Люцифераза текст презентации

Бактериальная люцифераза EC 1.14.14.3 Organism Vibrio harveyi
Биолюминесценция – ферментативный процесс, катализируемый особой
группой бактериальных ферментов – люцифераз (щелочных FMN-зависимых
монооксигеназ E.C. 1.14.14.3), сопровождающийся потреблением кислорода и
излучением света.
1. оксидоредуктаза
1.14 Действуя на парных доноров, с O2 в качестве окислителя и включение
или сокращение кислорода. Кислород вовлеченный не должны быть отнят от
O2.
1.14.14 При понижении флавин или флавопротеид как один донор, и
включение одного атома кислорода от других доноров.
1.14.14.3 Алканаль монооксигеназа (FMN)
Наименования фермента
Общепринятое название
alkanal monooxygenase (FMN-linked)
Другие названия
Vibrio fischeri luciferase
aldehyde monooxygenase
bacterial luciferase
luciferase
Систематическое название
alkanal,reduced-FMN:oxygen oxidoreductase
(1-hydroxylating, luminescing)
Ферментативная реакция
Все бактериальные люциферазы- флавинзависимые монооксигеназы.
Люциферазы катализируют in vitro реакцию окисления длинноцепочечных
алифатических
альдегидов
(RCHO)
при
участии
восстановленного
флавинмононуклеотида (FMNH2), продуктом реакции является излучение света
в сине-зеленой области видимого спектра:
MNH2 + O2 + RCHO → FMN + RCOOH + H2O + light
Особенность измерения активности бактериальных люцифераз состоит в
том, что время, требуемое для одного каталитического цикла, намного больше,
чем время жизни субстрата FMNH2, который автокаталитически окисляется
кислородом менее чем за 1 сек:
FMNH2 + O2 → FMN + H2O2
Поэтому в условиях запуска реакции одной порцией предварительно
восстановленного FMN люцифераза успевает совершить всего один оборот.
Наблюдается люминисцентная вспышка, затухающая по экспоненте, реакция
протекает в нестационарном режиме. Проведение биолюминесцентной реакции
с
химически
восстановленным
FMNH2, сопровождается
длительным
свечением, обусловленным увеличением числа оборотов фермента в реакции.
Второй субстрат- RCHO подвержен медленному неферментативному
окислению, и скорость окисления зависит от температуры и начальной
концентрации. При комнатной температуре раствор альдегида, используемый
для измерения биолюминесценции, стабилен в течение 8 ч. Неферментативное
окисление альдегида, в отличие от FMNH2, не оказывает влияния на ход
люминесцентной реакции, поскольку его скорость значительно меньше
скорости значительно меньше скорости ферментативного окисления
Строение
Несмотря на небольшие межвидовые различия все люциферазы имеют
сходное строение и представляют собой белковые αβ-гетеродимеры (продукты
расположенных рядом генов luxAB), состоящие из двух субъединиц, α (рис 1) и
β (рис 2), молекулярная масса которых 76±4 kDa, не содержащих металлов или
простетических групп.
Рис 1 структура и аминокислотный состав α субъединицы (аминокислоты,
составляющие активный центр обведены желтыми квадратами, стрелки
обозначают β складчатый лист-структуру, спирали – альфа-спирали, прямые
линии - катушки)
Рис 2 структура и аминокислотный состав β субъединицы (обозначения
аналогичный Рис 1)
Индивидуальные субъединицы неактивны, каталитической активностью
обладает только димер.
Эти α и β субъединицы гомологичны, однако
активный центр фермента главным образом находится на α-субъединице. Роль
β-субъединицы не до конца понятна, но предполагают, что она участвует во
взаимодействии восстановленного флавина с люциферазой и существенна для
высокого квантового выхода реакции. Химизм катализируемой люциферазами
реакции в наиболее общем виде представляется как ферментативное
окисление
восстановленного
флавинмононуклеотида
(FMN)
флавинмононуклеотида
с
(FMNH2)
одновременным
до
окислением
длинноцепочечного алифатического альдегида (RCHO) с 8-14 атомами углерода
до соответствующей жирной кислоты (RCOOH) посредством кислорода воздуха
и излучением кванта света в сине-зеленой области спектра с длиной волны
максимальной эмиссии около 495 нм. Все бактериальные люциферазы
проявляют биолюминесцентную активность с альдегидами, длина цепи
которых от восьми до шестнадцати углеродов, потому что предполагается, что
сродство
альдегида
к
люциферазе
обусловлено
гидрофобными
взаимодействиями между каждым участком алифатической цепи альдегида и
гидрофобными группами фермента. Благодаря этому, с увеличением длины
углеродной цепи альдегид прочнее связывается с люциферазой. Это
обеспечивает бóльшую эффективность превращения химической энергии в
световую.
В настоящее время определена кристаллическая структура люциферазы
V.harveyi, замороженной при -160 ° С в метиловом эфире полиэтиленгликоля, с
разрешением 2.4Ǻ и 1.5Ǻ. Молекула люциферазы имеет вид параллелепипеда
с размерами 75х45х40. Обе субъединицы складываются в однодоменный
(α./β)8-бочонок.
Такая
структура
люциферазы
ранее
была
корректно
предсказана на основе трехмерной модели α-субъединицы бактериальной
люциферазы. Две субъединицы – α- и β -, имеют идентичную топологию. Они
связаны большой соприкасающейся поверхностью, центр которой оккупирован
интересной формой параллельного 4-спирального пучка. В центре пучка –
парные псевдо оси вращения, связывающие α и β-субъединицы. Спирали α2 и
α3 каждой субъединицы из спирального пучка с двумя α2 спиралями,
упакованы очень плотно. Спиральные оси на 6.05Å находятся в стороне от
наиболее плотной точки, и имеют перекрестный угол 30º. Оси пучков α- и βсубъединиц связаны вращением на 80º и смещением на 34º.
Рис. 1.– структура бактериальной люциферазы Vibrio harveyi
Аминокислотная
последовательность
альфа
субъединицы:
Люциферазы
бактерий
содержат
в
своей
аминокислотной
последовательности от 7-8 остатков триптофана. Из них пять остатков являются
строго консервативными и присутствуют во всех видах бактериальных
люцифераз: три на α-субъединице (в положении 194, 250, 277), два – на βсубъединице (в положении 182, 194). Trp 40 и Trp 182 на α-субъединице так же
консервативны (характерны для всех люцифераз, кроме фермента из одного
штамма Photobacterium leognathi). Люциферазы бактерий рода Photobacterium
в целом отличаются от других люцифераз отсутствием в составе α-субъединицы
Trp131. Спектр флуоресценции бактериальной люциферазы имеет максимум
при 330 нм.
Сводка
Рис 1. Количество публикаций по годам (http://www.gopubmed.org/web/gopubmed/)
Рис 2. Количество публикаций по журналам (http://www.gopubmed.org/web/gopubmed/)
Рис 3. Количество публикаций по авторам (http://www.gopubmed.org/web/gopubmed/)
Источники
1. http://www.rcsb.org
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
3. http://www.ebi.ac.uk
4. http://www.gopubmed.org