На правах рукописи Обухова Елена Сергеевна

На правах рукописи
Обухова Елена Сергеевна
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПСЕВДОМОНАД В СОСТАВЕ АУТОФЛОРЫ
РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ В УСЛОВИЯХ КАРЕЛИИ
03.02.08 - экология
03.02.06 - ихтиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук
Петрозаводск-2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении
высшего профессионального образования Петрозаводский государственный университет
Научный руководитель
кандидат биологических наук
доцент
Сидорова Наталья Анатольевна
Официальные оппоненты
Веселов Алексей Елпидифорович,
доктор биологических наук, профессор
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биологии
Карельского научного центра РАН
главный научный сотрудник лаборатории
экологии рыб и водных беспозвоночных
Карасева Татьяна Альфредовна,
кандидат биологических наук,
Федеральное государственное унитарное
предприятие
полярный
научноисследовательский институт морского рыбного
хозяйства и океанографии им. Н.М.Книповича
заведующая
лабораторией
болезней
промысловых гидробионтов
Ведущая организация
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт водных проблем
Севера Карельского научного центра РАН
Защита диссертации состоится 23 октября 2013г.в 14.00 в ауд.117 на заседании
диссертационного совета Д 212.190.01 при Петрозаводском государственном университете по
адресу: 185910, Республика Карелия, г. Петрозаводск, ул. Красноармейская,31
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Петрозаводского государственного
университета, с авторефератом - на сайтах http://vak.ed.gov.ru/ и www.petrsu.ru
Автореферат разослан «23» сентября 2013г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
канд. биол. наук
Дзюбук И.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Разведение радужной форели в северных регионах перспективная отрасль
сельского хозяйства, о чем говорят увеличивающиеся объемы выращиваемой рыбы. Например,
с 2002 по 2012 гг. объем выращиваемой рыбы в Карелии вырос с 2729,7 т до 17490,2 т
[Экологический справочник…,2013]. Увеличение объемов производства рыбной продукции в
садках зависит от многих факторов: климата региона, наличия водных ресурсов, качества
водной среды, научно-технической базы, а также ряда других экономических и экологических
факторов. Однако, методы интенсификации, применяемые на хозяйствах , приводят к
ухудшению гидрохимического режима водоема за счет загрязнения водной среды продуктами
метаболизма рыб, остатками корма, что способствует активизации роста численности
сапрофитной, условно-патогенной и патогенной микрофлоры. Интенсификация производства
радужной форели также неизбежно влечет за собой риск эвтрофирования и увеличения индекса
сапробности используемых водоемов. Это особенно актуально для водных экосистем Севера,
которые являются малокомпонентными по своему составу, слабоустойчивыми и уязвимыми к
воздействию антропогенных факторов, процессы восстановления и самоочищения среды в
таких экосистемах происходят очень медленно [Румянцева,2010].
Масштабный рост
искусственного выращивания рыб, в том числе форели, и других гидробионтов чаще всего
сопровождается деградацией водных экосистем, вспышками массовых заболеваний среди
культивируемых объектов и аборигенных представителей природных водоемов, усилением
дестабилизирующего воздействия на рыб различных стрессовых факторов естественного и
антропогенного происхождения. [Маклакова и др.,2009; др., Казимирченко, 2006]
Нарушения экологического баланса в природной среде проявляются в природных
популяциях новыми болезнями аквакультуры и резкой активацией «вновь возникающих старых
инфекций» из-за снижения темпов самовосстановления водоемов. Особое значение в таком
случае приобретает природоохранная деятельность и исследования влияния форелевых
хозяйств на водоемы и гидробионтов.
Рыбы, как обитатели воды, постоянно находятся в окружении водных микроорганизмов, в
том числе бактерий. Последние могут проникать в рыб и находиться некоторое время в тканях
и органах, не принося им вреда. Бактерии постоянно присутствуют в желудочно-кишечном
тракте, откуда при определенных
условиях могут быстро проникать во внутренние ткани и
органы, таким образом, непосредственно влияя на здоровье рыб. В связи с этим особое
внимание необходимо уделять изучению микрофлоры рыб и особенно - аутофлоры. Несмотря
на то, что значение нормального микробиоценоза в поддержании естественной
функциональности организма рыбы очень велико, комплексных исследований форелевых
хозяйств и самой форели в Карелии не проводилось. Важность изучения бактериофлоры рыб
отмечают как отечественные, так и зарубежные ученые [Авдеева, Казимирченко, 2006,
Сидорова, Паршуков, 2010, Ringo E,1995, Kim2007]. Одной из групп микроорганизмов широко
представленной как в микрофлоре карельских водоемов, так и в микрофлоре радужной форели
является род Pseudomonas. Распространенность этих бактерий обусловлена характерными
особенностями. Среди отличительных признаков псевдомонад отмечаются следующие гибкость метаболизма, природная полирезистентность к антибиотикам, способность
самостоятельно синтезировать антимикробные вещества, биопленкообразование, а также
некоторые другие. Именно эти свойства позволяют псевдомонадам занимать доминирующее
положение в микробиоценозах воды и рыбы, но, тем не менее, микроорганизмы рода
Pseudomonas изучены недостаточно.
Исходя из этого, сформированы цель и задачи диссертационной работы:
Цель - исследование экологических особенностей микроорганизмов рода Pseudomonas в
составе аутофлоры радужной форели, выращенной в аквакультуре Карелии.
Задачи:
1. Оценить разнообразие микрофлоры в составе микробиоценозов воды и аутофлоры
форели, выращиваемой в садковых хозяйствах Карелии.
