Особенности преаналитической стадии при проведении

АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
Особенности преаналитической стадии
при проведении гематологических
и цитохимических исследований
Горностаев С. Н. (СанктПетербург)
орфологическая диагностика заболеваний от
личается наибольшей достоверностью и многие
старые и новые методы лабораторной диагнос
тики, имеющие очень большое значение, особенно в сово
купности, не могут исключить морфологические методы
исследования из клинической практики. Вместе с тем
морфологические исследования в клинике приобретают
особую значимость, если анализируются в сопоставлении
со всеми данными клиники во всем их объеме.
Чтобы максимально обеспечить интересы клиники,
интересы конкретного больного человека, морфологичес
кий диагноз должен быть предельно точным и объектив
но отражающим особенности конкретного заболевания.
В настоящее время успехи в обеспечении здоровья на
селения во многом зависят от проведения массовых про
филактических осмотров и в первую очередь групп с по
вышенным риском различными заболеваниями, особенно
злокачественными новообразованиями.
Важным аспектом клинического обследования явля
ется внимательное и полное изучение клеточной морфо
логии. Почти каждое заболевание, поражающее клетки
крови, может быть визуализировано либо в форме цито
логических изменений морфологии клеток, либо сдвига
ми распределения разных типов клеток. Разные области
медицины объединяют методы исследований и постанов
ки диагноза, а именно – морфологический анализ окра
шенных препаратов с помощью микроскопов.
Хорошо известно, что правильная и качественная
окраска мазков крови и костного мозга имеет большое зна
чение для точной оценки изменений морфологии клеток.
В связи с этим качественные препараты периферической
крови и костного мозга играют важную роль в диагностике
и контроле лечения гематологических заболеваний.
Морфологический анализ включает в себя три основ
ных пункта:
• преаналитический этап (подготовка пациента к ис
следованию, забор биоматериала, подготовка препа
рата)
• аналитический этап (фиксация и окрашивание)
• постаналитический этап (микроскопическое иссле
дование клеточных элементов)
М
Приготовление препаратов возможно двумя способа
ми: ручным и с помощью автоматов и центрифуг. Сущес
твующие автоматические устройства для приготовления
и окраски мазков позволяют стандартизовать условия
и повысить качество препаратов, однако автоматический
способ пока не нашел широкого распространения в на
ших лабораториях, поэтому напомним некоторые посту
латы «ручного» метода. Не касаясь вопросов, как подго
товка пациента к забору биоматериала, непосредственно
забор биоматериала и доставка к месту исследования, ко
торые сами по себе очень важны, коснусь вопросов даль
нейшего использования полученных материалов.
Особенности преаналитического этапа при гематоло
гических и цитохимических исследованиях состоят из:
1. Правильной и качественной подготовки стекол для ис
следования.
2. Правильно приготовленного препарата.
3. Правильно подобранном и использованном антикоагулянте
4. Условий хранения нефиксированных препаратов
5. Подбор фиксаторов и красителей для фиксации и окрас
ки препаратов, режимов для фиксации и окраски
6. Использование «забуференной» воды для приготовле
ния рабочих растворов.
I. Правильная и качественная
подготовка стекол для исследования.
Правильная оценка морфологических особенностей
возможна лишь на хорошо приготовленных и надлежа
щим образом окрашенных мазках. То есть стекла не толь
ко должны быть хорошо отмыты, но и обезжирены. Это
касается как новых, а тем более уже использованных, что
чаще встречается. Предметные и покровные стекла долж
ны быть безупречно вымыты и обезжирены. В настоящее
время российскими производителями предметные стек
ла, не нуждающиеся в обезжиривании, не выпускаются.
Импортные стекла, не нуждающиеся в очистке и обезжи
ривании имеют маркировку «pre cleaned».
Новые стекла могут использоваться без предваритель
ной обработки, необходимо лишь обезжиривание в смеси
состоящей из равных частей спирта и эфира. Ранее исполь
зованные стекла замачиваются в растворе стирального
29
АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
порошка или мыла с перекисью водорода, после чего, спус
тя сутки, промываются проточной водой, заливаются рас
твором стирального порошка или мыла и доводят до кипе
ния, по окончании процедуры промывают проточной водой
с щеткой, высушиваются и опять же помещаются в смесь
спирта и эфира. Ранее для подобных целей использовалась
смесь Никифорова, представляющая смесь этанола+диэти
лового эфира в пропорции 1:1, однако изза возможного
воспламенения реагентов, входящих в ее состав, от нее при
шлось отказаться. В настоящее время компания «Абрис+»
предлагает смесь для обезжиривания, не уступающую по
своим свойствам прежней смеси Никифорова. В такой сме
си происходит окончательное обезжиривание стекол, после
чего стекла необходимо извлечь, просушить или протереть
чистой, безворсистой тканью и хранить в чистом месте.
