На правах рукописи Мацынина Валентина Петровна ЗАК
реклама
На правах рукописи Мацынина Валентина Петровна ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ НЕКОТОРЫХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И АКТИВНОСТИ НАД(Ф)-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ДИФФУЗНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ЗОБЕ 14.03.03 – Патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Чита – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Савченко Андрей Анатольевич Официальные оппоненты: Витковский Юрий Антонович – доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения России, заведующий кафедрой нормальной физиологии Семинский Игорь Жанович – доктор медицинских наук, профессор, членкорреспондент РАЕН, ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, заведующий кафедрой патофизиологии с курсом клинической иммунологии Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (адрес: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2). Защита состоится «__» ______________ 2013 года в ______часов на заседании диссертационного совета Д.208.118.01 при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России (адрес: 672090, г. Чита, ул. Горького 39а). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России (адрес: 672090, г. Чита, ул. Горького 39а). Автореферат разослан «____» _________________2013г. Учёный секретарь диссертационного совета Д 208. 118. 01 д.м.н., профессор И.Н. Гаймоленко 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Диффузный токсический зоб (ДТЗ) является одним из наиболее часто встречающихся аутоиммунных заболеваний, его распространенность достигает 0,1% населения (Фадеев В.В., 2005). На долю ДТЗ приходится более 80% всех случаев синдрома тиреотоксикоза (Балаболкин М.И, 2007). Болеют преимущественно женщины (в 5 раз чаще мужчин) молодого возраста, пик заболеваемости приходится на возраст между 25 и 40 годами (Фадеев В.В., 2005; Балаболкин М.И, 2007). После медикаментозного лечения у 40-80% больных развивается рецидив ДТЗ. Даже субклинический тиреотоксикоз у лиц старше 60 лет сопровождается увеличением, как общей смертности, так и смертности от сердечнососудистых заболеваний (Collet T.H., 2012; Серебрякова О.В., 2008). В связи с этим изучение патогенеза ДТЗ и его осложнений является чрезвычайно актуальным. Т-лимфоциты играют центральную роль в развитии ДТЗ (Volpe R., 2000, Ashman R., 2012). Нарушение функций (вследствие наличия в них генетического дефекта) цитотоксических клеток, препятствующих развитию аутоиммунных поражений щитовидной железы, приводит к возникновению аутоиммунных заболеваний (Витковский Ю.А., 2012; Кузник Б.И., 2010; Зуева А.А., 2009). Лимфоциты как основные эффекторы иммунитета имеют богатый набор рецепторов, что делает их высокочувствительными к разнообразным изменениям гомеостаза организма. Реактивность организма определяется функциональной активностью лимфоцитов, которая зависит в свою очередь от интенсивности их метаболизма. Особенно высокой информативностью в метаболизме активированных лимфоцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты, т.к. они реализуют и контролируют ключевые реакции клеточного обмена. (Савченко А.А., 2012). Цель исследования: иммунологических параметров Выявить и 3 закономерности активности изменений НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови при диффузном токсическом зобе в динамике лечения тиамазолом и в зависимости от уровня антител к тиреопероксидазе. Задачи исследования. 1. Исследовать особенности состояния иммунной системы у больных ДТЗ при манифестном тиреотоксикозе. 2. Исследовать закономерности изменений иммунологических показателей у женщин с ДТЗ в процессе лечения. 3. Изучить особенности состояния активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ДТЗ при манифестном тиреотоксикозе. 4. Изучить закономерности изменений активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ДТЗ в процессе лечения. 5. Охарактеризовать особенности состояния иммунологических показателей и изменений активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у больных ДТЗ от уровня антител к тиреопероксидазе. Научная новизна. Впервые у больных с ДТЗ в процессе лечения тиамазолом изучена внутриклеточная метаболическая активность лимфоцитов, а именно активность НАД- и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови. Установлено, что нарушения обмена лимфоцитов до начала лечения ДТЗ сохраняются и через 3 месяца лечения тиамазолом, т.е. и после достижения медикаментозного эутиреоза. Усилены перекисные процессы (повышен уровень ГР), аминокислотный обмен (повышенная активность НАДФГДГ, НАДГДГ, НАДНГДГ, НАДФНГДГ) при увеличении аэробного окисления, т.