ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ АТЕРОСКЛЕРОЗА У КРЫС

80
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2012. Вып. 1
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
УДК 612.017.1[045]
И.В. Меньшиков, К.В. Фомина, Л.В. Бедулева, В.Г. Сергеев
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ АТЕРОСКЛЕРОЗА У КРЫС,
ВЫЗВАННОГО ИММУНИЗАЦИЕЙ НАТИВНЫМИ ЛИПОПРОТЕИНАМИ ЧЕЛОВЕКА
Иммунизация крыс нативными ЛПНП человека вызывает развитие аутоиммунной реакции против нативных
ЛПНП, сопровождающейся дислипопротеинемией, увеличением объема периваскулярной и эпикардиальной
жировой ткани и атеросклеротическим повреждением стенки аорты, что свидетельствует в пользу гипотезы о
том, что аутоиммунная реакция против нативных ЛПНП является причиной развития этого заболевания. Атеросклероз у крыс, вызванный иммунизацией нативными ЛПНП, является адекватной экспериментальной моделью атеросклероза человека.
Ключевые слова: атерома, атеросклероз, аутоиммунные реакции, дислипидемия, нативные липопротеины низкой плотности, экспериментальная модель атеросклероза у крыс, эпикардиальный жир.
Введение
Атеросклероз лежит в основе широкого спектра кардиоваскулярных заболеваний и ассоциирован со многими аутоиммунными и инфекционными заболеваниями [1-4]. Несмотря на многочисленные исследования, этиология и патогенез этого заболевания остаются неизвестными. Большинство
современных гипотез основываются на ключевом факте связи между нарушением обмена липопротеинов и формированием атеросклеротических бляшек. Однако почему и как происходит нарушение
обмена липопротеинов, ведущее к развитию заболевания, остается главным невыясненным вопросом
атерогенеза. В литературе обсуждается много внешних и внутренних факторов, ведущих к нарушению обмена липопротеинов, эти данные представлены в целом ряде обзоров [5-8]. Одной из наиболее
привлекательных сегодня гипотез является гипотеза об аутоиммунной природе атеросклероза, согласно которой причиной нарушения обмена липопротеинов является развитие аутоиммунной реакции против модифицированных (окисленных) липопротеинов низкой плотности (оЛПНП) [9-11]. Образующиеся при этом иммунные комплексы аутоантител с оЛПНП формируют эффекторные механизмы, ведущие к воспалению в стенке сосуда. В соответствии с этой гипотезой уровень оЛПНП и
аутоантител к ним должны быть ассоциированы с развитием атеросклероза. Однако однозначной связи между ними не обнаружено, а имеющиеся данные об уровне аутоантител к оЛПНП у больных атеросклерозом и здоровых людей противоречивы [12-15]. Эти факты ставят под сомнение идею об аутоиммунной реакции против оЛПНП как причине индукции и развития атеросклероза. В то же время
известны факты существования в норме аутоантител к нЛПНП, уровень которых при атеросклерозе
существенно повышается [16]. В исследованиях, проведенных нами ранее, было выявлено, что у
больных атеросклерозом людей (пациенты с ишемической болезнью сердца) по сравнению со здоровыми был достоверно выше уровень антител к нЛПНП и ниже уровень антител к оЛПНП в крови
[17]. На основании этих и других фактов нами была сформулирована гипотеза о том, что основной
причиной дислипопротеинемии и атерогенеза является развитие аутоиммунной реакции к нативным,
а не к окисленным ЛПНП. В пользу нашей гипотезы также свидетельствуют сравнительно недавно
полученные результаты исследований, указывающие на то, что аутоиммунные Т-клетки, распознающие эпитопы белка ApoB100 нЛПНП, способствуют развитию атеросклероза, тогда как ингибирование Т-клеточного ответа против нативных ЛПНП подавляет развитие атеросклероза [18]. Одним из
наиболее убедительных способов проверки гипотезы, направленной на определение этиологического
фактора развития того или иного заболевания является возможность вызвать этим фактором развитие
заболевания у экспериментальных животных. Поэтому с целью проверки гипотезы мы индуцировали
аутоиммунную реакцию к нЛПНП у крыс путем иммунизации их нативными липопротеинами низкой
плотности человека (чнЛПНП). В соответствии с гипотезой развитие аутоиммунной реакции против
нЛПНП должно привести к развитию дислипопротеинемии, атеромы сосудов как наиболее значимых
признаков, характеризующих развитие атеросклероза у человека.
