009897 Перекрестная ссылка на родственные заявки

009897
Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки на патент
США 60/414550, поданной 15 августа 2003 г., и она является частично продолжающейся заявкой на патент США, номер заявки 10/047710, поданной 15 января 2002 г., с испрашиванием приоритета на основании предварительной заявки на патент США № 60/269133, поданной 15 февраля 2001г. Полное содержание указанных предварительных заявок полностью включено в настоящий патент на основании данной ссылки.
Заявление об интересах государства
При разработке объекта настоящей заявки Национальным институтом проблем здоровья, г. Бетезда,
шт. Мэриленд, США, была предоставлена финансовая поддержка в виде исследовательских грантов (номера грантов AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45541, СА 09432 и N 01-СМ 97567). Правительство может
иметь определенные права на это изобретение.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к цитотоксическим факторам, выделяемым микроорганизмами, а
также к ингибиторам цитотоксических факторов и к их применению с целью задержки клеточного роста
и модулирования некроза клеток путем некроза и апоптоза. Настоящее изобретение также относится к
способам создания, выделения и идентификации таких цитотоксических факторов и к составам, включающим в основном чистые цитотоксические факторы, эффективно модулирующие некроз клеток и вызывающие задержку клеточного роста. Изобретение также относится к способам лечения болезней, связанных с апоптозом, в частности, изобретение относится к использованию в основном чистого цитотоксического фактора в способе стимулирования апоптоза или задержки клеточного роста в раковой клетке,
и к использованию ингибиторов цитотоксических факторов для лечения инфекций и иных заболеваний,
вызванных болезнетворными микроорганизмами.
Предпосылки к созданию изобретения
Инфекционные болезни могут быть вызваны рядом экологических факторов. Любую инфекционную болезнь вызывает болезнетворный возбудитель инфекции. Возбудителем инфекции обычно является
патогенный микроорганизм, например патогенная бактерия. Способность патогенного микроорганизма
преодолевать защитные механизмы организма и вызывать заболевания связана с его вирулентностью.
Известно, что как патогенные, так и непатогенные микроорганизмы способны проявлять экспрессию
цитотоксических факторов, позволяющих микроорганизму защищаться от иммунной системы организма-хозяина и предотвращать удаление микроорганизма из тела фагоцитами (например, макрофагами и
тучными клетками (мастоцитами). При выживании патогенных микроорганизмов они способны проникать в ткани организма-хозяина и распространяться в них, вызывая тем самым тяжелые симптомы заболевания. Установлено, что патогенные бактерии являются основной причиной различных истощающих
заболеваний и смертельных болезней, включающих, например, туберкулез, холеру, коклюш, чуму и т.д.
Для лечения таких тяжелых инфекций используются, например, такие лекарства, как антибиотики, которые либо уничтожают носителей инфекции, либо блокируют цитотоксические факторы таким образом,
чтобы носитель инфекции в дальнейшем был не способен защищать себя против действия иммунной
системы организма-хозяина. Тем не менее, как правило, патогенные бактерии развивают устойчивость к
антибиотикам и для предотвращения распространения инфекций, вызываемых такими микроорганизмами, требуются более совершенные средства.
Рак представляет собой злокачественную опухоль, характеризующуюся потенциально неограниченным ростом. Он главным образом представляет собой патогенную репликацию (утерю нормального
регулирующего воздействия) различных типов клеток, имеющихся в организме человека. Нередко на
начальном этапе лечения заболевания применяется хирургия, облучение или сочетание этих двух видов
лечения, однако при этом частым является появление на ограниченном участке рецидивирующей или
метастатической опухоли. Для лечения некоторых видов рака используется химиотерапия, но такое лечение редко приводит к долгосрочной регрессии. Следовательно, такие виды рака часто являются неизлечимыми. Обычно опухоли и их метастазы перестают поддаваться лечению с применением химиотерапии - такое явление представляет собой развитие устойчивости ко многим лекарственным средствам. Во
многих случаях опухоли по своей природе устойчивы к некоторым классам химиотерапевтических лекарственных препаратов. Кроме того, такой вид лечения угрожает нераковым клеткам, подвергает стрессу человеческий организм и вызывает большее количество побочных эффектов. Таким образом, необходимы усовершенствованные лекарственные средства для предотвращения распространения раковых клеток.
