Глава 2, разделы 1, 2, 7-9
реклама
ГЛАВА 2 Аппаратура для флуоресцентной спектроскопии Для успешного применения флуоресцентных методов необходимо хорошее знание аппаратуры и умение обращать внимание на детали эксперимента. Для этого существуют две причины. Во-первых, флуоресценция — очень чувствительный метод. Почти всегда можно получать наблюдаемые сигналы, увеличив коэффициент усиления приборов. Однако флуорофором: эти сигналы могут быть обусловлены не только используемым наблюдаются сигналы фоновой флуоресценции растворителей, просачивающегося в прибор света, побочное рассеяние света от мутных растворов, рэлеевское или/и комбинационное рассеяние (названы лишь некоторые из помех). Вовторых, идеальных спектрофлуориметров не существует. Из-за неоднородного спектрального состава источников света и зависимости чувствительности монохроматоров и фотоумножителей от длины волны на приборах нельзя получить истинных спектров возбуждения и испускания. На измерения интенсивностей флуоресценции могут влиять также поляризация и анизотропия испускаемого света. Поэтому для получения надежных спектральных данных надо постоянно осуществлять контроль за многочисленными факторами. В этой главе рассматриваются особенности отдельных узлов спектрофлуориметра, а также те свойства образцов, которые влияют на измеряемые параметры. Основной упор будет сделан на измерение спектров возбуждения и испускания. Однако аналогичный подход важен и при измерениях времен жизни и анизотропии (гл. 3 и 5). 2.1. Спектры возбуждения и испускания Чаще всего необходимо измерить как спектры возбуждения, так и спектры испускания. Спектр испускания представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждающего света. Спектр возбуждения - это зависимость интенсивности испускания при определенной длине волны от длины волны возбуждения. Спектры изображаются либо в шкале длин волн, либо в шкале волновых чисел. Свет определенной энергии можно описать длиной волны λ, частотой ν или волновым числом υ. Длину волны обычно измеряют в нанометрах, а волновые числа — в обратных сантиметрах. Длины волн и волновые числа — взаимообратные величины: например, 400 нм соответствует (400 *10-7 см-1 = 25000 см-1 ).Такое альтернативное изображение спектров флуоресценции было предметом больших споров. Общеизвестно что, шкала волновых чиcел линейна по энергии. Однако большинство приборов, выпускаемых промышленностью, градуировано в шкале длин волн, поэтому такие спектры более привычны, кроме того, их легче визуально интерпретировать. Поскольку при текучих исследованиях обычно, но обязательно нужны исправленные спектры, а также по той причине, что получить их трудно, мы предпочитаем использовать непосредственно описанные на приборе спектры в шкале длин волн. Для идеального прибора непосредственно написанный спектр испускания должен был бы соответствовать потоку фотонов, испущенных на каждой длине волны, приходящемуся на интервал длин волн и определяемому шириной щели и дисперсией монохроматора испускания. Аналогично, спектр возбуждения должен был бы представлять собой зависимость относительного квантового выхода для каждой длины волны возбуждения. Для большинства флуорофоров квантовые выходы и спектры испускания не зависят от длины волны возбуждающего света. Следовательно, спектр возбуждения флуорофора обычно совпадает с его спектром поглощения. Даже при идеальных условиях для такого совпадения необходимо присутствие единственного флуорофора, а также отсутствие осложняющих картину факторов, таких, как нелинейность, связанная с большой оптической плотностью образца. На рис. 2.1 изображена схема наиболее распространенного спектрофлуориметра. В качестве источника возбуждающего света в приборе используется ксеноновая лампа* Такие лампы удобны благодаря высокой интенсивности излучения при всех длинах волн от 250 нм и выше. Прибор снабжен монохроматорами для выделения как возбуждающего, так и испускаемого света. Применение двух решеток в монохроматоре возбуждения повышает монохроматичность возбуждающего света. Дополнительным преимуществом является то, что вогнутые дифракционные решетки, изготовленные голографическим способом, уменьшают рассеянный свет. В следующем разделе этой главы будет показано, насколько важна монохроматичность для сведения к минимуму влияния рассеянного света. Оба монохроматора снабжены моторами, что обеспечивает автоматическое