е. происходит перераспределение субстратных потоков и преобразование метаболизма, которое определяется усилением макромолекулярного синтеза (увеличение Г6ФДГ). Интенсифицирована малат-аспартатная челночная система (увеличена НАДНМДГ), отмечена 4 нестабильность энергетических процессов (повышение ЛДГ, снижение НАДНЛДГ). Впервые у больных с ДТЗ в процессе лечения тиреостатиком изучено нарушение активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов в зависимости от уровня АТкТПО. В метаболизме лимфоцитов выраженных различий в зависимости от уровня АТкТПО не обнаружено (повышены ГР, НАДФГДГ, НАДНЛДГ, НАДГДГ, НАДНМДГ, НАДНДГДГ), только НАДФИЦДГ была снижена у больных с уровнем АТкТПО менее 100мЕд/л (т.е. снижена возможность компенсаторного окисления через НАД(Ф)зависимые дегидрогеназные реакции). Впервые у больных ДТЗ с высоким уровнем АТкТПО выявлено усиление дизрегуляционных процессов, проявляющееся в полной потере взаимосвязей концентрации АТкТПО с уровнями активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов. Впервые установлены закономерности изменений в иммунной системе и метаболизма лимфоцитов у больных ДТЗ в процессе лечения тиамазолом и в зависимости от уровня антител к тиреопероксидазе. У пациентов с уровнем АТкТПО 100мЕд/л и больше повышено абсолютное и процентное содержание лифоцитов, Т-лимфоцитов (CD3+, CD8+), CD19+ и HLA-DR+, снижение величин лейко-Т-клеточного и лейко-В-клеточного коэффициентов, понижение уровней относительного синтеза IgA и IgM. Увеличение количества HLA-DR+ связано с повышением содержания В-лимфоцитов (индекс активации Т-лимфоцитов не изменился). Однако сниженные уровни относительного синтеза IgA и IgM доказывают преобладание функционально незрелых форм В-лимфоцитов. Установлено, что для иммунопатогенеза ДТЗ характерны положительные взаимосвязи между уровнем содержания АТкТПО и показателями В-клеточного иммунитета и отрицательными – с параметрами Т-клеточного иммунитета. При высокой интенсивности аутоиммунного процесса нарушается взаимосвязь иммунологическими показателями. 5 между уровнем АТкТПО и Впервые определена информативность уровней активности НАД(Ф)зависимых дегидрогеназ в модели нейросетевой предикции у больных ДТЗ. Практическая и теоретическая значимость работы и внедрение результатов в практику. Полученные данные расширяют представление о метаболических изменениях лимфоцитов компенсированном ДТЗ. при манифестном Прикладные и результаты медикаментозно работы послужили материалом для практических рекомендаций. Предложено использовать уровень АТкТПО для мониторирования напряженности иммунитета, учитывать иммунологические показатели и активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в динамике лечения больных с ДТЗ для прогнозирования ремиссии или рецидива заболевания. Материалы исследования внедрены в практику Краевого эндокринологического центра на базе КГБУЗ «Краевая клиническая больница» г. Красноярска, ФГБУ «НИИМПС» СО РАМН. Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертационного исследования представлены и обсуждены на Европейском эндокринологическом Всероссийском Конгрессе (г. тиреоидологическом Межрегиональной Гетеборг, Швеция, 2005), IV конгрессе (Москва, 2007), XI научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2008), III Сибирском съезде эндокринологов с международным участием (Красноярск, 2009), XII межрегиональной научнопрактической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Абакан, 2009), Всероссийской научнообразовательной конференции терапевтов «Достижения современной науки – в клиническую практику» (Красноярск, 2012), 16-й Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Абакан, 2013), Научно-практической конференции ФГБУ «НИИ медицинских проблем Севера» СО РАМН (Красноярск, 2013). Основные положения, выносимые на защиту: 6 1. У больных ДТЗ при манифестном тиреотоксикозе в периферической крови отмечается повышение количества лимфоцитов и В-клеток со сниженной функциональной активностью. Метаболизм лимфоцитов характеризуется усилением пластических и антиоксидантных процессов, реакций малат-аспартатного шунта и субстратного обмена между лимонным циклом и реакциями аминокислотного обмена. Гормонально-регуляторные механизмы осуществляют поддержку аутоиммунных процессов при полной потере тиреоидной регуляции метаболизма лимфоцитов. 2. В течение 3 месячного периода лечения больных ДТЗ тиамазолом полной нормализации иммунологических показателей не наблюдается. В метаболизме лимфоцитов сохраняется повышенным уровень пластического обмена, антиоксидантной активности клеток и увеличением нестабильности энергетических процессов. 3. При высокой интенсивности аутоиммунных реакций у больных ДТЗ наблюдаются наиболее выраженные изменения иммунологических показателей. Метаболические процессы лимфоцитов слабо зависят от интенсивности аутоиммунных реакций при ДТЗ. Усиление дизрегуляционных процессов при высокой интенсивности аутоиммунных реакций приводит к полной потере взаимосвязей концентрации АТкТПО с уровнями активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов. Материалы и методы исследования. 