Известно, что многие виды рака регрессируют, если пациенты инфицированы патогенными бактериями. Тем не менее, имеется исключительно ограниченный объем информации о том, каким образом
бактериальные инфекции вызывают регрессию рака человека.
Краткое изложение существа изобретения
Настоящее изобретение относится к цитотоксическим факторам, стимулирующим гибель клеток
путем некроза или апоптоза или вызывающим задержку клеточного роста. В одном примере осуществления изобретения были охарактеризованы и выделены в основном чистые цитотоксические факторы. В
-1-
009897
основном чистые цитотоксические факторы получают путем фракционирования среды для выращивания, подвергнутой воздействию патогенного микроорганизма, методом колоночной хроматографии.
Предпочтительно создание и секреция таких цитотоксических факторов стимулируется в процессе роста
патогенных организмов в присутствии белков млекопитающих.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения идентификация рецепторов для белков млекопитающих, как средства разграничения вирулентных и авирулентных микроорганизмов, может привести
к повышению специфичности лечения заболевания.
Еще одним аспектом настоящего изобретения, является способ лечения заболеваний, связанных с
устойчивостью клеток к некрозу или восприимчивости, включающий введение цитотоксического фактора, ингибитора цитотоксического фактора либо его модификации, либо производного, по выбору включенного в фармацевтический носитель.
Цитотоксический фактор либо его модификация, либо производное может быть включен в фармацевтический состав в целях профилактики и лечения заболеваний, связанных с патологической пролиферацией клеток. Например, цитотоксический фактор может найти применение для лечения рака.
Ингибитор цитотоксического фактора либо его модификация, либо производное может быть использован для лечения бактериальных инфекций, предотвращая некроз клеток фагоцитов и, следовательно, позволяя иммунной системе организма-хозяина бороться с проникшими в организм патогенами.
В другом примере осуществления настоящего изобретения цитотоксические факторы, а также компоненты их аппарата секреции могут быть использованы в качестве вариантов, приемлемых для создания вакцин против возбудителей инфекции.
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования некроза клеток, включающему
регулирование секреции цитотоксических факторов. В одном примере осуществления цитотоксические
факторы могут быть использованы в качестве противораковых средств против массы клеток рака человека. Цитотоксические факторы также можно использовать в качестве объектов для разработки лекарственных препаратов, применяя технику поиска мутантного организма на селективных средах или рациональный дизайн ингибиторов.
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования некроза клеток, включающему
использование цитотоксического фактора, такого как азурин, пластоцианин, рустицианин, псевдоазурин
или цитохром С551, либо мутант такого цитотоксического фактора.
Указанные и иные особенности, преимущества и признаки изобретения станут очевидными из следующего ниже описания предпочтительных примеров осуществления со ссылками на прилагаемые рисунки.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Диаграмма, иллюстрирующая воздействие 1,0 мМ АТР на уничтожение макрофагов в присутствии или при отсутствии отфильтрованного супернатанта среды для выращивания (SUP) или гидроксиапатитовых проточных (HAFT), АТР-агароза проточных (AAFT) и Q-сефароза проточных (QSFT)
колоночно-хроматографических фракций, полученных из среды для выращивания В. cepacia. Степень
некроза клеток макрофагов измеряется на основе секреции внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы (LDH). В анализах использовалось 2 мкг белка от каждой фракции. Все анализы были проведены
с трехкратным повторением, и указаны планки погрешностей («усы»).
Фиг. 2. Диаграмма, иллюстрирующая воздействие отфильтрованного супернатанта среды для выращивания (SUP) колоночно-хроматографических фракций (HAFT, AAFT и QSFT) В. cepacia на некроз
клеток макрофагов при отсутствии АТР. Степень некроза клеток макрофагов измеряется на основе секреции внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы (LDH). Все анализы были проведены с трехкратным повторением, и указаны планки погрешностей («усы»).
Фиг. 3. Диаграммы, иллюстрирующие активность каспазы (фиг. 3А - каспаза-3; фиг. 3В - каспаза-9)
в цитозольных экстрактах макрофагов J774, обработанных фракцией QSFT В. cepacia. Цитозольные экстракты были получены из макрофагов, инкубированных в течение ночи с фракцией QSFT В. cepacia (10
мкг белка), а также из необработанных макрофагов. Субстрат для определения активности каспазы-3
представлял собой Ac-DEVD-pNA (N-ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-р-NO2-анилин). Субстрат для определения активности каспазы-9 представлял собой Ac-LEHD-pNA (N-ацетил-Leu-Glu-His-Asp-р-NO2-анилин).