сканирование по длинам волн. Флуоресценция попадает на фотоумножители и затем количественно измеряется с помощью соответствующих электронных устройств. Выходной сигнал обычно представляется графически и может быть занесен в память компьютера, * Это утверждение автора неверно, поскольку спектром возбуждений называют зависимость интенсивности испускания от частоты или длины волны возбуждающего света при постоянном потоке фотонов, падающих на образец. Напротив, квантовый выход определяют как отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных фотонов. Из-за этого спектр возбуждения сильно зависит от поглощения (оптической плотности) образца, что и используют в ряде аналитических методов. Идеальный спектрофлуориметр должен был бы давать зависимость отношения числа испускаемых фотонов к числу падающих на образец фотонов от частоты возбуждающего света, компенсируя изменение с частотой интенсивности возбуждающего света. — Прим. ред. На схеме (рис. 2,1) показаны также детали оптической части прибора, находящиеся вблизи держателя образца. Спектрофлуориметр для научно- исследовательских работ должен быть снабжен универсальными и надежными оптическими деталями. Оптический модуль, показанный па рис, 2.1, включает множество удобных деталей, наличие которых необходимо учитывать при приобретении или изготовлении прибора. Для защиты от возбуждающего света или для перекрывания канала, по которому идет свет люминесценции, использованы затворы, На пути потока возбуждающего света помешают систему расщепления светового пучка. Она отражает часть возбуждающего света на эталонный образец, который, как правило, представляет собой устойчивый эталонный флуорофор. Система расщепления состоит из тонкого куска прозрачного кварца, который отражает ~ 4 % падающего света. Этого количества обычно достаточно для эталонного канала, в котором Монохроматор не используется. Измеренная интенсивность флуоресценции эталонного образца пропорциональна интенсивности возбуждающего света. Поделив интенсивность люминесценции образца на соответствующую величину для эталона, можно учесть колебания интенсивности излучения дугового источника. Па пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят поляризаторы. Чаще всего поляризаторы отодвинуты; их вводят только для измерений анизотропии флуоресценции или когда необходимо выделить определенным образом поляризованную компоненту испускаемого и/или возбуждающего света. Для точного измерения анизотропии флуоресценции требуется расположение поляризаторов под определенным углом, поэтому оправы поляризаторов должны быть хорошо закреплены и тщательно проградуированы. Оптический модуль (рис. 2.1) имеет дополнительный оптический путь с правой стороны от держателя образца. С его помощью можно проводить измерения анизотропии флуоресценции двухканальным методом (гл. 5), более точным, чем одноканальный метод, в котором этот дополнительный оптический канал не требуется (разд. 5.4). 2.1,1. Идеальный спектрофлуориметр Пусть нужно записать спектры возбуждения и испускания, в которых отражена относительная интенсивность фотонов в единичном интервале длин волн (см. выше). Для получения таких "исправленных" спектров испускания отдельные детали прибора должны иметь следующие характеристики: 1. Источник света должен иметь постоянный выход фотонов на всех длинах волн. 2. Монохроматор должен пропускать фотоны всех длин волн с равной эффективностью. 3. Эффективность монохроматора не должна зависеть от поляризации. 4. Приемник (фотоумножитель) должен регистрировать фотоны всех длин волн с одинаковой эффективностью. Эти характеристики для идеальных оптических систем представлены на рис. 2.2. К сожалению, источники света, монохроматоры и фотоумножители не обладают такими идеальными характеристиками. В результате приходится идти на компромисс в выборе отдельных деталей и исправлять неидеальные сигналы, полученные на приборе. Спектрофотометры для измерения поглощения света имеют те же самые узлы, однако на них удается правильно измерять спектры поглощения, поскольку обычно измеряют отношение интенсивности света, пропущенного изучаемым образцом, к интенсивности света, пропущенного образцом, не содержащим флуоресцирующего вещества. Такие относительные измерения проводят при одинаковых условиях и при одной и той же длине волны, поэтому не идеальность аппаратуры аннулируется. Иное положение при измерении