1. Гормональные, общеклинические, функциональные, ультразвуковые методы исследования. Обследование больных проводилось на базе Краевого эндокринологического центра при КГБУЗ «Краевая клиническая больница» и ФГБУ «НИИ МПС» СО РАМН г. Красноярска. В исследование было включено 35 женщин в возрасте от 18 до 50 лет с верифицированным диагнозом диффузного токсического зоба до начала лечения тиреотоксикоза и в динамике через 1 и 3 месяца на фоне лечения тиамазолом. В качестве 7 группы сравнения обследованы 45 практически здоровых женщин без отягощенного анамнеза по заболеваниям щитовидной железы. Критериями исключения из исследования являлись прием тиреостатика, ремиссия ДТЗ, рецидив ДТЗ в течение 3 месяцев наблюдения, наличие других аутоиммунных заболеваний (в т.ч. офтальмопатии), сопутствующих заболеваний, требующих параллельного лечения, беременность, лактация, узловые образования в щитовидной железе по данным сонографии и/или с локальным усилением захвата подавлением перинодулярной паренхимы, отказ пациента Tc и 99m подписать информированное согласие. Все больные до начала исследований тиреостатики не получали (впервые выявленный ДТЗ или впервые выявленный рецидив ДТЗ). Лечение проводилось тиреостатическим препаратом тиамазолом («Тирозол», производитель «Мерк КГаА», Германия) по общепринятой схеме «блокируй» со стартовой дозы 30мг/сут с постепенным снижением до поддерживающей под контролем данных объективного и гормонально-лабораторного статусов. Критерием достижения эутиреоза являлась нормализация уровней св.Т4 и Т3. Ультразвуковое исследование щитовидной железы (УЗИ) проводилось при помощи аппарата «Алока 1700» с линейным датчиком 7,5 МГц при установлении диагноза и через 3 месяца на фоне лечения тиреостатиком. Объем щитовидной железы рассчитывали по формуле, предложенной J. Brunn (1981). Увеличенным у женщин считали объем железы, превышающей 18 мл (классификация размеров зоба (ВОЗ, 2001г) (WHO/UNICEF/ICCIDD, 2001г.). Сцинтиграфия щитовидной железы проводилась с использованием Тс на базе КГБУЗ «Краевой онкологический центр». 99m Лабораторные методы исследования проводились на базе биохимической и гормональной лаборатории КГБУЗ «Краевая клиническая больница». Концентрация тиреотропного (ТТГ) и тиреоидных (Т3, св.Т4) в сыворотке крови определялись радиоиммунологическим методом при 8 постановке диагноза, через 1 и 3 месяца тиреостатической терапии. Уровень АТкТПО определялся иммуноферментным методом до начала лечения и спустя 3 месяца на фоне приема тиамазола по принципу двухсайтового (сэндвич) иммуноферментного анализа. 2. Методы исследования состояния иммунной системы. Исследования иммунологического статуса и ферментов лимфоцитов проводили на базе лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии ФГБУ «НИИМПС» СО РАМН. Выделение лимфоцитов производили центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина по методу A. Boyum (1968) в модификации, описанной Дж.Б. Натвигом с соавт (1980). Концентрацию лимфоцитов подсчитывали в камере Горяева. Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, HLA-DR (ТОО «Сорбент» г.Москва). В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, за исключением того, что вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса. Для дополнительной характеристики Т-клеточного звена иммунной системы вычисляли соотношение CD4+/CD8+, лейко-Т-клеточный (лейкоциты /CD3+), лейко-В-клеточный (лейкоциты/CD19+) индексы, а также индекс активации Т-лимфоцитов HLA-DR+/CD19+. Определение концентрации IgA, IgM и IgG в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа с помощью тест-систем фирмы Вектор-Бест (Новосибирск, Россия). Состояние гуморального иммунитета характеризовали также уровнем относительного синтеза Ig A (Ig A/CD19+), Ig M (Ig М/CD19+) и Ig G (Ig G/CD19+). 3. Определение активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах. Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)зависимых дегидрогеназ проводили по ранее разработанным методикам 9 (Савченко А.А., Сунцова Л.Н., 1989; Савченко А.А., 1991). Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ, КФ 1.1.1.8), малик-фермента (НАДФМДГ, КФ 1.1.1.40), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДНЛДГ, КФ 1.1.1.27), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДНМДГ, КФ 1.1.1.37), НАДФ-и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФНГДГ, КФ 1.4.1.4), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДНГДГ, КФ 1.4.1.2), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ, КФ 1.1.1.41 и НАДФИЦДГ, КФ 1.1.1.42, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2). Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (Е) на 1 мг белка (1 Е=1 мкмоль/мин (Березов Т.Т., 1998)). 4. Статистические методы исследования. По результатам исследования в пакете электронных таблиц MSExcel была сформирована база данных, на основе которой, с помощью пакетов прикладных программ Statistica 8,0 (StatSoft, USA) осуществлялся статистический анализ. Описание выборки производили интерквартильного с размаха помощью в виде подсчета 25 и 75 медианы (Ме) процентилей и [25;75]. Статистическую значимость различий независимых групп оценивали с помощью критериев Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни, связанных групп – Фридмана и Вилкоксона. Исследование силы взаимосвязей между исследуемыми параметрами осуществляли методом ранговой корреляции по Спирмену. Для решения задач системного многомерного анализа применяли нейросетевой классификатор. Результаты исследований и их обсуждение. 