Глиадин (GAF-3X) IgG (Anti- Gliadin (GAF

Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
1
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2005/1125 от 18.08.2005 г.
Глиадин (GAF-3X) IgG (Anti- Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG)
Иммуноферментный тест для полуколичественного или количественного определения антител класса IgG к
глиадину (GAF-3X) в сыворотке и плазме крови человека
Номер по каталогу: EV 3011-9601 G
Набор рассчитан на 96 определений
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для выявления
герпетиформного дерматита Дюринга.
глютен-зависимой
энтеропатии
(глютеновой
болезни),
ПРИНЦИП МЕТОДА
Набор для иммуноферментного анализа Глиадин (GAF-3X) IgG (Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG))
предназначен для полуколичественного или количественного in vitro определения антител класса IgG к
глиадину (GAF-3X) в сыворотке и плазме крови человека. В состав набора входят 8-луночные стрипы,
разделяемые на отдельные лунки, с иммобилизованным глиадином (GAF-3X). На первой стадии анализа в
лунках инкубируют разведенные исследуемые образцы. Если в исследуемом образце содержатся
специфичные антитела класса IgG, они (а также IgA и IgM) связываются с иммобилизованным антигеном.
Для выявления связавшихся антител проводят вторую инкубацию, используя меченные ферментом
антитела к IgG человека (конъюгат). Молекулы конъюгата, связавшиеся с комплексом «антиген-антитело»
на поверхности лунок, после добавления раствора субстрата катализируют химическую реакцию,
сопровождающуюся образованием окрашенного продукта. Интенсивность окрашивания раствора прямо
пропорциональна концентрации антител к глиадину в образце.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Необходимые реагенты и материалы, входящие в состав набора:
Цвет
---
Формат
12 х 8
Символ
2. Калибратор 1
200 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
темнокрасный
1 × 2,0 мл
CAL 1
3. Калибратор 2
25 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
красный
1 × 2,0 мл
CAL 2
4. Калибратор 3
2 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
розовый
1 × 2,0 мл
CAL 3
5. Положительный контроль
(IgG человека); готовый к использованию
синий
1 × 2,0 мл
POS CONTROL
6. Отрицательный контроль
(IgG человека); готовый к использованию
зеленый
1 × 2,0 мл
NEG CONTROL
7. Конъюгат
меченные пероксидазой антитела к IgG человека (кроличьи);
готовый к использованию
зеленый
1×12 мл
CONJUGATE
8. Буфер для разведения образцов
готовый к использованию
голубой
1×100 мл
SAMPLE BUFFER
9. Промывочный буфер
10х концентрат
бесцветный
1×100 мл
WASH BUFFER 10x
10. Раствор хромоген/субстрат
ТМБ/Н2О2; готовый к использованию
бесцветный
1×12 мл
SUBSTRATE
11. Стоп-реагент
0,5 М раствор серной кислоты; готовый к использованию
бесцветный
1×12 мл
STOP SOLUTION
12. Инструкция к набору
---
1 шт.
13. Протокол с целевыми значениями
---
1 шт.
Компоненты набора
1. Лунки планшета
с иммобилизованными антигенами; 12 8-луночных стрипов
планшета (разделяемых на отдельные лунки), в рамкедержателе; готовые к использованию
STRIPS
Серия
Температура хранения
Для in vitro диагностики
Невскрытый набор использовать до
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
2
_____________________________________________________________________________________________________
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ НАБОРА
Набор должен храниться при температуре 2-8 °С. Замораживание набора не допускается. Невскрытые
компоненты набора стабильны до истечения указанного срока годности.
УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Обращайтесь с исследуемыми образцами, калибраторами, контролями и проинкубированными стрипами
планшетов как с потенциально инфицированными материалами. Все реагенты и материалы, являющиеся
отходами, должны утилизироваться в соответствии с действующими нормативами.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание. Перед использованием все реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (1825 °С) примерно в течение 30 минут. После первого использования все реагенты стабильны до истечения
указанного срока годности при хранении при температуре 2-8 °С и предохранении от микробной
контаминации, если ниже не оговорены особые условия хранения.
- Стрипы с иммобилизованными антигенами: готовы к использованию. Вскройте предохраняющую
упаковку планшета за бороздку над застежкой. Перед вскрытием упаковки стрипы должны быть
доведены до комнатной температуры во избежание конденсации влаги внутри лунок. После вскрытия
упаковки неиспользуемые стрипы сразу верните в пакет и плотно закройте его имеющейся на пакете
самоуплотняющейся застежкой. Не удаляйте пакет с влагопоглотителем.