испускания флуоресценции, РИС. 2.2. Характеристики идеальных составных узлов спектрофпуориметра. так как измерения интенсивности флуоресценции абсолютны, а не относительны. Сравнение флуоресцирующего образца с образцом, не содержащим флуорофора, бесполезно, поскольку последний не дает никакого сигнала и поэтому нечувствителен к зависимости отдельных компонентов оптической системы прибора от длины волны. Следовательно, возможность внутренней компенсации ограничена 2.1.2. Искажения спектров возбуждения и испускания Для записи спектра возбуждения монохроматор испускания устанавливают на желаемую длину волны, в большинстве случаев - на максимум испускания. После этого осуществляют сканирование светового потока из монохроматора возбуждения по полосам поглощения флуорофора. Наблюдаемый сигнал может искажаться по следующим причинам: 1. Интенсивность света от возбуждающего источника является функцией длины волны. Даже если возбуждающий свет пропускают через систему расщепления пучка, показанную на рис. 2.1, и его интенсивность корректируют путем деления (см. выше), отношение сигналов может зависеть от длины волны. 2. Эффективность монохроматора является функцией длины волны, 3. Оптическая плотность образца может выходить за пределы линейной области, которая охватывает ~ 0,1 единицы оптической плотности и зависит от геометрии образца. Спектры испускания записывают, выбирая подходящую длину волны возбуждения и сканируя испускание по длинам волн. В добавок к указанным выше факторам спектр испускания искажается еще и вследствие того, что эффективность монохроматора испускания и чувствительность фотоумножителя зависят от длины волны. Рассмотрим теперь основные характеристики отдельных деталей спектрофлуориметра, а также причины, по которым выбирают именно эти конкретные устройства. 2.2. Источники света ксеноновые лампы, Наиболее универсальными источниками света являются ксеноновые (Хе) дуговые лампы высокого давления. Они обеспечивают почти непрерывный спектральный выход в области 270 - 700 нм (рис. 2.3), за исключением нескольких узких линий вблизи 450 нм. Испускание света ксеноновыми дуговыми лампами происходит за счет рекомбинации электронов с ионизованными атомами Хе. Эти ионы образуются при столкновениях атомов Хе с электронами в дуге Непрерывный спектр испускания возникает при полном удалении электронов из атомов. Атомы Хе, находящиеся в возбужденном состоянии, дают линии в спектре, а не широкие полосы; этим обусловлены пики вблизи 450 им. Интенсивность испускания резко падает в области < 280 нм. При работе многих ксеноновых ламп не происходит образования озона в окружающем воздухе. Кварцевый баллон таких безозонных ламп не пропускает света с длиной волны короче 250 нм, и выходной поток таких ламп быстро падает при уменьшении длины волны. Зависимость излучения ксеноновой лампы от длины волны является основной причиной искажений спектров возбуждения соединений, поглощающих в ультрафиолетовой области. Для иллюстрации величины такого эффекта на рис. 2.4 приведены исправленные и неисправленные спектры возбуждения флуоресцеина. Неисправленный спектр возбуждения имеет пики в области 450 нм, обусловленные излучением ксеноновой лампы (рис. 2.3). .На рис. 2.4 показан также спектр возбуждения, скорректированный по спектральному выходу ксеноновой лампы, зависящему от длины волны. РИС. 2.3. Спектральные выходы ртутно-ксеноновой (а) и ксеноновой (б) дуговых ламп (воспроизведено из проспекта Kratos). В канал сравнения был помещен счетчик квантов для получения сигнала, пропорционального интенсивности излучения лампы, на который делилась бы интенсивность свечения образца (разд. 2.7.1). В исправленном спектре возбуждения пики уже отсутствуют; этот спектр больше похож на спектр поглощения флуоресцеина. Заметная разница между исправленным и неисправленным спектрами иллюстрирует важность специфических свойств лампы для спектров возбуждения. РИС. 2.3. Спектральные выходы ртутно-ксеноновой (а) и ксеноновой (б) дуговых ламп (воспроизведено из проспекта Kraios). РИС. 2.4. Неисправленный (1) и исправленный (2) спектры возбуждения флуоресцеина. Кожухи дуговых ламп выполняют несколько функций. Газ в ксеноновых лампах находится под высоким давлением (около ~ 10 атм), и поэтому существует опасность взрыва. При работе с такими лампами необходимо надевать защитные очки. К кварцевому кожуху нельзя прикасаться; отпечатки