Биологическая устойчивость цианобактерий к различным

Биологическая устойчивость цианобактерий к различным
загрязнителям
Фонарев Никита
11 класса ГБОУ Лицей № 1502при МЭИ г.Москвы
Научные руководители: к.б.н.
Пахневич А.В.
Шашкова М.Б.
Содержание
Введение
2
Цель и задачи исследования
3
Краткий литературный обзор
3
Материал и методы
4
Результаты исследования и их обсуждение
5
Выводы
9
Список литературы
9
Приложение
11
Введение
Цианобактерии известны своей неприхотливостью к различным
условиям обитания, в лужах, отстойниках, горячих источниках, содовых
озерах. При этом их активное размножение, жизнедеятельность и
выделение продуктов обмена веществ может привести к увеличению
токсичности
органические
воды.
Они
вещества,
способны
например,
разлагать
высокомолекулярные
нефтепродукты.
Это
особенно
актуально в связи с экологическими катастрофами конца XX века и
последних лет (например, в связи с крупными разливами нефти).
Достаточно
вспомнить
события
в
Мексиканском
заливе.
Цианобактериальные сообщества способны существовать в присутствии
высоких концентраций различных металлов и радиоактивных элементов.
При этом они могут концентрировать некоторые элементы (например, Fe,
Mn, Au), образуя руды, что очень для металлургии будущего, так как
некоторые месторождения руд через несколько десятков лет будут
исчерпаны.
Важна
также
способность
цианобактерий
поддерживать
опредленный химический состав воды и ее pH. Это может быть
использовано в решении проблемы кислотных дождей.
Устойчивость цианобактерий и сообществ, где они являются
средообразователями, к пессимальным условиям, таким как высокие
температуры горячих источников, низкие температуры Арктики и
Антарктиды, высокие концентрации радиоактивных и ядовитых веществ,
определяет
интерес
астробиологов.
Именно
следы
прокариотных
сообществ ищут исследователи НАСА и отечественные специалисты на
других планетах (Марсе, спутниках планет-гигантов), в метеоритах.
Я
решил
провести
собственное
исследование
биологической
устойчивости цианобактерий, поскольку они являются биологически
пластичными организмами, имеющими столь важное значение для
2
естественных
экосистем
и
человека.
Подобных
исследований
с
привлечением подобной техники ранее не проводилось.
Цель и задачи исследования
Цель: Исследовать влияние солей тяжелых металлов, органических
твердых, горючих и моющих веществ на колонии цианобактерий.
Задачи: 1. Исследовать влияние растворов солей тяжелых металлов
различной концентрации на жизнедеятельность цианобактерий,
2.
Установить
какое
воздействие
оказывают
на
колонию
цианобактерий моющие и горючие органические вещества,
3. Определить влияние твердого мусора, на примере полиэтилена, на
развитие колоний цианобактерий.
4. Исследовать степень влияния цианобактерий на различные
загрязняющие вещества.
Краткий литературный обзор
Цианобактерии обитают в условиях повышенных загрязнений
сточных вод, при значительном увеличении содержания органического
вещества. Пр
этом они
способны разлагать высокомолекулярные
органические вещества, например, нефтепродукты (Сопрунова, 2005),
увеличивая свою биомассу. Это важно для утилизации отходов, в том
числе нефти, гербецидов, ряда токсических веществ. С другой стороны,
увеличение биомассы цианобактериального сообщества (куда входят и
другие прокариоты), приводит к выделению в воду различных токсинов,
объединяемых в группу цианотоксинов (Гаврилова, 2009). Они влияют на
размножение планктона, отравляют рыб, воздействуют на различные
органы человека и других млекопитающих.
Для
некоторых
прокариот
хорошо
известна
особенность
концентрирования веществ (например, соединений Fe, Mn) внутри клеток
3
и на их поверхности (Определитель…, 1997). Некоторые из них,
минерализуясь после смерти, образуют различные горные породы,
имеющие практическое значение для металлургии. К этому числу
относятся и цианобактерии. Их нити и чехлы, в которых они живут,
хорошо минерализуются, например, окремневают (Жегалло и др., 2007;
Орлеанский и др., 2007). Замещаются они и такими элементами, как
золото, уран-238 (Школьник и др., 2005). В связи с этими актуальными
проблемами исследования цианобактерий я и выбрал данную тему.