После первого вскрытия упаковки стрипы с лунками, покрытыми антигенами, можно хранить в сухом
месте при температуре 2-8 °С по меньшей мере в течение 4 месяцев.
- Калибраторы и контроли: готовы к использованию. Перед использованием тщательно перемешать.
- Конъюгат: готов к использованию. Перед использованием тщательно перемешать.
- Буфер для разведения образцов: готов к использованию.
- Промывочный буфер: поставляется в виде 10-кратного концентрата. Если в концентрате
промывочного буфера образовались кристаллы, необходимо подогреть флакон с буфером при
температуре 37 оС и тщательно перемешать перед разведением. С помощью чистой пипетки отберите
необходимый объем концентрата буфера и разведите деионизированной или дистиллированной водой
(1 часть реагента плюс 9 частей дистиллированной воды).
Например, для одного стрипа: 5 мл концентрата плюс 45 мл воды.
Приготовленный разведенный промывочный буфер стабилен в течение 4 недель при хранении при
температуре 2-8 °С и соблюдении правил использования.
- Раствор хромоген/субстрат: готов к использованию. Закрывайте флакон сразу после использования,
поскольку содержащийся в нем раствор чувствителен к свету. Используемый раствор
хромоген/субстрат должен быть бесцветен. Не используйте раствор, если он окрасился в голубой цвет.
- Стоп-реагент: готов к использованию.
Внимание! Калибраторы и контроли были проверены на наличие антигена гепатита В, а также антител к
вирусу гепатита С, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью методов иммуноферментного анализа и непрямой
иммунофлюоресценции, и при этом показали отрицательные результаты. Однако, все используемые
материалы следует считать потенциально инфекционно опасными и обращаться с ними, соблюдая
необходимые меры предосторожности. Часть реагентов содержит токсичный азид натрия. Избегайте
контакта реагентов с кожей.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Исследуемые образцы:
сыворотка крови или взятая в ЭДТА, гепарин или цитрат плазма крови.
Стабильность
Исследуемые образцы сыворотки или плазмы крови могут храниться до 14 дней при температуре 2-8 °С.
Разведенные образцы следует исследовать в течение одного рабочего дня.
Разведение образцов:
Образцы сыворотки или плазмы крови пациентов разводят 1:201 буфером для разведения образцов.
Например, разведите 5 мкл сыворотки крови в 1,0 мл буфера для разведения образцов и тщательно
перемешайте на вортексе (пипетка для перемешивания не пригодна).
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибраторы и контроли уже предварительно разведены и готовы к использованию, не
следует их разводить.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
3
_____________________________________________________________________________________________________
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Для полуколичественного анализа, кроме исследуемых образцов, используют калибратор 2, а также
положительный и отрицательный контроли. Для количественного анализа используют калибраторы 1, 2
и 3, а также положительный и отрицательный контроли.
Внесите в отдельные лунки планшета в соответствии со схемой внесения
реагентов по 100 мкл калибраторов, положительного и отрицательного
контролей или разведенных образцов сыворотки или плазмы крови.
Инкубируйте при комнатной температуре (18-25 °С) в течение 30 минут.
Ручная. Удалите содержимое лунок, затем последовательно промойте все
Промывка
лунки 3 раза, каждый раз внося по 300 мкл приготовленного промывочного
буфера в каждую лунку.
Автоматическая. Промойте лунки 3 раза, внося по 450 мкл приготовленного
промывочного буфера в каждую лунку (программирование устройства для
промывания планшетов в режиме переполнения: “Overflow Modus”).
Оставляйте промывочный буфер в каждой лунке в течение 30 – 60 секунд во
время каждого цикла промывки, затем удаляйте содержимое лунок. После
промывки (вручную или автоматической) тщательно удаляйте остатки
промывочного буфера из лунок, постукивая перевернутым планшетом о
фильтровальную бумагу.
Примечание. Остатки жидкости (>10 мкл), скапливающейся в лунках после
промывки, могут повлиять на субстратную реакцию и привести к получению
ложно заниженных значений оптической плотности. Неправильная промывка
(например, менее 3 промывочных циклов, слишком маленькие объемы
промывочного буфера или слишком короткое время реакции) может привести к
ложно завышенным значениям оптической плотности.
