации транскрипционных факторов и транслокации в ядре NF-κB через изменение соотношения цАМФ/цГМФ в тимоцитах, а также молекулы нисходящего каскада PКА. Эти изменения в свою очередь связаны с экспрессией CD3/CD28 и активацией фосфодиэстеразы-γ. Изменения в передаче сигналов в совокупности будут влиять на транскрипционные факторы, которые в свою очередь будут 96 воздействовать на экспрессию цитокинов, например, будут стимулировать синтез IL-12, IL-1β и TNF-α [94, 185]. В свете этих данных, определение уровня IL-10 может свидетельствовать об изменениях эффекторного звена иммунологической реактивности. Концентрация IL-10 на протяжении первых 3-х суток после облучения существенно не изменялась (рис. 4.1). Выраженное и стойкое увеличение продукции данного цитокина было выявлено только на 10-е сутки после облучения, и его уровень продолжал оставаться высоким на протяжении еще недели. В конце четвертой недели наблюдения содержание обоих цитокинов – TGF-β и IL-10 – в сыворотке крови по сравнению с показателями контрольной группы (интактных животных) существенно не отличалось. Функция IL-10 заключается в подавлении уже не нужного воспалительного процесса в организме и, тем самым, ограничении дальнейшего повреждения тканей. Тем не менее, иммуносупрессивные свойства IL-10 могут приводить к снижению защитных воспалительных и антигенспецифичных реакций, которые, как правило, необходимы для элиминации инфекционного агента. IL-10 также подавляет синтез промежуточных активных форм кислорода и азота в стимулированных макрофагах [55-57]. Исходя из вышеизложенного, активация продукции IL-10, как и TGFβ, в ответ на фракционированное тотальное рентгеновское облучение может носить негативный характер, поскольку повышение их уровней, вероятно, указывает на состояние радиационно-индуцированной иммунодепрессии. Известно, что действие IL-10 приводит к ингибированию синтеза каскада провоспалительных цитокинов, включая IFN–γ, TNF, IL-1, IL-2 и GM-CSF, а также ряд хемокинов [58-72, 186, 187]. 97 Что касается одного из маркерных цитокинов Th1-лимфоцитов – IFN-γ, то наши исследования показали снижение его уровня после воздействия фракционированного тотального рентгеновского облучения. Однако дефицит продукции данного цитокина определялся не сразу, а по прошествии 3-х суток после облучения, с последующей постепенной нормализацией к концу 4-й недели, когда существенных различий по сравнению с показателями у интактных животных не было выявлено (рис. 4.2). Продукция IL-4 Th2-клетками постепенно снижалась с минимальными значениями на 10-е сутки после облучения. Восстановление также происходило к концу периода наблюдений – на 28-й день. Несмотря на то, что в более ранних работах было показано, что Th1клетки являются более радиочувствительными по сравнению с Th2, изменения уровня IL-4 были не менее выражены, чем IFN-γ (рис 4.2). Данные факты свидетельствуют об опосредованном влиянии радиации – через индукцию их антагонистов – IL-10 и TGF-β [80, 100, 106]. Рис. 4.2. Содержание IFN-γ и IL-4 в сыворотке крови крыс (пг/мл) при воздействии низкодозового фракционированного рентгеновского облучения. 98 Приведенные выше данные свидетельствуют о наличии условий для угнетения индукции основных эффекторных механизмов (Th 1, Th2). Иммуносупрессивный эффект радиационного облучения также хорошо известен, но его механизм не изучен. Возможно участие обоих механизмов, как прямых, так и опосредованных: ионизирующее облучение не только вызывает повреждение ДНК, физиологических реакций иммуносупрессию и предположением, что но в воспаление. и запускает клетках Эти индуцируемая ряд разнообразных млекопитающих, данные включая согласуются радиационным и с облучением иммуносупрессия может быть связана с подавлением цитокинов Th1 [11, 13, 18, 19, 93-96], что совпадает с вышеописанным снижением уровня IFN-γ. В этих условиях существенный интерес представляет изучение клеточных и гуморальных факторов иммунологической реактивности. К клеточным факторам иммунологической реактивности относятся фагоциты, как макро -, так и микрофаги. Фагоцитоз представляет собой сложный процесс, в котором можно выделить такие стадии, как образование фагосомы и последующее созревание последней, а результатом завершенного фагоцитоза является уничтожение патогена и презентация антигена [45-47]. Учитывая высокую устойчивость фагоцитов к радиации, наиболее вероятный механизм воздействия радиации на процесс фагоцитоза – через сложный каскад цитокинов [18, 20, 188-190]. При исследовании параметров неспецифической иммунологической реактивности, динамика которых представлена на рисунке 4.3, установлено, что фракционированное тотальное рентгеновское облучение оказывает депрессивное воздействие на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов крыс. При этом фагоцитарное число макрофагов достигло заметных изменений уже на 3-и сутки, а минимальный его уровень 99 наблюдался на 10-е сутки, с последующим восстановлением до нормальных значений. Фагоцитарный индекс перитонеальных макрофагов на 1-й неделе наблюдения имел лишь тенденцию к снижению и только на 10-е сутки достиг достоверной разницы по сравнению с контрольной группой. Рис. возникающие 4.3. при Изменения воздействии поглотительной функции фракционированного фагоцитов, рентгеновского облучения. Динамика же показателей фагоцитарной активности перитонеальных нейтрофилов была более выраженной (рис. 4.3). Мы получили заметное 100 снижение количества фагоцитирующих нейтрофилов у облученных крыс уже на 3-и сутки, а минимум был отмечен на 10-е сутки после воздействия радиации. Что же касается показателя поглотительной способности перитонеальных нейтрофилов, то для него характерна была та же динамика. К концу периода наблюдений значения вышеуказанных показателей также восстанавливались до контрольных Макрофаги, эффекторных активированные клеток в защитных выполняют функции повреждающих реакциях IFN-γ, и воспалительного процесса. При этом макрофаги синтезируют и секретируют широкий спектр цитокинов, обладающих эффекторной и регуляторной активностью, разрушительных ферментов и активных форм кислорода и азота [46-48, 188]. Авторами [20] было показано, что активация макрофагов в ответ на радиацию вызвана взаимодействием с лимфоцитами. Она также просходит за счет паракринной индукции образования определенных цитокинов, которая инициируется наличием ИЛ-1β, высвобождаемым макрофагами, подвергшимися радиационному воздействию. К тому же, по современным представлениям, индукция цитокинов является прямым ответом на экзогенное воздействие [3]. Регулирующим цитокином для макрофагов является IL-10 – антагонист IFN-γ. Его продуцентами могут быть моноциты/макрофаги и Tклетки. Ингибирующим действием на фагоциты обладает TGF-β, эффекты которого зависят, как от дозы, так и от присутствия других цитокинов [62]. Напротив, влияние IL-4 на фагоцитоз противоречиво, так как у макрофагов, индуцированных IL-4, наблюдается как усиленная, так и сниженная фагоцитарная активность [84]. Данное противоречие может объясняться наличием множества форм фагоцитоза, для которых характерна 101 активация определенных рецепторов, что приводит к различным межмолекулярным взаимодействиям [45-48]. Благодаря способности IL-4 индуцировать альтернативную активацию макрофагов, запускается формирование реакции, существенно отличающейся от классической активации за счет IFN-γ. В частности, характерно усиление синтеза цитокинов и хемокинов макрофагами, активированными IL-4, под воздействием ЛПС и высокий уровнь эндоцитоза [82]. В свою очередь, Th2клетки синтезируют такой оппозитный цитокин, как IL-4, который может индуцировать реакции, управляемые IgE и эозинофилами за счет синтеза ряда цитокинов, тем самым обеспечивая гуморальный иммунитет [46]. Поэтому снижение содержания IL-4 на 3-и и 10 сутки совпадает с периодами снижения поглотительной активности фагоцитов. Недостаточный уровень функционирования фагоцитов отразился и на механизмах элиминации патогена, что проявилось в повышении уровня ЦИК с максимумом на 17-е сутки (рис. 4.4). Колебания комплементарной активности сыворотки крови на протяжении всего периода наблюдений имели лишь характер тенденций по сравнению с уровнем этого показателя у контрольных животных, за исключением 3-х суток после облучения, когда она была достоверно снижена (рис. 4.4). ЦИК и комплементарная активность сыворотки крови, с одной стороны, относятся к эффекторному звену воспалительного процесса, являясь участниками всех его феноменов: альтерации, экссудации, эмиграции и, в меньшей степени, пролиферации. С другой стороны, они являются маркерами эффективности элиминационных процессов, так как накопление ЦИК является неблагоприятным признаком [45-48]. 102 Рис. 4.4. Действие низкодозового фракционированного рентгеновского облучения на содержание ЦИК (МЕ) и активность комплемента (гем. ед.) в сыворотке крови крыс. Таким образом, фракционированного нами было рентгеновского установлено, облучения на что воздействие крыс привело к системному росту уровня TGF-β, что, в комплексе с усилением синтеза IL-10, создает условия для угнетения эффекторных механизмов Th1,/Th2 специфического иммунного ответа, проявляющегося в снижении уровней сывороточных цитокинов IFN-γ и IL-4. Наряду с этим, наблюдался нестойкий, носящий преимущественно характер тенденций, дефицит системы неспецифической иммунной защиты, что свидетельствует об угнетении инициальных этапов воспаления [44], которые, как правило, необходимы для элиминации инфекционного агента. Представленные выше данные о влиянии фракционированного тотального рентгеновского функциональной облучения декомпенсации свидетельствуют иммунологической о признаках реактивности у облученных животных, которая, при дополнительной функциональной нагрузке, в качестве которой нами выбрана модель экспериментального диссеминированного кандидозного сепсиса, проявляется возрастанием 103 функционального дефекта антиинфекционной защиты различной степени выраженности. Актуальность выбранной модели связана с тем, что проблема кандидемии и острого диссеминированного кандидоза приобретает весомое значение вследствие увеличения случаев этой патологии у больных с нарушениями противоинфекционной защиты, а также тяжести клинических проявлений и высокой летальности [140-152, 191]. На сегодняшний день хорошо изучено течение острой инфекции на фоне высоких доз ионизирующего облучения, по сути, острой лучевой болезни. При этом иммунотропные эффекты низкодозового облучения, достаточно распространенного, на течение и прогноз инфекционного процесса, изучены в гораздо меньшей степени [12, 127]. Достоверно установлено, что инфекция является основной причиной смерти после общего радиационного поражения, а также то, что цитокины играют ведущую роль в контроле реакций хозяина на радиацию и инфекцию. Первая линия противоинфекционной защиты включает в себя инициацию воспалительной реакции и высвобождение медиаторов, таких как свободные кислородные радикалы и провоспалительные цитокины активированными макрофагами и гранулоцитами [2, 3]. Таким образом, возникла необходимость в проведении исследований комбинированного влияния небольших доз радиации и инфекции на организм. Нами была разработана и запатентована экспериментальная модель инфицирования крыс линии Wistar путем внутривенного введения микробной суспензии широко используется для изучения вирулентности изолятов и штаммов Candida albicans, а также представляет собой наглядную модель диссеминированной инфекции у человека [192, 193]. 