10 У больных ДТЗ до начала лечения состояние иммунной системы характеризуется (рис.1,2) повышением содержания цитотоксических Тлимфоцитов и В-клеток при сниженном лейко-В-клеточном и неизменном индексе активаРис.1 Состояние Т-клеточного иммунитета у больных ДТЗ в динамике лечения. Примечание: р-достоверные различия с показателями контрольной группы. ции Т-лимфоцитов, что полностью связано с увеличением уровня Влимфоцитов со сниженной функциональной активностью, что характеризуется низким уровнем относительного синтеза IgA и IgM (рис.3,4) (Armengol М.,2001; Gianoukakis A.G., 2003). В течение 3 месячного периода лечения тиамазолом полной нормализации состояния аутоиммунореактивности не наблюдается. Рис.2. Показатели фенотипического состава лимфоцитов крови у больных ДТЗ в динамике лечения. 11 Примечание: р-достоверные различия с показателями контрольной группы; р2-достоверные различия с показателями больных ДТЗ до лечения. Рис.3. Показатели гуморального звена иммунитета у больных ДТЗ в динамике лечения. Примечание: р-достоверные различия с показателями контрольной группы; р2-достоверные различия с показателями больных ДТЗ до лечения. Состояние метаболизма лимфоцитов при ДТЗ имеет значительные особенности (рис. 5 и 6): уровни активности Г6ФДГ, НАДФГДГ, НАДФНГДГ, НАДНМДГ и ГР повышены при снижении уровня активности НАДФИЦДГ в лимфоцитах больных женщин по сравнению с группой контроля. Рис.4. Показатели гуморального звена иммунитета у больных ДТЗ в динамике лечения. Примечание: р-достоверные различия с показателями контрольной группы; р1-достоверные различия с показателями больных ДТЗ через 1 мес. лечения. 12 Рис.5. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ДТЗ в процессе лечения Примечание: группы больных ДТЗ: 1 – до лечения, 2 – через 1 месяц после Исходно повышенная Г6ФДГ (рис. 5) нарастает в динамике начала терапии, 3 – через 3активность месяца после начала терапии, к – контроль, *достоверные с группой контроля процессов макромолекулярного лечения, что различия характеризует нарастание синтеза. Высокую антиоксидантную и пролиферативную способность клеток отражает повышенная активность ГР (рис.5), сохраняющаяся на протяжении 3 месяцев лечения. Энергетические реакции лимфоцитов определяются интенсивностью как анаэробных, так и аэробных процессов Через 3 месяца после начала лечения повышается активность аэробной ЛДГ (рис. 5), что отражает подавление конечных реакций гликолиза. В лимфоцитах пациенток с манифестным тиреотоксикозом снижена активность анаэробной реакции ЛДГ при повышении аэробной, что приводит к увеличению концентрации пирувата. 13 При этом изменений активности ферментов цикла Кребса в лимфоцитах крови больных ДТЗ в динамике лечения обнаружено не было. Анаэробное и аэробное окисление связывает малат-аспартатная челночная система через транспорт восстановленного в гликолизе НАДН в митохондрии для окисления в цепи дыхательных ферментов. Уровень активности ключевого фермента малат-аспартатного шунта – НАДНМДГ (рис.5) изначально повышенный, в динамике лечения несколько снижается, но не достигает контрольной цифры, что характеризует усиление окислительновосстановительных процессов в цитоплазме. В лимфоцитах женщин с ДТЗ выявлена активация ГДГ (рис. 6) в течение всего периода наблюдения, кроме НАДНГДГ, активность которой к 3-му месяцу лечения снижается до нормального уровня. Повышение активности регуляторного фермента аминокислотного обмена – ГДГ отражает активацию белкового обмена. Снижение активности НАДНГДГ у пациенток с ДТЗ через 3 месяца характеризует повышение оттока -кетоглутората из цикла трикарбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена. Таким образом, в лимфоцитах женщин с манифестным ДТЗ выявлено усиление перекисных процессов, аминокислотного обмена при увеличении аэробного окисления, т.е. наблюдается перераспределение субстратных потоков и преобразование метаболизма, которое определяется усилением макромолекулярного синтеза. 14 Антитела к тиропероксидазе определяются у 85% больных с ДТЗ и у 95% больных с аутоиммунным тиреоидитом, 10-25% практически здоровых людей являются носителями АТкТПО. Антитела к ТПО являются наиболее чувствительным показателем аутоиммунного поражения щитовидной железы, и обнаружение этих антител у больных с зобом свидетельствует о возможном его аутоиммунном генезе (De Groot L.J., 2010). В отношении Активность НАДНГДГ, мкЕ 80 60 40 20 * * * К 0 1 2 3 16 12 8 * 4 * * К 0 1 2 100 80 60 * 40 20 Активность НАДФНГДГ, мкE Активность НАДФГДГ, мкЕ Активность НАДГДГ, мкЕ показателя титра антител к ТПО в литературе встречаются противоречивые К 0 1 2 400 300 * 200 * * 100 К 0 1 3 3 2 3 Рис.6. Активность глутаматдегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ДТЗ в динамике лечения. Примечание: то же, что и для рис.5. данные: от возможности использования мониторирования течения ДТЗ (отражает степень активности процесса) и прогноза заболевания, до нецелесообразности определения их титра при наблюдении больных при отсутствии их прогностической значимости (Балаболкин М.