2. Изучить особенности псевдомонад в составе аутофлоры радужной форели;
3. Оценить физиологические и биологические свойства доминирующих групп бактерий в
составе аутофлоры радужной форели.
3
4. Выяснить роль Pseudomonas в развитии неспецифической резистентности радужной
форели.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. В ходе данной работы впервые
исследованы особенности микроорганизмов рода Pseudomonas, выделенных из аутофлоры
радужной форели выращенной в условиях карельского региона. Впервые исследована
антагонистическая активность P. alcaligenes и P. cichoril , установлен профиль ауксотрофных
мутантов, оценена степень чувствительности псевдомонад к антибиотикам применяемым в
аквакультуре. Определена специфичность взаимодействия псевдомонад с организмом хозяином
в экологических условиях Карелии.
Практическая значимость. На основе полученных результатов, показано, что
микробиологические составляющие являются объективным показателем оценки состояния
экосистемы.
Качественные и количественные показатели микрофлоры позволяют прогнозировать
ситуацию и разрабатывать лечебно-профилактические мероприятия в садковых хозяйствах.
В ходе исследований разработан состав питальных сред наиболее подходящих для
культивирования псевдомонад.
Предложены рекомендации по рациональной антибиотикотерапии бактериозов
псевдомонадной этиологии.
Материалы, изложенные в диссертационной работе, могут быть использованы в курсах
лекций по микробиологии и экологии микроорганизмов, читаемых на профильных кафедрах
ВУЗов Российской Федерации. Некоторые результаты исследований включены в методическое
пособие «Санитарно-микробиологические исследования в рыбоводстве» Рыжков Л.П. и др ..;
Петрозаводск: ПетрГУ, 2013.-31с
Апробация результатов. Основные результаты исследований апробированы в докладах на:
Международной научно-практической конференции «Научные исследования и их практическое
применение. Современное состояние и пути развития (Одесса, 2-12 октября 2012г);
Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы гидробиологии и ихтиологии»
(Казань, 6 декабря 2011); Всероссийской научно-практической конференции " Экологическая
дискуссия: окружающая среда - здоровье человека" (Волгоград, 30 марта 2012); международной
научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 19 октября 2012);
Научно-практической Интернет-конференции «Актуальные проблемы гидробиологии и
ихтиологии в условиях биологических инвазий в пресноводных экосистемах» (Казань, 22 ноября
2012); 65-й научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Петрозаводск, 22–26
апреля 2013); Всероссийской научно-практической конференции «От микроскопа до
нанотехнологий» (Санкт-Петербург,21-22 мая 2013); Первой Всероссийской научно-практической
конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств. (Москва, 3-5
июня 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 в изданиях,
рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения,
выводов и содержит 39 рисунков, 42 таблиц, 3 приложения. Работа изложена на 135 страницах.
Список литературы содержит 210 источников, 62 из них на иностранном языке.
Благодарности.
Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю – доценту
кафедры фармакологии и организации экономики фармации, микробиологии и гигиены
медицинского факультета ПетрГУ, к.б.н. Сидоровой Наталье Анатольевне за помощь в
подготовке работы, советы и понимание. За научные консультации автор благодарит
профессора, д.б.н. Ивантера Эрнеста Викторовича; доцента, к.м.н. Образцову Антонину
Михайловну, старшего преподавателя курса микробиологии Комкову Ольгу Петровну,
профессора д.б.н. Рыжкова Леонида Павловича. За помощь в проведении экспериментальной
работы - коллектив кафедры фармакологии и организации экономики фармации,
микробиологии и гигиены медицинского факультета ПетрГУ в лице
Работа поддержана программой «Умник»
4
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 Литературный обзор
Глава рассматривает природно-географические условия исследуемого региона, а также
вопросы, посвященные экологии микроорганизмов рода Pseudomonas. Изучены и
проанализированы работы отечественных и зарубежных авторов о биотических особенностях
данных бактерий. Дана экологическая характеристика псевдомонад в составе аутофлоры
форели, а также в других ценотических условиях.
Описано положительное влияние
нормального микробиоценоза на организм хозяина, заключающееся в колонизационной
активности по отношению к транзитным видам микрофлоры; стимуляции иммунной системы;
участии в синтезе витаминов; инактивации экзо- и эндогенных токсических продуктов,
выработки бактериоцинов; участии в биохимических процессах пищеварения.
Глава 2 Материалы и методы исследований
Работа выполнялась в течение 2007-2012 гг на базе кафедры фармакологии,
организации и экономики фармации, микробиологии и гигиены . Для выяснения экологических
закономерностей становления аутофлоры форели во времени и в пространстве отбирались:
аутофлора форели с наружных и внутренних органов, вода из садка и прилежащих к
форелевому хозяйству районов. Всего для экологических и микробиологических исследований
отобрано около 2000 проб принадлежащих к форелевым хозяйствам, расположенным на озерах
Святозеро, Топозеро и Ладожском озере.
Объектами изучения являлись микроорганизмы рода Pseudomonas выделенные из
аутофлоры форели и микрофлоры воды.
Идентификацию микроорганизмов проводили на основании изучения морфологических,
тинкториальных, биохимических свойств в соответствии с Определителем бактерий Берджи
[Определитель…,1997].Изучение физиологических свойств псевдомонад производили согласно
принятым в бактериологии методикам [Биргер…,1982]. При оценке ферментативной
активности дополнительно оценивалась кинетика роста псевдомонад, выращенных на трех
различных опытных средах:
Среда №1 - минеральная среда М9 с глюкозой Na2HPO4·Н2O - 6,0; КН2PO4 - 3,0; NaCl 0,5; NH4Cl - 1,0; Mg2SO4 ·7H2O - 0,3; CaCl2 ·2H2O - 0,01; Агар-агар - 15,0; пируват натрия - 5
г. Вода дистиллированная - до 1 дм3; рН – 6,9.