Экспериментальная модель атеросклероза у крыс…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
81
2012. Вып. 1
Материалы и методика исследований
Крысы Wistar были иммунизированы нативными ЛПНП человека (Sigma) в составе неполного
адъюванта Фрейнда (НАФ) (Sigma) однократно, внутрикожно в дозе 200 мкг. Контрольным животным вводили НАФ. Кровь забирали еженедельно в течение 13 недель кардиальной пункцией. Последний забор крови был выполнен через 20 недель после иммунизации. В сыворотке крови определяли уровень антител к нЛПНП человека, уровень общего холестерина, холестерина ЛПНП, холестерина ЛПВП. Антитела против нЛПНП определяли по методу, описанному Хлюстовым B.Н., 1999
[16]. Общий холестерин определяли ферментативным методом с помощью набора Холестерин ФС
(«Диакон-ДС», Россия). Холестерин ЛПНП и ЛПВП определяли прямым гомогенным методом, используя коммерческие наборы «Холестерин ЛПНП», «Холестерин ЛПВП» (Human). Данные представляли как разницу (Δ) средних значений между группой опытных и контрольных животных. Для
определения значимости различий был использован критерий Манна-Уитни. Через 20 недель после
иммунизации каждой крысе была проведена интракардиальная перфузия фиксатором Иммунофикс.
Сердце и часть аорты были окрашены на липиды суданом III (модифицированная методика Holman,
1958). Другая часть аорты подвергалась гистологическому исследованию, для этого сосуды были залиты в парафин. Срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином-эозином.
Результаты и их обсуждение
Кинетика антител к нЛПНП, изменение уровня холестерина ЛПНП, холестерина ЛПВП в
ходе иммунного ответа, вызванного иммунизацией крыс нативными ЛПНП человека. С целью
проверки гипотезы о том, что причиной атерогенеза является развитие аутоиммунной реакции против
нативных ЛПНП, мы попытались индуцировать аутоиммунную реакцию против нативных ЛПНП у
крыс. Обычно для индукции аутоиммунных заболеваний у экспериментальных животных используют иммунизацию гетерологичными антигенами, сходными с аутоантигенами. Принято считать, что
причиной развития аутоиммунной реакции при иммунизации гетерологичным антигеном является
способность антигена вызвать активацию лимфоцитов, перекрестно реагирующих с аутоантигеном
[19; 20] или активировать аутореактивные лимфоциты через идиотип-антиидиотипические взаимодействия, как было показано нами ранее на экспериментальных моделях аутоиммунной гемолитической анемии [21] и коллаген-индуцированного артрита крыс [22]. Поэтому для индукции аутоиммунной реакции против нативных ЛПНП у крыс мы использовали гетерологичные (человеческие) нативные ЛПНП.
Однократная иммунизация крыс нативными ЛПНП человека в НАФ в дозе 200 мкг вызвала
рост уровня антител против нЛПНП человека, который происходил в течение 13 недель после иммунизации (рис. 1). Через 20 недель уровень антител оставался высоким. Рост антител против нативных
ЛПНП человека в ходе иммунного ответа был ступенчатым, каждое новое повышение уровня антител к нативным ЛПНП человека носило спонтанный характер и достигало максимума быстрее, чем
предыдущее. Такой самоподдерживающийся, самоусиливающийся характер развития иммунного ответа свойственен для развития реакций гиперчувствительности и аутоиммунных реакций.