Внесите в лунки планшета по 100 мкл конъюгата (меченных пероксидазой
Инкубация конъюгата
(2-я стадия)
антител к IgG человека). Инкубируйте при комнатной температуре (18-25 °С) в
течение 30 минут.
Удалите содержимое лунок. Промойте, как описано выше.
Промывка
Внесите в лунки планшета по 100 мкл раствора хромоген/субстрат. Инкубируйте
Инкубация субстрата
(3-я стадия)
при комнатной температуре (18-25 °С) в течение 15 минут (предохраняйте от
воздействия прямых солнечных лучей).
Внесите в лунки планшета по 100 мкл стоп-реагента в той же
Остановка реакции
последовательности и с той же скоростью, как и раствор хромоген/субстрат.
Измерение
С помощью планшетного спектрофотометра измеряют интенсивность
окрашивания в лунках при длине волны 450 нм (значение референтной длины
волны между 620 нм и 650 нм) в течение 30 минут после добавления стопреагента. Перед измерением осторожно встряхните планшет для обеспечения
равномерного распределения раствора.
Автоматизация процесса проведения анализа
Процесс разведение образцов и вся процедура анализа может быть полностью автоматизирована и
выполнена ИФА анализатором. Условия инкубации, запрограммированные в соответствующем
авторизированном фирмой EUROIMMUN программном обеспечении, могут слегка отличаться от описанных
в инструкции к данному набору. Проверка качества совместной работы данного набора EUROIMMUN ELISA
и таких автоматических систем как EUROIMMUN Analyser I показала хорошие результаты. Документы,
подтверждающие качество, доступны по запросу.
Возможно использование автоматических открытых систем других производителей, однако проверка
качества совместной работы должна быть выполнена пользователем.
Инкубация образцов
(1-я стадия)
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
4
_____________________________________________________________________________________________________
СХЕМА ВНЕСЕНИЯ РЕАГЕНТОВ
1
2
3
A С2
Р6
Р14
B pos. Р7
Р15
C neg. Р8
Р16
D Р1
Р9
Р17
E Р2
Р10 Р18
F Р3
Р11 Р19
G Р4
Р12 Р20
H Р5
Р13 Р21
4
Р22
Р23
Р24
5
6
7
С1
С2
С3
pos.
neg.
Р1
Р2
Р3
8
Р4
Р5
Р6
Р7
Р8
Р9
Р10
Р11
9
Р12
Р13
Р14
Р15
Р16
Р17
Р18
Р19
10
Р20
Р21
Р22
Р23
Р24
11
12
Схема внесения реагентов в лунки стрипов 1–4 представляет собой образец заполнения лунок при
полуколичественном анализе 24 образцов сыворотки или плазмы крови пациентов (Р1–Р24).
Схема внесения реагентов в лунки стрипов 7–10 представляет собой образец заполнения лунок при
количественном анализе 24 образцов сыворотки или плазмы крови пациентов (Р1–Р24).
Каждый из калибраторов (С1–С3), положительный (pos.) и отрицательный (neg.) контроли и каждый из
образцов сыворотки или плазмы крови пациентов вносят в отдельную лунку. Надежность
иммуноферментного анализа можно повысить внесением каждой пробы в дубликатах.
Стрипы можно разделить на отдельные лунки. Это позволяет отмерить точное количество реагентов по
числу исследуемых образцов и снизить расход реагентов.
Как положительный, так и отрицательный контроли служат внутренними контролями правильной
постановки анализа. Контроли необходимо включать в каждую постановку анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полуколичественный анализ
Оценка результатов полуколичественного анализа производится путем расчета соотношения оптической
плотности контроля или исследуемого образца и оптической плотности калибратора 2. При вычислениях
руководствуются следующей формулой:
Оптическая плотность контроля или исследуемого образца
Оптическая плотность калибратора 2
= Соотношение
EUROIMMUN рекомендует следующую интерпретацию результатов:
Отношение (RATIO) < 1,0:
Отношение (RATIO) ≥ 1,0:
Отрицательный результат
Положительный результат
Количественный анализ
Для определения концентрации антител к глиадину в образцах по измеренной оптической плотности
строится калибровочная кривая. По оси Y откладывают линейные значения измеренной оптической
плотности 3 калибраторов, по оси X - соответственно линейные значения концентраций антител к глиадину
в этих калибраторах, затем соседние точки соединяются. Концентрации антител в исследуемых образцах
можно вычислить с помощью компьютера, используя способ расчета по кривой «от точки к точке».