пальцев будут обугливаться, приводя к горячим пятнам на кварце и к возможному повреждению лампы. Если соприкосновение произошло, необходимо протереть кожух растворителем, например этанолом. Кожух служит также для того, чтобы направлять на лампу воздух и удалять избыток тепла и озона. На ксеноновую лампу нельзя смотреть без защиты глаз, так как ослепительно яркий свет может повредить сетчатку глаза, а ультрафиолетовое излучение — роговицу. Полезное время работы ксеноновых ламп обычно не превышает 2000 ч. Чтобы предотвратить возможность работы с уже использованной лампой, можно обернуть лампу в толстую бумагу и разбить кварцевый баллон. Источники питания дуговых ламп, производящие ток в 25 А при напряжении 20 В для типичных 450-ваттных ламп, также крайне опасны. Для запуска ламп необходимо напряжение 20 - 40 кВ. Такое напряжение может повредить кожу, а возникающие большие токи при этом могут быть смертельными. РТУТНЫЕ (Hg) ЛАМПЫ ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ. Излучение этих ламп более интенсивно, чем ксеноновых, но они имеют линейчатый спектр. Обычно необходимо бывает выбрать ту длину волны, которая нужна для данного флуорофора, а не наоборот. Следовательно, такие лампы годятся только в том случае, если ртутные линии имеют подходящую длину волны для возбуждения данного флуорофора. ртутно-ксеноновые дуговые лампы имеют более высокие интенсивности излучения в ультрафиолетовой области, чем ксеноновые лампы, а присутствие Хе приводит к более широкому спектральному выходу. Од-нако распределение интенсивности не такое плавное, как у ксеноновых ламп (рис. 2.3). ртутные лампы низкого давления дают очень узкие линии спектра ртути, .которые используются главным образом для целей градуировки. Детали такой процедуры описаны в разд. 2.3.1. 2.7. Исправленные спектры флуоресценции Многочисленные исследования были направлены на разработку методов получения спектров возбуждения и испускания, скорректированных на эффекты, зависящие от длины волны. Вообще ни один из этих методов не является полностью удовлетворительным, особенно если исправленные спектры необходимо иметь регулярно*. Прежде чем исправлять спектры, исследователь должен проанализировать, необходима ли такая корректировка. Часто бывает нужно лишь сравнить спектры испускания с другими спектрами, полученными на том же приборе, что можно сделать без исправления спектров. Далее, на многих типовых спектрофлуориметрах, собранных из однотипных деталей, получаются сходные результаты, и эти данные часто можно сравнивать со спектрами, приведенными в литературе. Конечно, спектральное распределение и положение максимумов испускания будут слегка различаться, однако зачастую совсем не нужно, чтобы спектры, полученные в различных лабораториях, строго совпадали друг с другом. * Многие проблемы, рассматриваемые автором, значительно упрощаются введением автоматизированных узлов. Современные приборы оборудованы встроенными микропроцессорами и компьютерами. — Прим. ред. Исправленные спектры важны для расчетов квантовых выходов и интегралов перекрывания (гл. 10), поэтому здесь будут кратко описаны методы, которые нам кажутся наиболее полезными. 2.7.1. Исправленные спектры возбуждения Спектр возбуждения искажается, прежде всего, потому, что интенсивность возбуждающего света зависит от длины волны. Эту интенсивность можно превратить в сигнал, пропорциональный числу падающих фотонов, используя счетчик квантов. Удобным счетчиком квантов служит раствор родамина С в этиленгликоле (3 г/ л) [ 1], который поглощает практически весь падающий свет в области 220 - 600 нм. В указанной области квантовый выход и максимум испускания (630 нм) в основном не зависят от длины волны возбуждения, поэтому получается сигнал с постоянной длиной волны, причем интенсивность сигнала пропорциональна потоку фотонов возбуждающего света. Поскольку спектр испускания родамина С не зависит от длины волны возбуждения, счетчик квантов позволяет избежать помех, вызванных зависимостью чувствительности стандартного фотоэлемента от длины волны. Счетчики квантов можно изготовить, используя умеренно концентрированные растворы хининсульфата или флуоресцеина. Хининсульфат (4 г/л в 1 н. H2S04) применяют при длинах волн возбуждения 220 -340 нм; флуоресцеин (2 г/л в 0,1 н. NaOH) пригоден для работы в этой же области, но иногда (менее надежно) в области 340 — 360 нм [ 1]. Для