Среда №2 - минеральная среда М9 с глюкозой и Fe3+,
Среда №3 - богатая питательная среда, содержащая пептон.
и среде Эндо.
Определение ауксотрофных мутантов производили методом тотальной селекции на глюкозоминимальной среде [ Биргер…,1982].
Определение механизма конкуренции Pseudomonas с патогенными видами.
Для исследования антагонистических свойств бактерий использовали методы прямого
антагонизма по Murray(1950), в модификации Усвяцова (1967) и отсроченного антагонизма
поFrederiq (1957) [Биргер…,1982]. Для количественной оценки антагонистическую активности
использовали метод Бухарина с соавторами [Патент РФ № 2175673 от 07.03. 2000/ Бухарин О.
В., Забирова Т. М., Чертков К. Л., Черкасов С. В., Иванов Ю. Б.] В качестве индикаторных
культур использованы лабораторные штаммы S. aureus и Aeromonas sp.
Определение спектра устойчивости Pseudomonas к физико-химическим параметрам
среды.
Для оценки воздействия химических и физических факторов среды на Pseudomonas
alcaligenes и Pseudomonas cichoril использовали стандартные методы [МУК 2293-81…,1981;
Руководство…,1985]
Определение спектра резистентности Pseudomonas к антибиотикам.
При оценке фенотипической чувствительности P. alcaligenes и P. cichoril к антибиотикам
использовано два метода: диско-диффузионный и серийных разведений [Methods…, 1998].
5
Антибиотики, участвовавшие в опыте : беталактамы (карбенициллин); цефалоспорины
(цефуроксим, цефоперазон , цефтриаксон, цефотаксим, цефтазидим , цефепим);
аминогликозиды (гентамицин , канамицин , неомицин , стрептомицин, нетилмицин) ; хинолоны
(левофлоксацин , ципрофлоксацин) ; макролиды (эритромицин).
Оценка биоморфологических показателей форели
Для исследования динамики факторов неспецифической резистентности
молоди
радужной форели под действием штаммов P. alcaligenes и P. cichoril создали 2 опытные группы
форели, по 15 особей в каждой, и помещенные в отдельные аквариумы (группа 1 и 2). Опытные
группы содержались при температуре 21 °С в течении 30 суток. Одновременно была
сформирована контрольная группа форели из 5 особей Контрольная группа содержались при
температуре 12 °С в течении 30 суток.Штаммы P. alcaligenes вносились при кормлении
опытной группы 1, а P. cichoril - при кормлении опытной группы 2 в течение 30 суток.
Модифицированный псевдомонадами корм изготавливали в лабораторных условиях на основе
полноценного гранулированного корма «BioMar» с последующим нанесением желатиновой
суспензии препарата.
Определение фагоцитарной активности лимфоцитов в периферической крови и
содержание лизоцима в слизи радужной форели проводили по стандартным методикам
[Комкова О.П. и др…, 2004].
Статистическая обработка полученных данных
Статистическую обработку данных проводили при помощи программ Microsoft Excel 2007
и StatGraphics Plus 2.1 [Коросов, Горбач, 2007]
Для анализа распределения резистентных и чувствительных штаммов P. alcaligenes и
P.cichoril к антибиотикам использовали аналитическую программу WHONET.
Глава 3 Результаты исследований
Описание исследованных групп аутофлоры Радужной форели
Микрофлора форели исследованных садковых хозяйств представлена бактериями
семейств Pseudomonadaceae и Bacillaceae. Кроме того, в ходе экспериментальной работы
выделены сапрофитные бактерии семейств Micrococcaceae, Neisseriaceae, а также семейство
Enterobacteriaceae представляющее санитарно-показательные микроорганизмы.
Обсемененность рыбы кишечными бактериями объясняется недостаточным естественным
самоочищением северных водоёмов, вследствие низких среднегодовых температур.
Доминирующей группой бактерий в составе аутофлоры радужной форели всех
исследуемых хозяйств являются микроорганизмы семейства
Pseudomonadaceae (род
Pseudomonas). Доля псевдомонад в аутофлоре форели Ладожкого озера составляет 29 %,
Святозера – 81,1 %, Топозера - 66,7 %.
Анализ ферментативной активности и аминокислотного профиля выделенных
культур Pseudomonas.
У обоих видов спектр ферментативной активности идентичен, за исключением гидролиза
крахмала, который отсутствовал у P. alcaligenes. Варианты с использованием бактерий
выращенных на разных средах статистически значимо отличались друг от друга. Максимальное
количество микроорганизмов - 6,7±0,5 тыс. КОЕ/мл установлено для P.alcaligenes при
культивировании на среде №2. Минимальное – 2,4±0,5 тыс. кое/мл установлено для P.cichoril
при культивировании на среде Эндо. Культура P.alcaligenes оказалась более адаптированной к
минеральной среде с добавлением Fe3+, чем P.cichoril.
В результате изучения прототрофности псевдомонад установлено, что количество
ауксотрофных мутантов по LД- аланину для P. alcaligenes составило 35% , LD-
–
35%, L-аргинину – 20%, АУК – 15%, L-аспарагину – 30%, DL-аспарагиновой кислоте – 10 %,
DL- фенилу – 10%, DL- фенилу – 10%, Dl-валину – 25%, DL-триптофану – 35 %, L-цистеину
солянокислому – 10%, L-цистеину – 40 %, нингидрину – 30%.