Ниже приводится образец типичной калибровочной кривой. Пожалуйста, не используйте эту кривую для
определения концентрации антител к глиадину в образцах.
2,0
Оптическая плотность
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
ОЕд/мл
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
5
_____________________________________________________________________________________________________
Если значение оптической плотности исследуемого образца превышает значение оптической плотности
калибратора 1 (200 ОЕд/мл), результат записывают как “>200 ОЕд/мл”. Рекомендуется провести повторный
анализ этого образца после разведения его 1:800. Полученный при расчете по калибровочной кривой
результат в ОЕд/мл следует умножить на фактор разведения 4.
EUROIMMUN рекомендует верхний предел нормальных значений (значение cut-off или уровень
отсечения) равный 25 относительным единицам (ОЕд)/мл. EUROIMMUN рекомендует следующую
интерпретацию результатов:
< 25 (ОЕд)/мл
> 25 (ОЕд)/мл
отрицательный
положительный
При постановке анализа в дубликатах следует использовать среднее из значений в двух лунках. Если два
значения существенно отличаются друг от друга, анализ образца следует повторить.
При постановке диагноза наряду с серологическими результатами следует всегда учитывать и клинические
симптомы.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Калибровка
Поскольку не существует международной референтной сыворотки для антител к глиадину (GAF-3X), набор
откалиброван в относительных единицах (ОЕд).
Для каждой группы выполненных тестов значения оптической плотности калибраторов и значения в
относительных единицах и/или соотношения, определенные для положительного и отрицательного
контролей, должны укладываться в указанные для данной серии набора диапазоны. К набору прилагается
протокол, включающий эти целевые значения. Если значения концентраций контролей выходят за рамки
заданных диапазонов, следовательно результаты анализа могут быть недостоверными, и тест необходимо
повторить.
Активность использованного фермента зависит от температуры, поэтому значения оптических плотностей
могут изменяться, если не используется термостат. Чем выше комнатная температура (18-25 °С) во время
инкубации субстрата, тем будут выше значения оптической плотности. Сходные колебания связаны и с
изменением времени инкубации. Однако калибраторы, контроли и исследуемые образцы подвергаются
одним и тем же воздействиям, так что результаты оказываются в значительной степени
скомпенсированными при расчете по калибровочной кривой.
Антиген
На поверхности лунок стрипов иммобилизован искусственный пептидный антиген — аналог
дезаминированного глиадина. Пептид состоит из двух частей: 1) октапептида – аналога фрагмента
глиадина, эмпирически отобранного из тысяч вариантов по реактивности к сывороткам больных целиакией
и 2) нонапептида – аналога участка молекулы глиадина, дезаминированного тканевой трансглутаминазой
(т.е. остатки глутамина в нем заменены остатками глутаминовой кислоты). Этот участок имеет очень
большую патофизиологическую значимость в отношении целиакии, при этом его величина составляет не
более 10% от всей молекулы глиадина. В качестве антигена используется триммер этого пептида (GAF-3X),
что позволяет увеличить его способность выявлять связанные с развитием целиакии аутоантитела.
Линейность
Линейность ИФА определяли, используя 4 серийных разведения 5-ти образцов сыворотки крови пациентов.
Была подсчитана линейная регрессия и R2 был больше 0,95 для всех образцов. На рисунке ниже
приведены типичные кривые линейности для образцов сывороток крови 4 пациентов. ИФА набор Глиадин
(GAF-3X) IgG обладает линейностью в диапазоне концентраций 10–183 ОЕд/мл.
Аналитическая чувствительность
Предел определения антител к глиадину в ИФА наборе Глиадин (GAF-3X) IgG рассчитан на основании
значения оптической плотности образца, не содержащего аналита, плюс утроенное среднее квадратичное
отклонение, и является наименьшим определяемым титром антител. Минимальная определяемая
концентрация антител в ИФА наборе Глиадин (GAF-3X) IgG составляет 0,3 ОЕд/мл.
Перекрестная реактивность
Данный набор определяет специфичные антитела класса IgG к глиадину (GAF-3X). Не была обнаружена
перекрестная реактивность набора с сыворотками пациентов, содержащими антитела к бокаловидным
клеткам, поджелудочной железе, Saccharomyces cerevisiae.