104 Несмотря на то, что Candida albicans связана с рядом тяжелых заболеваний, этот патоген, в первую очередь, является комменсалом. Данное явление является результатом постоянного двустороннего взаимодействия с иммунной системой хозяина. При развитии благоприятных условий, в частности, радиационно-индуцированной генерации противовоспалительного/толерогенного состояния, данный патоген имеет тенденцию к персистенции за счет модуляции и активации локальных регуляторных Т-клеток, способных подавлять системы врожденного и приобретенного иммунитета. Сама же C. albicans также может способствовать поддержанию толерогенного состояния [194]. Поэтому дуалистическая природа данного микроорганизма – одновременно комменсала и патогена – указывает на его способность управлять иммунной реакцией в двух направлениях [136]. Полный спектр взаимоотношений хозяина и C. albicans определяется наличием рецепторов распознавания на дендритных клетках и мононуклеарных фагоцитах, посредством которых, через определенные внутриклеточные сигнальные пути, происходит генерация различных противогрибковых иммунных реакций [151, 195]. При изучении продукции цитокинов в условиях кандидозного сепсиса показано прогрессивное возрастание уровня IFN-γ. Он увеличивается уже на 1-е сутки, с достижением максимальных значений на 3-и сутки и последующим снижением на 10-е сутки. К 17-м суткам уровень IFN-γ восстанавливался до нормы, а на 28-е сутки был ниже нормы (рис. 4.5). Облучение оказывало депрессивный эффект, поэтому в группе облученных и инфицированных крыс повышение уровня данного цитокина было менее выражено и достижение максимальных значений сдвигалось на 10-е сутки. При этом, однако, возврата к значениям уровня IFN-γ у интактной группы животных к концу периода наблюдений не происходило (рис. 4.5). 105 Рис. 4.5. Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на содержание IFN-γ и IL-17 в сыворотке крови при остром генерализованном кандидозе у крыс. Повышение уровня IL-17 (рис. 5.5) наблюдалось у необлученных крыс уже на 1-е сутки после инфицирования, максимальный рост зафиксирован на 3-и сутки. В последующем он снижался: на 10-е и 17-е сутки, вплоть до нормы на 28-е сутки. В группе облученных крыс продукция IL-17 оставалась на более высоком уровне на протяжении, по крайней мере, 14-ти суток после инфицирования, продолжая оставаться высокой даже на 28-е сутки исследования. Учитывая литературные данные [196- 197], в которых IL-17 определялся как маркер тяжести заболевания, снижение уровня данного цитокина может указывать на неспособность организма элиминировать C. albicans при диссеминированных и хронических формах кандидоза. Следует отметить, что благоприятный, или же, наоборот, отрицательный эффект экспрессии IL-17 в ходе инфекционного процесса также может быть связан с видом возбудителя [199]. В целом, основываясь на данных этих источников можно сделать вывод о том, что поскольку продукция IL-17 может иметь как 106 благоприятное, так и негативное влияние на ход различных патологических состояний, то использование его как маркера тяжести инфекционного процесса возможно только в случае учета всех составляющих наблюдаемого состояния. Кроме того, повышение уровня IL-17 явно указывает на интенсификацию нейтрофильного, цитотоксического воспаления, которое потенциально может нанести вред хозяину, и, таким образом, чрезмерная экспрессия данного цитокина является, скорее, свидетельством неблагоприятного течения заболевания [200, 201]. Роль IL-17 и Th17-клеток в противогрибковой защите организма также была подробно описана в ряде экспериментальных исследований с моделированием кандидозной инфекции. В частности, в этих работах указывалось, что инфицирование мышей путем внутривенного введения суспензии C. albicans индуцирует быструю экспрессию IL-17 [21]. В то же время для мышей, неспособных реагировать на IL-17 вследствие дефектов в рецепторах, воспринимающих данный цитокин, была характерна повышенная обсеменненность тканей и летальность. Это, в свою очередь, было связано с нарушением миграции периферических нейтрофилов к очагам инфекции [202]. Что касается такого регуляторного цитокина, как IL-10, то наши исследования показали, что у необлученных инфицированных животных рост уровня IL-10 в сыворотке крови наблюдался лишь на 10-е сутки после инфицирования. На 28-е сутки содержание IL-10 восстанавливалось до нормы (рис. 4.6). Как показано на том же рисунке, у животных, предварительно подвергавшихся облучению, уровень IL-10 заметно возрастал также на 2-е и 3-и сутки после инфицирования. По данным многих исследований, продукция IL-10 положительно коррелирует со степенью тяжести течения системного кандидоза [188, 189]. 107 Рис. 4.6. Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на содержание IL-10 и IL-4 в сыворотке крови при остром диссеминированном кадидозе у крыс. Уровень маркера Th2 – IL-4 – в нашем эксперименте у необлученных животных на фоне кандидозного сепсиса также прогрессивно возрастал на протяжении 1-й недели, достигая максимальных значений на 3-и сутки, и оставался высоким вплоть до 10-х суток. В группе облученных крыс рост уровня IL-4 имел похожую, однако, менее выраженную динамику. Для адекватного ответа на инфекцию C. albicans требуется экспрессия ряда провоспалительных цитокинов. Четко показана связь реакции Th2 в почках мышей с летальным исходом, поскольку мыши с отключенным геном IL-10 являются более устойчивыми к инфекции [192]. Эффект Th2-клеток, в данном контексте, заключается в подавлении активности Th1-лимфоцитов, стимулировании антителообразования, в т. ч. IgA и IgE, угнетении фагоцитоза, а также фунгицидного действия макрофагов и нейтрофилов [13, 151, 196, 201]. Значение баланса двух подтипов Т-хелперов, вероятно, заключается в том, что макроорганизм «предпочитает» относительно безопасный Th2 108 (антительный) ответ, а не сильный фунгицидный Th1 (клеточный) иммунный ответ, с обширным разрушением тканей в тех случаях, когда он не справляется с большим количеством микробных тел. Переключение на Th2-ответ может происходить и на промежуточных этапах, в целях контроля за избыточной деструктивной деятельностью фагоцитов. Участие CD8+-лимфоцитов («киллеров»/«супрессоров») в противогрибковом иммунном ответе также имеет разнонаправленный характер. CD8+ лимфоциты способны уничтожать макрофаги с незавершенным процессом фагоцитоза и расположенными в цитоплазме клетками кандиды [184]. Главная роль Th1-клеток заключается в опосредованной интерфероном стимуляции процесса фагоцитоза, презентации антигена фагоцитами, кислородных и NO-зависимых фунгицидных механизмов, а также секреции опсонинов. За счет продукции интерферона и IL-2 CD8+лимфоциты стимулируют Th1 и NK-клетки, увеличивают эффективность фагоцитоза и угнетают Th2-ответ. Кроме того, CD8+-лимфоциты могут оказывать непосредственный фунгицидный эффект, взаимодействуя с клетками C. albicans [152]. Вышеуказанные закономерности подтвердились и в наших исследованиях: динамика Th1-цитокина – IFN-γ – совпадала с активацией поглотительной способности фагоцитов, а рост маркеров Th2 – IL-10 и IL-4 – совпадал с его угнетением. Так, у необлученных крыс при генерализованном кандидозном сепсисе наблюдалась выраженная активация фагоцитарной функции перитонеальных макрофагов на протяжении 17-ти суток эксперимента, достигая максимума для ФИмф на 3-и сутки, а для ФЧмф – на 17-е (рис. 4.7). На том же рисунке показано, что у облученных и инфицированных животных наблюдалось уменьшение процента активных 109 макрофагов с первых же суток наблюдения по сравнению с необлученными инфицированными крысами. Еще более заметными были изменения со стороны поглотительной способности макрофагов, показатели которой были ниже таковых не только группы сравнения, но и интактных животных. Рис. 4.7. Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели поглотительной способности фагоцитов при остром диссеминированном кандидозе у крыс. Такую же динамику мы наблюдали и в отношении функциональной активности нейтрофилов: закономерное нарастание как поглотительной 110 активности фагоцитов, так и числа фагоцитирующих клеток у необлученных крыс на фоне диссеминированной кандидозной инфекции в течение первых 10-ти дней, с максимумом на 3-и сутки. Относительная недостаточность активации фагоцитоза нейтрофилов, которая наблюдалась у облученных и инфицированных животных по сравнению с аналогичными показателями в группе необлученных инфицированных крыс, достигала статистически достоверных значений на 10-е сутки (рис. 4.7). Макрофаги и нейтрофилы выполняют основную работу по элиминации грибов рода Candida как непосредственно – путем фагоцитоза, так и посредством регуляции иммунного ответа – за счет продукции цитокинов. Роль оксида азота в функции макрофагов в настоящее время рассматривается как одна из ключевых в противогрибковой защите. Специализированные макрофаги обладают высокоактивной «индуцибельной» синтазой оксида азота (iNOS). Индукция этого фермента происходит в присутствии IFN и TNF, а угнетение – под действием IL-4, IL10, TGF-β. В конечном итоге, это ведет к цитостатическим и гибельным для клеток эффектам [18, 199, 203]. Активация иммунного ответа макрофагами осуществляется за счет ряда цитокинов, являющихся ростовыми факторами и активаторами для многих популяций клеток, в т. ч. самих макрофагов, стимулирующих продукцию их цитокинов, а также острофазовых белков. Особенно важную роль играет IFN-γ, усиливающий фунгицидную активность фагоцитов. Лимфоциты различных популяций способны к связыванию с клетками кандиды, угнетению их роста и уничтожению инфицированных клеток за счет экспрессии IFN, TNF и IL-2, которые, в свою очередь, влияют на развитие Th1-реакций, могут усиливать фагоцитоз [195, 203, 204]. 111 Несмотря на то, что клеточный иммунитет играет основополагающую роль в защите против кандидозной инфекции, тем не менее, признается значение специфического гуморального иммунитета, который принимает участие в различных этапах борьбы с кандидозом. В эксперименте доказана защитная роль антител класса IgM к маннановой фракции клеточной стенки C. albicans, выполняющей функцию адгезии, а также роль опсонинов. Установлена защитная роль опсонинов – IgG подкласса 2а, продукция которых стимулируется Тh1-клетками. Антитела класса IgG к маннанам C. albicans активируют комплемент по классическому пути [151]. При исследовании нами уровня специфических антител к Candida albicans было установлено, что на 7-е сутки инфекции титры специфических антител у предварительно облученных крыс были вчетверо ниже, чем у необлученных животных. На 14-е сутки различия в титрах антикандидозных антител также наблюдались, однако были менее выраженными (рис. 4.8). Рис. 4.8. Сравнительный анализ динамики нарастания титров специфических антител к Candida albicans у облученных и необлученных крыс. 112 Как показано на рисунке 4.9, при диссеминированном кандидозном сепсисе у необлученных животных происходило повышение уровня ЦИК со 2-х суток и на протяжении всего периода наблюдения с максимумом на 17-е сутки. У облученных и инфицированных крыс содержание ЦИК было достоверно выше во все сроки исследования, что, вероятно, связано с нарушением функции элиминации со стороны фагоцитарных клеток и системы комплемента. Рис. 4.9. Динамика содержания ЦИК (МЕ) и активности комплемента (гем. ед.) в сыворотке крови у инфицированных облученных и необлученных крыс. Роль комплемента в защите макроорганизма при генерализованном кандидозе представляется несомненной. Однако конкретные механизмы действия компонентов системы комплемента и их взаимодействие между собой и другими факторами иммунитета остаются не уточненными. В 113 принципе, роль комплемента заключается в связывании (прямом по альтернативному пути и опосредованном антителами по классическому пути) с микробами, с их опсонизацией или непосредственным уничтожением, а также в образовании факторов, обеспечивающих хемотаксис фагоцитов [151]. Иммуноглобулины класса G к маннановым антигенам способны запускать активацию фактора С3 по классическому пути. Несколькими исследованиями была доказана способность различных видов Candida к