получения исправленных спектров возбуждения счетчик квантов помещают в канал сравнения спектрофлуориметра (см. рис. 2.1). Однако из-за высокой оптической плотности эталона держатель модифицируют таким образом, чтобы можно было наблюдать испускание с той же поверхности счетчика квантов, на которую падает свет. Между счетчиком квантов и ФЭУ помещают фильтр, задерживающий рассеянный свет, но пропускающий излучение флуоресценции. Устанавливают счетчик квантов и получают исправленный спектр возбуждения, сканируя излучение, выходящее из монохроматора возбуждения и измеряя отношение интенсивностей флуоресценции образца и счетчика квантов. Зависимость сигнала, выходящего из монохроматора испускания и регистрируемого фотоэлементом, от длины волны в данном случае неважна, поскольку длина волны испускания не меняется в процессе сканирования по длинам волн возбуждения. Такой точный способ был использован для записи исправленного спектра возбуждения флуоресцеина (см. рис. 2.4). При получении исправленных спектров возбуждения необходимо проверить, действительно ли система регистрации и электроника могут обеспечивать запись истинного отношения в широкой области интенсивностей сигналов. 2.7.2. Исправленные спектры испускания Для расчета исправленного спектра испускания необходимо знать, как зависит эффективность системы регистрации от длины волны. Непосредственное измерение поправочных коэффициентов для каждого данного спектрофлуориметра - процедура достаточно сложная и требующая больших затрат времени. Даже после тщательных исправлений точность результатов составляет ± 10% . По этой причине обычно приводят наблюдаемые рабочие спектры. В случае необходимости можно применить один простой и надежный метод получения необходимых поправочных коэффициентов путем сравнения спектра испускания стандартного вещества с исправленном спектром того же вещества. Такие спектры опубликованы для наиболее распространенных флуорофоров, таких, как хининсульфат, р -нафтол, 3-аминофталимид, .м-нитродимети л анилин и 4-ди-метиламино-4'-нитростильбен [2-5]. Длины волн испускания этих соединений перекрывают диапазон 300 - 800 нм, а данные представлены в виде таблиц или графиков. Для получения поправочных коэффициентов записывают спектр испускания эталона и сравнивают его со стандартным спектром. С помощью такого простого метода сравнения можно избежать трудностей, свойственных другим, более точным методам, описанным ниже. β-Нафтол, вероятно, не следует использовать в качестве стандарта, поскольку при описанных выше условиях наблюдается флуоресценция как самого нафтола, так и его ионной формы. Двойная флуоресценция это результат реакции в возбужденном состоянии, степень которой трудно контролировать. КОРРЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНОЙ ЛАМПЫ. Поправочные коэффициенты можно также найти, определив зависимость сигнала от калиброванного источника света от длины волны. Распределение интенсивности света от вольфрамовой ленточной лампы по длинам волн можно аппроксимировать черным телом эквивалентной температуры. Стандартные лампы известной цветовой температуры поставляются Национальным бюро стандартов и другими организациями. В основном используют приводимые в паспорте данные о спектральном выходе излучения лампы [L(λ)], поскольку уравнение черного тела не строго выполняется для вольфрамовой лампы. Система регистрации в этом случае градуируется следующим образом: 1. Используя систему регистрации спектрофлуориметра, измеряют зависимость интенсивности стандартной лампы от длины волны (λ). 2. Чувствительность системы регистрации S (λ) рассчитывают по уравнению (2.2) 3. После этого получают исправленные спектры делением измеренных спектров на эти поправочные коэффициенты, Важно помнить, что при работе со стандартной лампой необходим точный постоянный контроль цветовой температуры. Кроме того, спектральный выход лампы может меняться со временем и в процессе ее использования. ИСПРАВЛЕНИЕ СПЕКТРОВ ИСПУСКАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЧЕТЧИКА квантов и рассеивателя„ Можно также определить спектральный выход ксеноновой лампы и после этого использовать такую лампу в качестве градуированного источника света [ 1]. Помещая счетчик квантов в кюветное отделение, можно найти относительный выход фотонов L(λ ). После того, как такое распределение интенсивностей получено, направляют излучение ксеноновой лампы на детектор, применяя при этом рассеивающий экран из оксида магния. Считается, что MgO рассеивает все длины волн с одинаковой эффективностью. Поправочные коэффициенты в этом случае находят следующим образом: 1. Сканируют длину волны возбуждения, поместив счетчик квантов в кюветное определение. Полученный сигнал дает спектральный выход лампы L( λ). 