И., 2007). Другие авторы считают, что насколько важную роль в болезни Грейвса играют антитела к ТПО неизвестно (при АИТ - имеют цитотоксические функции). Предположительно АТкТПО могут так же привести к цитотоксичности и при ДТЗ (De Groot L.J., 2010). 15 В нашем исследовании в группе с рецидивом заболевания носительство АТкТПО был в 2,3 раза выше, чем в группе с впервые диагностированным ДТЗ. Медиана уровня АТкТПО при рецидивном ДТЗ 289,0 [78,8; 580] мЕд/л была достоверно выше медианы АТкТПО при впервые выявленном заболевании 24,0 [5,0;136,5] мЕд/л. Рис.7. Состояние фенотипического состава лимфоцитов крови у больных ДТЗ в зависимости от уровня АТкТПО. Примечание: р-достоверные различия с показателями контрольной группы; р2- достоверные различия с показателями больных ДТЗ у уровнем АТкТПО менее 100мЕд/л Рис.8. Состояние фенотипического состава лимфоцитов крови у больных ДТЗ в зависимости от уровня АТкТПО. Примечание: то же см. рис. 7 16 Рис.9. Величины коэффициентов, характеризующих активность клеточного иммунитета и состояние гуморального иммунитета у больных ДТЗ в зависимости от уровня АТкТПО. Примечание: р-достоверные различия с показателями контрольной группы. Анализ иммунологических показателей у больных ДТЗ в зависимости от уровня АТкТПО позволяет отметить, что наиболее выраженные изменения со стороны исследуемых показателей иммунной системы выявляются у больных при уровне АТкТПО 100 мЕд/л и больше (рис.7,8,9). Следовательно, в нашем исследовании увеличение HLA-DR+-клеток у больных с уровнем АТкТПО 100 мЕд/л и больше связано с повышением Влимфоцитов. Повышение количества В-лимфоцитов, вероятно, связано с выходом функционально незрелых форм, что определяется снижением относительного синтеза IgA и IgM (рис.9). С помощью корреляционного анализа были исследованы особенности взаимосвязи между уровнем АТкТПО и иммунологическими показателями. Установлено, что у контрольных лиц выявляется единственная достоверная взаимосвязь: с уровнем Ig А. В то же время, иммунопатогенез ДТЗ характеризуется положительными взаимосвязями между уровнем АТкТПО и показателями Вклеточного иммунитета и отрицательными – с Т-клеточного иммунитета. При высокой интенсивности аутоиммунного процесса система нарушается взаимосвязь между уровнем АТкТПО и иммунологическими показателями. В целом, необходимо отметить, что различия в особенностях метаболического состояния лимфоцитов больных ДТЗ в зависимости от 17 уровня Рис.10. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ДТЗ в зависимости от уровня АТкТПО. Примечание: 1 – контроль; 2 – больные ДТЗ с уровнем АТкТПО меньше 100 мЕд/л; 3 – больные ДТЗ с уровнем АТкТПО 100 мЕд/л и больше Рис.11. Активность НАД-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ДТЗ в зависимости от уровня АТкТПО. Примечание: то же, см. Рис.10. АТкТПО незначительны (рис.10,11). Только у больных с уровнем содержания АТкТПО меньше 100 мЕд/л снижена активность НАДФИЦДГ (рис.10). Уровни активности ферментов (рис.10,11) повышены в лимфоцитах больных ДТЗ относительно контрольных значений независимо от уровня 18 содержания АТкТПО. При этом необходимо отметить, что только у больных ДТЗ с уровнем содержания АТкТПО меньше 100 мЕд/л выявляются отрицательные взаимосвязи между концентрацией аутоантител и активностью НАДНГДГ (r=0,49, p=0,029) и НАДНФ-ГДГ (r=0,52, p=0,02). Выявленная зависимость определяет снижение оттока субстратов с цикла Кребса на реакции аминокислотного обмена при увеличении содержания АТкТПО у больных до уровня 100 мЕд/л. Следовательно, выявляется разнонаправленность в изменении интенсивности данных ферментативных реакций: под действием высокого уровня тиреоидных гормонов – они активируются, при повышенном уровне аутоиммунных процессов – они ингибируются. Таким образом, больных ДТЗ с уровнем АТкТПО 100 мЕд/л и больше выявляется усиление дизрегуляционных процессов, проявляющееся в полной потере взаимосвязей концентрации АТкТПО с иммунологическими показателями и уровнями активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов. На основании вышеизложенного можно предложить следующую патофизиологическую схему. 