Попова Ника Юрьевна - Московский государственный медико

На правах рукописи
УДК 616.5-008.939.53
ПОПОВА НИКА ЮРЬЕВНА
МЕХАНИЗМЫ АНТИАНДРОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ
КОМБИНИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА
ДРОСПИРЕНОН/ЭТИНИЛЭСТРАДИОЛ
14.00.25 – «Фармакология, клиническая фармакология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2007
2
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию».
Научные руководители:
член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,
профессор
Шимановский Николай Львович
доктор медицинских наук, профессор
Духанин Александр Сергеевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор
Макаров Владимир Александрович
Доктор медицинских наук, профессор
Яворский Александр Николаевич
Ведущая организация: Научно-исследовательский институт
фармакологии РАМН
Защита состоится «____» _______________2007 года в ____ часов на заседании
диссертационного
совета
Д208.041.01
при
ГОУ
ВПО
«Московский
государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу:
Москва, ул.Долгоруковская, д.4
С
диссертацией
можно
ознакомиться
в
библиотеке
Московского
государственного медико-стоматологического университета (127206, Москва, ул.
Вучетича, д. 10а).
Автореферат разослан __ ________________200__год.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор
Балуда М.В.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
При повышении продукции андрогенов или изменении их баланса в сторону
активных (свободных) фракций в крови у женщин наблюдаются признаки
дефеминизации и даже маскулинизации. Нередко даже
стертые формы
гиперандрогении
невынашиванию
приводят
к
бесплодию,
ановуляции,
беременности у женщин. Немаловажной социальной и психологической
проблемой для многих женщин становятся угревая сыпь, себорея и гирсутизм,
возникающие при повышении свободной концентрации тестостерона и других
андрогенов в крови. Для устранения симптомов андрогенизации применяются
препараты, получившие название антиандрогенов благодаря их способности
ограничивать синтез активных андрогенов и/или их эффект в органах-мишенях.
К таким препаратам относятся и некоторые комбинированные пероральные
контрацептивы,
способные
угнетать
секрецию
андрогенов
яичниками,
конкурировать с андрогенами за связывание с рецепторами и увеличивать синтез
глобулина, связывающего половые стероиды (ГСПС), который, в свою очередь,
связывая тестостерон и другие андрогены, уменьшает их свободную фракцию в
плазме белков плазмы. величина антиандроггенного эффекта комбинированных
контрацептивов во многом определяется гестагенным компонентом, так как у
применяемых в настоящее время гестагенов могут быть как андрогенные, так и
антиандрогенные свойства. В связи с этим особый интерес представляет каждый
новый
внедряемый
в
клиническую
практику
гестагенный
компонент
комбинированного контрацептива в отношении его способности регулировать
уровень андрогенов и
нуждающихся
в
реализацию их биологической активности у женщин,
контрацепции.
Недавно
комбинированный гормональный контрацептив
в
России
появился
новый
дроспиренон/этинилэстрадиол
(торговое название «Ярина»), обладающий целым рядом преимуществ, благодаря
спектру фармакологической активности гестагенноого компонента. По своим
гестагенным,
дроспиренон -
антиандрогенным
и
антиминералокортикоидным
свойствам
химическое производное спиронолактона, приближается к
4
эндогенному
прогестерону
[Gher,
2004].
Однако
отдельные
аспекты
молекулярных механизмов реализации гормональной активности дроспиренона
остаются не изученными. В частности не выяснена роль геномных и негономных
механизмов действия дропспиренона, что может играть большое значение во
временном характере развития его антиандрогенных эффектов.
За последние 5-7 лет появились серии публикаций, описывающих быстрые
экстрагеномные мембранотропные эффекты стероидов [Mendoza, 2003; Michel,
2004; Rana, 2005]. К ним можно отнести влияние прогестерона и тестостерона на
уровень кальция, активность тирозинкиназы, фосфолипазы С в гаметах,
негеномный эффект альдостерона на трансмембранный транспорт натрия в
эпителиальных клетках почечных канальцев, ранние эффекты витамина Д3 на
уровень кальция и цАМФ в клетках костной ткани. Получены также сведения об
участии
мембранных
рецепторов эстрогенов и гестагенов в регуляции
активности мембраносвязанных ферментов аденилатциклазы, протеинкиназы С,
5'-нуклеотидазы в норме и при опухолевом росте. Тем не менее, при
исследовании
соединений,
механизмов
обладающих
фармакологического
антиандрогенной
действия
активностью,
андрогенов
и
сведения
о
существовании негеномных эффектов половых стероидов на клетки-мишени до
последнего времени не учитывались.
Цель исследования: определение фармако-биохимических особенностей
антиандрогенного
действия
комбинированного
препарата
дроспиренон/этинилэстрадиол при лечении угревой болезни у женщин.
Задачи исследования:
1. Разработка тест-системы для оценки антиандрогенной активности половых
стероидов с использованием лимфоцитов периферической крови.
2. Исследование эффективности применения комбинированного препарата
дроспиренон/этинилэстрадиола при терапии угревой болезни у женщин.