Экстракты инкубировали с субстратом при 37°С в течение заданного времени. В каждом случае использовали 10 мкг цитозольного белка макрофагов. Секрецию pNA (p-нитроанилин) определяли спектрофотометрчиески при 405 нм.
Фиг. 4. Диаграмма, иллюстрирующая цитотоксичность, измеренную по % секреции лактатдегидрогеназы (LDH) в макрофагах в присутствии азурина (Az), цитохрома C551 (Cyt C551) и их смеси. Значения
представляют белок в мкг. Буферный контроль (буфер) показан справа.
Фиг. 5. Диаграмма, иллюстрирующая влияние антител анти-азурина и анти-цитохрома С551 на цитотоксичность QSFT фракций В. cepacia (А) и М. bovis (В) и в присутствии неиммунной сыворотки. А азурин (50 мкг); С - цитохром С551 (25 мкг); ab, смесь антител антиазурина и антихрома С551; P - неиммунная сыворотка. В каждом анализе использовали 2 мкг фракции QSFT. Цифры после ab и Р указывают
количество антитела или неиммунного белка в мкг. Приведенные результаты являются стандартными
-2-
009897
отклонениями от средней величины ± экспериментов, проведенных с трехкратным повторением.
Фиг. 6. Диаграмма, иллюстрирующая влияние последующей инъекции азурина/цитохрома С551 у
бестимусных мышей на размер опухоли после индуцирования опухолевых клеток меланомы (UISO-Mel2). Приблизительно 106 клеток UISO-Mel-2 было введено подкожно бестимусным мышам после проведения один раз в неделю интраперитонеальных инъекций цитратного буфера (контроль), известного средства против меланомы DTIC (7,5 мкг), либо три раза в неделю большой (150 мкг азурина/75 мкг цитохрома С551) или малой (10 мкг азурина/5 мкг цитохрома С551) дозы смеси азурина/цитохрома С551 в течение 4 недель. В различные периоды времени проводилось определение размеров (объема опухоли) опухолей у контрольных мышей (лечение с применением буферного раствора), у мышей, проходивших лечение с использованием DTIC, и у мышей, получавших большие и малые дозы смеси азурина/цитохрома
С551, и результаты измерений были представлены графически.
Фиг. 7. Диаграмма, иллюстрирующая увеличение или снижение веса мышей в процессе проведения
эксперимента, описанного на фиг. 6. В ходе проведения вышеуказанного эксперимента мыши взвешивались на весах, и проводилась регистрация веса в граммах.
Фиг. 8. Диаграмма, иллюстрирующая регрессию опухоли Mel-6 у бестимусных мышей, проходивших лечение с использованием фракции QSFT М. Bovis в присутствии или при отсутствии азурина (AZ).
Приблизительно 106 клеток UISO-Mel-6 было введено подкожно бестимусным мышам. Приблизительно
через одну неделю развились небольшие опухоли. Затем мышам интраперитонеально вводили фосфатносолевой буферный раствор (контроль), фракцию QSFT M. Bovis или смесь фракции QSFT M. Bovis и
азурина.
Фиг. 9. Диаграмма, иллюстрирующая цитотоксичность азурина для клеток MCF-7
и MDA-MBподвергнутых лечению азурином в различных концентрациях в течение 72 ч.
157
Фиг. 10. Диаграмма, иллюстрирующая регрессию опухоли MCF-7 у бестимусных мышей, проходивших лечение с применением азурина
и у контрольной группы животных
Фиг. 11 (а) и (b). Фиг. 11 (а) - таблица, иллюстрирующая совмещение аминокислотной последовательности азурина P. aeruginosa с другими бактериальными азуринами. Совмещение аминокислотной
последовательности было проведено с использованием программного обеспечения Genetyx. Фиг. 11 (b) таблица, иллюстрирующая азурин дикого типа (wt азурин) и химерные мутантые азурины.