Для P. cichoril количество ауксотрофных мутантов по LД- аланину составило 0% , LD
– 60%, L-аргинину – 25%, АУК – 5%, L-аспарагину – 10%, DL-аспарагиновой
6
кислоте – 25%, DL- фенилу – 20%, DL- фенилу – 15%, Dl-валину – 10%, DL-триптофану –
25%, L-цистеину солянокислому – 10%, L-цистеину – 15%, нингидрину – 20%.
Изучение механизма конкуренции псевдомонад с патогенными видами
Staphylococcus aureus и Aeromonas sp.
Влияние метаболитов и фрагментов клеточной стенки Pseudomonas alcaligenes и Pseudomonas cichoril на степень антагонистической активности.
По результатам анализа установлено закономерное изменение роста индикаторных
штаммов в присутствии P. alcaligenes и P.cichoril
Метаболической активностью в отношении липаз обладали все исследованные культуры
P. alcaligenes и P. cichoril. Удельная липолитическая активность у разных штаммов P.
alcaligenes менялась в пределах от 18,90 до 34,56 ед. (мкмоль/мл. мин) при титре бактерий от
103 до 109 клеток/мл. У штаммов P. сichoril активность липазы менялась от 11,50 до 15,80 ед.
(мкмоль/мл. мин) при титре бактерий от 103 до 106 клеток/мл
При изучении амилазной активности установлено, что из исследуемых 20 штаммов P. alcaligenes ферментативную активность проявили только 6 культур, что составило 30% от общего
количества исследуемых вариантов. Амилазная активность у изученных штаммов P.s alcaligenes менялась в пределах от 0,324 ± 0,012 до 0,425 ± 0,014 ед. (мкмоль/мл. мин) при титре
бактерий 106 и 105 клеток/мл, соответственно. Из 20 штаммов P. сichoril только 4 культуры
обладали амилазной активностью, что составило 20%, соответственно. Амилазная активность у
изученных штаммов P. сichoril менялась в пределах от 0,243 ± 0,014 до 0,317 ± 0,011 ед.
(мкмоль/мл. мин) при титре бактерий 104 и 105 клеток/мл, соответственно.
Метаболической активностью в отношении протеаз обладали все исследованные
культуры P. alcaligenes и P. cichoril. Удельная протеолитическая активность у штаммов
антагонистов P. alcaligenes менялась в пределах от 10,20 до 38,80 ед/мг белка при титре
бактерий от 106 до 1011 клеток/мл. У штаммов P. сichoril активность протеазы менялась от 5,04
до 38,60 ед/мг белка при титре бактерий от 103 до 106 клеток/мл. Следует отметить, что для
двух видов псевдомонад численность бактерий не всегда соотносилась с активностью
фермента, что возможно связано с гетерогенностью микроорганизмов.
Самая высокая антагонистическая активность установлена между P. alcaligenes и Aeromonas sp. (рис.1). Продукты метаболизма оказались эффективнее, чем нативный штамм в 5,5
раз, а компоненты клеточной стенки превышали контрольные величины в 4,3 раза. У P.cichoril
как и у P. alcaligenes высокая антагонистическая активность по отношению к Aeromonas sp.,
она составляет 2,0 при взаимодействии индикаторного организма с метаболитами и 5,0 при
взаимодействии с компонентами клеточной стенки (рис.2)
Рис.1. Антагонистическая активность Pseudomonas alcaligenes
7
Рис.2. Антагонистическая активность Pseudomonas cichoril
Влияние
микроорганизмов ассоциантов Escherichia coli и Bacillus subtilis
антагонистическую активность Pseudomonas alcaligenes и Рseudomonas cichoril in vitro
на
В присутствии B. subtilis 1, B. subtilis 2 и пробиотического штамма B. subtilis 534 отмечена
высокая антагонистическая активность метаболитов P. alcaligenes во всех случаях эксперимента.
Она оказалась выше, чем при действии нативного штамма в 0,6; 0,4; 0,5, соответственно. Кроме
метаболитов активными оказались и компоненты клеточной стенки, которые, в присутствии
B.subtilis 1 и B. subtilis 534 вызвали
стимуляцию антагонистической активности
микроорганизма в 1,9; 2,9 раз, соответственно. В присутствии E. coli M-17 эффективность
действия метаболитов антагониста превышала контрольные значения в 1,2 раза, а компонентов
клеточной стенки – в 2,4 раза (рис. 3).
В присутствии B. subtilis 1 действие нативного штамма P. cichoril оказалось более
эффективным в 0,7 раз, чем применение метаболитов и почти равнозначно применению
компонентов клеточных стенок. Тот же эффект наблюдался в присутствии пробиотического
штамма E. coli M-17 и составил преобладание над контрольными величинами в 0,6 раз (рис 4).
Рис.3. Влияние ассоциантов на антагонистическую активность
Pseudomonas alcaligenes in vitro
8
Рис.4. Влияние ассоциантов на антагонистическую активность
Рseudomonas cichoril in vitro
Влияние температуры культивирования на бактериостатический и бактерицидный
эффект Pseudomonas alcaligenes и Pseudomonas cichoril.
При испытании антагонистической активности псевдомонад выяснилась необходимость
ведения опытов при разных температурах – 5 °С и 21 °С, что объясняется психрофильным
образом жизни некоторых представителей рода и низкими среднегодовыми температурами
водоемов Карелии. Результаты экспериментов отражены в таблице 1. Оказалось, что рост Р. alcaligenes и Р. сichoril по-разному протекает в температурных диапазонах. При взаимодействии Р.
alcaligenes со стафилококком рост антагониста ускорялся при повышении температуры на 16 °С и
параллельно усиливалась его антагонистическая активность. Тот же эффект наблюдался и в
отношении Р. сichoril. При изучении влияния температуры культивирования на межвидовые
отношения между псевдомонадами и аэромонадами установлено, что низкие температуры
вызывают стимуляцию изученных процессов для Р. alcaligenes. При изучении антагонизма у Р.