3. Исследование
влияния
комбинированного
препарата
дроспиренон/этинилэстрадиола на показатели гормонального обмена (базальная
концентрация гонадотропинов ФСГ и ЛГ, уровень тестостерона, содержание
5
глобулина, связывающего половые стероиды) в крови женщин с явлениями
гиперандрогении.
4. Определение
относительного сродства дроспиренона в сравнении с
другими гестагенами (прогестерон, ципротерона ацетат) к рецепторам андрогенов
в лимфоцитах периферической крови женщин с симптомами гиперандрогении.
5. Сравнительная оценка влияния гестагенов и соединений, обладающих
доказанной гестагенной активность, на содержание вторичных мессенджеров
(ионов Ca2+ и цАМФ) в лимфоцитах периферической крови женщин с явлениями
андрогенизации.
Научная
новизна.
На
лимфоцитах
периферической
крови
женщин
с
гиперандрогенией впервые выявлено, что дроспиренон наряду с классическим
геномным
действием,
оказывает
прямые
эффекты
на
клетки-мишени,
опосредованные изменением ионной проницаемости плазматической мембраны.
Впервые установлено, что в зависимости от степени выраженности сродства к
внутриклеточным рецепторам андрогенов в лимфоцитах изученные соединения
располагаются в ряду: ципротерона ацетат > дроспиренон > прогестерон > АБМП.
Выявленная закономерность отражает вероятность развития геномного действия
стероидов. Впервые показано, что негеномное действие
дроспиренона в
терапевтической области концентраций определяется блокадой Са-каналов
плазматических мембран лимфоцитов.
Практическая значимость работы. Установлена выраженная клиническая
эффективность препарата дроспиренон/этинилэстрадиола у женщин с угревой
болезнью и выявлены особенности его антиандрогенного эффекта.
Предложена тест-система для скрининга и изучения молекулярных механизмов
экстрагеномного мембранотропного действия андрогенов и новых соединений,
обладающих антиандрогенной активностью.
Расшифровка молекулярных и клеточных механизмов антиандрогенного действия
современного комбинированного препарата дроспиренон/этинилэстрадиол будет
способствовать рациональному применению существующих средств, а также
6
поиску и созданию новых высокоэффективных и безопасных гормональных
препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту.
 Установлена
выраженная
антиандрогенная
активность
препарата
дроспиренон/этинилэстрадиол у женщин с угревой болезнью.
 При изучении биохимических механизмов реализации антиандрогенного
действия данной комбинации выявлена важная роль гестагенного компонента
–
дроспиренона,
который
по
конкурентному
специфическое связывание андрогенов с
механизму
их цитозольными
ингибирует
рецепторами,
регулирующими активность генов и определяющих андрогенный фенотип.
 По своим признакам влияние дроспиренона на [Са2+]цит относится к
специфическим
мембранотропным
эффектам
стероидов.
Признаками
негеномного действия дроспиренона являются: быстрое развитие в пределах 10
мин; микромолярный диапазон эффективных концентраций; обратимость;
отменяются антагонистами стероидов мембранного типа действия и не
чувствительны к антагонистам внутриклеточных рецепторов стероидов.
Внедрение. Результаты настоящего исследования используются в учебной работе
кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии РГМУ г.Москвы.
Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на XII
Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы
диагностики, лечения и реабилитации больных», октябрь 2006 г., Пенза; на
совместной научной конференции кафедры молекулярной фармакологии и
радиобиологии РГМУ и ПНИЛ молекулярной фармакологии РГМУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 работы в
журналах, рекомендованных «Перечнем» ВАК Рособрнадзора РФ.
Объем и структура
диссертации: диссертация изложена на ____ страницах
машинописи, иллюстрирована ____ рисунками, содержит ___ таблиц, состоит из
введения,
3
основных
глав,
выводов,
практических
рекомендаций.
Библиографический указатель включает ___ отечественных и ____ зарубежных
источника.
7
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Протокол исследования в соответствии с правилами GCP был рассмотрен и
одобрен этическим комитетом РГМУ (протокол №61 от 11.05.06).
В исследование было включено 46 женщин в возрасте от 18 до 35 лет (средний
возраст 23 года), нуждающиеся в контрацепции и также страдающие различными
клиническими
формами
угревой
болезни;
имеющие
подписанное
информированное согласие на участие в исследовании. Продолжительность
болезни составила от 7 месяцев до 12 лет, при средней продолжительности - 6
лет и 7 месяцев.
Критериями исключения являлись: беременность; венозный или артериальный
тромбоз в анамнезе; сахарный диабет I или II типа; артериальная гипертония
(САД>140 мм рт.ст., ДАД>90 мм рт.ст); ожирение (ИМТ>39 кг/м2); заболевания
печени, в т.ч. нарушения желчевыделительной функции, инфекционный гепатит;
вагинальные кровотечения невыясненной этиологии; кормление грудью (до
момента отнятия или на протяжении 6 мес после рождения); рак молочной
железы или половых органов; отказ пациента подписать информированное
согласие.