В дальнейшем стекла извлекаются по мере надобности и,
по возможности, не касаясь поверхности стекол.
При сильных загрязнениях предметных стекол можно
воспользоваться следующей методикой – обработка сер
ной кислотой, затем кипячение 1015 мин в 25%ном рас
творе соды, после тщательно промывают водой и помеща
ют в смесь для обезжиривания.
Для проверки качества очистки и обезжиривания
можно капнуть дистиллированной водой на предметное
стекло, на хорошо очищенном и обезжиренном стекле
капля растекается, если недостаточно обезжиреновода
собирается в капли. Возможно также воспользоваться так
называемой фенолфталеиновой пробой, предназначен
ной для определения остаточных количеств щелочных
компонентов моющих препаратов на изделиях медицин
ского назначения.
На контролируемое изделие (предметное стекло) на
носят 23 капли спиртового раствора фенолфталеина или
протирают его тампоном, смоченном в реактиве. При на
личии на изделиях медицинского назначения остатков
моющих средств раствор фенолфталеина окрашивается
в розовый цвет.
II. Правильное приготовление препарата.
Правильно и хорошо сделанный мазок крови является
совершенно необходимым условием для получения дос
товерных результатов при подсчете лейкоцитарной фор
мулы и изучении морфологии клеток крови.
Чем меньше угол, тем тоньше мазок. Вторым парамет
ром, с помощью которого можно изменить толщину маз
ка, является скорость движения шлифованного стекла:
чем медленнее движение, тем тоньше мазок. Начинать
движение следует плавно, существенно ускоряя его
к концу. Объем наносимой крови должен быть таким, что
30
бы она полностью размазывалась, и мазок заканчивался
на расстоянии приблизительно 1 см от края стекла.
При изготовлении мазка для подсчета лейкоцитарной
формулы угол наклона стекла должен составлять 240, а вре
мя движения по предметному стеклу 1 сек. Оптимальный
объем наносимой крови составляет в этом случае 4 мкл.
Для получения мазка в виде монослоя угол наклона
следует уменьшить до 160, скорость движения замедлить
до 2 сек, каплю крови уменьшить до 3 мкл.
На сухое предметное стекло, ближе к короткой сторо
не наносят пипеткой небольшую каплю крови. Предмет
ное стекло следует держать на столе или в левой руке за
узкие края. Правой рукой приставить шлифованное стек
ло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под уг
лом менее 45° и продвинуть его вправо до соприкоснове
ния с каплей крови. Выждать до тех пор, пока кровь
расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и за
тем легким быстрым движением провести его справа на
лево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля
крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы
весь мазок помещался на стекле, не доходя 1 – 1,5 см до
его края. Нельзя сильно нажимать на стекло, так как мно
гие клетки крови могут оказаться поврежденными. Хоро
шо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет
и оканчивается «метелочкой».
После приготовления мазки следует быстро высушить на
воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном
высыхании может изменяться морфология клеток крови
Приготовление препаратов костного мозга аналогич
но приготовлению препаратов периферической крови.
Хорошо сделанный мазок должен отвечать следую
щим требованиям:
• должен быть равномерно тонким, желтоватого цве
та, достаточной величины, т.е. располагаться на 1
1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчи
ваться «метелочкой».
• быть равномерной толщины, толстые, густорозовые
мазки не следует использовать, т.к. в них морфоло
гия клеток плохо различима.
• быть свободным с края
III. Правильно подобранный
и использованный антикоагулянт
Одним из важных условий взятия крови при гематоло
гических исследованиях является использование веществ,
препятствующих свертыванию крови и увеличивающих со
хранность клеток в течение длительного времени – антико
агулянтов. Основные антикоагулянты – соли ЭДТА, цитрат
натрия, оксалат натрия, кислая цитрат дестроза и гепарин.
АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
Нужно обязательно помнить, что несоответствие кон
центрации антикоагулянта к объему взятой крови, недо
статочно тщательное смешивание могут привести к зна
чительным ошибкам, в том числе повлечь за собой
неточное определение концентрации клеточных элемен
тов, искажение морфологической структуры клеток.