активации альтернативного пути активации комплемента. Хемотаксические факторы C3а и С5а сохраняют свое значение при кандидозе, играя ту же роль, что и при других инфекциях [151]. В наших исследованиях определяли общую комплементарную активность сыворотки крови по 50%-ному гемолизу, которая снижалась в обеих группах инфицированных животных (облученных и необлученных), скорее всего, за счет усиленного потребления компонентов системы комплемента. Данное явление, вероятно, связано с накоплением ЦИК, а также элиминацией патогена по альтернативному пути. Минимальные значения активности комплемента наблюдались на 10-е сутки эксперимента. При этом активность комплемента у облученных животных во все сроки исследования была ниже, чем у необлученных крыс, что указывает на более сильное его потребление в первом случае (рис. 4.9). Полученные нами результаты согласуются с литературными данными [152], которые свидетельствуют о том, что кандидоз относится к ряду оппортунистических инфекций и развивается только в иммунологически скомпрометированном макроорганизме [152, 153]. Как показано на рисунке 4.10, в группе облученных крыс наблюдалась 100%-ная генерализация инфекционного процесса как на 7-е, так и на 14-е сутки. Уровень элиминации возбудителя, о котором судили по отсутствию 114 положительной свидетельствует динамики об степени усугублении обсеменения внутренних клинического течения органов, инфекции, индуцированном фракционированным облучением, и, даже, наблюдалась летальность в данной группе животных. Рис. 4.10. Результаты бактериологического исследования течения кандидозного сепсиса у облученных и необлученных крыс. При сравнительном анализе исследуемых групп животных было установлено, что у необлученных крыс на 7-е сутки тоже наблюдалась 100%ная генерализация инфекционного процесса, но на 14-е сутки – только в 66,7 % случаев, а также имелась тенденция к снижению степени обсеменения 115 внутренних органов. Для необлученных животных инфекционная модель была сублетальной (рис. 4.10). Таким образом, при декомпенсация инфекционном процессе неспецифической реактивности у функциональная облученных крыс нарастала: усугубление имеющегося дисбаланса в цитокиновом соотношении IFN-γ/IL-4 привело негативным последствиям – диссеминации процесса и утяжелению клинической картины. Раскрытие роли иммунологической реактивности в физиологических и патофизиологических процессах создало предпосылки для разработки методов коррекции, основанных на направленной регуляции иммунных реакций. Одной из возможных сфер применения иммуностимулирующих препаратов является использование их при инфекционных заболеваниях, в особенности, в случае неадекватного функционирования иммунной системы, например, в условиях воздействия ионизирующей радиации. Наиболее современным подходом в иммунокоррекции данных нарушений является использование эндогенных полипептидов иммунной системы – цитокинов и связанных с ними факторов, наиболее распространенным из которых является интерферон [154-157]. При этом, однако, следует учитывать и побочные эффекты, которые наблюдаются при проведении цитокиновой или же, напротив, антицитокиновой терапии. Несмотря на плейотропизм и многообразие, в случае, если гомеостаз организма не имеет нарушений, цитокины эффективно взаимодействуют друг с другом, однако, искусственное введение дополнительного количества определенного цитокина может нарушить данное равновесие. Об этом свидетельствует тот факт, что при использовании цитокиновой терапии возникают вопросы с их дозировкой и временем введения [153]. Исходя из вышеизложенного, нами был выбран не сам интерферон, а его индуктор – метилглюкамина акридонацетат. При этом мы учитывали, что 116 воздействие различных стимуляторов экзогенного происхождения происходит через систему цитокинов, и, таким образом, качественных различий между эффектами от введения интерферона или его индуктора не должно быть. Значительным преимуществом метилглюкамина акридонацетата по сравнению с другими иммуностимуляторами является то, что он имеет синтетическое происхождение, небольшую молекулярную массу и обладает легко выявляемыми фармакокинетическими характеристиками. Однако, при этом, следует учитывать, что проявление эффекта от использования иммуностимулятора напрямую зависит от количественного и качественного состава индуцированного им синтеза интерферонов [205-207]. IFN-γ играет большую роль в процессе активации макрофагов, развитии и дифференцировке CD4+-T-клеток в Th1-клетки, при этом угнетая развитие Th2-клеток за счет ингибирования синтеза IL-4. Кроме того, важной функцией IFN-α/β также является усиление цитотоксичности NK-клеток и стимуляция их пролиферации [155]. При изучении действия метилглюкамина акридонацетата на иммунологическую реактивность крыс с кандидозным сепсисом мы выяснили, что у облученных животных происходило усугубление имеющегося дисбаланса в цитокиновом профиле за счет значительного повышения уровня IFN-γ и умеренного увеличения уровня IL-10 по сравнению с животными, не подвергнутыми коррекции. У неинфицированных животных (V группа) этот эффект был менее заметным: соотношение IFN-γ/IL-10 возросло за счет повышения уровня IFN-γ по сравнению с крысами без иммунокоррекции (рис. 4.11). Кроме того, из рисунка 4.11 видно, что уровень IL-4 возрастал у инфицированных крыс, получавших метиглюкамина акридонацетат, при том, что у животных без коррекции он существенно меньше. Это, очевидно, 117 только содействовало углублению дисбаланса в цитокиновом профиле. При этом ожидаемого уровня стимуляции функций фагоцитов у инфицированных облученных животных не наблюдалось (рис. 4.12). Рис. 4.11. Влияние метилглюкамина акридонацетата на уровень сывороточных цитокинов при лечении инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс. 118 Рис. 4.12. Влияние метилглюкамина акридонацетата на показатели фагоцитоза при лечении инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс. Как показано на рисунке 4.12, у облученных животных, которым вводили метилглюкамина акридонацетат, на 7-е сутки после инфицирования наблюдалось статистически достоверное повышение уровня активации макрофагов по сравнению с животныим без иммунокоррекции, а фагоцитарное число макрофагов у животных исследуемой группы также было существенно выше, чем в интактном контроле. 119 Заметное повышение фагоцитарной активности нейтрофилов под влиянием метилглюкамина акридонацетата также было выявлено лишь у облученных крыс, не подвергавшихся инфицированию. В обеих группах инфицированных животных под влиянием метилглюкамина акридонацетата фагоцитарная активность нейтрофилов практически не увеличивалась. Недостаточность достигнутого уровня стимуляции фагоцитарных функций нейтрофилов подтверждается и стабильностью в концентрации ЦИК в обеих группах инфицированных животных. Так, концентрация ЦИК у всех крыс, участвовавших в эксперименте, была достоверно выше по сравнению с интактными животными. У животных с кандидозным сепсисом без предварительного облучения, на фоне введения метилглюкамина акридонацетата наблюдалась лишь тенденция к снижению ЦИК. У аналогичных, но предварительно облученных животных, уровень ЦИК был практически такой же (рис. 4.13). Рис. 4.13. Влияние метилглюкамина акридонацетата на показатели циркулирующих иммунных комплексов и комплемента при лечении инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс. 120 Из рисунка 4.13 также видно, что метилглюкамина акридонацетат оказывал негативное влияние и на активность комплемента в сыворотке крови в условиях сепсиса, как у животных, подвергавшися предварительному облучению, так и не подвергавшихся. В отличие от данных, полученных нами, отчеты о клинических испытаниях, опубликованные в литературных источниках, указывают на то, что метилглюкамина акридонацетат обладает интерфероноподобным действием, активируя макрофаги и индуцируя выработку IL-1 и IFN-γ. Также было показано, что IFN-γ значительно снижает тяжесть течения, в основном, бактериальных инфекций у пациентов с хроническим грануломатозным заболеванием – на 70% [155-157]. Поскольку система интерферонов – это единая система регуляции функций клеток и межклеточных взаимодействий полипептидными молекулами, то в процессе иммунного ответа последние выполняют роль короткодистантных медиаторов межклеточного взаимодействия. Интерфероны связываются со специфическими рецепторами на клеткахмишенях, при этом они не обладают ферментативной либо химической активностью, а их действие проявляется опосредованно через клетки-мишени при помощи вторичных мессенджеров [203, 204]. Действие интерферона реализуется по сетевому принципу, т.е. передаваемая информация содержится в наборе регуляторных цитокинов, которые получили название цитокинового каскада. Включение каскада обусловливает синергические или антагонистические действия медиаторов, индукцию выработки ими друг друга, а также трансмодуляцию поверхностных рецепторов к другим медиаторам [154-157]. Данные взаимодействия имеют очень сложный характер, и, на сегодняшний день, они малоизучены. Можно предположить, что полученные нами данные указывают на то, что компрометация иммунной системы 121 низкодозовым ионизирующим облучением нарушает синтез ряда цитокинов, что, в свою очередь, приводит к сбоям в выработке компонентов цитокинового каскада, в частности, индукция IFN-γ, иммунокомпетентными клетками и усугубляет течение инфекционного процесса. Поскольку метилглюкамина акридонацетат, как указывалось выше, является индуктором синтеза эндогенного интерферона и непосредственно не влияет на выработку других цитокинов, то данный препарат не в состоянии скорректировать вызванные радиацией нарушения. Представленные данные свидетельствуют том, что дипептид глутамилтриптована не только тимомиметический иммуномодулятор, но, и, в не меньшей степени, полифункциональный биорегулятор, выполняющий, как и другие короткие пептиды, функцию стартового сигнала в пептидном регуляторном каскаде [33]. Эти представления позволяют понять способность дипептид глутамил-триптована одновременно индуцировать различные эффекты, направленность которых определяется видом клетокмишеней и характером имеющихся повреждений. Накопленная информация позволяет утверждать, что фактором, определяющим свойства того или иного пептида, является его структура, а не происхождение [33]. Большинство эффекторных и вспомогательных функций клеток иммунной системы осуществляются при участии особых эндогенных структур – внутрисистемных гормонов и медиаторов. Наибольшие успехи в этом направлении стали возможны после открытия регуляторных пептидов центральных органов иммунитета, в частности, тимуса. Дальнейшее развитие идеи пептидных тимомиметиков привело к пониманию того факта, что для индукции регуляторного сигнала системе может быть достаточно минимального пептида, состоящего всего из 2-х аминокислотных остатков. Дипептид глутамил-триптофан является классическим тимомиметиком, обладающим всей совокупностью иммуномодулирующих реакций, 122 иммунорегулирующими свойствами, которые могут быть использованы в терапевтической практике [33]. Триптофан представляет собой незаменимую аминокислоту, которая участвует в белковом синтезе и других метаболических процесах. В последнее время была установлена связь между катаболизмом триптофана и воспалительным процессом при многих заболеваниях [208]. Рис. 4.14. Влияние дипептида глутамил-триптофана на уровень сывороточных цитокинов при лечении инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс. 123 Как показано на рисунке 4.14, к наиболее существенным положительным изменениям в иммунном статусе облученных животных на фоне введения исследуемого препарата нужно отнести наличие тенденции к уменьшению дисбаланса в цитокиновом профиле, более выраженное у облученных животных с генерализованным сепсисом. Соотношение IFNγ/IL-10 у инфицированных животных уменьшилось за счет увеличения уровня IL-10 и умеренного повышения уровня IFN-γ. Аналогичный эффект наблюдался и у необлученных животных: соотношение IFN-γ/IL-10 также уменьшилось за счет значительного повышения уровня IL-10 и умеренного повышения уровня IFN-γ по сравнению с контрольными крысами (рис. 4.14). Кроме того, у облученных и инфицированных животных лечение глутамил-триптофаном привело к уменьшению уровня ИЛ-4 по сравнению с контролем. У инфицированных животных без предварительного облучения разница была также заметной, что, очевидно, свидетельствует о противовоспалительном эффекте препарата. Что касается продукции IL-17, то наблюдалось заметное уменьшение его уровня у животных ХІ группы. Фагоцитарная активность макрофагов значительно повышалась при введении дипептида глутамил-триптофана именно у облученных животных, которые имели наиболее низкий исходный уровень этого показателя. Аналогичный, но менее выраженный эффект стимуляции был у инфицированных необлученных животных (рис 4.15). На том же рисунке наглядно отображено, что дипептид глутамилтриптофан оказывал значительное стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов во всех исследованных группах, кроме инфицированных необлученных крыс, которые имели наиболее высокий исходный уровень этого показателя. 