Фиг. 12 (а) и 12 (b). Фиг. 12 (а) - диаграмма, иллюстрирующая цитотоксичность азуринов дикого
типа и редокс-мутантных азуринов по отношению к клеткам макрофагов. Азурин дикого типа
апоМ44КМ64Е
C112D
азурин
Фиг. 12 (b) - диаграмма, иллюстрирующая цитотоксичность азуринов дикого типа и химерных мутантных азуринов по отношению к клеткам макрофагов. Азурин дикого типа
S1
S2
S3
S4
S6
wtS5
wtS5S4S6
S3S5
. На фиг. 12 (b) также проиллюстрирована относительная
эффективность переноса электронов мутантов, выраженная в процентах эффективности азурина дикого
типа. Для расчета процента цитотоксичности количество не подвергшихся лечению жизнеспособных
клеток было взято за 100%, и определялось количество жизнеспособных клеток в пробах, прошедших
лечение азурином.
Фиг. 13 - диаграмма, иллюстрирующая апоптотическую активность азурина, апо-азурина и мутантов азурина по отношению к клеткам макрофагов. Азурин дикого типа
апо-азурин
М44КМ64Е
C112D
Фиг. 14 - диаграмма, иллюстрирующая цитотоксичность азурина дикого типа
рустиапорустицианина
и псевдоазурина
цианина
и пластоцианина
Фиг. 15 - диаграмма, иллюстрирующая цитотоксичность азурина дикого типа
Подробное описание предпочтительных примеров осуществления настоящего изобретения
Определения
В настоящем описании термин «цитотоксический фактор» относится к фактору, выделяемому патогенным или непатогенным микроорганизмом и стимулирующему гибель клеток путем некроза или апоптоза, либо вызывающему задержку клеточного роста. Примеры цитотоксических факторов включают
азурин, пластоцианин, рустицианин, псевдоазурин или цитохром C551. Термин «АТР-зависимый» при
использовании в целях определения термина «цитотоксический фактор» относится к цитотоксическому
фактору, вызывающему некроз клеток или задержку клеточного роста в присутствии аденозина 5'трифосфата (АТР). Термин «АТР-независимый» при использовании в целях определения термина «цитотоксический фактор» относится к цитотоксическому фактору, вызывающему некроз клеток или задержку
клеточного роста при отсутствии АТР.
В настоящем описании термин «лечение» включает профилактику, снижение, приостановление или
устранение прогрессирования или тяжести заболевания или симптомов, подвергающихся лечению. Как
-3-
009897
таковой термин «лечение» включает лечебное, терапевтическое и (или) профилактическое применение
лекарственного препарата при необходимости.
В соответствии с используемым в настоящем описании значением термин «заболевание, связанное
с устойчивостью клеток к некрозу» относится к заболеванию, состоянию или болезни, характеризующихся, как минимум, тенденцией к длительной жизни клеток по сравнению со здоровыми клетками аналогичного типа в соответствии с определением, данным объективным, квалифицированным врачом или
клиницистом. В соответствии со значением, используемым в настоящем описании, термин «заболевание,
связанное с восприимчивостью клеток к некрозу», относится к заболеванию, состоянию или болезни,
характеризующихся, как минимум, тенденцией к преждевременному некрозу клеток по сравнению со
здоровыми клетками аналогичного типа в соответствии с определением, данным объективным, квалифицированным врачом или клиницистом.
В соответствии со значением, используемом в настоящем описании, термин «имеющий функциональный ген р53, подавляющий опухоль» относится к клетке, имеющей подавляющий опухоль ген р53,
который не является инактивированным, мутировавшим, утраченным либо не соответствующим стандарту.
В соответствии со значением, используемом в настоящем описании, термин "лишенный гена р53,
подавляющего опухоль» относится к клетке, имеющей подавляющий опухоль ген р53, который инактивирован, мутировал, утрачен или не соответствует стандарту. Например, такой дефицит может возникнуть в результате генетических аберраций внутри гена р53 или взаимодействия с вирусными или клеточными онкогенами.
Термин «в основном чистый», используемый для определения термина «цитотоксический фактор»,
в соответствии со значением, используемым в настоящем описании, относится к цитотоксическому фактору, например, цитотоксическому фактору, выделенному из секретированной среды для выращивания в
форме, в основном, не содержащей активные ингибирующие соединения или незагрязненные активными
ингибирующими соединениями. Термин «в основном чистый» относится к фактору в количестве, как
минимум, около 75% по весу выделенной фракции или, как минимум, «в основном чистый на 75%». Более предпочтительно термин «в основном чистый» относится к соединению в количестве, как минимум,
около 85% по весу активного соединения или, как минимум, «в основном чистого на 85%». В основном
чистый цитотоксический фактор может быть использован в сочетании с одним или несколькими другими
в целом чистыми соединениями или выделенными цитотоксическими факторами.