Исследование включало несколько этапов (таблица 1). Пациенты осматривались
гинекологом в начале исследования, через 3 месяца и в конце исследования для
оценки эффективности и безопасности терапии и забора крови.
Во время каждого визита оценивалось состояние кожи лица по количеству и
выраженности таких морфологических элементов угревой болезни, как комедоны,
пятна, папулы и пустулы. В зависимости от степени выраженности клинических
проявлений и тяжести течения дерматоза все больные были разделены на три
группы: легкая, средняя и тяжелая формы течения дерматоза. Степень
выраженности угревой сыпи (градации) определяется по методу Кука на
основании шкалы от 0 до 8 (табл. 2). Градации 1 – 2 – 3 по шкале Кука
соответствует легкой степени течения заболевания, градации 4 – 5 – средней
степени течения, градации и > 6 – тяжелое течение дерматоза.
8
Таблица 1. Дизайн исследования
-1 нед
Информированное
старт
3 мес
6 мес
+
согласие
Критерии
+
включения/невключения
Анамнез
+
Осмотр гинеколога
+
+
+
+
Физикальный осмотр
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Оценка топографии
угревой сыпи и лицевых
кожных симптомов*
Оценка функциональной
активности лимфоцитов
Определение
концентрации ФСГ, ЛГ,
ГСПС в крови
* динамику изменения выраженности угревой сыпи у пациентов на фоне
фармакотерапии оценивали с 2 месячным интервалом
Комбинированный препарат дроспиренон/этинилэстрадиол назначали всем
пациенткам с первого дня менструального цикла по 1 таблетки в течение 21 дня.
После 7-дневного перерыва назначают следующий курс. Длительность терапии
составила 6 циклов (около 6 месяцев).
Терапевтическая эффективность применяемого лечения по окончанию
исследования оценивалось как клиническое выздоровление (полное разрешение
элементов угревой сыпи), значительное улучшение (разрешение элементов сыпи
более чем на 75% от исходного уровня), улучшение (регресс элементов сыпи
менее чем на 50%) и «без эффекта» (без существенной клинической динамики).
9
Таблица 2. Шкала оценки симптомов выраженности угревой сыпи (шкала
Кука)
Градация Описание
0
Кожа не безупречно чистая, может присутствовать небольшое
количество маленьких комедонов или папул, но это заметно только при
осмотре с близкого расстояния
2
Приблизительно на 1/4 поверхности лица имеются небольшие папулы
(6 - 12 штук), или комедоны (может быть небольшое количество
больших комедонов или 20 - 30 маленьких закрытых комедонов)
4
Приблизительно на 1/2 поверхности лица имеются небольшие папулы и
большие или небольшие комедоны. Имеется небольшое количество
пустул или больших выступающих комедонов (если имеются
поражения большого размера, заболевание может быть
классифицировано как "шкала 4", даже если поражено менее 1/2
площади лица)
6
Приблизительно на 3/4 поверхности лица имеются папулы и/или
большие открытые комедоны (возможна меньшая площадь поражения
лица, если воспалительные элементы большого размера). Обычно
имеются множественные пустулы, некоторые из них могут быть
большими
8
Поражена практически вся площадь лица. Визуально выделяются
большие выступающие пустулы. Поражения обычно соответствуют
воспалению высокой степени, могут присутствовать и другие типы
угревой сыпи (такие как сonglobata, включая синусовые и кистозные
типы)
Примечание. Шкала от 0 до 8 является линейной, т.е. различие между градацией 0
и 2 должно быть тем же самым, что и между градацией 2 и 4, 4 и 6 и т.д. Градации
1, 3, 5, 7 могут быть применены для промежуточных случаев.
Методы исследования
Концентрацию гормонов в сыворотке крови и андрогенов в моче определяли
радиоиммунологическим методом с использованием стандартных наборов
реактивов фирм: "Immunotech" (Чехия) — определение ЛГ, ФСГ; ГП "ХОП
ИБОХ" (Беларусь) — определение тестостерона; "BCM Diagnostics" (США) —
определение ГСПС.
10
Концентрацию цАМФ определяли с помощью стандартных наборов фирмы
"Amersham".
Внутриклеточный уровень свободных ионов кальция в лимфоцитах оценивали с
помощью флуоресцентного индикатора Fura-2/АМ по методу [Doye F., 1998].
Жизнеспособность лимфоцитов определяли методом витального окрашивания
клеток трипановым синим.
Определение относительного сродства дроспиренона к рецепторам андрогенов
проводили радиолигандным методом. В пробы,
содержащие по 120 мкл
суспензии клеток, вносили 10 мкл раствора 3Н-тестостерона (Т) в HEPES-буфере
до конечных
концентраций
0,1-5 мкМ и 10 мкл избытка немеченого
тестостерона. Пробы инкубировали в течение 30 минут при температуре 37С.
Специфическое связывание
вычисляли
как
разницу
между
количеством
связанного клетками меченого Т в отсутствие и в присутствии немеченого
гормона.