сichoril отмечено некоторое увеличение зоны бактерицидности при повышении температуры до
21 °С, а сам рост антагониста оказался стабильным.
Таблица 1.
Влияние температуры на антагонистическую активность
Стимуляция активности в отношении
Стимуляция активности в отношении
S. aureus
Aeromonas sp.
Антагонист
5 °С
21 °С
Антагонист
5 °С
21 °С
Р. alcaligenes
2-3
4-7
P. alcaligenes
9
7
2
3-4
6
1
3
3-4
1
1
Р. cichoril
2
3
1
3
P. cichoril
Примечание: числитель - d зоны бактерицидности (см), знаменатель - d колонии
По результатам оценки закономерных различий роста псевдомонад в присутствии
стафилококка и аэромонад при разных температурах можно предположить, что одинаковые
температурные оптимумы роста микробной культуры (в нашем случае для псевдомонад и
аэромонад) вызывают стимуляцию у штамма антагониста роста и антагонистической
активности. Если температурные оптимумы роста культуры имеют разные кардинальные точки
9
(в нашем случае для псевдомонад и стафилококка) то происходит незначительная стимуляция
роста и антагонистиеской активности вида. Данная закономерность оказалась более
выраженной для Р. alcaligenes , чем для Р. сichoril.
Исследование спектра резистентности выделенных культур Pseudomonas к
антибиотикам.
В результате проведенного анализа обнаружена чувствительность исследуемых
микроорганизмов к карбенициллину, цефтриаксону, цефепиму, гентамицину, стрептомицину и
левофлоксацину. Степень чувствительности P. alcaligenes к данным препаратам колебалась от
80 до 100 % (рис.5). Для P. cichoril наибольшая чувствительность - 53, 4% установлена для
цефоперазона (рис.6).
Рис.5. Чувствительность Pseudomonas alcaligenes к исследуемым антибиотикам
Рис.6. Чувствительность Pseudomonas cichoril к исследуемым антибиотикам
10
В ходе исследования установлен высокий процент нечувствительных штаммов P. alcaligenes и P. cichoril, к таким традиционным антипсевдомонадным антибиотикам, как цефтазидим
(56% - P. alcaligenes 93%- P. cichoril), цефепим (93% для P. cichoril) и ципрофлоксацин (67 %
для P. cichoril).
Для P. cichori полирезистентность к 5 и более антибиотикам установлена у 9 культур
(табл. 3). Для P. alcaligenes доказано наличие природной полиризестинтности у 14 фенотипов
(табл. 2) Сопоставляя данные о распространении антибиотикорезистентности среди штаммов
P. alcaligenes и P. cichoril, выделенных из различных сред обитания, можно сделать вывод о
значительной вариабельности исследуемого признака.
Таблица 2.
Наиболее распространенные фенотипы антибиотикорезистентности Pseudomonas alcaligenes
Фенотип антибиотикорезистентности
Число штаммов
%
NET-KAN-HAP-CXM-CAZ
4
26, 6
NET-KAN-HAP-GEN-FEP-CXM
3
20, 0
NET-KAN-HAP-FEP-CXM
7
46, 6
Таблица 3.
Наиболее распространенные фенотипы антибиотикорезистентности Pseudomonas cichoril
Фенотип антибиотикорезистентности
Число штаммов
%
GEN- FEP- ERY-CXM-CRO-СRB-СAZ
5
33, 3
GEN- FEP- ERY-CXM-СAZ
4
26, 6
GEN- FEP-CXM-CRO-СRB-СHE
4
26, 6
Для оценки перекрестной резистентности псевдомонад к исследуемым антибиотикам
использовали скаттерграммы созданные при помощи программы WHONET.
Скаттерграммы представляют собой графики рассеивания, в которых распределено
абсолютное число штаммов микроорганизмов, протестированных к 2 антибиотикам.
Построенные графики служат для анализа распределения изолятов P. alcaligenes и P. cichoril по
результатам определения чувствительности к двум антибиотикам одновременно. Поскольку
число протестированных штаммов псевдомонад невелико, то данные представлены в
абсолютных числах. Перекрестная резистентность для P. alcaligenes установлена к
цефуроксиму и карбенициллину, стрептомицину и неомицину, левофлоксацину и
эритромицину, нетилмицину и эритромицину, карбенициллину и канамицину; для P. cichoril –
к эритромицину и ципрофлоксацину, к канамицину и стрептомицину, к цефуроксиму и
канамицину.
Изучение устойчивости пробиотических культур к физико-химическим параметрам
среды.
Устойчивость к физическим параметрам среды
По результатам изучения влияния температуры на особенности роста и скорость
генерации P. alcaligenes и P. cichoril можно отметить, что температура выполняет ведущую
роль в популяционной изменчивости бактерий. Установлен оптимальный температурный
диапазон для P.s alcaligenes и P. cichoril – 15 – 20С, который наряду с питательным
субстратом, является направляющим и стабилизирующим фактором отбора (рис.7) При
переходе от низких температур (50 С) к высоким (350 С) создается неблагоприятная ситуация,
усиливающая гетерогенность популяции, вследствие чего у штаммов увеличивается
потенциальная возможность освоения новой экологической ниши. Снижение температуры
11
может привести к возникновению у псевдомонад способности к прототрофному питанию. В
таких условиях проявляются сапрофитические свойства микроорганизма, позволяющие ему
длительно сохраняться в окружающей среде.