2. Рассеиватель помещают в кюветное отделение и сканируют излучение монохроматоров возбуждения и испускания синхронно. Эта процедура дает произведение L(λ )S (λ ), где S (λ) - чувствительность регистрирующей системы. 3. Деление S(λ)L(λ) на L(λ) дает поправочные коэффициенты S(λ). Наиболее сложным аспектом этого способа является изготовление подходящего рассеивателя. MgO должен быть свежеприготовленным и не содержать примесей. Хотя процедура и кажется простой, трудно получить надежные поправочные коэффициенты. Более того, даже сравнение результатов, полученных в разных лабораториях, существенно не улучшает положения ввиду индивидуальной природы поправочных коэффициентов в стандартные спектры. каждом случае. Поэтому предпочтительнее использовать Переход от длин волн к волновым числам. Иногда желательно представлять спектры в шкале волновых чисел (ν), а не в шкале длин волн (λ). Длины волн легко перевести в волновые числа, просто взяв обратные величины, Однако, когда данные получены с постоянным разрешением в длинах волн, что обычно бывает в случае использования решеточных монохроматоров, интервал волновых чисел непостоянен. Например, рассмотрим постоян-ный интервал Δλ = λ 2 - λ 1, где λ 1 и λ 2 - длины волн по обе стороны максимума испускания (рис. 2.12). При 300 нм интервал (Δ λ) в 2 нм эквивалентен 222 см-1. При 600 нм тот же интервал эквивалентен разрешению 55 см-1. Следовательно, при увеличении длины волны интервал в обратных сантиметрах уменьшается пропорционально квадрату длины волны. Таким образом, если спектры получены в обычной форме, т. е. в интервале Длин волн, при переходе к шкале волновых чисел надо каждое значение интенсивности умножить на λ 2: (2.3) Переход от длин волн к волновым числам показан на рис. 2.12. Умножение на λ 2 приводит к избирательному увеличению интенсивности в длинноволно вой части спектра испускания и к сдвигу видимого максимума испускания. Необходимо отметить, что даже после того, как коррекция произведена, разрешение спектра все еще меняется с изменением волнового числа. 2.8. Влияние условий освещения образца Наблюдаемая интенсивность флуоресценции и спектральное распределение могут зависеть от оптической плотности образца и от того, как освещается образец. Наиболее удобно при измерениях флуоресценции наблюдение под прямым углом к середине центрально освещенной кюветы (рис, 2.13, а). Другие варианты геометрического расположения включают фронтальное освещение и нецентральное освещение. Нецентральное освещение уменьшает длину пути, чего также можно достичь, используя кюветы длиной менее 1 см. Эти способы обычно используют для уменьшения эффектов внутреннего фильтра (см. ниже), обусловленных большими оптическими плотностями или мутностью образца. Фронтальное освещение часто осуществляют, используя либо треугольные, либо квадратные кюветы, ориентированные под углом 45° по отношению к падающему свету (рис. 2.13, г - е). По нашему мнению, такое расположение неприемлемо, так как большое количество света отражается при этом прямо в монохроматор испускания, увеличивая вероятность того, что побочный свет будет мешать измерениям. Когда необходимо фронтальное предпочитаем ориентировать освещаемую поверхность под освещение, мы углом около30° к падающему свету. Такой способ имеет два преимущества. Во-первых, меньше отраженного света попадает в монохроматор испускания. Во-вторых, падающий свет распределяется по большой площади поверхности, поэтому точное расположение кюветы внутри держателя не играет существенной роли. Одним из неудобств такой ориентации является уменьшение чувствительности измерений из-за того, что большая часть падающего света отражается от поверхности кюветы. Необходимо учитывать, что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации лишь в ограниченном диапазоне оптических плотностей. Рассмотрим кювету 1x1 см, которую освещают по центру, а наблюдение ведут под прямым углом (рис. 2.13, б). Предположим далее, что оптическая плотность при длине волны возбуждения равна 0,1. Из определения оптической плотности (lgI0/I = D) следует, что интенсивность света в центре кюветы (I) равна 0,88 I0, где I0 - интенсивность света, падающего на кювету. Поскольку наблюдаемая интенсивность флуоресценции пропорциональна интенсивности падающего света, кажущийся выход будет примерно на 10% меньше, чем наблюдаемый для бесконечно разбавленного раствора. Этот эффект называется аффектом внутреннего фильтра. Такие эффекты могут уменьшить либо интенсивность возбуждения в точке наблюдения, либо наблюдаемую флуоресценцию из-за того, что часть ее поглощается. Относительный вклад каждого из процессов зависит от оптических плотностей образца на длинах волн возбуждения и испускания. Рис. 2.14. Влияние оптической плотности на интенсивность флуоресценции хининсульфата. 1 – измеренные интенсивности; 2 – исправленные интенсивности, вычисленные по уравнению (2.4) с Dисп = 0. Эти данные получены для кюветы 1x1 см2 при центральном освещении. Для иллюстрации влияния оптической плотности на интенсивность флуоресценции на рис. 2.14 представлены данные для хининсульфата. Измеряемая интенсивность пропорциональна оптической плотности только до значения D = 0,05. Линейную область этой зависимости для интенсивностей флуоресценции можно расширить, используя нецентральное облучение, которое уменьшает эффективный путь света. Поправки на величину эффекта внутреннего фильтра можно внести следующим образом. Предположим, что образец имеет значительную оптическую плотность как при длине волны возбуждения, так и при длине волны испускания (Dвозб и Dисп соответственно). Значения оптических плотностей ослабляют интенсивности возбуждения и испускания на 10-1/2Dвозб и 10-1/2 соответственно. Исправленная интенсивность Dисп флуоресценции в этом случае приблизительно равна Fиспр = Fнабл * 10(Dвозб + Dисп) / 2. (2.4) Исправленные интенсивности для хининсульфата показаны на рис. 2.14, из которого видно, что рассчитанные значения ложатся на прямую, являющуюся продолжением начального линейного участка экспериментально наблюдаемой кривой. Для нахождения точных поправок желательно иметь градуировочные кривые, которые строят, используя стандарты в условиях, близких к условиям текущих экспериментов. РИС. 2.15. Влияние самопоглощения антрацена.Концентрации в этаноле: 1 - 10-5 на спектр испускания М 2 - 10-4 М; 3 - 4 * 10-4 М. Кювета 1 х 1 см2. Наблюдение велось под прямым углом. Интересно отметить, что при фронтальном освещении интенсивность при больших оптических плотностях не зависит от концентрации [ 6]. При этих условиях весь падающий свет поглощается вблизи поверхности кюветы. Фронтальное освещение хорошо также использовать для измерения оптической плотности таких образцов, как суспензии макрочастиц [7] и гемоглобин [ 6]. В работе [ 6] указывается, что интенсивность пропорциональна отношению оптической плотности флуорофора к оптической плотности образца. РИС. 2.16. Влияние длины волны возбуждения на самопоглощение флуо- ресценции для 9,10-дифенилантрацена при фронтальном освещении излучением указанных длин волн (по данным [8]), При использовании фронтального освещения полная оптическая плотность может быть очень велика (20 или больше), но уровень сигнала остается неизменным. Высокие оптические плотности могут искажать спектры испускания. Например, когда наблюдение ведут под прямым углом, коротковолновые полосы испускания антрацена избирательно уменьшаются (рис, 2.15). Это происходит потому, что испускание коротких длин волн поглощается антраценом. Уменьшение голубого края спектра испускания наиболее сильно проявляется для флуорофоров, у которых спектры поглощения и испускания сильно перекрываются. Флуорофоры с большим стоксовым сдвигом менее чувствительны к этому явлению. При фронтальном освещении спектры испускания могут искажаться также и при высоких концентрациях. Например, спектр испускания 9, 10-дифенил-антрацена зависит от длины волны возбуждения (рис. 2.16). Если возбуждение происходит при 365 нм, коротковолновая часть спектра уменьшается, чего не наблюдается при длине волны возбуждения 265 нм. Оптическая плотность меньше при 365 нм, чем при 265 нм. В результате пучок возбуждающего света с длиной волны 365 нм глубже проникает в образец, при этом вероятность реабсорбции излучения люминесценции возрастает. Не существует простых и надежных методов точного определения величин концентрационных эффектов и введения поправок на них. Лучше избегать связанных с этим проблем, работая с разбавленными растворами. 