Конкурентный анализ связывания Т
клетками
в
присутствии
различных немеченых прогестинов (дроспиренона, прогестерона, ципротерона
ацетата, АБМП), лигандов рецепторов андрогенов проводили
выше схеме. Конечная
по
описанной
концентрация препаратов среде инкубации - 310-5 М.
Для оценки внутриядерного связывания меченых андрогенов клетки подвергали
гипоосмотическому
лизису,
затем
с
помощью
дифференциального
центрифугирования получали ядра лимфоцитов, в которых измеряли содержание
гормон-рецепторных комплексов.
По окончанию инкубации аликвоты проб (100 мкл) быстро переносили на
фильтры GF/C "Whatman" и дважды отмывали 2 мл HEPES-буфера (t=4C).
Фильтры
высушивали
при
комнатной
температуре
и
помещали
в
сцинтилляционные флаконы для определения содержания меченого Т методом
жидкостной радиометрии.
Методы статистической обработки. Расчет доверительных интервалов
значений и оценку
использованием
достоверности различий между ними проводили с
непараметрического
парного
критерия
Вилкоксона
(для
статистической оценки эффективности лечения); для определения межгрупповых
11
различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. t-Критерий
Стьюдента использовали для статистического анализа данных, полученных в
опытах in vitro. Достоверными считали различия при р<0,05. Результаты в тексте
представлены в виде M±m.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В зависимости от степени выраженности клинических проявлений и тяжести
течения дерматоза все больные были разделены на три группы: легкая, средняя и
тяжелая формы течения дерматоза. I группа включала 7 женщин с легкой
степенью течения дерматоза, наибольшее число случаев – 24 женщины
составляли больные со среднетяжелым течением угревой болезни (II группа),
тяжелое течение заболевание было у 15 больных (III группа).
На фоне проводимого лечения мы наблюдали активное разрешение элементов
угревой сыпи уже после первого курса. После четвертого курса лечения в 76,1%
(35 больных), а после шестого курса - в 95,7% случаях наступало значительное
клиническое улучшение. Все больные положительно реагировали на проводимое
лечение: клиническое выздоровление мы наблюдали у 43 (93,4%) женщин,
значительное улучшение у 2 (4,4%) больных и улучшение также у 1 (2,2%)
женщин. При этом динамика изменения выраженности угревой сыпи по шкале
Кука от первого визита к последнему в зависимости от степени тяжести течения
дерматоза изменялась следующим образом (табл. 3).
Таблица 3. Динамика изменения выраженности угревой сыпи у пациентов на
фоне лечения препаратом Ярина
Группы
Сроки лечения (баллы по шкале Кука)
больных
До
2 месяц
4 месяц
6 месяц
2,75
1,41
0,08
0
II n=24
5,14
3,03
1,0
0,03
III n=15
7,35
3,35
1,1
0,15
лечения
I
n=7
12
У больных с легким течением заболевания общая выраженность угревой сыпи к
концу 4 курса лечения составила 0,08 балла (p<0,001 по сравнению с исходным
уровнем).
Таким
образом,
терапевтическую
эффективность
препарата,
выражающуюся в клиническом выздоровлении в данной группе, мы наблюдали
после 4 курса лечения. Таким пациенткам проводили еще один курс лечения для
консолидации достигнутого результата. Во второй и в третьей группах больных
курс лечения составил 6 месяцев. К концу 4 курса лечения общая выраженность
угревой сыпи составила 1,0 и 1,1 соответственно.
Надо отметить, что лечение
дроспиренон/этинилэстрадиолом женщины переносили
хорошо, серьезные
побочные реакции не отмечены.
Проведенное исследование показало высокую клиническую эффективность
нового комбинированного препарата дроспиренон/этинилэстрадиола при лечении
угревой болезни у женщин. На фоне приема препарата к концу 6 курса лечения
происходит активное разрешение элементов угревой сыпи: из 46 женщин,
страдающих угревой болезнью клиническое выздоровление и значительное
улучшение наблюдали у 45 женщин (97.8%).
Таблица
4.
Результаты
лечения
угревой
болезни
препаратом
дроспиренон/этинилэстрадиола в течение 6 месяцев
Результат лечения
Кол-во
Клиническое
Значительное
больных
выздоровлени
улучшение
Улучшение Без эффекта
е
абс.
46
%
100
абс.
43
%
93,4
абс.
2
%
4,4
абс.
2
%
2,2
абс.
%
-
-
Для оценки влияния терапии препаратом Ярина на гормональные показатели
у больных угревой болезнью мы проанализировали данные, полученные при
исследовании фоновых концентраций гормонов и после 6 месячного приема
препарата.
13
Исследования гормонального фона показали, что препарат благоприятно
влияет на андрогенные показатели
- увеличивая уровень ГСПС, параллельно
снижая уровни тестостерона и суммарных и свободных андрогенов в моче (табл.
5).