Рост уровня антител к нЛПНП у иммунизированных крыс сопровождался повышением уровня
холестерина ЛПНП и снижением холестерина ЛПВП относительно контрольных животных (рис. 1).
Наблюдаемые изменения в обмене липопротеинов являются общепринятым признаком развития атеросклероза у человека.
Изменение уровня холестерина ЛПНП и холестерина ЛПВП в крови крыс, так же как и изменение уровня антител к нативным ЛПНП человека, имело ступенчатый характер. При этом изменение
уровня холестерина ЛПНП и ЛПВП углубляются, становятся более выраженными с новой фазой роста антител (рис. 1). Сравнение кинетики антител к нЛПНП и уровня холестерина ЛПНП и ЛПВП в
ходе иммунного ответа явно указывает на их взаимосвязь. Развитие дислипопротеинемии, наличие
взаимосвязи между изменением уровня антител против нативных липопротеинов и дислипидемией в
ходе иммунного ответа свидетельствует о развитии у крыс, иммунизированных нативными ЛПНП
человека, аутоиммунной реакции к нативным ЛПНП крыс.
82
2012. Вып. 1
И.В. Меньшиков, К.В. Фомина, Л.В. Бедулева, В.Г. Сергеев
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Рис. 1. Кинетика антител против нативных ЛПНП человека, изменение уровня холестерина ЛПНП
и холестерина ЛПВП в крови крыс, иммунизированных нативными ЛПНП. Результаты представлены
в виде разницы средних между группой иммунизированных нЛПНП крыс (n=8) и группой контрольных крыс (n=8). * – значимые различия по сравнению с контрольными животными p≤ 0,05, критерий
Манна-Уитни
Развитие атеромы аорты у крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека. У контрольных крыс, которым однократно вводили НАФ, изменений в структуре аорты не обнаружено.
Интима аорты крыс представлена в виде единственного эндотелиального слоя, который плотно прилегает к внутренней эластической мембране; медиа аорты состоит из нескольких слоев мышечных
клеток и экстрацеллюлярного коллагенового матрикса, разделенного эластиновыми пластинками;
адвентиция аорты представлена соединительной и жировой тканью (рис. 2а).
Гистологический анализ аорты экспериментальных крыс выявил изменения, характерные для
атеросклероза. Наблюдается несколько видов изменений стенки аорты, которые могут рассматриваться как разные стадии развития атеросклеротических повреждений. На рис. 2б видно утолщение
интимы, дезорганизация медии, обнаруживаются скопления лейкоцитов в интиме и между медиа и
адвентицией, не просматривается elastic lamina, что может представлять собой ранние атеросклеротические повреждения сосудов. На рис 2в представлен участок аорты с более глубокими нарушениями интима-медиа комплекса. Наблюдаются участки полного разрушения интимы, вспучивания и обнажения медии. Таким образом, однократная иммунизация крыс нативными ЛПНП человека в НАФ
вызывает повреждения стенки аорты, типичные для атеросклероза.
Рост объема эпикардиальной и периваскулярной жировой ткани у крыс, иммунизированных нативными ЛПНП человека. Однократная иммунизация крыс нативными ЛПНП человека вызвала увеличение объема эпикардиального жира (рис. 3). На рис. 3 видно, что сердце контрольного
животного почти не имеет эпикардиального жира, тогда как у экспериментальных животных наблюдается его существенный объем. Увеличение объема эпикардиального жира у крыс, иммунизированных чнЛПНП, составляет 250±35%.
Экспериментальная модель атеросклероза у крыс…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
83
2012. Вып. 1
Рис. 2. Стенка аорты, окрашенная гематоксилином-эозином: а – стенка аорты контрольных крыс;
б – стенка аорты крыс, иммунизированных нЛПНП. Наблюдаются утолщение интимы, дезорганизация медиа, накопление лейкоцитов в стенке сосуда. Elastic lamina не определяется; в – стенка аорты у
крыс, иммунизированных нЛПНП. Участок полной деградации интимы, вспучивание и обнажение
медиа. Длина линии = 1200 μm
Рис. 3. Сердце, контрольных крыс (1) и крыс, иммунизированных нЛПНП человека (2), окрашенное
суданом. Темные области – эпикардиальный жир
У экспериментальных животных выявлено увеличение объема периваскулярной жировой ткани
– количества и размеров адипоцитов белой жировой ткани в адвентициальной оболочке (рис. 4 а, б).
Важно отметить, что при этом менялся и характер распределения липидов в адипоцитах бурой жировой ткани адвентиции аорты. В некоторых адипоцитах бурой жировой ткани мелкие липидные капли,
84
2012. Вып. 1
И.В. Меньшиков, К.В. Фомина, Л.В. Бедулева, В.Г. Сергеев
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
обычно диспергированные по всей цитоплазме, становились крупнее, сливались и локализовались в
центре клеток (рис 4 в, г). Можно предположить, что в условиях эксперимента происходило не только увеличение количества клеток бурой жировой ткани аорты, но и их постепенное превращение в
адипоциты белой жировой ткани.
Рис. 4. Периваскулярная жировая ткань: а – адипоциты аорты контрольных животных; б – адипоциты
аорты крыс, иммунизированных нЛПНП; в, г – превращение адипоцитов бурой жировой ткани в адипоциты белой жировой ткани в адвентиции и периадвентиции аорты крыс, иммунизированных
нЛПНП. (1*, 2*, 3* – последовательные стадии превращения адипоцитов); 1 – медиа; 2 – адвентиция;
3 – периадвентиция. Длина линии (A, B, C) = 1400 μm, D - 420 μm
В последнее время роли эпикардиальной и периваскулярной жировой ткани в патогенезе атеросклероза уделяется большое внимание [23; 24]. Увеличение объема эпикардиальной жировой ткани
сегодня рассматривают как маркер коронарного атеросклероза и прогностический показатель его
развития [25]. Периваскулярная жировая ткань, окружающая артерии, также вовлечена в локальную
стимуляцию образования атеросклеротических бляшек [24]. Результаты in vitro и in vivo показали,
что периваскулярная жировая ткань обладает провоспалительными свойствами и способна вызывать
атеросклеротический процесс в стенке сосуда, что обосновывает гипотезу о том, что повреждение в
стенке сосуда индуцируется с его внешней стороны [24]. Поэтому выявленные нами повреждения
внутренней стенки аорты у крыс могут быть вызваны реакцией периваскулярной жировой ткани на
иммунизацию крыс нЛПНП человека.
В сущности, нами получена новая экспериментальная модель атеросклероза. Несмотря на то
что известно много экспериментальных моделей атеросклероза [26], сегодня не существует адекватной модели, которая бы полностью воспроизводила все стадии и признаки атеросклероза человека
[27; 28]. Разработанная нами экспериментальная модель атеросклероза у крыс, вызванная иммунизацией нативными ЛПНП человека, воспроизводит основные метаболические, патофизиологические
признаки заболевания и тем самым является адекватной экспериментальной моделью атеросклероза
человека. Экспериментальная модель открывает перспективу для изучения причинно-следственных
связей между процессами, вовлеченными в патогенез атеросклероза; механизмов срыва естественной
толерантности к нативным ЛПНП, ведущих к атеросклерозу; ассоциации атеросклероза с инфекциями и другими аутоиммунными заболеваниями.
Выводы
Таким образом, иммунизация крыс нативными ЛПНП человека вызывает развитие аутоиммунной реакции против нативных ЛПНП, сопровождающейся дислипопротеинемией, увеличением объема периваскулярной и эпикардиальной жировой ткани и атеросклеротическим повреждением стенки
аорты, что свидетельствует в пользу гипотезы о том, что аутоиммунная реакция против нативных
Экспериментальная модель атеросклероза у крыс…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
85
2012. Вып. 1
ЛПНП является причиной развития этого заболевания. Атеросклероз у крыс, вызванный иммунизацией нативными ЛПНП человека, является адекватной экспериментальной моделью атеросклероза
человека.
Благодарности
Работа выполнена в рамках государственного заказа Министерства образования и науки РФ на
проведение НИР ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» по теме «Аутоиммунные
механизмы атеросклероза. Новая экспериментальная модель атеросклероза у крыс» № 4.5505.2011.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
Masiá M., Padilla S., Robledano C. et al. Evaluation of endothelial function and subclinical atherosclerosis in association with hepatitis C virus in HIV-infected patients: a cross-sectional study // BMC Infect. Dis. 2011. Vol. 11.
P. 265.
Muhlestein J.B. Chronic infection and coronary atherosclerosis will the hypothesis ever really pan out? // J. Am.
Coll. Cardiol. 2011. Vol. 58. P. 2007-2009.
Stassen F.R., Vainas T., Bruggeman C.A. Infection and atherosclerosis. An alternative view on an outdated hypothesis // Pharmacol. Rep. 2008. Vol. 60. P. 85-92.
Symmons D.P., Gabriel S.E. Epidemiology of CVD in rheumatic disease, with a focus on RA and SLE // Nat. Rev.
Rheumatol. 2011. Vol. 7. P. 399-408.
Galkina E., Ley K. Immune and Inflammatory Mechanisms of Atherosclerosis // Annu Rev. Immunol. 2009. Vol.
27. P. 165-197.
Libby P., Okamoto Y., Rocha V.Z. et al. Inflammation in Atherosclerosis:Transition From Theory to Practice //
Circ. J. 2010. Vol. 74. P. 213-220.
Shah P.K. Residual risk and high-density lipoprotein cholesterol levels: is there a relationship? // Rev. Cardiovasc.
Med. 2011. Vol. 12. P. 55-59.
Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid Res. 2009. Vol. 50. P. 376-381.
Klimov A.N. Autoimmune theory of atherogenesis and the concept of modified lipoproteins // Vestn. Akad. Med.
Nauk SSSR. 1990. Vol. 11. P. 30-36.
Klimov A.N, Nagornev V.A. Evolution of cholesterol concept of atherogenesis from Anitchkov to our days //
Pediatr. Pathol .Mol. Med. 2002. Vol. 21. P. 307-320.
Virella G., Lopes-Virella M.F. Atherogenesis and the humoral immune response to modified lipoproteins //
Atherosclerosis. 2008. Vol. 200. P. 239-246.
Gounopoulos P., Merki E., Hansen L.F. et al. Antibodies to oxidized low density lipoprotein: epidemiological studies and potential clinical applications in cardiovascular disease // Minerva Cardioangiol. 2007. Vol. 55. P. 821-837.
Mandal K., Jahangiri M., Xu Q. Autoimmune mechanisms of atherosclerosis // Handb. Exp. Pharmacol. 2005. Vol.
170. P. 723-743.
Matsuura E., Kobayashi K., Inoue K. et al. Intravenous immunoglobulin and atherosclerosis // Clin. Rev. Allergy
Immunol. 2005. Vol 29. P. 311-319.
Weinbrenner T., Cladellas M., Covas M.I. et al. High oxidative stress in patients with stable coronary heart disease
// Atherosclerosis. 2003. Vol. 168. P. 99-106.
Хлюстов В.Н. Количественное определение аутоантител к липопротеинам низкой плотности // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. № 4. С. 17-20.
Меньшиков И.В., Макарова М.И., Булатова Н.И. и др. Аутоиммунные реакции в патогенезе атеросклероза
// Иммунология. 2010. № 5. С. 242-246.
Hermansson A., Ketelhuth D., Strodthoff D. et al. Inhibition of T-cell response to native low density lipoprotein
reduces atherosclerosis // J. Exp. Med. 2010. Vol. 207. P. 1081-1093.
Rose N.R. Infection, mimics, and autoimmune disease. J. Clin. Invest. 2001. Vol. 107. Р. 943-944.
Wucherpfennig K.W. Mechanisms for the induction of autoimmunity by infectious agents // J. Clin. Invest. 2001.
Vol. 108. P. 1097-1104.
Menshikov I., Beduleva L. Evidence in favor of a role of idiotypic network in autoimmune hemolytic anemia induction: theoretical and experimental studies // Int. Immunol. 2008. Vol. 20. P. 193-198.
Beduleva L., Menshikov I. Role of idiotype-anti-idiotype interactions in the induction of collagen-induced arthritis
in rats // Immunobiology. 2010. Vol. 215. P. 963-970.
Djaberi R., Schuijf J.D., van Werkhoven J.M. et al. Relation of epicardial adipose tissue to coronary atherosclerosis
// Am. J. Cardiol. 2008. Vol. 102. P. 1602-1607.
Verhagen S.N., Visseren F.L., Perivascular adipose tissue as a cause of atherosclerosis // Atherosclerosis. 2011.
Vol. 214. P. 3-10.
86
И.В. Меньшиков, К.В. Фомина, Л.В. Бедулева, В.Г. Сергеев
2012. Вып. 1
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
25. Yorgun H., Canpolat U., Hazırolan T. et al. Epicardial adipose tissue thickness predicts descending thoracic aorta
atherosclerosis shown by multidetector computed tomography // Int. J. Cardiovasc. Imaging. 2011.
26. Xiangdong L., Yuanwu L., Hua Z. et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review // Protein Cell.
2011. Vol. 2. P. 189-201.
27. Russell J.C., Proctor S.D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis // Cardiovasc. Pathol. 2006. Vol.15. P. 318-330.
28. Zaragoza C., Gomez-Guerrero C., Martin-Ventura J.L. et al. Animal Models of Cardiovascular Diseases // Journal
of Biomedicine and Biotechnology. 2011. doi:10.1155/2011/497841.
Поступила в редакцию 02.12.11
I.V. Menshikov, K.V. Fomina, L.V. Beduleva, V.G. Sergeev
A new experimental murine model of atherosclerosis by immunization with human native low-density
lipoproteins
Immunization of rats with native human LDL leads to anti-nLDL autoimmune reaction accompanied by an increase in
LDL-С levels, a reduction in HDL-C, and an epicardial and perivascular increase in the adipose tissue volume, together
with endothelial destruction and media disorder. The results achieved prove the hypothesis that autoimmune reaction to
nLDL is the cause of atherosclerosis. Our murine model of atherosclerosis induced by heterologous nLDL reproduces
key metabolic and pathologic features of human atherosclerosis and is a suitable experimental model of this disease.
Keywords: atheroma, atherosclerosis, autoimmunity, dyslipidemia, epicardial adipose tissue, native low-density lipoproteins, rat model of atherosclerosis.
Меньшиков Игорь Викторович,
доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: miv140560@yandex.ru
Фомина Ксения Владимировна, инженер
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail:fomina_ksenia@mail.ru
Бедулева Любовь Викторовна,
доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: blv76@mail.ru
Сергеев Валерий Георгиевич,
доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: cellbio@ya.ru
Menshikov I.V., doctor of biology, professor
Udmurt State University
426034,Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
E-mail: miv140560@yandex.ru
Fomina K.V., engineer
Udmurt State University
426034,Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
E-mail: fomina_ksenia@mail.ru
Beduleva L.V., doctor of biology, professor
Udmurt State University
426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
E-mail: blv76@mail.ru
Sergeev V.G., doctor of biology, professor
Udmurt State University
426034,Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
E-mail: cellbio@ya.ru