2.9, Поглощение света и отклонения от закона Ламберта - Бера 2-9.1. Поглощение света Основным аспектом флуоресцентной спектроскопии является измерение поглощения света. Для получения правильных результатов необходимо учитывать множество факторов, которые могут ввести в заблуждение экспериментатора. В этом разделе выводится закон Ламберта - Бера и указываются причины, вызывающие отклонения от него. Рассмотрим тонкий слой раствора толщиной dxt содержащий п моле кул/см3 (рис. 2.17), и предположим, что σ (см2) - эффективное сечение пог лощения. Число фотонов dI, поглощенных в слое dx, пропорционально интенсивности падающего света I, а также σ и n, где n - число молекул в 1 см3: dI/dx=-I σ n. РИС. 2.17. Схема, иллюстрирующая поглощение света. (2.5) После перегруппировки, интегрирования и подстановки граничных условий I= I0 при х = 0 получаем InI0/I = σnd, (2.6) где d - толщина образца. Это и есть уравнение Ламберта - Бера, обычно используемое в несколько иной форме: lgI0/I = εcd = D где (2.7) ε - молярный коэффициент поглощения (экстинкции) в М-1см-1*; с - концентрация, моль/л; D -оптическая плотность. Из уравнений (2.6) и (2.7) находим σ=2,303εс/n.. (2.8) Поскольку n= Nc/108, где N - число Авогадро, имеем σ =3,82*10-21 ε Интересно подсчитать (2.9) сечения поглощения для типичных ароматических соединений. Молярные коэффициенты поглощения антрацена равны 160 000 и 6 300 моль-1 • см-1 для 253 и 375 нм соответственно. Эти значения соответствуют сечениям поглощения 6,1 и 0,24 А2 соответственно. Если принять, что сечение молекул антрацена равно 12 А2, видно, что при 253 нм антрацен поглощает ~ 50% фотонов, с которыми он сталкивается, а при 375 нм - 2% фотонов. 2.9.2. Отклонения от закона Бера Согласно закону Бера, оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации поглощающих частиц. Отклонения от закона Бера могут быть связаны как с природой исследуемых веществ, так и с прибором. РАССЕЯНИЕ СВЕТА. Биологические образцы часто мутны из-за наличия макромолекул или других больших агрегатов, рассеивающих свет. Оптическая плотность, вызванная рассеянием, пропорциональна 1/λ4 (рэлеевское рассеяние), и, таким образом, ее легко можно определить как некое фоновое поглощение, быстро увеличивающееся при уменьшении длины волны. *В системе СИ размерность десятичного молярного коэффициента поглощения м 2 • моль-1, что в 10 раз больше исторически сложившейся и используемой прак- тически во всех публикуемых работах курьезной размерности дм3- моль-1 • см-1, содержащей две различные десятичные доли одной и той же единицы длины. —Прим. ред. Флуоресценция. Если оптическая плотность образца велика, а поглощающие частицы флуоресцируют, испускаемое ими излучение может попасть в детектор, что вызовет отклонения от закона Бера; график будет отклоняться в сторону оси концентраций. Но поскольку побочная флуоресценция направлена во все стороны, тогда как падающий свет сосредоточен вдоль оси, ее влияние можно уменьшить, располагая детектор на определенном расстоянии от образца. Ассоциация. Если растворимость поглощающих частиц невелика, они могут ассоциировать в растворах при высоких концентрациях. Спектры поглощения ассоциатов и мономеров могут различаться. Например, раствор распространенного красителя бромфенолового голубого при концентрациях порядка 10 мг/мл имеет красный цвет, а при меньших концентрациях - голубой. В зависимости от длины волны, выбранной для наблюдения, отклонения от закона Бера могут быть либо положительными, либо отрицательными. Описанные выше факторы обусловлены собственными свойствами образца. Несовершенства аппаратуры могут также привести к нелинейной зависимости оптической плотности от концентрации. Это в особенности справедливо при больших оптических плотностях. Например, рассмотрим раствор индола с D = 5 при длине волны 280 нм. Для того чтобы измерить такую оптическую плотность, спектрофотометр должен очень точно регистрировать интенсивности I0 и I. Последняя в 10 -5 раз меньше, чем интенсивность падающего света I0 . Обычно интенсивность побочного света, пропущенного монохроматором, на тех длинах волн, где вещество не поглощает, больше, чем I. Следовательно, невозможно надежно измерять большие оптические плотности, если не приняты все предосторожности, чтобы свести к минимуму побочный свет.