Таблица 5. Влияние терапии препаратом дроспиренон/ этинилэстрадиол на
уровень андрогенов у женщин с угревой болезнью
Показатель
Тестостерон
Группа 1
Группа 2
Группа 3
до
после
до
после
до
0.560.13
0.490.09*
0.730.14
0.590.08*
51.675.0
69.177.33* 45.44.37
63.906.14* 31.807.96#
65.208.27*
7.850.42
5.630.88*
8.600.62
6.130.95
14.324.29#
11.441.45#
0.370.03
0.350.06
0.550.08
0.380.03
1.030.21#
0.840.15#*
1.540.99
После
0.780.66*
крови (нг/мл)
ГСПС крови
(нмоль/л)
Андрогены мочи
суммарные
(пг/л)
Андрогены мочи
свободные (пг/л)
*- отличия до/после (p<0,05), #- отличия от группы 1(p<0,05)
Исходно группы показатели 1 и 2 достоверно не отличалось. Больные
группы 3 имели достоверно более низкую концентрацию ГСПС в крови
(35,8±10,9 нмоль/л) и статистически значимое более высокое содержание
суммарного (92,7±20,5 нг/дл) и свободного
тестостерона (3,8±1,3 пг/мл)
по
сравнению с больными группы 1 (48,1±9,7 нмоль/л, 81,7±20,5 нг/дл и 3,2±1,4
пг/мл, соответственно).
Лечение больных группы 1 привело к повышению концентрации ГСПС (32,2%) и
снижению содержания тестостерона крови (11%) и суммарных андрогенов мочи
(29%).
У больных группы 2 повышение содержания ГСПС было более выраженным
(40,7%), тогда как концентрация тестостерона достоверно не изменилась.
Лечение больных группы 3 привело к существенному снижению содержания
тестостерона крови (50,6%) и повышению — ГСПС (52,4%), при этом
14
концентрация ГСПС перестала отличаться от таковой у больных группы 1.
Лечение
дроспиренон/этинилэстрадиолом
также
привело
к
снижению
концентрации свободного тестостерона в плазме крови.
Таким образом, противоугревая эффективность исследованного нового
комбинированного препарата может быть связана с его способностью как
увеличивать связывание тестостерона с белками крови, так и подавлять синтез
андрогенов путем ингибирования ферментов стероидогенеза. Необходимо
отметить, что исходная степень выраженности акне также зависела от изучаемых
параметров обмена андрогенов. Более высокий уровень тестостерона и более
низкая концентрация ГСПС в плазме крови отмечены у больных с тяжелым
течением дерматоза, а в
результате приема сочетания дроспиренона и
этинилэстрадиола эти параметры достигали значений сходных с теми, которые
наблюдались у больных с легкой формой заболевания.
В задачи следующего раздела работы входило проведение сравнительного
исследования аффинитета (сродства) прогестерона, гестагенов с доказанной
антиандрогенной активностью с внутриклеточными рецепторами андрогенов
лимфоцитов периферической крови женщин с гиперандрогенией.
Кривая специфического связывания имела характерный вид изотермы насыщения,
что свидетельствует о наличии в клетках высокоспецифических участков
связывания гормона. Для вычисления параметров рецепторного связывания
полученные данные были представлены в координатах Скетчарда, что позволило
определить количественные значения величины аффинитета и концентрации
рецепторов андрогенов в лимфоцитах обследованных пациентов (табл. 6).
В таблице
7 приведены сведения о содержании цитозольных и ядерных
рецепторов андрогенов в лимфоцитах, а также вычисленное нами значение
соотношения
количества
ядерных/цитозольных
рецепторов.
Сравнение
вычисленных показателей для Т и ДТ свидетельствует о достоверном увеличении
содержания ГР в ядрах лимфоцитов при использовании ДТ.
15
Таблица 6. Параметры рецепторного связывания 3Н-тестостерона (Т) и 3Ндигидротестостерона (ДТ) лимфоцитами периферической крови женщин с
гиперандрогенией
Препарат
Параметры специфического связывания
Вмакс, фмоль/106клеток
Кд, нМ
(среднее количество
рецепторов на одну клетку)
Тестостерон
26,0  1,3
Дигидротестостерон
5,1  0,6
13,6  0,8
(7650)
16,9  0,9
(9486)
Таблица 7. Соотношение между цитозольными и ядерными рецепторами
андрогенов лимфоцитов периферической крови
Препарат
содержание рецепторов,
соотношение
фмоль/105 клеток
ядерные/цито-
цитозоль
ядро
зольные
общее
рецепторы
Тестостерон
0,80,2
0,30,1
1,40,2
0,38
0,60,1
0,90,1
1,70,2
1,5
Дигидротестостерон
В табл. 8 суммированы данные ингибиторного анализа связывания меченого ДТ
лимфоцитами в присутствии тестируемых соединений.
Полученные результаты свидетельствуют, что в зависимости от степени
выраженности
сродства
к
внутриклеточным
рецепторам
андрогенов
в
лимфоцитах изученные соединения располагаются в ряду: ципротерона ацетат >
дроспиренон > прогестерон > АБМП. Выявленная закономерность одновременно
отражает вероятность развития геном-опосредованного действия стероидов [Cho
JJ et al., 2002].