Влияние гемоглобина, триглицеридов и билирубина
Не отмечено искажения результатов при исследовании данным набором гемолизированных, липемических
или желтушных образцов с концентрацией гемоглобина до 10 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и
билирубина – до 0,4 мг/мл.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
6
_____________________________________________________________________________________________________
Воспроизводимость
Воспроизводимость ИФА оценивали по коэффициенту вариации (CV) в пределах одной постановки и между
постановками, проводя повторные исследования 4 образцов сыворотки крови с различной концентрацией
антител. Коэффициент вариации в пределах одной постановки оценивали по 20 определениям,
коэффициент вариации между постановками – по 4 определениям, выполненным в течение 6 разных дней.
Вариабельность в пределах постановки,
n = 20
Сыворотка Среднее значение
CV
крови
(ОЕд/мл )
(%)
1
41
6,4
2
60
4,5
3
104
5,9
4
176
4,4
Вариабельность между постановками,
n=4х6
Сыворотка
Среднее значение
CV
крови
(ОЕд/мл )
(%)
1
42
11,4
2
61
4,6
3
104
5,3
4
174
4,1
Клиническая чувствительность и специфичность
Клиническую чувствительность анализировали с помощью набора Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG) на
панели образцов сыворотки крови пациентов с целиакией и герпетиформным дерматитом Дюринга.
Чувствительность составила 82,3%, а специфичность 95,9% (сыворотки пациентов с различными видами
гастроэнтеропатии, хроническими воспалительными заболеваниями кишечника, ревматическими
заболеваниями и аутоиммунными дерматозами).
Панель
n
Целиакия (0-18 лет, подтверждена биопсией)
Целиакия (1-54 лет, подтверждена биопсией)
Герпетиформный дерматит Дюринга
Чувствительность
Гастроэнтеропатии, отрицательная биопсия на целиакию
Хронические воспалительные заболевания кишечника,
отрицательная биопсия на целиакию
Ревматоидный артрит
Синдром Шегрена
Системная красная волчанка
Прогрессирующий системный склероз
Буллёзный пемфигоид (пузырчатка)
Линеарный IgA-дерматоз
Специфичность
183
58
36
277
243
55
Глиадин (GAF-3X)
положительный результат (IgG)
160 (87,4%)
55 (94,8%)
28 (77,8%)
82,3%
7 (2,9%)
0 (0,0%)
300
200
150
126
30
22
1126
3 (1,0%)
4 (2,0%)
7 (4,7%)
3 (2,4%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
95,9%
При проведении ROC анализа (значение AUC: 0,957) использовали результаты исследования 183
пациентов с целиакией (перечисленные в таблице выше) и 298 контрольных образцов (пациентов с
различными видами гастроэнтеропатии, хроническими воспалительными заболеваниями кишечника), при
этом были получены следующие данные:
cut-off
15,1 ОЕд/мл
33,3 ОЕд/мл
специфичность
95,0%
98,0%
чувствительность
96,0%
84,0%
Ожидаемые значения
Уровни антител (IgG) к глиадину (GAF-3X) анализировали с помощью набора EUROIMMUN Anti-Gliadin
(GAF-3X) ELISA (IgG) на панели сывороток 400 здоровых доноров крови в возрасте от 18 до 68 (176
женщин, 224 мужчины). Средняя концентрация антител к глиадину (GAF-3X) составила 3,4 ОЕд/мл, а
диапазон значений – от 0,2 до 94,4 ОЕд/мл. При уровне отсечения (значение cut-off) 25 ОЕд/мл 98,0%
доноров крови были анти-глиадин (GAF-3X) (IgG) отрицательными.
cut-off
13,8 ОЕд/мл
24,5 ОЕд/мл
процентиль
95
98
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
7
_____________________________________________________________________________________________________
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Высокочувствительные тест-системы Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA и EUROPLUS Anti-Gliadin (GAF-3X)
IIFT предназначены для выявления антител к участку молекулы глиадина, связанному с целиакией (CDAGA), при серодиагностике глютен-чувствительной энтеропатии (целиакии, нетропической спру) и
герпетиформного дерматита Дюринга. Целиакия – это аутоиммунное заболевание, обусловленное
генетической предрасположенностью и характеризующееся непереносимостью больными глютена.