Рис.7 Влияние температуры на скорость роста Pseudomonas
При изучении устойчивости P. alcaligens к УФО в диапазоне от 75 до 120 эрг/см2 были
получены следующие результаты - во всех случаях наименьшее количество клеток было
обнаружено при облучении псевдомонад УФО 125 эрг/см2 и в среднем составляет 56,80, для
действия УФО 100 эрг/см2-69,89, а для УФО 75 эрг/см2- 80,61. Наименьшая устойчивость P.
cichoril к УФО проявляется при излучении 125 эрг/см2, количество выживших клеток
составляет в среднем 32,39; это почти в 2 раза меньше, чем при излучении 75 эрг/см2, где
результат составляет 65,06; для УФО 100 эрг/см2 полученные данные 55,68.
Устойчивость к химическим параметрам среды
По результатам изучения влияния химических веществ на пробиотические культуры
можно отметить, что уксусная кислота и наноалмазы с железом оказывают бактерицидное
действие на исследуемые микроорганизмы при экспозиции 168 и 336 часов. Хлорамин, сулема
и шунгит оказывают выраженное бактериостатическое действие на P. alcaligenes, для этого
микроорганизма отмечено снижение численности клеток в опытных растворах в 1,5; 4,5 и 2
раза соответственно. P.cichoril обнаруживает задержку роста только при культивировании с 1%
раствором хлорамина, численность бактерий в данных условиях эксперимента снижалась в 2,5
раза.
Динамика биологических показателей радужной форели
Клеточные факторы неспецифической резистентности
При изучении неспецифической резистентности рыб исследовали фагоцитарное число
(ФЧ ), как показатель клеточного звена иммунитета, и уровень лизоцима, как показатель
гуморального звена. Как видно из графика (рис. 8), максимальное значение ФЧ зафиксировано
в первой группе и составляет 17%. Во второй группе наибольшее значение - 14%, в
контрольной группе - 6,5%.
Полученные данные свидетельствуют, что у рыб, выращенных в условиях
модифицированного кормления, было большим и количество фагоцитирующих лейкоцитов и
их активность. Данные различия напрямую связаны с условиями выращивания и являются
результатом влияния псевдомонад на физиологическое состояние рыб.
12
Рис.8. Фагоцитарное число лейкоцитов крови радужной форели
Гуморальные факторы неспецифической резистентности
Как основной фактор гуморальной неспецифической резистентности изучена лизоцимная
активность радужной форели при различных условиях кормления. При кормлении рыбы
добавкой псевдомонад, стабилизированных желатином (ПСЖ) зафиксирован наибольший
уровень лизоцима, который составляет 41,5±11,7 мг/мл (рис.9).
Самый низкий уровень лизоцима (1,7±0,3 мг/мл) установлен при выращивании форели в
условиях температурного режима окружающей среды 21 С. При снижении температуры
среды до 12 С уровень лизоцима в составе слизи увеличился почти в 2 раза и составил 3,9±0,6
мг/мл. При различных условиях кормления форели диапазон индивидуальной изменчивости
гуморального фактора неспецифической резистентности организма менялся от 16,1±3,2 мг/мл
(кормление желатиновыми шариками) до 41,5±11,7 мг/мл (кормление ПСЖ)
Рис. 9. Уровень лизоцима в слизистых покровах радужной форели
Динамика рыбоводных показателей радужной форели
По результатам эксперимента установлено, что полноценный гранулированный корм
модифицированный культурами псевдомонад оказывает положительный эффект на
морфологические показатели молоди радужной форели.
Анализируя темп роста молоди форели на протяжении всего эксперимента отмечен
максимальный среднесуточный прирост молоди в первые 10 суток. Для группы 1 зафиксирован
13
наибольший ростстимулирующий эффект, который по параметру абсолютного прироста
составил 21,1 г, в группе 2 – 12,5 г, в контрольной группе -10г (рис.10)
Рис.10 Динамика массы радужной форели при кормлении модифицированным
псевдомонадами кормом.
Глава 5 Обсуждение результатов
В ходе исследований выявлено, что микроорганизмы рода Pseudomonas являются
доминирующей группой бактерий в аутофлоре радужной форели всех изученных хозяйств.
Результаты соотносятся с данными, получеными другими учеными [Каховский, 1987;
Паршуков 2011; Сидорова, 2010; Austin, 2002; Holbenetal., 2002; Kimet al.,2007; Navarrete et al.,
2009]. Такое положение объясняется комплексом особых морфологических и физиологических
свойств, присущим этим бактериям и позволяющим псевдомонадам успешно конкурировать с
другими микроорганизмами.
У P.alcaligenes и P. cichoril изучены ферментативные свойства, установлена степень
прототрофности по 13 аминокислотам, определен процент ауксотрофных мутантов.
В ходе изучения механизма конкуренции псевдомонад с патогенными микроорганизмами
установлено закономерное изменение роста индикаторных штаммов в присутствии P. alcaligenes и P. cichoril, что свидетельствует о высокой биологической активности выделенных
культур. При исследовании отношений между штаммом-антагонистом и чувствительными
культурами обнаружена зависимость проявления антагонизма от вида чувствительных культур.