16
Таблица
8
Влияние
изученных
соединений
на
специфическое
связывание ДТ лимфоцитами (ингибиторный анализ)
Препарат
IC50, мкМ
Прогестерон
3,3±0,2
Ципротерона ацетат
0,35±0,04
Дроспиренон
2,4±0,2
АБМП
9,2±0,5
Примечание: IC50 – значение концентрации препарата, при котором наблюдается
снижение рецепторного связывания на 50%.
Одним из критериев, свидетельствующих о чувствительности клеток к
гормональному воздействию, является антипролиферативное действие гормонов,
которое обусловлено их способностью ингибировать ранние этапы активации
лимфоидных клеток. К таким ранним этапам относятся изменения в системе
вторичных мессенджеров (Са2+; цАМФ), являющихся триггерными пусковым
механизмам активации и деления клеток.
Внутриклеточный уровень ионов кальция ([Са2+]цит) в покоящихся клетках
не превышал значения 110 нМ (9812 нМ). Внесение в суспензию клеток 3 мкМ
дроспиренона (соответствует средней терапевтической концентрации гестагена в
плазме крови) не приводило к достоверному изменению концентрации Са 2+.
При изучении влияния арахидоновой кислоты (АА) в концентрации 3 мкМ
на изменения внутриклеточной концентрации Са2+ в лимфоцитах наблюдали
быстрое достоверное увеличение [Са2+]цит до 240  25 нМ (р <0,05). Для того,
чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при
действии АА, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Ca2+ в
инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что
приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции (рис. 1,б).
17
Рис. 1. Влияние ЭГТА на индуцированное арахидоновой кислотой (АА)
повышение уровня [Са2+]цит в среде, содержащей 1 мМ CaCl2 (а) и в
бескальциевом буфере (б). Обозначения: 1 - АА (3 мкМ), 2 – ЭГТА (1 мM), 3 CaCl2 (4.5 mM).
АА (3 мкМ) на фоне ЭГТА вызывала увеличение внутриклеточной
концентрации ионов кальция примерно на 55  12 нМ (р<0,05), что примерно в
два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с нормальным
содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Саответа на АА в среде без Са позволяют предположить, что арахидоновая кислота
индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с
ионами Ca2+ на фоне действия АА к суспензии клеток добавляли ЭГТА (1 мМ),
наблюдалось
резкое
снижение
уровня
[Ca2+]цит
(рис.1,а),
который
восстанавливался при добавлении CaCl2 за счет поступления ионов кальция через
18
каналы плазматических мембран. Таким образом, при действии АА на
лимфоциты Са-ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов
Са из инкубационной среды в цитоплазму, а также выхода Ca2+ из
внутриклеточных депо. Добавление АА (3 мкМ) на фоне действия дроспиренона
(3 мкМ) приводило к росту [Ca2+]цит на 52 ± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня,
что напоминает увеличение Ca2+ в бескальциевой среде. Полученные результаты
свидетельствуют
о
том,
что
в
терапевтической
области
концентраций
дроспиренон блокирует Са-каналы плазматических мембран и препятствует
индуцированному арахидоновой кислотой входу Ca2+ извне в клетки. В то же
время гестаген практически не влияет на стимулированный АА выход Ca2+ из
внутриклеточных депо.
Исследование аденилатциклазного звена клеточного ответа лимфоцитов
показало, что базальный уровень цАМФ составил в среднем 2.3 ± 0,6 пмоль/107
клеток (n=10). При определении влияния Con А на содержание цАМФ в
лимфоцитах
были
обнаружены
значительные
индивидуальные
различия.
Добавление к суспензии лимфоцитов Con А (25 мкг/мл) в одних случаях (7
наблюдений) приводило к достоверному снижению уровня цАМФ (1.2 ± 0,4
пмоль/107
клеток),
в
других
(6
наблюдений)
вызывало
увеличение
внутриклеточной концентрации цАМФ (3.1 ± 0,4 пмоль/107 клеток). АА в
изученном диапазоне концентраций (1-3 мкМ) достоверно не изменяла
внутриклеточное содержание цАМФ. Исследование влияния
дроспиренона
(3мкМ) на цАМФ-ответ клеток не позволило выявить какие-либо закономерности.
На следующем этапе работы мы сравнили характер
действия
андрогенов
(тестостерона,
мембранотропного
дигидротестостерона),
соединений
с
выявленной антиандрогенной активностью (ципротерона ацетата, дроспиренона)
и АБМП на внутриклеточную концентрацию свободных ионов кальция в
цитоплазме лимфоцитов ([Са2+]цит) периферической крови человека. 17ацетокси-3-бутаноилокси-6-метил-прегна-4,6-диен-20-он
(АБМП)
-
новое
отечественное соединение с гестагенной активностью, обладающее рядом
преимуществ по сравнению с другими гестагенами. В ряде работ была показана
19
его
гестагенная
активность
и
перспективность
применения
в
качестве
противоопухолевого препарата и средства повышающего противоопухолевое
действие цитостатиков [Семейкин А.В. и соавт., 2006]. Однако антиандрогенные
свойства АБМП остаются малоизученными.