Установлено, что после абсорбции в lamina propria слизистой оболочки желудка глиадин дезаминируется
тканевой трансглутаминазой (tTG), в результате чего некоторые остатки глутамина превращаются в остатки
глутаминовой кислоты. У больных с генетической предрасположенностью к целиакии пептидные участки
измененного таким образом глиадина связываются с молекулами HLA DQ2/DQ8 на поверхности антигенпрезентирующих клеток, в результате чего T-хелперы распознают этот антиген более эффективно. Это
приводит к запуску активной аутоиммунной реакции, приводящей патологическим изменениям в тканях. В
тонком кишечнике повреждение тканей выражено особенно сильно.
Компонентами этой иммунной реакции являются антитела к дезаминированному глиадину, тканевой
трансглутаминазе и эндомизию. Антитела к эндомизию, по-видимому, идентичны аутоантителам к
ретикулину (белку соединительной ткани), обнаруженным P.P.Seah в 1971 году, а также к тканевой
трансглутаминазе.
Распространенность глютен-чувствительной энтеропатии: от 1:300 (западная часть Ирландии,
Италия, США, Средний Восток, Индия, Куба) до 1:1000 (Германия, Австрия) и до 1:2000-1:4500 в других
европейских странах. Глютен содержится в различных злаковых культурах, например пшенице, ячмене,
ржи. Это смесь белков, которые можно разделить на две подгруппы: проламины (самый распространенный
– глиадин) и глутелины. Если больные целиакией употребляют в пищу содержащие глютен продукты, это в
конце концов приводит к атрофии слизистой оболочки тонкого кишечника, которая выглядит как гладкая
мозаичная поверхность, полностью лишенная ворсинок, но с видимыми глубокими криптами. Это, в свою
очередь, ведет к функциональным расстройствам. По классификации Марша гистопатологические стадии
изменений слизистой оболочки кишечника в процессе заболевания можно разделить на 3 уровня:
I уровень: слизистая оболочка имеет нормальную структуру, но увеличено количество межэпителиальных
лимфоцитов (МЭЛ, >40 МЭЛ/100 эпителиальных клеток).
II уровень: развивается гиперплазия крипт при сохранении нормальной структуры ворсинок.
III уровень: количество МЭЛ повышено, гиперплазия крипт, дегенерация эпителиальных клеток и атрофия
ворсинок.
Третий уровень по классификации Марша далее подразделяется на подтипы: IIIA – частичная
атрофия ворсинок, IIIB – выраженная атрофия ворсинок, IIIC – полная атрофия ворсинок.
Клиническая картина характеризуется слабостью (78%), урчанием (72%) и болями (64%) в области
живота, диареей (56%), нарушениями всасывания (44%), сопровождающимися потерей веса, анемией и
задержкой роста у детей, рвотой (16%), запорами (12%), ломотой в костях (12%). Некоторые пациенты с
глютен-зависимой энтеропатией также страдают от герпетиформного дерматита Дюринга – хронической
кожной болезни, характеризующейся образованием многочисленных пузырей. При продолжительном
течении целиакии, особенно у взрослых, риск возникновения опухолей, в частности, Т-клеточной лимфомы
тонкого кишечника, составляет около 10 %.
Если на фоне целиакии присутствуют другие аутоиммунные заболевания, примерно в 60% случаев
возникает гипофункция селезенки, причем независимо от того, как долго пациент соблюдает
безглютеновую диету. В особо тяжелых случаях целиакии риск увеличивается до 80%. Причиной
гипофункции селезенки, ассоциированной с целиакией, является дефицит IgM-продуцирующих Влимфоцитов памяти, которые играют важную роль в защите организма от бактерий, особенно
инкапсулированных (например, Streptococcus pneumoniae). В наиболее легких, протекающих без
осложнений и сопутствующих аутоиммунных заболеваний случаях целиакии вероятность развития
гипофункции селезенки составляет около 20%.
У больных с глютеновой атаксией (спорадической мозжечковой атаксией) — прогрессирующей
мозжечковой дисбазией, сопровождающейся всеобщим нарушением мышечного равновесия и потерей
ориентации в пространстве — антитела к глиадину обнаруживаются и в кишечнике, и в головном мозге. Это
подтверждает предположение, что глютеновая атаксия является аутоиммунным заболеванием и
принадлежит к той же группе, что и глютен-зависимая энтеропатия и герпетиформный дерматит Дюринга.