Кровь с антикоагулянтом может сохраняться при 40С
в течение 24 часов без какихлибо существенных измене
ний числа и морфологии клеток. Тем не менее, гематоло
гические исследования рекомендуется проводить как
можно раньше, так как патологические клетки часто ме
нее устойчивы к хранению.
Кроме этого, несоответствие концентрации антикоа
гулянта к объему взятой крови, недостаточно тщательное
смешивание могут привести к значительным ошибкам,
в том числе повлечь за собой неточное определение кон
центрации клеточных элементов, искажение морфологи
ческой структуры клеток.
В настоящее время, в качестве антикоагулянтов ис
пользуются соли ЭДТА (минимальное изменение клеточ
ной морфологии), цитрат натрия (только для СОЭ), окса
лат натрия (подсчет количества клеток и иследование
морфологии), кислая цитрат декстроза (смесь веществ,
используемая в качестве антикоагулянта и консерванта
при исследовании морфологии клеток крови и при цито
химических исследованиях), гепарин (являясь неодно
родным химическим веществом, влияет на цвет и окраску
клеток крови в мазке). Так как патологические клетки не
устойчивы не только к хранению, но и к действию антико
агулянтов, особо касаемо цитохимических исследований,
исследования необходимо проводить как можно раньше.
После приготовления мазки следует быстро высушить
на воздухе до исчезновения влажного блеска. При мед
ленном высыхании может изменяться морфология кле
ток крови. Мазки должны быть хорошо высушены на воз
духе, что позволит избежать сморщивания и смывания их
со стекла во время фиксации.
Препараты фиксируют сразу после высушивания на
воздухе.
Мы подошли к главному вопросу в процессе приго
товления препаратов, это выбор красителей.
Серия «ДиахимГемистейн», включившие в свой со
став: красителификсаторы по МайГрюнвальду, типа
Лейшмана, а также краситель по Романовскому двух ква
лификаций – «профессионал», предназначенный для
окраски периферической крови, костного мозга, различ
ных биоматериалов, для докрашивания хромосом и т. д.,
и «классик» – предназначенный для окраски перифери
ческой крови.
Результатом проделанной работы явились следующие
выводы:
наилучшим способом окраски препаратов периферичес
кой крови и костного мозга, а также лимфатических узлов
красителями серии «ДиахимГемистейн», производства
фирмы «Абрис+» можно считать метод ПаппенгеймаКрю
кова, а именно: комбинированная окраска фиксаторомкра
сителем по МайГрюнвальду и красителем Романовского.
Рекомендуется погружать мазки в фиксатор и выдерживать
в течение 2 минут. В качестве фиксатора можно использо
вать и фиксаторкраситель типа Лейшмана в течение 3 ми
нут. Последующую докраску производить раствором краси
теля по Романовскому производства нашей фирмы.
Ценным качеством красителей фирмы «Абрис+» явля
ется возможность использовать фиксаторкраситель по
МайГрюнвальду в качестве фиксатора и для последующе
го докрашивания мазков. Данный краситель был успешно
использован и для окраски мазков крови и костного мозга
в аппарате «НЕМА ТЕК» фирмы «Bayer» вместо стандарт
ной краски, предлагаемой в наборах к названному аппарату.
Разные биоматериалы требуют своего режима окрас
ки. Так для окраски выпотных жидкостей лучшим, по на
шему мнению является фиксатор по МайГрюнвальду,
причем фиксация длится не более 1 минуты, с последую
щей окраской красителем по Романовскому в разведении
1: 10 и даже 1: 15 в течение 3 мин.
Обращаем ваше внимание на то, что каждая новая
партия красителя требует отработки своего режима
окраски, даже если они применяются для одного и того
же биоматериала. Препараты костного мозга и лимфати
ческих узлов требуют индивидуального подхода к режи
му окраски в зависимости от клеточности материала.
Правильно окрашенный препарат внешне имеет неж
ный красноваторозовый цвет с фиолетовым оттенком;
яркокрасный цвет мазка свидетельствует о присутствии
кислот в воде или посуде, слишком синий или грязнова
тофиолетовый – об избытке щелочи. Слишком продол
жительное окрашивание дает также фиолетовый цвет,
слишком кратковременное – чистый красный цвет. Уже
по этим макроскопическим приметам можно судить
о правильности окрашивания.