124 Рис. 4.15. Влияние дипептида глутамил-триптофана на показатели фагоцитоза при лечении инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс. На сегодняшний день значение расщепления триптофана, индуцированное IFN-γ, изучено недостаточно, однако, многие исследователи полагают, что данный феномен является частью биологического механизма, направленного на снижение доступа триптофана к патогенным микроорганизмам и раковым клеткам [208]. Наши исследования показали снижение уровня IFN-γ у инфицированных и облученных крыс по сравнению с животными без предварительного облучения. Данный факт может 125 указывать на то, что в организме облученных крыс происходит замедление расщепления триптофана. Также известно, что у людей наблюдается повышение интенсивности расщепления триптофана при вирусных инфекциях, злокачественных новообразованиях, а также аутоиммунных заболеваниях [207]. Кроме того, было установлено, что триптофан является ключевым компонентом формирования иммунной толерантности при беременности [208]. Расщепление триптофана контролируется, кроме IFN-γ, также рядом других цитокинов, таких как IL-4 и IL-10. Последние, согласно данной теории, способны подавлять расщепление триптофана мононуклеарами периферической крови, вероятно, за счет прямого ингибирования продукции цитокинов Th1, а также влияния IFN-γ на моноциты/макрофаги [32, 163]. Результаты нашего эксперимента согласуются данными о том, что при добавлении в культуру макрофагов IL-4 и IL-10 в тех же концентрациях наблюдается аддитивный эффект по отношению к эффекторным функциям макрофагов [163]. Дипептид полипептидом, глутамил-триптофан который обеспечивает является активацию синтетическим макрофагов через активацию Toll-подобных рецепторов, в том числе и рецептора TLR9. Стимуляция данного рецептора может приводить к усилению формирования регуляторных Т-клеток фенотипа CD4+ и CD25+ под контролем дендритных клеток. Т-клетки данного фенотипа являются ключевыми компонентами защитных реакций против грибковой инфекции [26-28, 163]. В обеих группах инфицированных животных на фоне введения дипептида глутамил-триптофана заметно снижалось количество ЦИК. В этих же группах наблюдалось повышение комплементарной активности сыворотки крови (рис. 4.16). 126 Рис. 4.16. Влияние дипептида глутамил-триптофана на показатели циркулирующих иммунных комплексов и комплемента при лечении инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс. Эффекторное звено системной противокандидозной защиты обеспечивается не только за счет активации фагоцитов, но и за счет стимуляции синтеза защитных антител. Уровень специфических антител против Candida albicans нарастал после введения как метилглюкамина акридонацетата, так и дипептида глутамил-триптофана практически у крыс всех групп, однако, как показано на рисунке 4.17, глутамил-триптофан оказал большее влияние именно у животных, подвергшихся предварительному облучению, в то время как метилглюкамин акридонацетат оказался более эффективным у необлученных крыс. 127 Рис. 4.17. Сравнительный анализ динамики нарастания титров специфических антител к Candida albicans в группах животных, которые получали метилглюкамина акридонацетат и дипептид глутамил-триптофан. На 7-е сутки инфекционного процесса титры специфических антител были вчетверо ниже у облученных крыс III группы, на 14-е сутки различия в титрах антикандидозных антител были вдвое. При этом у облученных животных введение метилглюкамина акридонацетата стимулировало рост титра антител как на 7-е, так и на 14-е сутки, а при действии дипептида глутамил-триптофана стимуляция выработки антител была намного более выраженной. У необлученных крыс при введении дипептида глутамил-триптофана на 7-е и 14-е сутки стимуляция происходила в 2 раза. Метилглюкамина акридонацетат в группе инфицированных крыс влияния на титры специфических антител не оказывал. Кроме того, вышеуказанные препараты оказывали влияние и на степень обсемененности внутренних органов. Так, на фоне введения 128 метилглюкамина акридонацетата у необлученных животных на протяжении 1-й недели инфекционного процесса наблюдалась тенденция к снижению степени обсеменения. В течение следующей недели отмечалось существенное снижение показателей генерализации процесса у половины животных, а плотность культуры Candida albicans во внутренних органах ни в одной из исследуемых групп к концу 2-й недели не превышала 50 КОЕ/г. У облученных животных наблюдалась генерализации инфекционного процесса на 7-е сутки и высокая степень обсемененности. При введении метилглюкамина акридонацетата его эффект проявился лишь через две недели. При этом он составлял больше 100 КОЕ у 50% животных, меньше 100 КОЕ – у 33,3% и меньше 50 КОЕ – у 16,7%. О положительном влиянии на течение инфекционного процесса используемых иммуностимуляторов свидетельствует отсутствие летальности у облученных животных. У необлученных животных, которым вводили дипептид глутамилтриптофан, генерализация инфекционного процесса через неделю снизились и наблюдалась чуть больше, чем в половине случаев. Также существенно снижалась степень обсемененности, по сравнению с животными аналогичной группы, которым вводили метилглюкамина акридонацетат. Через 2 недели генерализация инфекционного процесса наблюдалась лишь у небольшого числа животных при слабой обсемененности. Эффект от воздействия дипептида глутамил-триптофана наблюдался и у облученных животных, у половины из которых в конце первой недели инфекционного процесса снизилась степень обсемененности, а в конце второй недели генерализация наблюдалась лишь у 50% животных со слабой обсемененностью. Однако, по сравнению с необлученными животными, процент крыс с генерализованной формой инфекционного процесса и степень обсемененности внутренних органов были выше. 129 Таким образом, проведенные иммунологические, бактериологические и клинические исследования позволяют утверждать, что в пределах разработанной модели дефекта иммунологической реактивности дипептид глутамил-триптофан можно считать адекватным средством иммунокоррекции, который стимулирует активность фагоцитарных систем, содействует восстановлению баланса в цитокиновом профиле и повышению эффективности процессов формирования специфического иммунного ответа с соответствующими клиническими результатами. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что недостаточный уровень активации макрофагов значительное углубление дисбаланса и нейтрофилов, и про- и противовоспалительных цитокинов при остром диссеминированном кандидозе можно считать одними из характерных и, возможно, ключевыми показателями дестабилизации деятельности системы иммунологической резистентности. Это вытекает из прямых исследований инфекционном фагоцитоза процессе в и цитокинового облученном профиля организме, при позволяющих предполагать патогенетичность этих механизмов, а также из результатов попыток коррекции патогенетичность обнаруженных данных механизмов. изменений, Дипептид подтверждающих глутамил-триптофан сильнее стимулирует фагоцитоз, чем метилглюкамина акридонацетат. Он также нормализует баланс цитокинов, в то время как метилглюкамина акридонацетат, напротив, усугубляет дисбаланс цитокинов. Это, в свою очередь, показывает, что более высокая эффективность дипептида глутамил-триптофана, чем метилглюкамина акридонацетата, связана с разницей в механизмах действия этих иммуностимуляторов. Как указывалось, метилглюкамина акридонацетат является индуктором интерферона, влияющим на эффективность фагоцитоза. Однако на нашей модели выраженной активации фагоцитоза под влиянием этого препарата мы 130 не получили. В то же время обнаружено усугубление дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов. Дипептид глутамил-триптофан эффективно стимулирует фагоцитоз и нормализует баланс цитокинов. Бóльшая эффективность этого препарата, по-видимому, объясняется тем, что он, по данным литературы, обладает более широким спектром иммуномодулирующей активности, стимулирует специфический иммунитет. В наших исследованиях это подтверждается тем, что дипептид глутамилтриптофан способствует формированию специфического гуморального ответа на антигены Candida albicans, причем более выраженного, чем метилглюкамина акридонацетат. Кроме того, дипептид глутамил-триптофан обладает радиопротекторными и противовоспалительными свойствами, важными при терапии инфекционного процесса в облученном организме. Полученные результаты показывают, что одним из патогенетических принципов коррекции нарушений иммунологической реактивности при инфекционном процессе на фоне облучения может быть использование иммуномодуляторов, нормализующих цитокиновый баланс. 131 ВЫВОДЫ В диссертационной работе представлено теоретическое обобщение и решение актуальной научной медицинской задачи, состоящей в выявлении механизмов формирования иммунологической радиационно-индуцированных реактивности при инфекционном изменений процессе и патогенетическом обосновании коррекции этих нарушений с использованием иммунотропных препаратов (метилглюкамина акридонацетата, дипептида глутамил-триптофана). 1. Тотальное низкодозовое фракционированное рентгеновское облучение крыс (по 0,5 Gy в сутки в течение 3-х дней) приводит к дисбалансу сывороточных про- и противовоспалительных цитокинов (повышению уровня TGF-β и IL-10 и снижению содержания IFN-γ и IL-4), угнетению фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и нейтрофилов, увеличению концентрации циркулирующих иммунных комплексов и снижению активности комплемента в сыворотке крови. 2. При кандидозном сепсисе у необлученных животных концентрации IFN-γ и IL-4 прогрессивно нарастают на протяжении первой недели. У облученных крыс их повышение менее выражено, что, вероятно, обусловлено депрессивным воздействием облучения на противоинфекционную защиту. У облученных и инфицированных крыс наблюдаются гораздо более высокие уровни циркулирующих иммунных комплексов по сравнению с необлученными животными, что связано с нарушением функции элиминации со стороны фагоцитов и системы комплемента. Показатели генерализации инфекционного процесса и степени обсемененности внутренних органов у облученных крыс также выше, чем у необлученных. 3. При кандидозной инфекции, как у облученных, так и у необлученных животных, дипептид глутамил-триптофан нормализует баланс 132 цитокинов, в то время как метилглюкамина акридонацетат, напротив, усугубляет дисбаланс цитокинов. Дипептид глутамил-триптофан также сильнее стимулирует фагоцитоз, чем метилглюкамина акридонацетат. 