Установлено ингибирующее действие P. alcaligenes в отношении патогенных микроорганизмов
S. aureus и Aeromonas sp.
Сопоставляя данные о распространении антибиотикорезистентности среди штаммов P. alcaligenes и P. cichoril, выделенных из различных сред обитания можно сделать вывод о
значительной вариабельности исследуемого признака. В результате исследования установлен
высокий процент нечувствительных штаммов P. alcaligenes и P. cichoril, к таким традиционным
антипсевдомонадным антибиотикам, как цефтазидим (56% для P. alcaligenes, 93% для P. cichoril), цефепим (93% для P. cichoril) и ципрофлоксацин (67 % для P. cichoril). Обнаружена
чувствительность исследуемых микроорганизмов к карбенициллину, цефтриаксону, цефепиму,
гентамицину, стрептомицину и левофлоксацину. Степень чувствительности P. alcaligenes к
данным препаратам колебалась от 80 до 100 % . Для P. cichoril наибольшая чувствительность 53, 4% установлена для цефоперазона .
Полученные различия в уровне антипсевдомонадной активности исследуемых препаратов
в значительной степени объясняются и различиями в их способности диффундировать через
внешнюю мембрану псевдомонад.
14
Для P. alcaligenes установлена перекрестная резистентность к цефуроксиму и
карбенициллину, стрептомицину и неомицину, левофлоксацину и эритромицину, нетилмицину
и эритромицину, карбенициллину и канамицину; для P. cichoril – к эритромицину и
ципрофлоксацину, к канамицину и стрептомицину, к цефуроксиму и канамицину.
По результатам изучения влияния температуры на особенности роста и скорость
генерации P. alcaligenes и P. cichoril можно отметить, что температура выполняет ведущую
роль в популяционной изменчивости бактерий. Установлен оптимальный температурный
диапазон для P. alcaligenes и P. cichoril – 15-20С, который наряду с питательным субстратом,
является направляющим и стабилизирующим фактором отбора.
Для выяснения механизма толерантности к УФО проведена серия экспериментов по
выяснению устойчивости микроорганизмов к действию УФ облучения. В ходе исследований
установлено закономерное снижение устойчивости бактерий при увеличении диапазона
облучения. Во всех случаях наименьшее количество клеток было обнаружено при облучении
псевдомонад УФО 125 эрг/см2, это можно объяснить особенностью действия УФ-лучей на
микроорганизмы, а именно повреждением мРНК за счет разрывов в тиминовых димерах.
Необходимо отметить, что повреждения вызванные УФО частично обратимы.
По результатам изучения влияния химических веществ на пробиотические культуры
можно отметить, что уксусная кислота и наноалмазы с железом оказывают бактерицидное
действие на исследуемые микроорганизмы при экспозиции 168 и 336 часов. Это можно
объяснить особенностями механизма взаимодействия данных веществ с чувствительными
бактериями (снижение уровня pH, коагуляция и денатурация белков микробной клетки).
При исследовании неспецифической резистентности радужной форели, зафиксировано
увеличение показателей клеточного и гуморального звена иммунитета, так, ФЧ в опытных
группах возросло в 2,1-2,6 раз по сравнению с контрольными значениями, наибольшее значение
лизоцима (41,5мг/мл) также установлено в опытной группе.
При оценке выживаемости показано, что полноценный гранулированный корм,
модифицированный культурами псевдомонад, оказывает положительный эффект на молодь
радужной форели. Так, выживаемость опытных групп была выше в 1,5 и 1,2 раза по сравнению
с контролем.
Заключение
В результате проведенной работы по изучению экологических особнностей бактерий рода
Pseudomonas установлено, что бактерии исследуемого рода доминируют в микробном
сообществе аутофлоры радужной форели.
Впервые изучена антагонистическая активность P. alcaligenes и P. cichoril. Показано, что
спостобность псевдомонад к антагонизму зависит от многих факторов, к ним относятся:
метаболическая активность штамма, строение клеточной стенки, температура культивирования,
а также вид чувствительной культуры. Наличие у P. alcaligenes и P. cichoril доказанной
антагонистической активности создает предпосылки для создания биологически активного
препарата на основе этих микроорганизмов.
Впервые установлен фенотип антибиотикорезистентности изучаемых видов, изучена
перекрестная антибиотикорезистентность. Сформированы рекомендации по рациональной
антибиотикотерапии проводимой на форелевых хозяйствах.
По результатам изучения влияния температуры на особенности роста и скорость
генерации P. alcaligenes и P. cichoril установлен оптимальный температурный диапазон для
исследуемых видов – 15 – 20С. Подобный диапазон соотносится с температурным оптимумом
культивирования радужной форели- 16-18С, что обуславливает возможность биотических
отношений между этими организмами.
При изучении влияния УФО, как одного из наиболее значимых физических факторов
внешней среды, на псевдомонад выявлено снижение устойчивости бактерий при увеличении
диапазона облучения. В ходе исследования действия химических веществ на исследуемые
культуры, показано, что только уксусная кислота и наноалмазы с железом оказывают
бактерицидное действие на исследуемые микроорганизмы (при экспозиции 168 и 336 часов), а
15
сулема, хлорамин и шунгит - бактериостатическое.
При оценке выживаемости и показателей неспецефичесих звеньев иммунитета показано,
что полноценный гранулированный корм, модифицированный культурами псевдомонад,
оказывает положительный эффект на молодь радужной форели.
Выводы
1. Исследования показали, что состав аутофлоры рыб представлен 5 семействами
(Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Micrococcaceae, Bacillaceae , Neisseriaceae) 7
родами (Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus, Bacillus, Azotobacter, Artrobacter). Бактерии семейства Neisseriaceae встречаются на форелевых хозяйствах
Ладожского озера и Топозера. Семейства Pseudomonadaceae и Bacillaceae обнаружены
на всех исследуемых хозяйствах.