Окраска ретикулоцитов
При многих гематологических заболеваниях необходимо
оценить эффективность эритропоэза. Постоянство процента
ретикулоцитов крови в норме позволяет по количеству рети
кулоцитов судить об интенсивности эритропоэза. Одним из
очень информативных, но крайне «капризных» исследова
ний является подсчет ретикулоцитов. Время созревания
31
АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
ретикулоцитов составляет 4,5 дня, из них в течение 23 дней
они созревают в периферической крови. Название обуслов
лено присутствием в цитоплазме сетчатого вещества – рети
кулофиламентозной субстанции, представляющие собой
остатки РНК и митохондрий. Эта субстанци выявляется при
суправитальной (без предварительной фиксации) окраске
клеток. Существуют два вида окраски клеток крови:
• на чистое и ровное и слегка подогретое предметное
стекло наносится краситель, так же как это делается с кро
вью при получении мазков. Краска ложится тонким слоем,
придающим стеклу лиловатый оттенок. На таком окрашен
ном стекле делается обычным способом мазок исследуемой
крови и стекло с влажным мазком немедленно помещается
во влажную камеру, где и остается 1520 минут, лучше до
полного высыхания препарата, после чего исследуется под
микроскопом. Однако этот способ очень трудоемок и не
всегда с его помощью получаются препараты, пригодные
для исследования, поэтому в нашей фирме разработан кра
ситель для суправитальной окраски ретикулоцитов проби
рочным способом «ЦитоСтейнРТК». Способ окраски:
• смешать в пробирке раствор красителя и кровь в со
отношении 1:1 – 1:4.Выдержать при комнатной темпера
туре в течении 3040 минут. Приготовить мазки и микро
скопировать.
Цитология – область, где традиционно реагенты гото
вились в лабораториях, предавая рецептуру и секреты из
поколения в поколения врачей. Мы тщательно изучили
эти методики и запустили промышленное производство
красителей для цитологов, что значительно упрощает им
работу и стандартизирует хотя бы в этой области приго
товление препаратов.
Окраска цитологических препаратов
В цитологической практике используются как обыч
ные гистологические методы окраски, так и гематологи
ческие, а также специальная окраска по Папаниколау.
В зависимости от материала, окрашивание проводят либо
гематоксилином и эозином, либо азурэозиновыми краси
телями. Среди наиболее частых применяемых гематокси
линов можно упомянуть красители Майера, Карацци,
Эрлиха. Для каждого красителя нужно выбирать свой ре
жим окраски, производить контроль окрашивания под
микроскопом. Окрашивание производится в течение 520
минут и в результате после промывания водой краситель
избирательно окрашивает ядра с синим оттенком.
Эозином цитоплазма окрашивается в розовый цвет.
Красители можно использовать неоднократно, соблюдая
условия хранения, чистоту препаратов и инструкцию по
использованию.
32
Обеспечение контроля качества на преаналитичес
ком этапе.
По статистике от 46% до 56% ошибок в лаборатории
совершается на преаналитическом этапе.
Внутренние стандарты проведения преаналитичес
кого этапа контроля качества:
• разработка удобных высокоинформативных печатных
документов, содержащих необходимую для врачаклини
циста информацию о перечне анализов с указанием необ
ходимости предварительной подготовки перед взятием
крови (прайслисты) и наглядные инструкции для сред
него медицинского персонала по забору биоматериала
• введение единой формы бланказаявки
• наличие информационного отдела лаборатории и ме
неджера по работе с клиентами
• использование вакуумных систем взятия крови, что обес
печивает стандартизацию условий забора, хранения
и транспортировки, а также качество аналитического этапа
• для взятия материала в процедурных кабинетах ис
пользуются вакуумные системы Vacuette
• оснащение пунктов забора крови оборудованием, необхо
димым для забора и хранения биологического материала
• оснащение курьерской службы оборудованием, необхо
димым для транспортировки биологического материа
ла, обучение курьеров, контроль соблюдения времени
и условий доставки материала
• наличие единой лабораторной информационной систе
мы, позволяющей документировать время поступления
биологического материала в лабораторию, время, затра
ченное на обработку проб, проведение анализа и офор
мление бланка результатов
• ведение журнала выбраковки проб по четко определен
ным критериям отказа в приеме материала на исследова
ния (расхождение между данными заявки и этикетки на
пробирке (инициалы, дата, время взятия материала
и т.д.); отсутствие этикетки на пробирке или другой ем
кости, материал взят или собран не с тем антикоагулян
том или консервантом, превышение сроков доставки, на
личие сгустков в цельной крови с антикоагулянтом и т.п.