4. Дипептид глутамил-триптофан способствует формированию более выраженного специфического гуморального ответа на антигены Candida albicans и более эффективно снижает показатели генерализации инфекционного процесса и степени обсемененности внутренних органов, чем метилглюкамина акридонацетат. 5. Значительное углубление дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов и недостаточный уровень активации макрофагов и нейтрофилов при остром диссеминированном кандидозе можно считать одними из характерных и, возможно, ключевыми показателями дестабилизации деятельности системы иммунологической резистентности. Одним из патогенетических принципов коррекции нарушений иммунологической реактивности при инфекционном процессе на фоне облучения может быть использование иммуномодуляторов, нормализующих цитокиновый баланс. 133 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Williams J. P. Animal Models for Medical Countermeasures to Radiation Exposure / J. P. Williams, S. L. Brown, G. E. Georges, M. HauerJensen, R.P. Hill, A. K. Huser, D.G. Kirsch, T. J. MacVittie, K. A. Mason, M. M. Medhora, J. E. Moulder, P. Okunieff, M. F. Otterson, M. E. Robbins, J. B. Smathers, W. H. McBride, // Radiat. Res. -2010, - Vol. 173. - P. 557 – 578. 2. Васильев, Н. В. Медико-социальные последствия ядерных катастроф / Н. В. Васильев, В. И. Мальцев, В. Н. Коваленко, В. М. Шубик, В. Ф. Москаленко, Ю. Л. Волянский, Т. И. Коляда, В. М. Пономаренко, З. М. Парамонов // «Здоров'я». – 1999. – 197 С. 3. Шойхет, Я. Н. Иммунная система населения, подвергшегося воздействия на следе ядерного взрыва / Я. Н. Шойхет, В. А. Козлов, В. И. Коненков, В. И. Киселев, С. В. Сенников, И. Б. Колядо, А. И. Алгазин, В. Б. Колядо, Е. В. Зайцев // Барнаул. - 2000. – 179 с. 4. DiCarlo, A. L. Development and Licensure of Medical Countermeasures for Platelet Regeneration after Radiation Exposure / A. L. DiCarlo, M. Poncz, D. R. Cassatt, J. R. Shah, C. W. Czarniecki, B. W. Maidment // Rad. Res. – 2011. – V. 176. P. 134–137. 5. Augustine D. Animal models for radiation injury, protection and therapy // D. Augustine, T. Gondre-Lewis, W. McBride, L. Miller, T. C. Pellmar, S. Rockwell // Radiat. Res. – 2005. – Vol. 164, - P. 100–109. 6. Самбур М.Б. Динамика состояния системы иммунитета крыс в процессе адаптации к однократному и фракционированному воздействию малых доз внешнего γ-облучения / М. Б. Самбур, О. Ф. Мельников, С. В. Тимченко, М. Д. Тимченко // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1994. - №1. - Т.34. - С. 55 - 63. 134 7. Самбур М.Б. Морфологическая характеристика центральных и периферических органов системы иммунитета крыс в динамике адаптации к внешнему γ-облучению в малых дозах // М. Б. Самбур, Л. П. Калиновская, О. Ф. Мельников, Л. Г. Розенфельд // Радиационная биология. Радиоэкология. 1998. - № 2. - Т.38. - С. 191-199. 8. Шмакова, Н.Л. Цитогенетические эффекты малых доз облучения в клетках млекопитающих: анализ ферментов гиперчувствительности и индуцированной резистентности // Н. Л. Шмакова, Т. А. Фадеєва, Е. А. Насонова // Радиационная биология. - Радиоэкология. - 2002. - № 3. - Т.42. С.245 - 250. 9. Гриневич Ю.А. Иммунные и цитогенетические эффекты плотно- и редкоионизирующих излучений: Монография // Ю. А. Гриневич, Э. А. Демина, под ред. А. А. Ярилина - К.: Здоров'я, 2006. - 200 с. 10. Zhang, H. The Development of Classically and Alternatively Activated Macrophages Has Different Effects on The Varied Stagesof Radiationinduced Pulmonary Injury in Mice / H. Zhang, G. Han, H. Liu, J. Chen, X. Ji, F. Zhou, Y. Zhou, C. Xie // J. Radiat. Res. – 2011. – V. 52. – P. 717 – 726. 11. Rizvi A. Low-dose gamma-rays and simulated solar particle event protons modify splenocyte gene and cytokine expression patterns [Text] / A. Rizvi, M. J. Pecaut, D. S. Gridley // J. Radiat. Res., - 2011. – V. 52. – P. 701–711 12. Brook I. Susceptibility of the irradiated mice to Bacillus anthracis Sterne by intratracheal route of infection // I. Brook, T. B. Elliot, R. A. Harding // J. Med.Microbiology, - 2011. – V. 50. - P. 702 - 711 13. Chang, C. M. Ionizing radiation and bacterial challenge alter splenic cytokine gene expression [Text] / C. M. Chang, T. B. Elliott, M. E. Dobson, et al. // J. Radiat. Res. – 2000, - V. 41. – P. 259–277 14. Ryu T. Transplantation of newborn thymus plus hematopoietic stem cells can rescue supralethally irradiated mice // T. Ryu, N. Hosaka, T. Miyake, W. 135 Cui, T. Nishida, T. Takaki, M. Li, K. Kawamoto, S. Ikehara // Bone Marrow Transplant – 2008, - Vol. 41. – P. 659–666 15. Yoshino H. Differential induction from X-irradiated human peripheral blood monocytes to dendritic cells // H. Yoshino, K. Takahashi, S. Monzen, I. J. Kashiwakura // J. Radiat. Res. – 2008, - Vol. 49. – P. 293–303 16. Anno G. H. Dose response relationships for acute ionizing-radiation lethality // G. H. Anno, R. W. Young, R. M. Bloom, J. R. Mercier // Health Phys. – 2003, - Vol. 84. – P. 565–575. 17. Gridley D. S. Radiation and primary response to lipopolysaccharide: bone marrow-derived cells and susceptible organs in vivo // D. S. Gridley, G. M. Miller, M. J. Pecaut –2007, – V. 21. - P. 453-462 18. Ibuki Y. Contribution of inflammatory cytokine release to activation of resident peritoneal macrophages after in vivo low-dose γ-irradiation [Text] / Yuko Ibuki, Rensuke Goto // Journal of Radiation Research. – 1999. – V. 40. - № 3. – P. 253 - 262 19. Gremy O. Caffeic acid phenethyl ester modifies the Th1/Th2 balance in ileal mucosa after y-irradiation in the rat by modulating the cytokine pattern [Text] / O. Gremy, M. Benderiter, C. Linard // World. J. Gastroenterol. - 2006. – V. 12. - № 31. – P. 4996-5004 20. Coates P.J. Indirect macrophage responses to ionizing radiation: implications for genotype-dependent bystander signaling [Text] / P.J. Coates, J.K. Rundle, S.A. Lorimore, E.G. Wright // Cancer Res. – 2008. – V.68. - №2. – P. – 21. Flierl M. A. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis [Text] / M. A. Flierl, Rittirsch D., Gao H., Hoesel L. M. et al. // FASEB J. – 2008. – V. 22. – P. 2198–2205 22. van der Veerdonk F. L. Th17 responses and host defense against microorganisms: an overview [Text] / F. L. van der Veerdonk, M. S. Gresnigt, B. 136 J. Kullberk, J. W. M. van der Meer et al. // BMB reports. - 2009. – V. 42. - № 12. – P. 776 - 787 23. Passos S. T. IL-6 Promotes NK cell production of IL-17 during toxoplasmosis [Text] / S. T. Passos, J. S. Silver, A. C. O’Hara, D. Sehy et al. // The journal of immunology. – 2010. –V. 184. – P. 1776–1783 24. Wang Y. Activated CD4+ T cells enhance radiation effect through the cooperation of interferon-γ and TNF-α [Text] / Y. Wang, S. Radfar, H. T. Khong // BMC Cancer. – 2010. –V. 10. – P. 60 – 73 25. Keestra, A. M. Early MyD88-dependent induction of interleukin-17A expression during Salmonella colitis [Text] / A. M. Keestra, I. Godinez, M. N. Xavier, M. G. Winter et al. // Infection and immunity. – 2011. – V. 79. - № 8. –P. 3131-3140. 26. Zhang P. Activation of IKK by thymosin a1 requires the TRAF6 signalling pathway [Text] / P. Zhang, J. Chan, A.-M. Dragoi, X. Gong et al. // EMBO reports. – 2005. – V. 6. - № 6. – P. 531-538 27. Zhang Y. Thymosin alpha1- and ulinastatin-based immunomodulatory strategy for sepsis arising from intra-abdominal infection due to carbapenemresistant bacteria [Text] / Y. Zhang, H. Cheng, Y. M. Li, S. S. Zheng et al. // J Infect Dis. – 2008. – Vol. 198. - №5. – P. 723-30 28. Yang X. Effect of thymosin alpha-1 on subpopulations of Th1, Th2, Th17, and regulatory T cells (Tregs) in vitro [електронний ресурс] / X. Yang, F. Qian, H.-Y. He, K.-J. Liu et al. // Brazilian Journal of Medical and Biological Research Online Provisional Version. – 2011.: www.bjournal.com.br 29. Klebanoff C. A. Sinks, suppressors and antigen presenters: how lymphodepletion enhances T cell-mediated tumor immunotherapy // C. A. Klebanoff, H. T. Khong, P. A. Antony, D. C. Palmer, N. P. Restifo // Trends Immunol. – 2005, - Vol. 26. - P. 111–117 137 30. MacVittie T. J. Defining the full therapeutic potential of recombinant growth factors in the post radiation-accident environment: the effect of supportive care plus administration of G-CSF // T. J. MacVittie, A. M. Farese, W. Jackson 3rd. // Health Phys. – 2005, - Vol. 89. – P. 546–555 31. Olascoaga D. Wound healing in radiated skin: pathophysiology and treatment options // D. Olascoaga, A. Vilar-Compte, A. Poitevin-Chacon, J. Contreras-Ruiz // Int. Wound J. – 2008, - Vol. 5. – P. 246–257 32. Chen X. M. Immunomodulatory function of orally administered thymosin α1 [Text] / X. – M. Chen, H.-L. Jiang, L.-F. Zhou, X.-P. Pan et al. // Zhejiang Univ. Sci. – 2005, –Vol. 6B. - № 9. – P. 873-876. 33. Клиническая фармакология тимогена / под ред. В.С. Смирнова. // СПб:, 2003. С.156. 34. Yao Q. Thymosin-alpha1 modulates dendritic cell differentiation and functional maturation from human peripheral blood CD14+ monocytes [Text] / Q. Yao, L. X. Doan, R. Zhang, U. Bharadwaj et al. // Immunol. Lett. – 2007. – Vol. 110. - № 2. – P. 110 - 120 35. De Chadarevian S. Mice and the reactor: the “genetics experiment” in 1950s / S. De Chadarevian - Britain. J. Hist. Biol. – 2006. - Vol. 39. P. 707–735 36. FDA New drugs and biological drug products: evidence needed to demonstrate effectiveness of new drugs when human efficacy studies are not ethical or feasible, In Federal Register, Std. 37988–37998. – 2002. - Washington, 37. Давыдовский, И. В. Общая патология человека / И. В. Давыдовский. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : Медицина, 1969. – 611 с. 38. Sereti, A. Biomarkers in Immune Reconstitution Inflammatory Syndrome: Signals from Pathogenesis [Text] / I. Sereti, A. J. Rodger, M. A. French // Curr. Opin. HIV AIDS. – 2010. – V. 5. - № 6. – P. 504–510. 138 39. Кузник Б.И. Иммуногенез и неспецифическая резистентность организма / Б. И. Кузник, Н. В. Васильев, Н. Н. Цыбиков — М. : Медицина, 1989.320 с. 40. Коляда Т. И. Адаптационный синдром и иммунитет / Т. И. Коляда, Ю. Л. Волянский, Н. В. Васильев, В. И. Мальцев — Харьков, 1995.368 с. 41. Игнатьева Г. А. Современные представления об иммунитете (контуры общей теории) / Г. А. Игнатьева // Патол. физиология и эксперим. терапия. – 2003. – № 2. – С. 2 – 7. 42. Горицький В. М. Запалення – типовий патологічний процес / В. М. Горицький М. С. Регеда / Проблеми патології в експерименті та клініці : зб. наук. праць. – Львів - 1996. – Т. 17. – С. 155 – 180. 43. Медведецкий Е. Б. Маркеры воспаления и их клиническое значение / Е. Б. Медведецкий, В. А. Деев, В. П. Шкарбан / Клініч. хірургія. – 2005. – № 11/12. – C. 42. 44. Никоненко А. Г. Современные представления о механизмах регуляции воспалительного процесса / А. Г. Никоненко - Биол. терапия. – 2006. – № 1. – С. 11 – 16. 45. Ройт А. Иммунология: пер. с. англ. / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл — М.: Мир, 2000. — 592 с, ил. 46. Дранник Г.М. Клінічна імунологія та алергологія [Текст] / Г. М. Дранник, О.С. Прилуцький, Ю.И. Бажора - Підручник під ред. Г. М. Драник К.: Здоров’я, 2006. - 888 с. 47. Чоп'як В.В. Клінічна імунологія для практичних лікарів (цикл лекцій частина перша) [Текст] / В. В, Чоп'як, Г. О. Потьомкіна, А. М. Гаврилюк – Л, 2010. - 226 с. 48. Якобісяк М. Імунологія / М. Якобісяк під ред. В. В. Чоп'як, Вінниця: Нова книга. - 2003. - 705 с. 139 49. Lopez A. F. Molecular basis of cytokine receptor activation / A. F. Lopez, T. Hercus, R. P. Ekert et al. - IUBMB Life. – 2010. – Vol. 62, № 7. – P. 509–518. 50. Bordon Y. Cytokines: Cytokines reach out / Y. Bordon - Nat. Rev. Immunol. – 2010. – Vol. 10, № 6. – Р. 382. 51. Ishii H. Inflammatory cytokines / H. Ishii, M. Yoshida - Nippon Rinsho. – 2010. – Vol. 68, № 5. – P. 819–822. 52. Schett G. Effects of inflammatory and anti-inflammatory cytokines on the bone / G. Schett - Eur. J. Clin. Invest. – 2011. May 25. doi: 10.1111/j.13652362.2011.02545.x. [Epub ahead of print]. 53. Goriely S. Interleukin-12 family members and type I interferons in Th17-mediated inflammatory disorders / S. Goriely, R. Cavoy, M. Goldman Allergy. – 2009. – Vol. 64, № 5. – P. 702–709. 54. Hamza T. Interleukin 12 a key immunoregulatory cytokine in infection applications / T. Hamza, J. B. Barnett, B. Li - Int. J. Mol. Sci. – 2010. – Vol. 11, № 3. – P. 789–806. 55. Cyktor J. C. Interleukin-10 and immunity against prokaryotic and eukaryotic intracellular pathogens [Text] / J. C. Cyktor, J. Turner - Infection and immunity. - 2011. – V. 79. - № 8. –P. 2964–2973. 56. Moore K. W. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor // K. W. Moore, R. de Waal Malefyt, R. L. Coffman, A. O'Garra - Annu. Rev. Immunol. 2001. – Vol. 19. – P. 683–765. 57. Saraiva M. The regulation of IL-10 production by immune cells / M. Saraiva, A. O'Garra - Nat. Rev. Immunol. - 2010. – Vol. 10. – P. 170–181. 58. Stumhofer J. S. Interleukins 27 and 6 induce STAT3-mediated T cell production of interleukin 10 / J. S. Stumhofer et al. - Nat. Immunol. - 2007. – Vol. 8. – P. 1363–1371. 140 59. McGeachy M. J. TGF-beta and IL-6 drive the production of IL-17 and IL-10 by T cells and restrain T(H)-17 cell-mediated patholog / M. J. McGeachy et al. - Nat. Immunol. – 2007. – Vol. 8. - P. 1390–1397. 60. Fitzgerald D. C. Suppression of autoimmune inflammation of the central nervous system by interleukin 10 secreted by interleukin 27-stimulated T cells / D. C. Fitzgerald et al. - Nat. Immunol. – 2007. – Vol. 8. P. 1372–1379. 61. Murugaiyan G. IL-27 is a key regulator of IL-10 and IL-17 production by human CD4+ T cells / G. Murugaiyan, A. Mittal, R. Lopez-Diego, L. M. Maier, D. E. Anderson, H. L. Weiner - J. Immunol. – 2009. – Vol. 183. – P. 2435–2443. 62. Nemeth Z. H. Adenosine augments IL-10 production by macrophages through an A2B receptor-mediated posttranscriptional mechanism / Z. H. Nemeth et al. - J. Immunol. – 2005. – Vol. 175. – P. 8260–8270. 63. Guichelaar T. Autoantigen-specific IL-10-transduced T cells suppress chronic arthritis by promoting the endogenous regulatory IL-10 response / T. Guichelaar et al. - J. Immunol. – 2008. – Vol. 180. - P. 1373–1381. 64. Horwitz D. A. Natural and TGF-β-induced Foxp3+CD4+ CD25+ regulatory T cells are not mirror images of each other / D. A. Horwitz, S. G. Zheng, J. D. Gray - Trends Immunol. – 2008. – Vol. 29. – P. 429–435 65. Mantel P. Y. Transforming growth factor-β: recent advances on its role in immune tolerance / P. Y. Mantel, C. B. Schmidt-Weber - Methods Mol. Biol. – 2011. – Vol. 677. – P. 303–338 66. Shevach E. M. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression / E. M. Shevach - Immunity - 2009. – Vol. 30. – P. 636–645 67. Wahl S. M. Transforming growth factor-β: innately bipolar / S. M. Wahl - Curr. Opin. Immunol. – 2007. – Vol. 19. – P. 55–62 68. Yoshimura A. TGF-β function in immune suppression / A. Yoshimura, G. Muto - Curr. Top Microbiol. Immunol. – 2011. – Vol. 350 – P. 127–147 141 69. Kulkarni A. Inflammatory myositis in association with inflammatory bowel disease / A. Kulkarni, T. J. Ravi, G. J. Brodmerkel Jr., R. M. Agrawal - Dig. Dis. Sci. – 1997. – Vol. 42. – P. 1142–1145. 70. Mi S. Blocking IL-17A promotes the resolution of pulmonary inflammation and fibrosis via TGF-β1-dependent and -independent mechanisms / S. Mi, Z. Li, H. Z. Yang, H. Liu, J. P. Wang, Y. G. Ma, X. X. Wang, H. Z. Liu, W. Sun, Z. W. Hu - J. Immunol. – 2011. – Vol. 187. – P. 3003–3014 71. Dwivedi V.P. Transforming Growth Factor-β Protein Inversely Regulates in Vivo Differentiation of Interleukin-17 (IL-17)-producing CD4+ and CD8+ T Cells / V. P. Dwivedi, S. Tousif, D. Bhattacharya, D. V. R. Prasad, L. V. Kaer, J. Das, G. Das - The Journal Of Biological Chemistry – 2012. - Vol. 287. No. 5, pp. 2943–2947 72. Harrington L.E. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages / L. E. Harrington, R. D. Hatton, P. R. Mangan, H. Turner, T. L. Murphy, K. M. Murphy, C. T. Weaver - Nat Immunol. – 2005, Nov. - Vol. 6 (11). P. 1123-32. Epub 2005 Oct 2. 73. Ivanov I. I. Transcriptional regulation of Th17 cell differentiation / I. I. Ivanov, L. Zhou, D. R. Littman // Semin Immunol. – 2007. - Dec;19 (6): 409-17. Epub 2007 Nov 28. 74. Mathur A.N. T-bet is a critical determinant in the instability of the IL17-secreting T-helper phenotype / A. N. Mathur, H. C. Chang, D. G. Zisoulis, R. Kapur, M. L. Belladonna, G. S. Kansas, M. H. Kaplan // Blood. – 2006. - Sep 1;108(5):1595-601. 75. Schett G. Review: Immune cells and mediators of inflammatory arthritis / G. Schett // Autoimmunity – 2008. - Apr;41(3):224-9. Review. 142 76. Schett G. Denosumab - a novel strategy to prevent structural joint damage in patients with RA? / G. Schett, J. P. David // Nat. Clin. Pract. Rheumatol. – 2008. - Dec;4(12):634-5. Epub 2008 Oct 7. 77. Pollard K.M. Using single-gene deletionsto identify checkpoints in the progression of systemic autoimmunity / K. M. Pollard, P. Hultman, D. H. Kono // Ann. NY Acad. Sci. – 2003. - 987:236–239. doi:10.1111/j.1749-6632.2003. 78. Sebba A. Tocilizumab: the first interleukin-6-receptor inhibitor / A. Sebba // Am. J. Health Syst. Pharm. – 2008. – Vol. 65. – P. 1413–1418. 79. Yang X.O. T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma / X. O. Yang, B. P. Pappu, R. Nurieva, A. Akimzhanov, H. S. Kang, Y. Chung, L. Ma, B. Shah, A. D. Panopoulos, K. S. Schluns, S. S. Watowich, Q. Tian, A. M. Jetten, C. Dong // Immunity – 2008. - Jan;28 (1): P. 29-39. Epub 2007 Dec 27. 80. de Keijzer S. Interleukin-4 alters early phagosome phenotype by modulating class I PI3K dependent lipid remodeling and protein recruitment / S. de Keijzer, M. B. Meddens, D. Kilic, B. Joosten, I. Reinieren-Beeren, D. S. Lidke, A. Cambi // PLoS One. – 2011. – Vol. 6 (7):e22328. Epub 2011 Jul 25. 81. Шевелев С. В. Иммунологические способности последствия индукции антител к IFN-гамма и IL-4 у мышей / С. В. Шевелев, А. Н. Митин // Цитокины и воспаление. – 2008. – № 3. – С. 3–8. 82. Gordon S. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions / S. Gordon, F. O. Martinez // Immunity – 2010. – Vol. 32. – P. 593–604. 83. Wainszelbaum M. J. IL4/PGE2 induction of an enlarged early endosomal compartment in mouse macrophages is Rab5-dependent / M. J. Wainszelbaum, B. M. Proctor, S. E. Pontow, P. D. Stahl, M. A. Barbieri // Exp. Cell. Res. – 2006. – Vol. 312. – P. 2238–2251 84. Varin A. Alternative activation of macrophages by IL-4 impairs phagocytosis of pathogens but potentiates microbial-induced signalling and 143 cytokine secretion / A. Varin, S. Mukhopadhyay, G. Herbein, S. Gordon // Blood. – 2010. – Vol. 115. – P. 353–362 85. Loke P. Alternative activation is an innate response to injury that requires CD4+ T cells to be sustained during chronic infection / P. Loke, I. Gallagher, M. G. Nair, X. Zang, F. Brombacher, et al. // J. Immunol. – 2007. – Vol. 179. P. 3926–3936 86. Серебренникова С. Н. Роль цитокинов в воспалительном процессе (Сообщение 2) / С. Н. Серебренникова, И. Ж. Семинский // Сиб. мед. журнал. – 2008. – № 8. – С. 5–8. 87. Weiss U. Inflammation / Nature. – 2008. – Vol. 454, № 7203. – P. 427. 88. Черноморец П. М. Основные современные данные о механизмах воспаления. Основные механизмы развития острого воспаления: взгляд современной физиологии / П. М. Черноморец, А. В. Жолос // Антигомотоксическая терапия острых воспалительных заболеваний: тез. Междунар. науч.-практ. симпозиума. – К., 2006. – С. 6–21. 89. Novotny A. R. Biomarkers in SIRS and sepsis: Quo vadis? / A. R. Novotny // J. Emerg. Trauma Shock. – 2010. – Vol. 3, № 1. – P. 36–38. 90. Bone R.C., Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS / R. C. Bone // Crit Care Med. – 1996. - Jul;24(7) – P. 1125-1128. 91. Козлов В.А. Клиническая иммунология в клинике внутренних болезней / В. А. Козлов – Новосибирск: Типография СО РАМН, 1997. – 21 с. 92. Mossman R.T. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more / R. T. Mossman, S. Sad // Immunology Today. – 1996. - V. 17, N3. P. 138 – 146. 93. Cao, M. Gamma irradiation alters the phenotype and function of CD4+CD25+ regulatory T cells [Text] / M. Cao, R. Cabrera, Y. Xu, C. Liu, D. Nelson // Cell. Biol. Int. – 2009. – V. 33. - № 5. – P. 565–571 144 94. Liu, S. – Z. Nonlinear dose response relationship in the immune system following exposure to ionizing irradiation: mechanisms and implications [Text] / S. – Z. Liu // Nonlinearity in Biology, Toxicology and Medicine. – 2003. – V. 1. - № 1. – P. 71-92 95. Stone H. B. Models for evaluating agents intended for the prophylaxis, mitigation and treatment of radiation injuries / H. B. Stone, J. E. Moulder, C. N. Coleman, K. K. Ang, M. S. Anscher, M. H. Barcellos-Hoff, W. S. Dynan, J. R. Fike, D. J. Grdina, D. Zaharevitz // Report of an NCI Workshop, December 3–4, 2003. Radiat. Res. – 2004. Vol. 162. - P. 711–728 (2004). 96. McBride W. H. A sense of danger from radiation / W. H. McBride, C. S. Chiang, J. L. Olson, C. C. Wang, J. H. Hong, F. Pajonk, G. J. Dougherty, K. S. Iwamoto, M. Pervan, Y. P. Liao, // Radiat. Res. – 2004. Vol. 162. – P. 1–19 97. Yoshino H. Differential induction from X-irradiated human peripheral blood monocytes to dendritic cells / H. Yoshino, K. Takahashi, S. Monzen, I. J. Kashiwakura // Radiat. Res. – 2008. – Vol. 49. – P. 293–303 98. Thompson, A. L. Cytokines: the future of intranasal vaccine adjuvants [Text] / A. L. Thompson, H. F. Staats // Clinical and Developmental Immunology. – 2011. - V. 2011. - Article ID 289597. – 17 p 99. Плехова Е.И. Характеристика иммуногормональных связей на этапе позднего полового созревания у здоровых подростков и потомков ликвидаторов последствий чернобыльской катастрофы / Е. И. Плехова, Н. В. Шляхова // Проблеми ендокринної патології - №2, 2011. – С. 12 – 16. 100. Ярилин А.А. Действие ионизирующей радиации на лимфоциты (повреждающий и активирующий эффекты) / А. А. Ярилин // Иммунология. 1988. - № 5. - С. 5-11. 101. Бычковская И. Б. Особые долговременные изменения клеток при воздействии радиации в малых дозах / И. Б. Бычковская, Р. П. Степанов, Р. Ф. 145 Федорцева // Радиационная биология. Радиоэкология. -2002. - №1. - Т.42. - С. 20-35. 102. Губский В.И. Пострадиационные изменения структуры плазматических мембран тимоцитов и лимфоцитов при фракционированном облучении крыс / В. И. Губский, В. И. Древаль, Н. А. Митряева // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1994. - № 6. - Т.34. 103. Клименко М.О. Вплив низькоінтенсивного γ-випромінювання на клітинний склад вогнища хронічного запалення / М. О. Клименко, М. І. Онищенко // Фізіол. журн. - 2004. - №6. - Т.50. - С. 88-94. 104. Пинчук Л.Б. Состояние костномозгового кроветворения у крыс / Л. Б. Пинчук, Я. И. Серкиз, Н. К. Родионова // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1991. - №5. - Т.31. - С. 635 -641. 105. Мельников О.Ф. Состояние клеточного иммунитета у разных поколений крыс / О. Ф. Мельников, М. Б. Самбур, В. М. Индык // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1991. - №5. - Т.31. - С. 673 -677. 106. Ручко М.В. Влияние различных доз ионизирующего излучения на функциональную активность и механизмы активации лимфоидных клеток селезенки и тимуса крыс при воздействии стимулирующего сигнала / М. В. Ручко, Л. И. Остапченко, О. Е. Налевина, Н. Е. Кучеренко // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1994. - №2. - Т.34. - С. 247 - 250. 107. Савцова З.Д. Кооперативные иммунные реакции у различных поколений мышей / З. Д. Савцова, С. А. Ковбасюк, О. Ю. Юдина // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1991. - №5. - Т.31. - С. 679 -686. 108. Серкиз Я.