В соответствии со значением, используемом в настоящем описании, термин «модификация или
производное» цитотоксического фактора относится к соединению или веществу, полученному путем
химической модификации или обработки цитотоксического фактора или гена, кодирующего цитотоксический фактор. Модификация или производное цитотоксического фактора могут быть получены путем
химической модификации цитотоксического фактора или путем обработки генов, кодирующих цитотоксический фактор, например путем изменения основного состава или характеристик цитотоксического
фактора, но не его токсичности. Аналогичным образом, «модификация или производное» ингибитора
цитотоксического фактора может включать химические модификации химической структуры ингибитора или обработку генов, кодирующих ингибитор.
Термин «процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» определяется как процент аминокислотных остатков в цитотоксическом факторе, являющихся идентичными аминокислотным
остаткам в вариантной последовательности при совмещении двух последовательностей. С целью определения % аминокислотной идентичности последовательности совмещаются и, при необходимости, вводятся интервалы для достижения максимального % идентичности последовательности; консервативные
замены не рассматриваются как часть идентичности последовательности. Процедуры совмещения аминокислотных последовательностей с целью определения процента идентичности хорошо известны специалистам в данной области техники. Для совмещения пептидных последовательностей нередко используется доступное программное обеспечение, такое как BLAST, BLAST2, ALIGN2 или Megalign (DNASTAR).
При выравнивании аминокислотных последовательностей процент (%) идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А по отношению к данной аминокислотной последовательности В, в сочетании с ней или по сравнению с ней (которую иначе можно характеризовать как данную аминокислотную последовательность А, имеющую или содержащую определенный % идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к данной аминокислотной
последовательности В, в сочетании с ней или по сравнению с ней) можно рассчитать по формуле:
% идентичности аминокислотной последовательности = X/Y⋅100,
где X - число аминокислотных остатков, количественно подсчитанных в виде идентичных подборов
с помощью программы совмещения последовательностей или алгоритма совмещения А и В; и
Y - общее число аминокислотных остатков в В.
Если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то % идентичности аминокислотной последовательности А к В не будет равен % идентичности
аминокислотной последовательности В к А.
-4-
009897
Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, являющееся эффективным
для профилактики развития или смягчения симптомов, имеющихся у проходящего лечение пациента.
Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалистов в данной
области техники.
Общая часть
В настоящем изобретении предлагаются цитотоксические факторы, выделяемые патогенными или
непатогенными микроорганизмами, стимулирующие гибель клеток в результате некроза или апоптоза
или вызывающие задержку клеточного роста. При проникновении патогенных микроорганизмов в ткани
человека или животного фагоциты представляют собой первую линию обороны в иммунной системе организма-хозяина. Обычно фагоциты отыскивают и уничтожают проникшие в организм инородные патогены. Тем не менее, цитотоксические факторы, выделяемые микробными патогенами, способны стимулировать некроз клеток в фагоцитарных клетках. В результате этого, фагоциты не в состоянии выполнить свою защитную иммунную функцию.
Ранее изобретатели сообщали, что многие патогенные бактерии выделяют АТР-зависимые цитотоксические факторы, например, использующие АТР ферменты, вызывающие гибель фагоцитарных клеток
в результате некроза. [Zaborina О. et al., Infect. Immun. 67: 5231-5242 (1999); Melnikov A. et al., Mol. Microbiol. 36: 1481-1493 (2000); and Punj V. et al., Infect. Immun. 68: 4930-4937 (2000), содержание которых
включено для всех целей путем ссылки.] Использующие АТР ферменты воздействуют на различные
энергетические производные нуклеотидов, такие как АТР, аденозин 5'-дифосфат (ADP), аденозин 5'монофосфат (AMP) или аденозин, преобразуя их в различные продукты, которые в свою очередь способны модулировать некроз фагоцитарных клеток, таких как макрофаги и мастоциты путем активации пуринергических рецепторов.
Один аспект настоящего изобретения относится к открытию того факта, что АТР-независимые цитотоксические факторы, например редокс-белки, также выделяются некоторыми видами патогенных
микроорганизмов, и что такие факторы вызывают некроз фагоцитарных клеток в результате апоптоза.
[Zaborina О. et al., Microbiology 146: 2521- 2530 (2000), содержание которых включено для всех целей
путем ссылки.]