• для материала, подвергающегося цетрифугированию
существует определенный стандартный протокол, опре
деляющий режим центрифугирования
Контроль качества на аналитическом этапе
В современной лаборатории вклад аналитического
этапа в количество ошибок минимален и составляет око
ло 7%. Это связано с оснащением лаборатории высоко
точными автоматическими анализаторами и современны
ми аналитическими системами.
АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
Под внутрилабораторным контролем качества на ана
литическом этапе понимают проверку результатов изме
рений каждого аналита в каждой аналитической серии,
осуществляемую ежедневно непосредственно в лаборато
рии путем использования принятых алгоритмов оценки
измерений контрольных материалов, преимущественно
с целью оценить их воспроизводимость (близость резуль
татов измерений одной и той же величины, полученных
в разное время).
Цель внутрилабораторного контроля – выявление
и устранение недопустимых отклонений от стабильного
выполнения теста в лаборатории, т.е. выявление и устра
нение недопустимых аналитических ошибок.
Внутрилабораторный контроль качества имеет свои
ограничения и является только одной из составляющих
обеспечения качества аналитического процесса.
Важной составляющей организации внутрилабора
торного контроля качества служит выбор адекватного
контрольного материала.
Контрольный материал – однородный стабильный
материал, результаты исследования которого используют
для оценки погрешности выполняемых аналитических
измерений.
Один из основных принципов выбора контрольного
материала – при использовании реактивов и калибраторов
одного производителя рекомендуется применять аттесто
ванные контрольные материалы другого производителя.
Для систематического оперативного слежения за ста
бильностью аналитической системы по результатам ис
следования контрольных проб используются контроль
ные карты (карты LeveyJennings).
Контрольная карта – графическое изображение полу
ченных в установочной серии статистических характерис
тик вариаций аналитической системы, соответствующих
требованиям к ее точности. Используется для системати
ческою систематического оперативного слежения за ста
бильностью аналитической системы по наносимым на
карту результатам исследования контрольных проб.
Построение контрольных карт с последующей архива
цией данных внутрилабораторного контроля качества
в лаборатории ведется в автоматическом режиме, опера
тивный контроль качества результатов измерения анали
та в пробах пациентов осуществляют путем измерения
этого аналита в контрольных материалах в каждой анали
тической серии и нанесении полученных результатов на
контрольные карты.
Выявление и устранение отклонений от стабильного
выполнения теста в лаборатории и является целью внут
рилабораторного контроля качества.
Обеспечение контроля качества
на постаналитическом этапе
Как и преаналитический, постаналитический этап
можно разделить на внутрилабораторную и внелабора
торную части. Стандартизация является самым эффек
тивным способом решения большинства проблем органи
зации и обеспечения качества постаналитического этапа.
Основой элемент внутрилабораторной части постана
литического этапапроверка квалифицированным лабо
раторным специалистом результата анализа на предмет
его достоверности, биологической вероятности или прав
доподобия, а также сопоставление его с референсными
интервалами.
При наличии единой лабораторной информационной
системы LIS передача данных с анализаторов осуществ
ляется непосредственно в бланк авторизованного отчета,
что значительно уменьшает процент ошибок постанали
тического этапа.
Важнейшим на данном этапе является определение
референсных пределов, которые указываются для каждо
го исследования в бланке авторизованного отчета.
В соответствии с рекомендациями Международной
федерации клинической химии (IFCC) и по мнению меж
дународных экспертов по этой проблеме, референсные
пределы разрабатываются и устанавливаются авторитет
ными крупными производителями тестсистем, с предо
ставлением максимальной информации о деталях разра
ботки этих пределов.
Лаборатория проверяет приемлемость и в случае
проблем разумно обращаться к производителю тестсис
тем за подробной информацией по формированию рефе
ренсных пределов для данного аналита.
Ответственность за выбор референсных интервалов
лежит на специалистах клинической лабораторной диаг
ностики.
Необходимо строго документировать решения по их
выбору или смене, четко указывать литературные или
иные источники.
Лабораторная часть этапа заканчивается авторизаци
ей бланка отчета, т.е. формированием конечного продукта
лабораторного процесса и передача его клиницисту.
Трактовка лабораторного исследования в лаборатории
осуществляется только врачом клинической лаборатор
ной диагностики.
Внелабораторная часть постаналитического этапа –
помощь клиницисту в интерпретации результатов лабо
раторных исследований, которая осуществляется специа
листами лаборатории.
33