И. Модель эксперимента. Радиационные нагрузки у животных, постоянно находившихся в условиях внешнего и внутреннего радиационного воздействия в зоне ЧАЭС / Я. И. Серкиз, А. И. Липская, Л. Б. Пинчук // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1991. - №5. - Т.31. - С. 629 - 634. 146 109. Амвросьев А.П. Состояние кровеносных капилляров яичника плодов белой крысы после облучения в различные периоды их эмбриогенеза / А. П. Амвросьев, О. Н. Аблековская // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2001. - №4. - Т.41. - С. 373-377. 110. Амвросьев А.П. Влияние однократного внешнего γ-облучения в дозе 0,5 Гр на развитие зародышей крысы / А. П. Амвросьев, Ю. И. Рогов, Р. И. Дорохина, В. С. Павленко // Радиационная биология. Радиоэкология. 1993. - №2 (5). - Т.33. 111. Бурлакова Е.Б. Особенности биологического действия малых доз облучения / Е. Б. Бурлакова, А. Н. Голощапов, Н. В. Горбунова // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1996. - № 4. - Т.36. - С. 611-631. 112. Клименко М.О. Вплив низько інтенсивного γ-випромінювання на кістковий мозок при хронічному запаленні / М. О. Клименко, В. В. Золотухін // Укр. радіол. журн. - 2006. - Т.41, вип. 1. - С. 42-46. 113. Клименко М.О. Лейкоцитарная реакция периферической крови при действии низкоинтенсивного γ-излучения на фоне хронического воспаления / М. О. Клименко, В. В. Золотухін // Експерим. і клін. медицина. 2006. - №2. - С. 22-25. 114. Клименко М.О. Лейкоцитарная реакция очага хронического воспаления при действии низкоинтенсивного γ-излучения / М. О. Клименко, В. В. Золотухін // Експерим. і клін. медицина. - 2006. - №3. - С.5-9. 115. Klimenko N.A. Cellular response on low dose-rate gamma-irradiation at chronik inflammation in rats / N. A. Klimenko, V. I. Onyshchenko, O. S. Varvarycheva, V. V. Zolotukhin // Chin. J. Pathophysiol. - 2006. - Vol. 22, №13. Р. 353. 116. Клименко М.О. Вплив низькоінтенсивного γ-випромінювання на хемілюмінесценцію тканин тимуса при хронічному запаленні / М. О. 147 Клименко, О. С. Варваричева // Експерим. і клін. медицина. - 2006. - №2. С.17-21. 117. Клименко М.О. Експресія білка р53 у лімфоцитах тимуса й селезінки щурів при дії низькоінтенсивного гамма-випромінювання на тлі хронічного запалення / М. О. Клименко, О. С. Варваричева // Укр. радіол. журн. - 2007. - Т.15, № 1. - С. 71-75. 118. Клименко Н.А. Морфологические изменения тимуса под влиянием низкоинтенсивного γ-облучения при хроническом воспалении / Н. А. Клименко, И. В. Сорокина, О. С. Варваричева // Медицина сьогодні і завтра. - 2006. - № 3-4. - С.42-49. 119. Кузьменко А.В. Индивидуальные особенности восстановления показателей иммунитета крыс после общего однократного рентгеновского облучения / А. В. Кузьменко, М. О. Иваненко, Н. А. Никифорова / / Украинский радиологический журнал. — 2008. — Т. XVII, вып.2. — С. 206 — 210. 120. Liu, C. Gamma-ray irradiation impairs dendritic cell migration to CCL19 by down-regulation of CCR7 and induction of cell apoptosis [Text] / C. Liu, J. Lin, L. Zhao, Y. Yang et al. // Int. J. Biol. Sci. - 2011. – V. 7. – № 2. – P. 168-179 121. Gridley, D. S. Low dose, low dose photon radiation modifies leukocyte distribution and gene expression in CD4+ Cells [Text] / D. S. Gridley, A. Rizvi, X. Luo-Owen, A. Y. Makinde, M. Pecaut // J. Radiat, Res. – 2009. – V. 50. – P. 139-150 122. Narang H. Mitogen-activated protein kinases: specificity of response to dose of ionizing radiation in liver / H. Narang, M. Krishna // J Radiat Res. 2004 Jun;45(2):213-20. 123. Gallet., P. Long-term alterations of cytokines and growth factors expression in irradiated tissues and relation with histological severity scoring 148 [Електронний ресурс] / P. Gallet., B. Phulpin., J. Merlin, A. Leroux, P. Bravetti, H. Mecellem, N. Tran, G. Dolivet // PlosONE. – 2011. – V. 6. – Issue 12. –P. 293299. 124. Shigematsu, S. Effects of Low-dose Irradiation on Enhancement of Immunity by Dendritic Cells / S. Shigematsu, Y. Adachi, N. Koike-Kiriyama, Y. Suzuki, M. Iwasaki, Y. Koike, K. Nakano, H. Mukaide, M. Imamura, S. Ikehara // J. Radiat. Res. – 2007. – Vol. 48. – P. 51-55 125. Soule, B. P. Effects of gamma radiation on FcεRI and TLR-mediated mast cell activation [Text] / B. P. Soule, J. M. Brown, N. M. Kushnir-Sukhov, N. L. Simone et al. // The Journal of Immunology. - 2007. –V. 179. –P. 3276–3286. 126. Scaldaferri F. Inflammatory bowel disease: progress and current concept of etiopathogenesis / F. Scaldaferri, C. Fiocchi // J. Dig. Dis. – 2007. – Vol. 8. – P. 171–178. 127. Garga, S. Influence of sublethal total-body irradiation on immune cell populations in the intestinal mucosa [Text] / S. Garg, M. Boerma, J. Wang, Q. Fu et al. // Radiat Res. – 2010. – V. 173. - № 4. - P. 469–478 128. Linard, C. Acute induction of inflammatory cytokine expression after gamma-irradiation in the rat: effect of an NF-κB inhibitor / C. Linard, C. Marquette, J. Mathieu, A. Pennequin, D. Clarencon, D. Mathe // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. – 2004. – Vol. 58. – P. 427–434. 129. Gremy, O. Acute and persisting Th2-like immune response after fractionated colorectal gamma-irradiation / O. Gremy, M. Benderitter, C. Linard // World J. Gastroenterol. – 2008.- Vol. 14. P. - 7075–7085. 130. MacDonald, T. T. The mucosal immune system / T. T. MacDonald // Parasite Immunol. – 2003. – Vol. 25. – P. 235–246. 131. Han, S. K. Effect of gamma radiation on cytokine expression and cytokinereceptor mediated STAT activation / S. K. Han, J. Y. Song, Y. S. Yun, S. Y. Yi, // Int. J. Radiat. Biol. – 2006. – Vol. 82. - P. 686–697. 149 132. Park, H. R. Factors effecting the Th2-like immune response after gamma-irradiation: low production of IL-12 heterodimer in antigen-presenting cells and small expression of the IL-12 receptor in T cells / H. R. Park, S. K. Jo, S. G. Paik // Int. J. Radiat. Biol. – 2005. – Vol. 81. P. 221–231. 133. Reissfelder, C. A randomized controlled trial to investigate the influence of low dose radiotherapy on immune stimulatory effects in liver metastases of colorectal cancer [Електронний ресурс] / C. Reissfelder, C. Timke, H. Schmitz-Winnenthal, N. N. Rahbari, M. Koch, F. Klug, F. Roeder, L. Edler, J. Debus, M. W. Büchler, P. Beckhove, P. E. Huber, J. Weitz // BMC Cancer. – 2011. – P. 11:419. 134. Saito-Fujita, T. Attenuated lung fibrosis in interleukin 6 knock-out miceafter c-ion irradiation to lung / T. Saito-Fujita, M. Iwakawa, E. Nakamura, M. Nakawatari, H. Fujita, T. Moritake, T. Imai // J. Radiat. Res. – 2011. – V. 52. - P. 270–277. 135. Kiyohara, H Radiation-induced ICAM-1 Expression via TGF-β1 Pathway onHuman Umbilical Vein Endothelial Cells; Comparisonbetween X-ray and Carbon-ion Beam Irradiation / H. Kiyohara, Y. Ishizaki, Y. Suzuki, H. Katoh, N. Hamada, T. Ohno, T. Takahashi, Y. Kobayashi, T. Nakano // J. Radiat. Res. – 2011. – V. 52. – P. 287–292. 136. Conti, H. R. Host responses to Candida albicans: Th17 cells and mucosal candidiasis [Text] / H. R. Conti, S. L. Gaffen // Microbes Infect. – 2010. – V. 12. - № 7. – P. 518–527. 137. Fitzgerald D. C. Suppression of autoimmune inflammation of the central nervous system by interleukin 10 secreted by interleukin 27-stimulated T cells / D. C. Fitzgerald et al. // Nat. Immunol. – 2007. – Vol. 8. – P. 1372–1379. 150 138. Abba, M. C. GATA3 protein as a MUC1 transcriptional regulator in breast cancer cells / M. C. Abba, M. I. Nunez, A. G. Colussi, M. V. Croce, A. Segal-Eiras, C. M. Aldaz // Breast Cancer Res. – 2009.- Vol. 8. – P. 64. 139. Cash, H. L. Symbiotic bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin / H. L. Cash, C. V. Whitham, C. L. Behrendt, L. V. Hooper – Science – 2006. – Vol. 313. - P. 1126–1130. 140. Aubert, D. Characterization of specific anti-Candida IgM, IgA and IgE: diagnostic value in deep-seated infections / D. Aubert, D. PuygauthierToubas, P. Leon, B. Pignon, F. Foudrinier, F. Marnef, J. Boulant, J. M. Pinon // Mycoses. - 1996 May-Jun Vol. 39. – P. 5-6, 169-176. 141. Balish, E. Importance of beta2-microglobulin in murine resistance to mucosal and systemic candidiasis / E. Balish, F. A. Vazquez-Torres, J. JonesCarson, R. D. Wagner, T. Warner // Infect. Immun. – 1996. - Dec 64:12 5092-7. 142. Vazquez-Torres, F. A. Macrophages in resistance to candidiasis / F. A. Vazquez-Torres, E. Balish // Microbiol. Mol. Biol. - Rev. 1997. – Vol. 61, 2. P. 170-192. 143. Samaranayake, Y. H. The antifungal effect of lactoferrin and lysozyme on Candida krusei and Candida albicans / Y. H. Samaranayake, L. P. Samaranayake, P. Wu, M. So // APMIS. – 1997. - Nov. Vol. 105. –P. 875-883. 144. Wang, Y. Cytokine Involvement in Immunomodulatory Activity Affected by Candida albicans / Y. Wang, S. Li, A. Moser, K. Bost, J. Domer // Mannan. Infect. Immun. – 1998. – Vol. 66. P. 1384-1391. 145. Romani, L. Th1 and Th2 cytokine secretion patterns in murine candidiasis: association of Th1 responses with acquired resistance / L. Romani, S. Mocci, C. Bietta, L. Lanfaloni, P. Puccetti, F. Bistoni // Infect. Immun. – 1991. – Dec. Vol. 59. – P. 4647-4654. 146. Cenci, E. T helper cell type 1 (Th1)- and Th2-like responses are present in mice with gastric candidiasis but protective immunity is associated with 151 Th1 development / E. Cenci, A. Mencacci, R. Spaccapelo, L. Tonnetti, P. Mosci, K. H. Enssle, P. Puccetti, L. Romani, F. Bistoni // J. Infect. Dis. – 1995. - Vol. 171. – P. 1279-1288. 147. Ashman, R. B. Production and function of cytokines in natural and acquired immunity to Candida albicans infection / R. B. Ashman, J. M. Papadimitriou // Microbiol. Rev. – 1995. - Dec Vol. 59. - P. 646-672. 148. Romani, L. Natural killer cells do not play a dominant role in CD4+ subset differentiation in Candida albicans-infected mice. / L. Romani, A. Mencacci, E. Cenci, R.Spaccapelo, E. Schiaffella, L. Tonnetti, P. Puccetti, F. Bistoni // Infect. Immun. – 1993. – Vol. 61. - P. 3769-3774. 149. De Bernardis, F. Protective role of antimannan and anti-aspartyl proteinase antibodies in an experimental model of Candida albicans vaginitis in rats / F. De Bernardis, M. Boccanera, D. Adriani, E. Spreghini, G. Santoni, A. Cassone // Infect. Immun. – 1997. – Aug. Vol. 8. – P. 3399- 33405. 150. Wojdani, A. In vivo augmentation of natural killer cell activity by Candida albicans / A. Wojdani, M. Ghoneum // Int. J. Immunopharmacol. – 1987. – Vol.9. – P. 827-832. 151. Лебедева Т. Н. Иммунитет при кандидозе (обзор) / Т.Н. Лебедева //. Проблемы медицинской микологии. - 2004. - Т.6, №4 - С.8-16. 152. Сергеев А. Ю. Кандидоз, природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение / А. Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев // М., 2001, 472 с.. 153. Werner, G. H., Immunostimulating agents: what’s next? A review of their potential medical applications [Text] / G. H. Werner, P. Jolles // Eur. J. Biochem. – 1996. - V. 242. – P. 1-19. 154. Dawson, R. Immunomodulation with recombinant interferon-γ1β in pulmonary tuberculosis [Електронний ресурс] / Dawson, R. Condos, D. Tse, M. L. Huie // PLoS One. – 2009. – V. 4. – Issue 9. – P. e6984. 152 155. Goodbourn, S. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral responses and virus countermeasures [Text] / S. Goodbourn, L. Didcock, R. E. Randall // Journal of General Virology. – 2000. – V. 81. – P. 2341–2364. 156. Randall, R. E. Interferons and viruses: an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures / R. E. Randall, S. J. Goodbourn // J. Gen. Virol. – 2008. – Vol. 89. – P. 1-47. 157. Tilahun, A. Y. Interferon gamma-dependent intestinal pathology contributes to the lethality in bacterial superantigen- induced toxic shock syndrome [Електронний ресурс] / A. Y. Tilahun, M. Holz, T.-T. Wu, C. S. David, G. Rajagopalan // PlosOne. – 2011. – V. 6. – Issue 2. – P. e16764. 158. Yang, C. Immunosuppressive exosomes: a new approach for treating arthritis / C. Yang, P. D. Robbins // Int. J. Rheumatol. - 2012;2012:573528. Epub 2012 Mar 6. 159. Hiejima, E. Gastric ulcer and gastroenteritis caused by Epstein-Barr virus during immunosuppressive therapy for a child with systemic juvenile idiopathic arthritis / E. Hiejima, T. Yasumi, H. Kubota, K. Ohmori, K. Ohshima, R. Nishikomori, H. Nakase, T. Chiba, T. Heike // Rheumatology (Oxford). – 2012. - May 15. 160. Nurmohamed, M. T. Malignancy risk during TNF-blocking therapy increased or not? / M. T. Nurmohamed // Ned. Tijdschr. Geneeskd. – 2012. – Vol. 156(21):A4812. 161. Segal, B. H. Immunotherapy for fungal infections [Text] / B. H. Segal, J. Kwon-Chung, T. J. Walsh, B. S. Klein et al. // Clinical Infectious Diseases. 2006. – V. 42. – P. 507–15. 162. Bethunaickan, R. Anti-TNF treatment of IFN induced lupus nephritis reduces the renal macrophage response but does not alter glomerular immune complex formation / R. Bethunaickan, R. Sahu, Z. Liu, Y. T. Tang, W. Huang, Q. 153 Edegbe, H. Tao, M. Ramanujam, M. P. Madaio, A. Davidson // Arthritis Rheum. – 2012. - Jun 5. doi: 10.1002/art.34553. 163. Romani, L. Thymosin alpha1:an endogenous regulator of inflammation, immunity, and tolerance [Text] / L. Romani, F. Bistoni, C. Montagnoli, R. Gaziano et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2007. – V. 1112. – P. 32638. 164. Naik, S. R. Study of immunological aspects of aspergillosis in mice and effect of polyene macrolide antibiotic (SJA-95) and IFN-γ: a possible role of IFN-γ as an adjunct in antifungal therapy [Text] / S. R. Naik, V. N. Thakare, S. K. Desai, P. R. Rahalkar // Immunol. Lett. – 2011. – V. 141. - № 1. – P. 68-73 165. Periti, P. Antimicrobial chemoimmunoprophylaxis in colorectal surgery with cefotetan and thymostimulin: prospective, controlled multicenter study / P. Periti, F. Tonelli, T. Mazzei, F. Ficari // Italian Study Group on Antimicrobial Prophylaxis in Abdominal Surgery. J Chemother. – 1993. Feb;5(1). – P. 37-42. 166. Netea, M. G. Aspergillus fumigatus evades immune recognition during germination through loss of tolllike receptor 4—mediated signal transduction / M. G. Netea, A. Warris, J. W. Van der Meer et al. // J. Infect. Dis. – 2003. – Vol. 188. – P. 320–326. 167. Romani, L. Thymosin alpha1: an endogenous regulator of inflammation, immunity, and tolerance [Text] / L. Romani, F. Bistoni, C. Montagnoli, R. Gaziano et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2007. – V. 1112. – P. 32638. 168. Hao, C. Treatment of patients with severe sepsis using Ulinastatin and Thymosin α1: a prospective, randomized, controlled pilot study [Text] / C. Hao, M. He, Y. Li // Chinese Medical Journal. – 2009. – V. 122. - № 8. –P. 883-888. 169. Пат. № ua 76250 Державна служба інтелектуальної власності Україна, ДП «Український інститут промислової власності» МПК «Спосіб 154 отримання моделі генералізованого кандидозу» [Текст] / Коляда О.М., Коляда Т.І., Скляр Н.І..Клименко О. М. », заявл.26.06. 2012; опубл. 25.12.2012, Бюл.№ 24/ 170. Караулов, А. В. Клиническая иммунология // А. В. Караулов // Медицинское информационное агенство. – Москва. - 1999. – 650 с. 171. Lorimore, S. A. Inflammatory-type responses after exposure to ionizing radiation in vivo: a mechanism for radiation-induced bystander effects?[Text] / S. A. Lorimore, P. J. Coates, G. E. Scobie, G. Milne, E. G. Wright // Oncogene. – 2001. –V. 20. – P. 7085 – 7095 172. Zheng, L. TLR9 engagement on CD4 T lymphocytes represses γradiation–induced apoptosis through activation of checkpoint kinase response elements [Text] / L. Zheng, N. Asprodites, A. H. Keene, P. Rodriguez et al. // Blood. -2008. – V. 111. - № 5. –P. 2704 - 2713 173. Tsukimoto, M. Low-dose gamma-ray irradiation induces translocation of Nrf2 into nuclear in mouse macrophage RAW264.7 cells [Text] / M. Tsukimoto, N. Tamaishi, T. Homma, S. Kojima // J. Radiat. Res. -2010. –V. 51. – P. 349–353 174. Гусев, Е. Ю. Системное воспаление с позиции теории типового патологического процесса [Текст] / Е. Ю. Гусев, В.А. Черешнев, Л.Н. Юрченко // Цитокины и воспаление. – 2007. – Т. 6. - № 4. – С. 9-21 175. Tedder, T. F. Innate and adaptive receptors interact to balance humoral immunity [Text] / T. F. Tedder // J. Immunol. – 2010. – V. 184. – P. 2231-2232 176. Sirisingha, S. Insight into the mechanisms regulating immune homeostasis in health and disease [Text] / S. Sirisingha // Asian Pac. J. Allergy Immunol. – 2011. – V. 29. – P. 1-14 177. Новиков В.С. Иммунофизиология экстремальных состояний / В. С. Новиков, В. С. Смирнов // СПб: Наука, - 1995. - 172 с. 155 178. Schklovskaya, E. Severely impaired clonal deletion of CD4+ T cells in low-dose irradiated mice: role of T cell antigen receptor and IL-7 receptor signals [Text] / E. Schklovskaya, B. F. de St. Groth // The Journal of Immunology. – 2006. – V. 177. – P. 8320–8330 179. Hernandez, J. B. Life and death in the thymus – cell death signaling during T cell development [Text] / J. B. Hernandez, R. H. Newton, C. M. Walsh // Curr Opin Cell Biol. – 2010. – V. 22. - № 6. – P. 865–871 180. Смирнов В.С. Вторичные иммунодефицитные состояния и их коррекция при промышленных катастрофах и стихийных бедствиях: Автореф. дисс. докт. мед. наук. СПб, 1992. 38 с. 181. Kiyohara, H. Radiation-induced ICAM-1 Expression via TGF-β1 Pathway onHuman Umbilical Vein Endothelial Cells; Comparisonbetween X-ray and Carbon-ion Beam Irradiation / H. Kiyohara,Y. Ishizaki, Y. Suzuki, H. Katoh, N. Hamada, T. Ohno, T. Takahashi, Y. Kobayashi, T. Nakano // J. Radiat. Res. – 2011. – Vol. 52. - 287–292 182. Yoshimura A. GF-β function in immune suppression / A. Yoshimura, G. Muto // T. Curr. Top Microbiol. Immunol. – 2011. – Vol. 350. – P. 127–147. [PubMed: 20680806] 183. Kaser A. Inflammatory bowel disease / A. Kaser A, S. Zeissig, R. S. Blumberg // Annu. Rev. Immunol. – 2010. – Vol. 28. – P. 573–621. [PubMed: 20192811] 184. Mi S. Blocking IL-17A promotes the resolution of pulmonary inflammation and fibrosis via TGF-β1-dependent and -independent mechanisms / S. Mi, Z. Li, H. Z. Yang, H. Liu, J. P. Wang, Y. G. Ma, X. X. Wang, H. Z. Liu, W. Sun, Z. W. Hu // J. Immunol. – 2011. – Vol. 187. – P. 3003–3014. [PubMed: 21841134] 156 185. Hamsa, T. Interleukin 12 a key immunoregulatory cytokine in infection applications [Text] / T. Hamsa, J. B. Barnett, Bingyun Li // Int. J. Mol. Sci. – 2010 – V. 11. – P. 789-806; 186. Croxford, A. L. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned [Text] / A. L. Croxford, T. Buch // Immunology. – 2010. – V. 132. – P. 1–8 187. Hu, X. Cross-regulation of Signaling and Immune Responses by IFNγ and STAT1 [Text] / X. Hu, L. B. Ivashkiv // Immunity. – 2009. – V. 31. - № 4. – P. 539–550 188. Acosta-Iborra, B. Macrophage Oxygen Sensing Modulates Antigen Presentation and Phagocytic Functions Involving IFN-γ Production through the HIF-1α Transcription Factor [Text] / B. Acosta-Iborra, A. Elorza, I. M. Olazabal et al. // The Journal of Immunology. – 2009. – P. 182. – P. 3155–3164. 189. Flohe, S. B. Diversity of Interferon γ and Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor in Restoring Immune Dysfunction of Dendritic Cells and Macrophages During Polymicrobial Sepsis [Text] / S. B. Flohé, H. Agrawal, S. Flohé // Mol Med. – 2008. – V. 14. - № 5 – 6. –P. 247 - 256 190. Shenoy, A. R. Emerging themes in IFN-γ-induced macrophage immunity by the p47 and p65 GTPase Families [Text] / A. R. Shenoy, B.-H. Kim, H.-P. Choi et al. // Immunobiology. – 2007. – V. 212. – № 9-10. – P. 771–784 191. Климко Н. Н. Диагностика и лечение кандидемии и острого диссеминированного кандидоза [Електронний ресурс] / Н. Н. Климко // Инфекции и антимикробная терапія. – 2002. – Том 4, № 1. – режим доступу http://www.consilium-medicum.com/article/8012. 192. McCallum, D. M. Massive induction of innate immuneresponse to Candida albicans in the kidney in a murine intravenous challenge model [Text] / D. M. McCallum // FEMS Yeast Res. – 2009. - V. 9. – P. 1111–1122 157 193. MacCallum, D.M. Hosting Infection: ExperimentalModels to Assay Candida Virulence [Електронний ресурс] / D. M. MacCallum // International Journal of Microbiology. – 2012. – V. 2012. - Article ID 363764. – P.12. 194. Bonifazi, P. Balancing inflammation and tolerance in vivo through dendritic cells by the commensal Candida albicans [Text] // P. Bonifazi, T. Zelante , C. D’Angelo, A. De Luca et al. // Mucosal immunology. – 2009. – V. 2 № 4. – P. 362- 374 195. Heinsbroek, S. E. M. Stage-specific sampling by pattern recognition receptors during Candida albicans phagocytosis [Електронний ресурс] / S. E. M. Heinsbroek, P. R. Taylor, F. O. Martinez, L. Martinez-Pomares et al. // PLoS Pathogens. – 2008. - V. 4. – Issue 11. – P.e1000218. Режим доступу до журналу: www.plospathogens.org 196. Camargo, M. R. Modulation of macrophage cytokine profiles during solid tumor progression: susceptibility to Candida albicans infection [Text] / M. R. Camargo, J. Venturini, F. R. Vilani-Moreno, M. S. P. Arruda // BMC Infectious Diseases. – 2009. - V 9. – P. 98 - 106 197. Cheng, S. – S. Candida albicans dampens host defense by downregulating IL-17 production [Text] / S.-S. Cheng. – F. van de Veerdonk, S. Smeekens, L. A. B. Joosten et al. // The Journal of Immunology. – 2010. – V. 185. – P. 2450–2457 198. Curtis, M. M. Interleukin-17 in host defence against bacterial, mycobacterial and fungal pathogens [Text] / M. M. Curtis, S. S. Way // Immunology. – 2009. – V. 126. – P. 177-185 199. De Luca, A. Functional yet Balanced Reactivity to Candida albicans Requires TRIF, MyD88, and IDO-Dependent Inhibition of Rorc / A. De Luca, C. Montagnoli, T. Zelante, P. Bonifazi, S. Bozza, S. Moretti, C. D’Angelo, C. Vacca, L. Boon, F. Bistoni, P. Puccetti, F. Fallarino, L. Romani // The Journal of Immunology, 2007, 179: 5999 – 6008 158 200. Eyerich K. Patients with chronic mucocutaneous candidiasis exhibit reduced production of Th17-associated cytokines IL-17 and IL-22 [Text] / K. Eyerich, S. Foerster, S. Rombold, H.-P. Seidl et al. // Journal of Investigative Dermatology –2008. – V. 128. – P. 2640–2645 201. Fei M. – J. TNF-α from inflammatory dendritic cells (DCs) regulates lung IL-17A/IL-5 levels and neutrophilia versus eosinophilia during persistent fungal infection [Text] / M. – J. Fei, S. Bhatiaa, T. B. Orissa, M. Yarlagaddaa et al. // PNAS. – 2011. – V. 108. - № 13. – P. 5360-5365 202. Freitas, A. IL-17 receptor signaling is required to control polymicrobial sepsis [Text] / A. Freitas, J.´ C. Alves-Filho, T. Victoni, T. Secher et al. // The Journal of Immunology. – 2009. – V. 182. – P. 7846–7854. 203. Hu, X. Regulation of IFN and TLR signaling during macrophage activation by opposing feedforward and feedback inhibition mechanisms [Text] / X. Hu, S. D. Chakravarty, L. B. Ivashkiv // Immunol. Rev. – 2008. – V. 226. – P. 41–56. 204. Han, S. K. Gamma irradiation-reduced IFN-γ expression, STAT1 signals, cell-mediated immunity [Text] / S. –K. Han, J.-Y. Song, Y.-S. Yun, S.-Y. Yi // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. – 2002. - V. 35. - № 6. – P. 583-589 205. Лавлинский А.Д. Циклоферон в клинической онкологии (реферативный сборник) / А. Д. Лавлинский // СПб., - 2009. — 52 с. 206. Ершов Ф.И. Циклоферон. Клиническая фармакология и терапия: Руководство для врачей / Ф. И. Ершов, А. Л. Коваленко, М. Г. Романцов, С. Ю. Голубев // М.; СПб., 1998. - 109 с. - ISBN 5-88874043. 207. Moffet, J. R. Tryptophan and the immune response [Text] / J. R. Moffet, M. A. Namboodri // Immunology and Cell Biology. – 2003. – V. 81. – P. 247–265 159 208. Mellor, A. L. Tryptophan catabolism and regulation of adaptive immunity [Text] / A. L. Mellor, D. H. Munn // The Journal of immunology. – 2003. – V. 170. – P. 5809-58113. 160