Еще один аспект настоящего изобретения относится к неожиданному открытию того факта, что
АТР-независимые цитотоксические факторы вызывают апоптоз или задержку клеточного роста раковых
клеток. Такие цитотоксические факторы могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с
устойчивостью клеток к некрозу. Такие заболевания могут включать, например, меланому человека, лейкемию, рак груди, рак яичника, рак легких, мезенхимальный рак, рак толстой кишки и рак воздухоносных путей (например, рак желудка, пищевода, гортани и ротовой полости).
Обычно раковые клетки не восприимчивы к апоптотическому некрозу. Такая устойчивость к апоптотическому некрозу клеток может быть вызвана инактивирующими мутациями в гене, кодирующем
подавляющий опухоль белок р53. Известно, что для апоптоза клеток млекопитающих требуется присутствие белка р53. Тем не менее, в 50% случаев рака человека присутствуют инактивирующие мутации в
гене, кодирующем подавляющий опухоль белок р53.
Хотя известно, что белок р53 регулирует экспрессию редокс-белков в клетках млекопитающих, редокс-белки млекопитающих непосредственно не участвовали в апоптозе раковых клеток или задержке
клеточного роста. Не была продемонстрирована роль микробных АТР-независимых цитотоксических
факторов ни в стимулировании апоптоза в раковых клетках, ни в сокращении размера опухолей.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способам идентификации и характеристике цитотоксических факторов, секретируемых микроорганизмами. Такие способы обеспечивают пути открытия соответствующих ингибиторов или стимуляторов некроза клеток. Ингибиторы или стимуляторы могут быть разработаны как фармацевтические препараты и использованы для лечения заболеваний, характеризующихся устойчивостью или восприимчивостью клеток к некрозу.
Другой аспект настоящего изобретения относится к цитотоксическим факторам, которые были характеризованы и выделены, а также к ингибиторам таких цитотоксических факторов. Цитотоксические
факторы могут быть активированы или инактивированы в соответствии со способом изобретения с целью профилактики или лечения заболевания, связанного с некрозом клеток. Ингибитор цитотоксического фактора может быть использован для лечения заболевания, связанного с восприимчивостью клеток к
некрозу.
Секреция цитотоксических факторов
Согласно одному аспекту настоящего изобретения цитотоксические факторы по настоящему изобретению секретируются рядом различных патогенных микроорганизмов, включая бактерии и простейшие. Примеры патогенных бактерий, приемлемых для получения цитотоксических факторов, включают
Pseudomonas aeruginosam (P. aeruginosa), Burkholderia cepacia (B. cepacia), Vibrio cholera (V. cholera), and
Mycobacterium bovis (M. bovis), но не ограничиваются ими. Кроме того, цитотоксические факторы секретируются такими патогенами, как Leishmania amazonensis и Brugia malayi.
Было обнаружено, что P. aeruginosa, условно-патогенный микроорганизм, В. cepacia, вызывающий
смертельные инфекционные заболевания у пациентов, страдающих кистозным фиброзом и хроническим
-5-
009897
гранулематозным заболеванием, V. cholerae, кишечный патоген, вызывающий холеру, и медленно растущая вирулентная группа микобактерий, таких как М. tuberculosis или М. bovis, вызывающих туберкулез, секретируют ферменты, использующие АТР.
Кроме секреции ферментов, использующих АТР, изобретатели обнаружили, что P. aeruginosa секретирует АТР-независимые цитотоксические факторы. Они были идентифицированы как два редоксбелка: азурин и цитохром C551. Было также продемонстрировано, что В. cepacia секретирует редоксбелки. Было продемонстрировано, что М bovis также секретирует цитотоксические факторы, обладающие высокой АТР-независимой цитотоксичностью по отношению к фагоцитарным клеткам.
Стимулирование секреции цитотоксических факторов в присутствии белков млекопитающих
Согласно другому аспекту настоящего изобретения выработка и секреция цитотоксических факторов стимулируется в процессе роста патогенных организмов в присутствии белков млекопитающих. Например, секреция цитотоксических факторов такими патогенными микроорганизмами, как Р. aeruginoza,
M. bovis и B. Cepacia, стимулируется присутствием таких белков млекопитающих, как каппа-казеин, бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин или α2-макроглобулин. В данном описании делается
предположение, но не утверждается, что патогенные микроорганизмы обнаруживают присутствие определенных белков млекопитающих, указывающих на среду организма-хозяина млекопитающих, тем самым запуская механизм секреции для цитотоксических агентов, чтобы противодействовать обороне организма-хозяина и разрушить ее.