Распространенность бессимптомной глютеновой энтеропатии у женщин, страдающих
невынашиванием в первом триместре беременности, достаточно высока и составляет до 5% от всех
случаев. Так как соблюдение такими пациентками безглютеновой диеты создает возможность
благополучного исхода беременности, серологический скрининг чрезвычайно важен, особенно учитывая,
что по клиническим данным заболевание можно диагносцировать только у 10% больных.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
8
_____________________________________________________________________________________________________
Антигены системы HLA играют решающую роль в возникновении глютен-зависимой энтеропатии и
герпетиформного дерматита Дюринга, вследствие чего разная частота распространения определенных
комбинаций этих антигенов в разных географических регионах коррелирует с распространенностью
заболевания. Активность генов HLA-DQ2 и HLA-DQ8 являются причиной 40% генетической
предрасположенности.
Новый этап в развитии диагностики глютен-зависимой энтеропатии и герпетиформного дерматита
Дюринга возник после появления тест-систем для определения антител классов IgA и IgG, направленных к
эндомизию (непрямая иммунофлуоресценция, НРИФ), к глиадину и тканевой трансглутаминазе (ИФА), а
также к участку глиадина, связанному с целиакией (CD-AGA). Для последнего случая разработаны новые
высокоспецифичные тесты Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA и EUROPLUS Anti-Gliadin (GAF-3X) IIFT.
Серологические исследования дают возможность подтвердить клинический диагноз, а также
выявить предрасположенность родственников больных. Определение антител к глиадину также
используется для контроля эффективности лечения и безглютеновой диеты, а также при проведении теста
с введением в пищу глютена. Выявление характерного повышения или снижения титра антител к глиадину
позволяет избавить больного от необходимости дополнительной биопсии тонкого кишечника. Наличие
специфических антител у детей с глютен-чувствительной энтеропатией, находящихся на безглютеновой
диете, зависит от соблюдения ими предписанной диеты и составляет, по литературным данным, 15-30%.
Если после возвращения в диету глютена происходит рецидив заболевания, уровень IgA и IgG антител к
глиадину повышается в течение несколько дней.
В период острой фазы глютен-зависимой энтеропатии антитела класса IgA к эндомизию/тканевой
трансглутаминазе и (или) глиадину выявляются почти всегда. У IgA-отрицательных больных чаще, чем у
IgA-положительных, встречаются латентные формы заболевания (около 13%), рецидивирующие инфекции
(около 30%) и атопические заболевания (около 13%). У больных, не продуцирующих IgA антитела к
глиадину, титр антител IgG к глиадину очень высок почти в 100% случаев. Антитела класса IgM к глиадину
выявляются редко и, как правило, тогда, когда уже присутствуют IgG и IgA антитела, поэтому особенного
значения для диагностики не имеют.
Определение IgG и IgA антител к участку глиадина, связанному с целиакией (CD-AGA), —
высокочувствительный метод диагностики целиакии и герпетиформного дерматита Дюринга, с хорошим
соотношением «цена–качество» и не травматичный для больного. Он также дает информацию об
иммунологической ассоциации между целиакией и определенными аутоиммунными заболеваниями
(ревматоидный артрит, синдром Шегрена, системная красная волчанка, прогрессирующий системный
склероз, пузырчатка). Эта тест-система применима также при диагностике целиакии с гипофункцией
селезенки, бессимптомной глютеновой энтеропатии у женщин, приводящей к невынашиванию
беременности в первом триместре, и глютеновой атаксии. Кроме того, с ее помощью целесообразно
тестировать следующие группы риска:
• пациенты с атипичными симптомами (например, бесплодие, остеопороз);
• пациенты с заболеваниями, ассоциированными с целиакией и связанными с HLA-системой
(например, сахарный диабет 1 типа, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз печени);
• пациенты с генетическими заболеваниями, ассоциированными с целиакией (например,
недостаточность образования антител класса IgA, синдром Дауна);
• ближайшие родственники больных целиакией.
При лечении целиакии с использованием безглютеновой диеты концентрации IgA антител к
глиадину и эндомизию за несколько месяцев падают, причем уровень IgA антител к глиадину снижается
гораздо быстрее, чем уровень антител к эндомизию. Постоянно повышенный уровень IgA антител к
глиадину свидетельствует о несоблюдении безглютеновой диеты.