Внесение в суспензию клеток 1 мкМ тестостерона (Т) вызывало увеличение
внутриклеточной концентрации кальция: эффект развивался быстро – в течение
нескольких секунд, максимум [Са2+]цит отмечался через 1,5-2 мин и достигал
значения 20912 нМ (n=6). В течение последующего времени наблюдения
[Са2+]цит снижался с выходом на стационарный уровень, составлявший 13511 нМ.
Для того чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток
при действии Т, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Ca2+ в
инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что
приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции. Т (1 мкМ) на
фоне ЭГТА вызывал увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция
на 55  12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в
инкубационной среде с нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а
также характерная кинетика Са-ответа на Т в среде без Ca2+ позволяют заключить,
что тестостерон индуцирует вход ионов кальция из внеклеточной среды через Саканалы
цитоплазматической
мембраны.
Для
проверки
гипотезы
о
мембранотропном характере действия Т в нашей работе был использован
коммерческий препарат тестостерона, ковалентно иммобилизованный на БСА
(бычий сывороточный альбумин, «Sigma»). Высокомолекулярный препарат
тестостерона не способен проникать через цитоплазматическую мембрану клеток,
ему не доступны внутриклеточные места связывания андрогенов. Динамика и
выраженность влияния Т-БСА на [Са2+]цит повторяли выявленные нами
закономерности
действия
свободного
Т,
что
свидетельствует
в
пользу
мембранотропного действия Т (рис. 2). Важно отметить, что активный метаболит
Т – дигидротестестерон, сродство к внутриклеточным рецепторам андрогенов
которого существенно выше, чем у Т, по способности увеличивать [Са2+]цит
уступал Т примерно в 2 раза (рис. 2).
20
250
[Ca2+]цит
200
150
100
50
0
1
2
3
4
Рис. 2. Влияние андрогенов на содержание ионов кальция в лимфоцитах.
Обозначения: 1 – базальный уровень; 2
- тестостерон (1 мкМ); 3 –
дигидротестостерон (1 мкМ); 4 – тестостерон-БСА (1 мкМ в расчете на
соедержание тестостерона). Условия: время инкубации с препаратами 1 мин.
Для оценки антиандрогенного эффекта изучаемых соединений мы
определяли Т-индуцированные изменения
[Са2+]цит в присутствии различных
концентраций ципротерона ацетата, дроспиренона или АБМП, вычисленные
значения IC50 приведены в табл. 9. Наименее активным препаратом был
ципротерона ацетат, его ингибирующее действие в максимальной концентрации
10 мкМ на стимулированный подъем кальция составляло не более 20% от
контрольных значений (в отсутствие в среде инкубации ципротерона ацетата).
Наиболее выраженным эффектом отличался гестаген дроспиренон. Добавление Т
(1 мкМ) на фоне действия дроспиренона (3 мкМ) приводило к росту [Са2+]цит на 52
± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня, что соответствует значениям
стимулированного уровня Ca2+ в бескальциевой среде. Эффект дроспиренона
характеризуется
концентраций
наличием
(0,1-10
дозовой
мкМ).
зависимости
Новый
в
изученном
отечественный
диапазоне
гестаген
АБМП
характеризовался умеренным антиандрогенным действием на стимулированное
тестостероном увеличение [Са2+]цит. Вычисленное среднее значение
IC50 для
АБМП составляло 8,4 мкМ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в
терапевтической области концентраций дроспиренон и, в меньшей степени,
21
АБМП подавляют негеномное действие андрогенов на содержание ионов кальция
в лимфоцитах человека.
Таблица
9.
Влияние
индуцированное
изученных
увеличение
соединений
уровня
кальция
на
тестостерон-
в
лимфоцитах
(ингибиторный анализ)
Препарат
IC50, мкМ
Ципротерона ацетат
>10,0
Дроспиренон
2,1±0,2
Прогестерон
1,3±0,1
АБМП
8,4±0,5
Примечание: IC50 – значение концентрации препарата, при котором наблюдается
снижение Са2+-стимулирующего действия тестостерона на 50%.
Таким образом, проведение данной клинико-экспериментальной работы
позволило установить выраженную антиандрогенную активность препарата
дроспиренон/этинилэстрадиол у женщин с угревой болезнью. При изучении
биохимических механизмов реализации антиандрогенного действия данной
комбинации была выявлена
важная
роль
гестагенного
компонента –
дроспиренона, который по конкурентному механизму ингибирует специфическое
связывание андрогенов с
их цитозольными
рецепторами, регулирующими
активность генов, определяющих андрогенный фенотип. Если эта активность
дроспиренона была немного слабее известного антиандрогена ципротерона
ацетата, то негеномные эффекты дроспиренона, выражающиеся в уменьшении
мембранотропных эффектов тестостерона были сильнее в случае дроспиренона.
Способность дроспиренона блокировать способность тестостерона увеличивать
кальциевую проницаемость в клетках мишенях может иметь дополнительное
терапевтическое преимущество, выражающееся в снижении артериального
давления, которое наблюдается у женщин при приеме ими комбинации
22
дроспиренон/этинилэстрадиол. В связи с этим есть все основания считать, что
комбинация дроспиренон/этинилэстрадиол обладает полезными геномными и
негеномными
антиандрогенными
эффектами
у
женщин
страдающих
гиперандрогенией и одновременно нуждающихся в контрацепции. Такая
рекомендация имеет теоретические обоснования, выражающиеся в быстрых
мембранотропных
и
отсроченных
геномных
эффектах
дроспиренона,
направленных на снижение избыточной активности андрогенов у некоторых
женщин.
ВЫВОДЫ
1. Терапия препаратом дроспиренон/этинилэстрадиолом положительно влияет
на угревую сыпь различной степени тяжести у женщин с гиперандрогенией.
На фоне приема препарата происходит активное разрешение элементов
угревой сыпи: клиническое выздоровление и значительное улучшение
отмечено в 97,8% случаях.
2. Подтверждением антиандрогеного действия дроспиренон/этинилэстрадиола
служат данные о
достоверном снижении концентрации свободного
тестостерона (в среднем на 28%) и повышении уровня глобулина,
связывающего половые стероиды (в среднем на 31%).
3. В зависимости от степени выраженности сродства к внутриклеточным
рецепторам
андрогенов
в
лимфоцитах
изученные
соединения
располагаются в ряду: ципротерона ацетат > дроспиренон > прогестерон >
АБМП. Выявленная закономерность отражает вероятность развития геномопосредованного действия стероидов.
4. Помимо
классического
рецептор-опосредованного
геномного
пути
андрогены оказывают прямые эффекты на клетки-мишени, осуществляемые
системой вторичных мессенджеров и изменением ионной проницаемости
мембран.
 Тестостерон в концентрации 1-10 мкМ дозозависимо индуцирует вход
ионов кальция из внеклеточной среды через Са-каналы цитоплазматической
23
мембраны. По механизму развития данный
эффект относится к
проявлениям раннего экстрагеномного действия стероидных гормонов.
 В терапевтической области концентраций дроспиренон блокирует Саканалы
плазматических
мембран
и
препятствует
индуцированному
тестостероном входу Ca2+ извне в клетки.
5. Разработана модель изучения антиандрогенной активности соединений
различной химической и гормональной природы с использованием
лимфоцитов периферической крови человека. По сочетанию таких свойств,
как тропность к внутриклеточным рецепторам андрогенов, способность
инициировать негеномные эффекты,
дроспиренон наиболее близок к
природному прогестерону.
Практические рекомендации
1.
На основе проведенного клинико-экспериментального исследования
комбинированный препарат дроспиренон/этинилэстрадиол может быть
рекомендован для коррекции симптомов гиперандрогении у женщин.
2.
Лимфоциты человека могут быть использованы в качестве тест-системы
для скрининга и изучения молекулярных механизмов действия новых
соединений, обладающих антиандрогенной активностью.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Попова Н.Ю., Духанин А.С., Шимановский Н.Л. Комбинированные эстроген/
гестагенные препараты в лечении гиперадрогении у женщин. Международный
медицинский журнал, 2006, т.12, №4, с 116-119.
2.
Попова
Н.Ю.,
комбинированного
Духанин
препарата
А.С.,
Шимановский
Н.Л.
дроспиренон/этинилэстрадиола
Применение
при
терапии
угревой болезни у женщин. 15 научные чтения памяти академика Н.Н.Бурденко
«Актуальные
вопросы
современной
клинической
медицины».
областной научно-практической конференции. Пенза, 2006, с.249-250.
Материалы
24
3. Попова Н.Ю., Духанин А.С., Шимановский Н.Л. Влияние комбинированного
препарата дроспиренон/этинилэстрадиола на показатели гормонального обмена у
женщин с андрогенозависимой формой угревой болезни. Там же. с.250-251.
4. Попова Н.Ю., Духанин А.С., Шимановский Н.Л. Лимфоциты периферической
крови как экспериментальная модель изучения антиандрогенной активности
дроспиренона. Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации
больных. Материалы 12 межрегиональной научно-практической конференции
ГОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей Федерального
агентства по здравоохранению». Пенза, 2006, с. 218-220.
5. Духанин А.С., Попова Н.Ю., Шимановский Н.Л. Влияние дроспиренона на
обмен вторичных мессенжеров в лимфоцитах периферической крови человека.
Известия высших учебных заведений. Поволжский регион, 2007, №1, с.106111.
6. Попова Н.Ю., Духанин А.С., Шимановский Н.Л. Негеномный эффект
андрогенов на содержание ионов кальция в лимфоцитах человека. Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины, 2007, т.143,№5, с.542-544.
Список сокращений
АА
АБМП
БСА
ГСПС
ДТ
ЛГ
РА
Т
ФСГ
арахидоновая кислота
17-ацетокси-3-бутаноилокси-6метил-прегна-4,6-диен-20-он
бычий сывороточный альбумин
глобулин, связывающий половые
стероиды
дигидротестостерон
лютеинизирующий гормон
рецепторы андрогенов
тестостерон
фолликулостимулирующий
гормон