2. Микроорганизмы семейства
Pseudomonadaceae (род Pseudomonas) являются
доминирующей группой бактерий в аутофлоре радужной форели всех опытных
хозяйств. Доля псевдомонад в аутофлоре форели Ладожкого озера составляет 29 %,
Святозера – 81,1 %, Топозера -66,7 %.
3. У P.alcaligenes и P. cichoril определено наличие лецитиназы и цитохромоксидазы,
способность к ферментации глюкозы и гидролизу крахмала, гемолитическая активность.
Установлена степень прототрофности P. alcaligenes и P. cichoril по 13 аминокислотам,
определен процент ауксотрофных мутантов.
4. Изучен механизм конкуренции псевдомонад с патогенными микроорганизмами S. aureus
и Aeromonas sp.. Установлено, что активность антагонистов по отношению к ним
зависит от метаболической активности штамма и компонентов клеточной стенки.
Изучено влияние температуры культивирования на бактериостатический и
бактериоцидный эффект P. alcaligenes и P.cichoril по отношению к S. aureus и Aeromonas
sp. Установлено, что одинаковые температурные оптимумы роста индикаторной
культуры и антагониста вызывают стимуляцию роста и антагонистической активности у
исследуемого штамма P. alcaligenes
5. Изучено in vitro влияние микроорганизмов ассоциантов B. subtilis и E. coli на
антагонистическую активность псевдомонад. В присутствии
бактерий регуляторов
антагонистическая активность исследуемых штаммов возрастает;
6. Исследована чувствительность P. alcaligenes и P. cichoril псевдомонад к следующим
антибиотикам: карбенициллин, цефуроксим, цефоперазон , цефтриаксон, цефотаксим,
цефтазидим , цефепим, гентамицин , канамицин , неомицин , стрептомицин,
нетилмицин, левофлоксацин , ципрофлоксацин, эритромицин. У исследуемых штаммов
установлена перекрестная резистентность к антибиотическим препаратам.
7. Изучено влияние температуры на скорость роста P. alcaligenes и P. cichoril. Показано,
что температурным оптимумом для исследуемых штаммов являются 15- 20С.
8. Определена устойчивость P. alcaligenes и P. cichoril к ультрафиолетовому облучению в
диапазоне энергий от 75 до 250 эрг/см2. Наименьшей устойчивостью исследуемые
микроорганизмы обладают при облучении энергией 250 эрг/см2, наибольшей при 75
эрг/см2.
9. Изучено влияние уксусной кислоты, сулемы, хлорамина, наноаламазов с железом и
шунгита на скорость роста P. alcaligenes и P.cichoril. Наибольшую чувствительность к
химическим веществам проявили микроорганизмы P. alcaligenes. Оценен механизм
действия дезинфектантов на пробиотические культуры. Выявлено два типа действия:
бактерицидное - для уксусной кислоты и наноалмазов с железом и бактериостатическое
для хлорамина, сулемы и шунгита.
10. Проанализировано влияние P. alcaligenes и P.cichoril на биологические показатели
радужной форели. Показано, что культуры псевдомонад оказывают значимое влияние на
количественные характеристики, активность фагоцитов периферической крови и
16
уровень лизоцима радужной форели, а также оказывают положительный эффект на
степень прироста и выживаемость молоди.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
В изданиях рекомендованных ВАК:
1. Обухова Е.С. Сидорова Н.А. «Влияние микроорганизмов ассоциантов на
антагонистическую активность Pseudomonas alcaligenes и Pseudomonas cichoril,
выделенных из некоторых водоемов Карелии» // Материалы международной научнопрактической конф. «Научные исследования и их практическое применение.
Современное состояние и пути развития 2012».- Одесса 2012. Выпуск 3.Том 31. С.3335
2. Обухова Е.С. Сидорова Н.А. «Физиологическая характеристика ахромогенных видов
рода Pseudomonas в условиях динамики термического режима культивирования» //
Ученые записки ПетрГУ. 2013 . № (113). С. 14-17
3. Сидорова Н.А., Обухова Е.С. «Особенности биологической активности
представителей рода Pseudomonas» // Проблемы медицинской микологии. СанктПетербург, 2013. С.120-121
В прочих изданиях:
1. Сидорова Н.А. Обухова Е.С. «Гетеротрофный бактериопланкон» // Актуальные
проблемы гидробиологии и ихтиологии: сборник трудов Международной Интернетконференции. Казань, 2011.С.61-66
2. Сидорова Н.А. Обухова Е.С. «Представители рода Pseudomonas – индикаторы
трансформации рыбохозяйственных водоемов» // Материалы всероссийской научнопрактической конференции " Экологическая дискуссия: окружающая среда- здоровье
человека".Волгоград 2012. С. 245-248.
3. Обухова Е.С., Сидорова Н.А. «Анализ бактериального самоочищения на примере
некоторых водоемов Карелии» // Материалы международной научно-практической
конференции «Проблемы современной биологии» Москва,2012.С.88-90.
4. Сидорова Н.А. Обухова Е.С «Основные группы гетеротрофного бактериопланктона
рыбохозяйственных водоемов Карелии» // Материалы научно-практической
Интернет-конференции «Актуальные проблемы гидробиологии и ихтиологии в
условиях биологических инвазий в пресноводных экосистемах» Казань, 2012. С. 8790.
5. Обухова Е.С. « Исследование свойств пробиотических культур рода Pseudomonas»
// Материалы 65-й научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых.
Петрозаводск 2013. С.116-117
6. Сидорова Н.А. Обухова Е.С «Антагонистическая активность оригинальных штаммов
Pseudomonas alcaligenes и Pseudomonas cichoril» // Материалы Всероссийской
научно-практической конференции «От микроскопа до нанотехнологий» СанктПетербург, 2013.С.61-62.
17