Материал и методы
Работа проводилась с мая 2011 г. по январь 2012 г. включительно. В
исследовании использовались осциллаториевые цианобактерии из луж,
располагавшихся на берегу Лебедянского пруда. Они были помещены в
стеклянные прозрачные цилиндры, колбы, стаканы. В пяти цилиндрах для
поддержания pH более 7 использовалась подложка из молотого мела. Один
из них оставался контрольным, в 4 остальных добавлялось по 5 мл
свежеприготовленных растворов водных солей FeSO4, MnSO4, CoSO4,
CuSO4. Концетрация добавляемых растворов увеличивалась от 5% до 10%
(FeSO4), до 11,8% (MnSO4), до 22,3% (CoSO4), до 10,8% (CuSO4) в
зависимости от порога насыщения р-ра каждой из солей. Измерения pH
производились с помощью электрода и цифровой лаборатории NOVA. Для
сравнения измерялось значение pH в стаканчике с молотым мелом и в 5%
растворах добавляемых солей. Для получения одного значения pH
выполнялось 2000 измерений. В колбу с цианобактериями добавлялось три
раза по одной капле моющего средства AOS. Во вторую колбу была
прилита нефть, распространившаяся по поверхности жидкости в виде
пленки. Параллельно в стаканчик с водой без цианобактерий также
добавлялась нефть для сравнения результатов. В третью колбу, помимо
цианобактерий, были помещены три полоски полиэтилена для выяснения
4
влияния загрязнений твердого мусора на исследуемых прокариот. В
стаканчике также в воду, но без цианобактерий, были положены еще три
полоски полиэтилена для выявления возможного влияние продуктов
жизнедеятельности цианобактерий на полимер. Во время всего периода
исследований производились визуальные наблюдения за состоянием
поселений
цианобактерий,
велась
фотодокументация
с
помощью
фотоаппарата Canon Power Shot A610. Остаточную концентрацию ионов Fe
и Cu в воде цилиндров измеряли с помощью колориметра HANNA
Instruments C100. Концентрация ионов Mn и Co вычисляли по увеличению
мутности при осаждении их с помощью фосфата натрия. Для этого была
собрана установка, состоящая из штатива с бюреткой, в которой был
раствор Na3PO4, кюветы с исследуемым раствором, в котором была
магнитная
мешалка,
подключенного
к
датчика
цифровой
измерения
лаборатории
мутности
L-micro.
раствора,
Прекращение
увеличения мутности раствора я интерпретировал как полное осаждение
исследуемых ионов. Была собрана установка для измерения силы,
прилагаемый для разрыва полосок полиэтилена, который находился в
колбе с цианобактериями и в контрольной воде. Она состояла из датчика
измерения
силы
растяжения,
цифровой
лаборатории
NOVA
и
поднимающегося штатива. Полиэтиленовая крепилась с помощью скотча к
верхнему и нижнему уровню штатива и к датчику. При поднятии верхнего
уровня штатива пленка натягивалась и со временем лопалась. В цифровой
лаборатории NOVA регистрировался характер изменения прилагаемой к
разрыву силы. Для сравнения данных использовалась программа Statistica
7.
Результаты и их обсуждение
Визуальные наблюдения. После 2-х недель после заселения
цилиндров цианобактериями, обнаружилось, что их зеленая пленка
5
покрывает дно цилиндров и распространяется вверх по их стенкам. С
добавлением первых растворов солей в цилиндрах с сульфатами железа и
меди наблюдались признаки гидролиза с образованием соответствующих
гидрооксидов. Наиболее активно этот процесс шел с FeSO4. Позже во всех
цилиндрах стал появляться осадок. Степень выпадения осадка зависела от
его ПР. В цилиндре с раствором медного купороса гидрооксид стал
образовывать корки на границе твердой и жидкой фаз. Гидрооксид железа
(III)
в
виде
коричнево-ржавого
рыхлого
налета
оседал
на
цианобактериальные пленки. В цилиндре с сульфатом меди была
подчеркнута интересная особенность: цианобактерии структурировали
осадок под пленкой, перемещая голубой гидрооксид в виде тонкого
прослоя внутрь осадка. Эту особенность подчеркнули Л.Е. Ким и В.А.