Если IgA антитела к глиадину определяются у здоровых детей с нормальной глютен-содержащей
диетой, анализ необходимо повторить через три месяца. В случае, если есть подозрения на глютенчувствительную энтеропатию, а уровни IgA антител к глиадину и эндомизию низкие, возможна общая
недостаточность IgA антител. В этом случае проводят определение общего уровня IgA антител.
В большинстве исследований тесты на определение специфических IgA антител к
эндомизию/тканевой трансглутаминазе показывают высокочувствительные и высокоспецифичные
результаты (более 95% для обоих параметров). Хорошие результаты были получены при исследовании и
детей, и взрослых. При анализе образцов от больных с нелеченной целиакией из Италии и Бельгии
выявлено, что специфические IgA антитела к эндомизию обнаруживаются в 95% случаев.
Использование нового синтетического антигена, сконструированного на основе последних научных
данных и при помощи самых современных технологий, для тест-систем Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA и
EUROPLUS Anti-Gliadin (GAF-3X) IIFT, позволило повысить их специфичность почти до 100%. Этот антиген
— рекомбинантный пептидный аналог глиадина; положительная реакция с ним возникает только при
наличии целиакии и герпетиформного дерматита Дюринга. У здоровых лиц или больных другими
заболеваниями желудочно-кишечного тракта реакция в этих тест-системах всегда отрицательная. Пептид
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
9
_____________________________________________________________________________________________________
состоит из двух компонентов: дезаминированного эпитопа глиадина длиной в 9 аминокислотных остатков и
искусственного глиадин-гомологичного октапептида. Ранее для определения антител к глиадину в качестве
антигена использовали полноразмерный глиадин. Однако в последнее время было показано, что только
десятая часть молекулы глиадина имеет патофизиологическую и диагностическую значимость. Антитела к
этому участку молекулы глиадина образуются только у пациентов с целиакией, у здоровых людей их нет.
Оставшиеся 90% молекулы составляют аминокислотные последовательности, для диагностических целей
не нужные и являющиеся причиной неспецифических реакций. В большинстве современных тест систем
(выявляющих CD-AGA) эта часть молекулы не используется, что приводит к значительному увеличению
специфичности анализа.
Определение IgG антител к целой молекуле глиадина с использованием традиционных тест-систем
для диагностики целиакии бесполезно, так как четверть всего населения демонстрирует положительную
реакцию в этом тесте. Определение IgA антител с использованием таких тест-систем также недостаточно
специфично; кроме того, в этом случае не выявляются больные целиакией с общей недостаточностью
продукции IgA антител (состояние, часто ассоциированное с целиакией). При использовании тест-систем,
выявляющих антитела к антигену CD-AGA, обычно достаточно определять только антитела класса IgG;
таким образом можно диагносцировать целиакию и у больных с дефицитом IgA антител. Но для надежной и
исчерпывающей диагностики рекомендуется проводить определение антител к CD-AGA и класса IgG, и
класса IgA.
Результаты исследования панели сывороток больных целиакией из Института Лабораторной
медицины (Лейпциг, Германия) набором Anti-Gliadin (GAF-3X) ELISA показали, что чувствительность тестсистем составляет 83% (IgA) и 95% (IgG), специфичность – 95% (и для IgA, и для IgG); для сравнения,
традиционные тест-системы с целой молекулой глиадина в качестве антигена (anti-gliadin ELISA) имели
специфичность 54% (IgA) и 31% (IgG). Эти результаты были представлены на 10-м Семинаре по
аутоантителам и аутоиммунным реакциям (Гвадалахара, Мексика) в марте 2008 года. При исследовании
образцов сывороток больных герпетиформным дерматитом Дюринга (n=36) с помощью нового набора были
получены следующие результаты: чувствительность – 83% (IgA) и 78% (IgG), что на 30% выше, чем
чувствительность системы anti-gliadin ELISA с целой молекулой глиадина в качестве антигена (55% для IgA,
50% для IgG).
Параллельное определение антител к CD-AGA и антител к эндомизию/тканевой трансглутаминазе
(IgG, IgA) позволяет провести достоверную диагностику целиакии и герпетиформного дерматита Дюринга, а
также целиакии с гипофункцией селезенки, бессимптомной глютеновой энтеропатии у женщин, приводящей
к невынашиванию беременности в первом триместре, и глютеновой атаксии.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-Gliadin(GAF-3X)-EV 3011-9601G_rus.doc
11/11/2009 1:35:00 PM
Оригинал
EV_3011G_A_UK_C04.doc Version: 12.08.2009 15:31
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru