ПОЛУЧЕНИЕ ППЗ-ПОДОБНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЭМБРИОНОВ

ÁÈÎÒÅÕÍÎËÎÃÈß
(ИП=4,16, жизнеспособность 98%).
После частотно-резонансного воздействия на контаминированные клетки
HeLa отмечалось значительное снижение ИП до 1,3 и жизнеспособности
до 85% по сравнению с контролем
(ИП=1,9, жизнеспособность 93%).
Эти клетки были не способны к дальнейшему пассированию.
Учитывая полученные данные,
мы внесли некоторые изменения в
условия опыта. Так, частотно-резонансное воздействие проводили не на
монослой клеток, а на их суспензию,
оставив тот же режим облучения, но
провели его в инверсии (противофазе). В данных экспериментах также
наблюдалось снижение индекса пролиферации контаминированных клеток HeLa в 2 раза (ИП=2,0 при контрольном значении ИП=4,0). Однако
в этих опытах жизнеспособность клеток оставалась такой же, как в контроле (99%). Клетки HeLa не содержали
микоплазм на протяжении 4-х пас-
сажей, и не утратили способности к
дальнейшему пассированию, хотя и
более замедленному. Так, максимальный монослой клеток отмечался на 5-е
сутки по сравнению с контролем, в котором полный монослой клеток образовывался на 3-е сутки.
Выводы:
1. В результате экспериментов,
проведенных на модели клеток HeLa
in vitro, отмечено существенное подавление микоплазменной контаминации в течение 4-х пассажей. При этом
морфологическая картина культуры
клеток HeLa полностью нормализовалась.
2. Наиболее оптимальными условиями для подавления микоплазм в
инфицированных клетках с помощью
частотно-резонансного метода является применение программ F 44 и 45
с интенсивностью 100 У.Е. с добавлением F программ для регенерации
клеток с частотами 97,5 и 69,5 Гц интенсивностью 30 У.Е. в противофазе.
THE USE OF BIORESONANCE METHOD FOR THE DECONTAMINATION
OF CELLS FROM MYCOPLASMES
Podchernjaeva R.Ya., Danlibaeva G.A., Mikchailova G.R., Khizhniakova T.M., Melnichenko
E.I., Osipova O.V.
The D.I. Ivanovski s Institute of virology RAMN
Summary
In result of experiments with cells HeLa
four subcultivations. Morphologic picture
in vitro was note essential suppression of
of cell culture HeLa in that time was fully
mycoplasma contamination in course of
normal.
Литература
1. ”Экзогенная биорезонансная терапия аппаратами “Мини-эксперт-ДТ” и “Мини-эксперт-Т”. Инструкция пользователя. “Имедис”, 2000. 86 с.
2. Осипова О.В., Алимбарова Л.М., Подчерняева Р.Я., Баринский И.Ф. Влияние био-
резонансного излучения на репродукцию
вируса простого герпеса в опытах ин витро.
VIII Международная конференция «Теоретические и клинические аспекты применения биорезонансной и мультирезонансной
терапии». Ч.II.М., 2002. С. 350-352.
УДК 619:616.98.578/579.573.086.83
ПОЛУЧЕНИЕ ППЗ-ПОДОБНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЭМБРИОНОВ
КРОЛИКА НА СТАДИИ ГАСТРУЛЯЦИИ И ИХ КУЛЬТУРАЛЬНОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
М.А. Селюгин
ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко
(ВИЭВ), г. Москва
Изучали факторы, влияющие на получение примордиальных половых зародышевых
клеток (ППЗК) кролика. Для выделения ППЗ-подобных клеток кролика были использова-
Ветеринарная патология. № 1. 2003.
57
ÁÈÎÒÅÕÍÎËÎÃÈß
ны ферментативная и механическая диссоциации эмбрионов на стадии гаструляции. ППЗподобные клетки культивировали в среде ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5 г\л)
+ 15% СПК. Культивирование проводили без заранее приготовленных фидерных слоев на
собственных митотически активных эмбриональных фибробластоподобных клетках. При
культивировании ППЗ-подобных клеток кролика получено 4 штамма ЭС-подобных клеток.
Эмбриональные стволовые клетки
(ЭСК), в том числе и примордиальные половые зародышевые клетки
(ППЗК), разновидность ЭСК, широко используются в биотехнологии
для изучения процессов цитодифференцировки как источник уникальных тотипотентных ядер при реконструировании новых клеточных типов посредством клонирования, получении трансгенных животных, для
скрининга лекарственных препаратов
и в других исследованиях. ППЗК используются также при изучении гаметогенеза.
Если ППЗК мыши стали постоянным объектом биологических и
генно-инженерных исследований, то
проблема получения и изучения таких клеток сельскохозяйственных
животных далека от разрешения. В
литературе имеются сведения о работе с ППЗК свиньи [1, 12, 13], кролика
[8], кур [11] и крупного рогатого скота
[10]. Как правило, для этих целей используют плоды на стадии органогенеза, когда данные клетки локализуются в гонадах [1, 8]. В ходе нашей
работы возник интерес исследовать
возможность получения аналогичных
клеток от эмбрионов на более ранних
стадиях развития. Мы попытались
выделить ППЗК из гаструл кролика.
В литературе отсутствуют данные по
изоляции таких клеток на этой стадии
развития зародыша. Известно, что закладка ППЗК мыши идет на стадии
гаструляции (Гилберт С., 1995), однако четких данных о времени появления этих клеток в зародыше кролика
мы не нашли, поэтому эксперименты
по выделению ППЗК из гаструл носили поисковый характер.
Материалы и методы.
Работу проводили в лаборатории клеточной биотехнологии ГНУ
58
ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.
В целях проведения данного опыта была разработана следующая схема. После осеменения самок естественным путем убой производили на
9 сут. В течение 20 минут после убоя
удаляли матку с яичниками и яйцеводами в боксе из освежеванной тушки
крольчихи. После извлечения производилось вскрытие матки стерильными инструментами и перенос гаструл
в стерильные чашки Петри d=100 мм.
Качество зародышей оценивалось посредством визуально-морфологического анализа. Критериями качества
гаструл служили: соответствие стадии развития возрасту эмбрионов, наличие оболочки Рейхерта, разделение
яйцевого цилиндра на три камеры,
отделенные друг от друга будущими
амнионом и хорионом и отсутствие
явных признаков их дегенерации.
Для культивирования эмбриональных клеток использовали среду
ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), дополненную 15% сыворотки плода коров (СПК), 2мМ αглутамином и гентамицином (конечная концентрация 50 мкг/мл) и другие вспомогательные растворы для
получения первичной культуры, диссоциации монослоя клеток и т.д.
Для получения первичной культуры, использовали механическую и
ферментативную дезагрегации. Эмбрионы делили на две равные группы, производили измельчение гаструл, одну часть зародышей заливали
средой ДМЕМ + 100Ед\мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и
механически диспергировали до появления характерной аполлисценции.
После центрифугирования полученной суспензии осадок ресуспендировали в ростовой среде и высаживали
на 4-луночные планшеты в конценВетеринарная патология. № 1. 2003.
ÁÈÎÒÅÕÍÎËÎÃÈß
5
Таблица
трации 5×10 клеток на
Выделение ППЗК кролика
лунку (d=15мм) для субЧисло штамДлителькультивирования.
Способ Количество мов
ЭС-подобность
культиВторую группу фраг- получения
гаструл
ных клеток
вирования
ментов гаструл ферментативно диссоциировали Механиче9
2
2 пассажа
раствором коллагеназы ская дезагрегация
(конечная концентрация
1 мг/мл). После инакти- Фермента8
2
3 пассажа
вации фермента прово- тивная дезагрегация
дили манипуляции, описанные ранее.
сажей. В результате мы не увидели
Весь полученный материал стави- существенных различий между двули на культивирование в инкубатор мя способами получения, что может
при определенной влажности, темпе- свидетельствовать о пригодности как
ратуре 37°С и 5% СО2 в воздухе.
механической, так и ферментативной
Результаты.
диссоциации эмбрионов на стадии
Сравнение способов получения гаструляции для выделения гоноциППЗ-подобных клеток кролика
тов кролика.
Для изоляции ППЗ-подобных клеХарактеристика первичных культок кролика из эмбрионов на стадии тур клеток кролика, выделенных из
гаструляции было использовано два гаструл
метода, которые предлагаются мноВ этой серии экспериментов мы
гими авторами для выделения ППЗК немного отошли от общепринятой
из половых желез плодов животных методики получения и культивиро[1, 3, 5, 9]:
вания ППЗК, пытаясь упростить ма- механическая дезагрегация;
нипуляции. Суспензии полученных
- ферментативное диспергирова- клеток эмбрионов мы высаживали
ние.
на культуральную посуду без зараКак видно из результатов, пред- нее приготовленных фидерных слоев.
ставленных в таблице, эти два спо- Среда для культивирования не содерсоба показали пригодность в этой жала ростовых факторов, используесвязи.
мых обычно для культивирования таВ обоих случаях было получено ких клеток.
по два штамма ЭС-подобных клеток,
В результате на 2–3 сутки поверх
длительность культивирования кото- прикрепившихся митотически активрых достигала максимально трех пас- ных фибробластоподобных клеток
обнаруживались лежащие одиночно
или группами клетки с ППЗ-подобной морфологией, сферической формы, которые имели малый диаметр
(~10 мкм), высокое ядерно-цитоплазмотическое соотношение. В дальнейшем эти клетки пролиферировали, давая колонии ЭС-подобных клеток. К
5–7 суткам колонии таких клеток достигали довольно крупных размеров
и насчитывали около 100–150 клеток
(рис. 1).
Рис. 1. Колония ЭС-подобных клеток кроТакая картина наблюдалась максилика, 0 пассаж (микрофото, нативный
мально в течение трех пассажей. При
препарат, увеличение 10×20).
Ветеринарная патология. № 1. 2003.
59
ÁÈÎÒÅÕÍÎËÎÃÈß
дальнейшем культивировании колонии клеток с морфологией подобной
ЭСК не обнаруживались, а культура
была представлена в основном фибробластоподобными клетками.
При достижении высокой плотности клеток в ЭС-подобных клонах наблюдалось начало дифференцировки,
в результате которой образовывались
«первичные» (рис. 2), а за тем и «цистические» ЭТ, что свидетельствует о
плюрипотентности полученных клеток.
Заключение
В результате мы показали возможность получения ППЗ-подобных
клеток из эмбрионов кролика на стадии гаструляции, причем предложили простой, а может, и оптимальный
способ их выделения для создания
штаммов ЭС-подобных клеток. Большинство авторов используют для таких целей заранее заблокированные
фидерные слои [1, 2, 4, 7]. Что имеет
ряд неудобств (работа с дополнительным объемом клеточных культур, необходимость временного сопоставления графиков культивирования
фидерных слоев и проведения основных экспериментов, дегенеративные
изменения в клетках на 8-10 сут. после подавления митотической активности). В наших экспериментах мы
предложили способ культивирования
ППЗ-подобных клеток без заранее
приготовленных фидерных слоев на
собственных митотически активных
эмбриональных фибробластоподобных клетках.
И хотя нам не удалось определить
точную природу полученных культур и доказать тотипотентность выделенных клеток, ряд характеристик,
таких, как морфология, степень пролиферации, способность образовывать эмбриоидные тела при индукции
к дифференцировке, позволяют нам с
уверенностью сказать, что выделенные клетки обладают плюрипотентными свойствами, т.к. есть мнение,
что способность клеток образовывать эмбриоидные тела является подтверждением их плюрипотентности
[6]. Таким образом, можно предположить, что условия, используемые
в наших экспериментах, могут быть
применимы для получения новых линий ЭСК кролика.
Приведенные нами данные свидетельствует о необходимости дальнейшего глубокого анализа этой проблемы
и совершенствования методов культивирования с целью получения постоянных тотипотентных, протестированных участием в получении химерного
потомства, линий ЭСК кролика.
Several factors, which were affected the
obtaining of rabbit’s PGC, were studied. In
order to extract PG-like cells of rabbit fermentative and mechanical dissociation of
gastrula were used. PG-like cells were cultivated in the medium DMEM with high glu-
cose content (4,5 g/l) + 15% FCS. Cultivation
was carried out without pre-prepared feeder
layers on the own mitotic active embryonic fibroblast-like cells. 4 strains of EG-like cells
were obtained by the cultivation of rabbit’s
PG-like cells.
Рис. 2. Первичное ЭТ кролика (микрофото, нативный препарат, увеличение
10×20).
Литература.
1. Приданцева Т.А. Выделение и характеристика примордиальных половых зародышевых клеток свиньи. Дис. канд. биол. наук.
Дубровицы, 2001. 110 л.
2. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и буду-
60
щее. Дубровицы, 1999. 95 с.
3. Buehr M., McLaren A. Isolation and culture
of primordial germ cells. // Methods Enzymol.
1993, V. 225. P. 58-77.
4. Chen L.R., Shiue Y.L., Bertolini L. et al. Establishment of pluripotent cell lines from porcine
Ветеринарная патология. № 1. 2003.
ÁÈÎÒÅÕÍÎËÎÃÈß
preimplantation embryos. // Theriogenology,
1999, V. 52, N. 2. P. 195-212.
5. De-Felici M., Pesce M. Growth factors in
mouse primordial germ cell migration and proliferation. // Prog. Growth Factor Res. 1994, V.
5. P. 135-143.
6. Evans M.J., Notarianni E., Laurie S., Moor
R.M. Derivation and preliminary characterization of pluripotent cell lines from porcine and
bovine blastocysts. // Theriogenology, 1990, V.
33. P. 125-128.
7. Hochereau-de Reviers M.T., Perreau C. In vitro culture of embryonic disc cells from porcine blastocists. // Reprod. Nutr. Dev. 1993. V.
33, N. 5. P. 475-483.
8. Jianch i Ding, Hahnel A.C., Keith J.B. Isolation of germ cells from rabbit fetal gonads
– Theriogenology, 1995, V. 25. P. 196.
9. Koshimizu U. Retinoic acid is a potent growth
activator of mouse primordial germ cells in vitro. // Dev. Biol. 1995. V. 168. P. 683-685.
10. Lavoir M. -C., Basrur P.K., Betteridge K.J.
Isolation and identification of bovine fetal
germ cells // Mol. Reprod. Dev. 1994. V. 37.
P. 413-424.
11. Park T.S., Han J.Y. Derivation and characterization of pluripotent embryonic germ cells in
chicken. // Mol. Reprod. Dev. 2000. V. 56. N.
4. P. 475-482.
12. Piedrahita J.A., Moor K., Oetama B. et
al. Generation of transgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived
colonies. // Biol. of reprod. 1998. V. 58. P.
1321-1329.
13. Shim H., Guterrez-Adan A., Chen L.R. et al.
Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells. // Biol.
Reprod. 1997. V. 57. N. 5. P. 1089-1095.
УДК 619:616.5.002.828
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА
И.А. Новикова, Г.И. Ронь, С.Ю. Медведева, Н.П. Глинских,
А.А. Бахарев, И.В. Устьянцев
Уральская государственная медицинская академия
Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций
(ТЕЗИСЫ)
За последние два десятилетия появилось много сообщений о развитии новых медицинских технологий,
основанных на применении живых
клеточных культур — аллофибробластов в различных областях медицины.
В пародонтологии опыт применения аллофибробластов на сегодняшний день незначителен. Применение
в хирургической пародонтологии
культивируемых аллофибробластов в
качестве оптимизаторов раневого заживления обусловлено высокой терапевтической эффективностью фибробластов: стимуляцией ими белкового
синтеза, выделением факторов роста
и усилением регенерации тканей.
Целью проведенного нами экспериментального исследования явилось
изучение процессов репаративной
регенерации тканей пародонта при
Ветеринарная патология. № 1. 2003.
использовании различных материалов, способствующих направленному
остеогенезу и стимуляции восстановительных процессов в тканях пародонта.
В эксперименте было использовано 45 белых крыс линии Вистар массой тела около 250 граммов. Первоначально у всех животных было произведено моделирование пародонтитоподобных изменений в области
нижних резцов.
На 14 сутки после моделирования
проведено введение в пародонтальные карманы различных видов остеопластических препаратов с целью
изучения динамики репаративных
процессов тканей пародонта.
Предусматривалось 3 схемы послеоперационного ведения крыс.
1 группу исследования составляли
животные с имплантацией компози61