Мартыненко в проектной работе 2011 г., но в данном случае с соединением
меди это было видно нагляднее. Цианобактерии, в случае с CuSO4,
способны прорастать сквозь пленку осадка, избегая увеличение дефицита
освещения.
В
результате
из-за
осаждения
гидрооксида
Fe
цианобактериальная колония почти полностью отмерла. В остальных
случаях, несмотря на образование осадка, наличия в растворе тяжелых
металлов – кобальта и меди, цианобактерии выживали, сохраняя зеленый
цвет своих пленок. Вероятно, гидрооксид железа экранировал процесс
фотосинтеза, что приводило к гибели цианобактерий. Только после
очистки поверхности пленок от гидрооксида железа, поверх отмерших
участков появился зеленый слой нитей, что свидетельствует о неполной
гибели пленки.
В колбах с нефтью, AOS, полиэтиленом все цианобактерии
прижились и образовали зеленую пленку на их дне. В колбе с нефтью
поверхностная пленка загрязнителя постепенно разрывалась пузырьками
О2, образовывавшегося за счет фотосинтеза. В результате, она стала гуще и
была разобщена на фрагменты. Этого не происходило в контрольном
6
стакане с нефтью. Возможно, что на пленку нефти действовали и
цианобактериальные метаболиты. В начале опыта наиболее интенсивно
зеленая пленка цианобактерий находилась в той части колбы, где был
прорыв нефтяной пленки. В завершении опыта на дне этой колбы
образовалась зеленая подушка из цианобактерий, поднимающаяся над
поверхностью дна. В колбе с AOS развитие прокариот происходило без
признаков угнетения и только в конце цианобактерии расселились по
стенкам стакана, а те, что жили на дне ушли вглубь грунта. Цианобактерии
в колбе с полиэтиленом использовали фрагмент полимера для того, чтобы
подняться выше к источнику света и обросли полимерный образец.
Сравнивая контрольные полиэтиленовые пленки с пленками из колбы с
цианобактериями, я установил, что различия в прилагаемой к растяжению
и разрыву силе существуют. Среднее значение силы для полиэтилена из
контрольной колбы 3,445 Н (max- 4,02; min – 2,84), а из колбы с
цианобактериями – 3,055 Н (max- 3,61; min – 2,61). Сравнив два массива
данных с помощью статистической программы, используя критерии
Стьюдента и Фишера, я получил следующие результаты: t-критерий 1,1441, df – 6, p - 0,2961; F-критерий - 1,2897, p - 0,8393. Таким образом,
значения
достоверно
не
отличаются,
и
необходимо
проводить
дополнительные исследования с большими выборками полиэтиленовых
пленок.
Измерения
pH.
Изначально
значение
pH
в
цилиндрах
с
цианобактериями составляло 7, через неделю оно повысилось до 8,75 и
держалось
вплоть
до
добавления
растворов
солей.
Эти
данные
свидетельствуют о том, что колонии цианобактерий прижились во всех
цилиндрах и влияют на химизм растворов. При этом наличие мела в
цилиндрах не могло увеличить pH до такого значения, так как
экспериментально выявлено, что в стакане с мелом pH=7,8 (мел был в
стакане неделю). А ранее было показано (Ким, Мартыненко, 2011), что в
7
цилиндрах без мела (только с небольшим количеством CaCl2) pH может
подниматься до 9,7. С добавлением солей pH изменилось следующим
образом: в цилиндре с FeSO4 – 5,17, MnSO4 – 7,08, CoSO4 – 7,4, CuSO4 –
5,65. Если сравнить значения pH 5% р-ров соответствующих солей и
подобные значения в цилиндрах после добавления р-ров той же
концентрации, то можно заметить, что в цилиндрах они выше: в 5% р-ре
FeSO4 – 3,2, MnSO4 – 6,2, CoSO4 – 6,6, CuSO4 – 4,2. Дальнейшее
добавление
солей
уменьшало
pH,
но
иногда, несмотря
на
это,
цианобактерии влияли на его увеличение, например, с 5,65 до 6,6, а потом
и до 7,11 (сперва, при добавлении 5 мл. 10% р-ра CuSO4, а потом без новых
добавлений). Или pH увеличивался с 5,17 до 5,64 при добавлении 10% р-ра
FeSO4. Самое низкое значение pH наблюдалось в цилиндре с р-ром FeSO4
– 3,6. Это значение соответствовало времени почти полного отмирания
колонии. После недели без новых добавлений р-ров солей (на 8 неделе
эксперимента) pH во всех цилиндрах, за исключением цилиндра с FeSO4
(где уже измерения не проводились), возросло почти на 0,5, что еще раз
доказывает сохранение жизнеспособности колоний цианобактерий до
конца эксперимента (кроме цилиндра с FeSO4). Значения pH в
контрольном цилиндре варьировали от 7 до 8,8, а колония оставалась в
жизнеспособном состоянии. Окончательные концентрации ионов в
цилиндрах достаточно высоки: Fe – 0,52 г/л, Mn – 8,3 г/л, Co – 2,3 г/л,
CuSO4 – 0,208 г/л.
Образование
кристаллов.
Известно,
что
нити
и
чехлы
цианобактерий хорошо и быстро минерализуются (Жегалло и др., 2007;
Орлеанский и др., 2007), что может способствовать минерало- и
породообразованию.
Я
предположил,
что
в
качестве
центров
кристаллизации могут выступать нити цианобактерии. Но кристаллов
солей, выросших на нитях, не обнаружил. При рассмотрении фрагментов
цианобактериальных пленок под микроскопом Биолам в образцах пленок
8
из цилиндров с CuSO4 и CoSO4 на поверхности нитей были обнаружены
мелкие зерна-кристаллы соответствующих гидрооксидов. Это может быть
показателем концентрации минеральных веществ на поверхности чехлов и
мембран цианобактерий, что может быть полезно для концентрирования
соединений металлов из растворов, например, в почве или при обогащении
руд.
Выводы
1. Из всех солей металлов наибольшее угнетающее воздействие
имеет сульфат железа, покрывавший поверхность цианобактериальной
пленки.
2. Состояние колоний даже при высоких концентрациях солей Mn,
Co, Cu сохраняется жизнеспособным, о чем можно судить по показаниям
pH-метра.
3. Цианобактерии прорастают пленки осадка гидроксидов тяжелых
металлов и структурируют его.
4. Наличие нефтяной пленки, полиэтиленовых пакетов, моющих
средств не способствует угнетению жизнедеятельности цианобактерий.
5. Цианобактерии способны нарушать структуру загрязняющих
веществ, что можно использовать в практических целях.
Список литературы
1.
Гаврилова Е.В. Видовой состав, динамика численности и
токсичность цианобактерий Шершневского водохранилища Челябинской
области.
Автореф.
канд.
биол.
наук,
2009.
24
(http://www.dissercat.com/content/vidovoi-sostav-dinamika-chislennosti-itoksichnost-tsianobakterii-shershnevskogo-vodokhranil)
9
с.
2.
Жегалло Е.А., Карпов Г.А., Лупикина Е.Г. Герасименко Л.М.,
Орлеанский В.К. Cyanophyta в гейзеритовых отложениях Камчатки //
Альгология. 2007. Т. 17. № 1. С. 88-92.
3.
Ким.
Л.Е.,
Мартыненко
В.А.
Изучение
культуры
цианобактерий в лицейской лаборатории. Проектная работа по экологии.
М.: Лицей 1502 при МЭИ. 2010. 29 с.
4.
Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Пер. с англ. Под ред.
Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. 1997. Т. 1. 432
с.; 1997. Т. 2. 368 с.
5.
Орлеанский В.К., Жегалло Е.А., Карпов Г.А., Лупикина Е.Г.,
Герасименко Л.М. Гейзерит и цианобактерии / Минералогия и жизнь:
происхождение биосферы и коэволюция минерального и биологического
миров,
биоминералогия:
Материалы
IV
Международного
минералогического семинара. Сыктывкар: Ин-т геологии Коми НЦ УрО
РАН, 2007. С. 124-126.
6.
Сопрунова О.Б. Циано-бактериальные консорциумы в очистке
сточных вод / Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» /
http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2005/011.pdf
7.
Школьник Э.Л., Жегалло Е.А., Герасименко Л.М., Шувалова
Ю.В. Углеродистые породы и золото в них бассейна Витватерсранд, ЮАР
– исследование с помощью электронного микроскопа. М.: Эслан, 2005 .
120 с.
10
Приложение
Рис. 1.
11
Рис. 2. Иллюстрации некоторых результатов исследования
12