19 Рис.12. Патогенез развития диффузного токсического зоба. ВЫВОДЫ: 1. У больных ДТЗ при манифестном тиреотоксикозе отмечается повышение количества лимфоцитов периферической крови на 10,8% за счет увеличения содержания В-клеток в 1,2 раза. Уровень относительного синтеза иммуноглобулинов А и М снижается на 25,5% и 18,5% соответственно, что характеризует пониженную функциональную активность В-лимфоцитов. Положительные корреляционные связи количества В-лимфоцитов и уровней концентрации тиреоидных гормонов и АТкТПО характеризует наличие гормонально-регуляторных механизмов поддержки аутоиммунных процессов при ДТЗ. 2. Основной закономерностью изменения состояния иммунологических показателей при лечении тиреостатиками является нормализация уровней В-лимфоцитов и повышение количества CD4+лимфоцитов (на 5,7%) и содержания Ig G (на 46,8%) уже через 1 месяц. Через 3 месяца лечения количество лимфоцитов остается на контрольном уровне, но на 24,5% повышается содержание Т-лимфоцитов. С помощью нейросетевого и корреляционного анализов установлена тенденция к восстановлению гормонально-иммунных взаимодействий при отсутствии нормализации Т-клеточного иммунитета. 3. Состояние метаболизма лимфоцитов у больных ДТЗ при манифестном тиреотоксикозе характеризуется повышением активности ключевых реакций пентозофосфатного цикла на 75,4% и малат-аспартатного водородного шунта в 4,3 раза, активность ГР возрастает в 3,2 раза и снижается уровень активности НАДФИЦДГ в 2,12 раза. При ДТЗ наблюдается усиление субстратного взаимодействия между циклом трикарбоновых кислот и реакциями аминокислотного обмена (повышается активность глутаматдегидрогеназ) и полное отсутствие взаимосвязей между тиреоидными гормонами и активностью ферментов в лимфоцитах. 20 4. Закономерностью изменения активности ферментов в лимфоцитах крови у больных ДТЗ при лечении тиамазолом является повышение активности аэробной реакции ЛДГ через 1 (на 82,8%) и 3 месяца (в 2,94 раза) лечения. Активность анаэробной реакции ЛДГ через 3 месяца лечения снижается на 99%. Активность пентозофосфатного цикла, малатаспартатной челночной системы и ГР, а также интенсивность субстратного взаимодействия между циклом трикарбоновых кислот и реакциями аминокислотного обмена сохраняется высокой на всем протяжении лечения. 5. У больных ДТЗ с уровнем АТкТПО 100 мЕд/л и более определяется повышение количества лимфоцитов в периферической крови (на 16,2%) за счет Т- (в 1,3 раза) и В-клеток (25,0%), а также снижение уровней относительного синтеза Ig A (в 1,6 раза) и Ig M (в 2,5 раза). У больных ДТЗ с низким содержанием АТкТПО наблюдается только увеличение количества лимфоцитов в крови на 10,8%. Метаболизм лимфоцитов у больных ДТЗ слабо зависит от уровня содержания АТкТП О. У больных ДТЗ при уровне АТкТПО менее 100 мЕд/л определяется снижение активности НАДФИЦДГ в 2,9 раза. Усиление дизрегуляционных процессов при высоком содержании АТкТПО проявляется в полной потере взаимосвязей концентрации АТкТПО с иммунологическими показателями и уровнями активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Уровень АТкТПО как показатель напряженности иммунитета следует учитывать при выборе тактики ведения больного, продолжительности тиреостатической терапии (как самостоятельного лечения, так и в качестве предоперационной подготовки). 2. При отмене тиамазола через 1-1,5года лечения ДТЗ следует учитывать иммунологические показатели и активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Отсутствие нормализации показателей расценивать как высокий риск рецидива тиреотоксикоза и планировать более радикальные методы лечения. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в научных рецензируемых журналах, определенных ВАК: 1. Савченко А.А., Мацынина В.П., Кадричева С.Г., Догадин С.А. Изменение иммунного статуса у больных диффузным токсическим зобом в динамике лечения тиреостатиками // Сиб. мед. журн. – 2008. – № 3, Вып. 1. – С. 30–33. 2. Шагарова С.Г., Мацынина В.П., Догадин С.А., Савченко А.А., Манчук В.Т. Состояние метаболизма лимфоцитов крови у больных диффузным токсическим зобом в процессе лечения // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. – 2010. – №3. – С. 42–47. 3. Мацынина В.П., Шагарова С.Г., Догадин С.А., Савченко А.А. Особенности метаболизма лимфоцитов крови у женщин с диффузным токсическим зобом в процессе лечения // Сиб. мед. обозрение. – 2012. – №4. – С. 16–19. Работы, опубликованные в прочих изданиях: 4. Савченко А.А., Кадричева С.Г., Догадин С.А., Новых М.И., Мацынина В.П. Нейросетевая предикция концентрации аутоантител по уровням активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Всероссийская научно-практическая конференция «Клиническая эндокринология - достижения и перспективы», посвящ. 80-лет. со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, проф. Д.Я. Шурыгина : тез. конф. - СПб, 2003. – С. 237–238. 22 5. Кадричева С.Г., Мацынина В.П., Догадин С.А., Савченко А.А. Взаимосвязь морфологического состава лимфоцитов крови с показателями тиреоидного статуса у больных диффузным токсическим зобом // Гомеостаз и экстремальные состояния организма : тез. докл. XI междунар. симп., Красноярск, 19-23 мая 2003 г. – Красноярск, 2003. – С. 61–62. 6. Кадричева С.Г., Мацынина В.П., Догадин С.А., Савченко А.А. Особенности взаимосвязи морфологического состава лимфоцитов крови с показателями тиреоидного статуса у больных диффузным токсическим зобом // Медицинская иммунология. Материалы VII Всероссийского научного Форума с международным участием «Дни иммунологии в Санкт- Петербурге». – 2003. – №3-4. – С. 255. 7. Мацынина В.П., Кадричева С.Г. Клинико-иммунологические особенности у больных с диффузно-токсическим зобом // Эндокринология Сибири : материалы Второй Сибирской конф. эндокринологов, посвящ. 50летию эндокринологической службы Красноярского края (23-24 октября 2003 г.). – Красноярск, 2003. – С. 114–115. 8. Кадричева С.Г., Мацынина В.П., Догадин С.А., Савченко А.А. Метаболизм иммунокомпетентных клеток крови в динамике лечения диффузного токсического зоба // Медицинская иммунология. Материалы VIII Всероссийского научного Форума с междунар. участием им. акад. В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 27-30 сентября 2004 г. – 2004. – №3-5. – С. 286–287. 9. Мацынина В.П., Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А. Состояние метаболизма и фенотипического состава лимфоцитов крови у женщин с диффузным токсическим зобом // Медицинская иммунология. Материалы VIII Всероссийского научного Форума с междунар. участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 27-30 сентября 2004 г. – 2004 – №3-5. – С. 290. 10. Кадричева С.Г., Савченко А.А., Мацынина В.П., Догадин С.А. Состояние метаболизма лимфоцитов крови в динамике лечения диффузного 23 токсического зоба // Дни иммунологии в Красноярском крае: метаболические механизмы иммунореактивности : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием (6-8 октября 2004 г.). – Красноярск, 2004. – С. 127– 130. 11. Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А., Мацынина В.П., Белоусова С.В. Особенности фенотипического состава и метаболизма лимфоцитов крови у женщин с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Клиническая тиреоидология. – 2004. – № 4. – С. 32– 36. 12. Кадричева С.Г., Мацынина В.П., Белоусова С.В., Савченко А.А., Догадин С.А. Показатели аутоиммунными иммунология. иммунного заболеваниями Материалы IX международным участием «Молекулярные основы статуса щитовидной женщин железы // Всероссийского Дни у иммунологии иммунорегуляции, научного в больных Медицинская Форума с Санкт-Петербурге иммунодиагностики и иммунотерапии», 23-26 мая 2005 г. – Санкт-Петербург, 2005. – № 2-3. – С. 140– 141. 13. Мацынина В.П., Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А Фенотипический состав лимфоцитов крови у больных диффузным токсическим зобом в динамике лечения // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири : материалы итоговой науч.-практ. конф. с междунар. участием 15-17 июня 2005 г. – Красноярск, 2005. – С. 311– 313. 14. Kadricheva S., Macinina V., Savchenko А., Dogadin S. The peculiarities of the immunocompetent blood cells metabolism in dynamics in the Grave’s disease treatment // European Congress of Endocrinology, 3-7 September 2005, Goteborg, Sweden. Expanding endocrinology : abstract book. – Goteborg, 2005. – P. 187. 15. Kadricheva S., Savchenko А., Dogadin S.,. Macinina V., Belousova S. The phenotype content and metabolism of blood lymphocytes in patients with the thyroid autoimmune diseases // European Congress of Endocrinology, 3-7 September 2005, Goteborg, Sweden. Expanding endocrinology : abstract book. – Goteborg, 2005. – P.153. 24 16. Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А., Мацынина В.П., Белоусова С.В. Особенности метаболизма лимфоцитов крови у женщин с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Дни иммунологии в Сибири : материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИДом и другими инфекционными заболеваниями, 7-9 сентября, 2005 г. – Красноярск, 2005. – С. 35– 37. 17. Кадричева С.Г., Мацынина В.П., Белоусова С.В., Савченко А.А., Догадин С.А. Особенности метаболизма лимфоцитов крови в динамике лечения диффузного токсического зоба // Медицинская иммунология. Материалы X Всероссийского научного Форума с международным участием Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 29 мая -1 июня 2006 г. – Санкт-Петербург, 2006. – № 2–3. – С. 223–224. Кадричева С.Г., Мацынина В.П., Савченко А.А., Догадин С.А. 18. Белоусова С.В. Метаболические механизмы реализации аутоиммунитета при диффузном токсическом зобе и аутоиммунном тиреоидите // Дни иммунологии в Сибири : материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30летнему юбилею ГУ НИИ мед. проблем Севера СО РАМН и 25-летнему юбилею ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН 20-21 сентября 2006 г. – Красноярск, 2006. – С. 16–19. 19. Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А., Мацынина В.П., Гайдук К.К. Метаболический статус лимфоцитов крови больных диффузным токсическим зобом // Высокие медицинские технологии в эндокринологии : материалы V Всерос. конгр. эндокринологов, 30 октября-2 ноября. – М., 2006. – С. 311. 20. Кадричева С.Г., Мацынина В.П., Белоусова С.В., Савченко А.А., Догадин С.А. Показатели иммунного статуса и метаболизма лимфоцитов крови женщин с диффузным токсическим зобом в зависимости от степени тяжести заболевания // Медицинская 25 иммунология. Материалы XI Всероссийского научного форума с международным участием им. акад. В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 28-31 мая 2007 г. – Санкт-Петербург, 2007. – № 2–3. – С. 197. 21. Мацынина В.П., Савченко А.А., Догадин С.А., Кадричева С.Г. Состояние иммунного статуса у больных диффузным токсическим зобом при гипертиреозе // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири : материалы итоговой науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» : материалы науч.-практ. конф. молодых ученых 13-15 июня 2007 г. – Красноярск, 2007. – Вып. 6. – С. 109–112. 22. Мацынина В.П., Догадин С.А., Савченко А.А., Кадричева С.Г. Метаболизм лимфоцитов крови и особенности иммунного статуса у женщин с диффузным токсическим зобом в зависимости от степени тяжести заболевания // Материалы IV Всероссийского тиреоидологического Конгресса, г. Москва, 9-11 декабря 2007 г. – М., 2007. – С. 103. 23. Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А., Мацынина В.П. Особенности активности НАД(Ф)зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови в динамике лечения диффузного токсического зоба // Рос. иммунол. журн. – 2008. – №2–3. – С. 232. 24. Кадричева С.Г., Савченко А.А., Мацынина В.П., Догадин С.А. Особенности метаболизма лимфоцитов крови при диффузном токсическом зобе в динамике тиреостатической терапии // Эндокринология Сибири : материалы III Сибирского съезда эндокринологов с междунар. участием, 1820 февраля 2009 г. – Красноярск, 2009. – С. 90– 92. 25. Мацынина В.П., Догадин С.А., Савченко А.А., Кадричева С.Г. Клиническая характеристика диффузного токсического зоба // Эндокринология Сибири : материалы III Сибирского съезда эндокринологов с междунар. участием, 18-20 февраля 2009 г. – Красноярск, 2009. – С. 98– 99. 26 26. Савченко А.А., Мацынина В.П., Кадричева С.Г., Догадин С.А. Состояние иммунного статуса у больных диффузным токсическим зобом в динамике лечения тиреостатиками // Эндокринология Сибири : материалы III Сибирского съезда эндокринологов с междунар. участием, 18-20 февраля 2009 г. – Красноярск, 2009. – С. 117– 119. 27. Кадричева С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А., Мацынина В.П. Взаимосвязь показателей иммунного статуса и состояния тиреоидной функции у больных диффузным токсическим зобом // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Республики Хакасия : материалы конф. в рамках ежегодной итоговой науч.-практ. конф. «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири», «Актуальные проблемы медицины», XII межрегион. науч.-практ. конф., 3-4 июня 2009 г. – Абакан, 2009. – Вып. 8. – С. 234–237. 28. Мацынина В.П., Шагарова С.Г., Догадин С.А., Савченко А.А. Изменение уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у женщин с диффузным токсическим зобом в процессе // Актуальные проблемы медицины : материалы 16-ой межрегион. науч.-практ. конф. с междунар. участием, г. Абакан, 24-25 апреля 2013 г. – Абакан, 2013. – С. 25–28. 29. Мацынина В.П., Шагарова С.Г., Савченко А.А., Догадин С.А. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у больных диффузным токсическим зобом в динамике лечения // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири : материалы науч.–практ. конф. ФГБУ «НИИ медицинских проблем Севера» СО РАМН, г. Красноярск, 10-11 июня 2013 г. – Красноярск, 2013. – Вып. 12. – С. 52–56. Список основных сокращений ДТЗ диффузный токсический зоб ТТГ тиреотропный гормон Т3 трийодтиронин Св.Т4 свободный тироксин 27 АТкТПО антитела к тиреопироксидазе АТрТТГ антитела к рецептору ТТГ НАДФ никотинамиддинуклеотидфосфат окисленный НАД никотинамиддинуклеотид окисленный НАДФН никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный НАДН никотинамиддинуклеотид восстановленный ГДГ глутаматдегидрогеназа ГР глутатионредуктаза Г6Ф глюкозо-6-фосфат Г6ФДГ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Г3ФДГ глицерол-3-фосфатдегидрогеназа ИЦДГ изоцитратдегидрогеназа ЛДГ лактатдегидрогенеза МДГ малатдегидрогеназа НАДФМДГ малик-фермент НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа НАДФГДГ НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа НАДГДГ НАД-зависимая глутамат дегидрогеназа НАДФИЦДГ НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа НАДИЦДГ НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа НАДНЛДГ НАДН-зависимая лактатдегидрогеназа НАДНМДГ НАДН-зависимая малатдегидрогеназа НАДНГДГ НАДН-зависимая глутаматдегидрогеназа НАДФНГДГ НАДФН-зависимая глутаматдегидрогеназа CD кластер дифференцировки лимфоцитов CD3+ зрелые Т-лимфоциты CD4+ CD4+-клетки CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты CD16+ натуральные клетки CD19+ В-лимфоциты CD4+/ CD8+ дифференцировочный индекс 28 Лейкоциты / CD3+ лейко-Т-клеточный индекс Лейкоциты / CD19+ лейко-В-клеточный индекс ЦИК циркулирующие иммунные комплексы HLA система лейкоцитарных антигенов гистосовместимости HLA-DR+ клетки с HLA-DR+ антигеном HLA-DR+/CD19+ индекс активации Т-лимфоцитов Ig/CD19+ нг/клетку уровень относительного синтеза иммуноглобулинов 29