Изобретатели определили, что несколько клинических (вирулентных) изолятов В. cepacia секретируют большое количество ферментов, использующих АТР, таких как аденилаткиназа или 5'нуклеотидиза, при этом несколько экзогенных (авирулентых) изолятов секретировали эти ферменты
только в небольших количествах. В клинических изолятах, таких как штамм 38 В. cepacia, уровень секреции цитотоксических факторов значительно повышается в присутствии α2-макроглобулина в среде
для выращивания. Секретированные продукты из клинических изолятов имеют более высокий уровень
цитотоксичности по отношению к макрофагам и мастоцитам, чем токсичность продуктов экзогенных
изолятов. Клинические изоляты, проявляющие повышенную секрецию цитотоксических факторов в присутствии α2-макроглобулина, также демонстрируют присутствие рецепторов для α2-макроглобулина на
своей поверхности.
В одном примере осуществления настоящего изобретения выработка и секреция АТР-независимых
цитотоксических факторов стимулируется в процессе роста микроорганизмов в присутствии белков млекопитающих. Повышенная секреция цитотоксических факторов может быть достигнута путем выращивания микроорганизмов в среде для выращивания, содержащей белки млекопитающих. Например, приемлемыми средами для выращивания являются среда Луриа, питательный бульон, триптиказный соевый
бульон и триптоновый дрожжепептоновый бульон (Difco Laboratories, Maryland, U.S.A.). Обычно приблизительно от 500 до 1000 мл стерильной автоклавированной среды для выращивания инокулируют от
104 до 106 клеток/мл. Далее инокулированную среду инкубируют при условиях, приемлемых для обеспечения роста микроорганизма, обычно на ротационном шейкере при температуре от 30 до 37°С. Выбор
среды для выращивания, инкубационных условий и иных факторов, обеспечивающих успешную культуру бактерий или иных микроорганизмов, является очевидным для специалистов в данной области техники. Изобретатели отмечали, что максимальные концентрации цитотоксических факторов в среде для выращивания достигались в конце экспоненциальной фазы роста и в начале стационарной фазы роста.
В другом примере осуществления настоящего изобретения идентификация рецепторов для белков
млекопитающих обеспечивает разграничение вирулентных и авирулентных штаммов микроорганизмов.
Например, присутствие рецепторов для α-2 макроглобулина, главным образом в клинических изолятах,
но не в экзогенных изолятах, не только согласуется со способностью первых секретировать цитотоксические вещества в качестве оружия против защиты организма-хозяина, но также обеспечивает разграничение между клиническими вирулентными штаммами и экзогенными авирулентными штаммами. Следовательно, вирулентные штаммы организмов могут быть идентифицированы и далее протестированы на их
антибиотическую чувствительность или в иных клинических целях.
Очистка АТР-независимого цитотоксического фактора
В другом примере осуществления настоящего изобретения в основном чистые АТР-независимые
цитотоксические факторы получают путем фракционирования среды для выращивания секретирующих
микроорганизмов методом колоночной хроматографии. Предпочтительным является удаление бактериальных клеток из среды для выращивания до процесса фракционирования. Это может быть достигнуто
путем начального центрифугирования и последующего фильтрования среды для выращивания. Приемлемые фильтры обычно имеют размер пор менее или равный приблизительно 0,5 мкм и предпочтительно
приблизительно 0,2 мкм. Тем не менее, другие способы удаления патогенов известны специалистам в
данной области техники.
Нефракционированная среда для выращивания не обладает высокой АТР-независимой цитотоксической активностью, и, следовательно, фракционирование методом колоночной хроматографии необходимо для повышения активности, вызывающей апоптоз, или активности, задерживающей клеточный
-6-
009897
рост. Фракционирование позволяет удалить АТР-зависимые цитотоксические факторы. В настоящем
описании также выдвигается предположение, но не утверждается, что фракционирование также позволяет удалить ингибиторы АТР-независимых цитотоксических факторов, которые могут присутствовать в
нефракционированной среде для выращивания.
Хроматографические методы, используемые при очистке цитотоксических факторов, известны специалистам в данной области техники. Эти методы, например, включают ионно-обменную хроматографию, гидроксиапатитовую хроматографию, аффинную хромтографию и гель-фильтрационную хроматографию. Хроматографические колонки, используемые в процессе фракцинации среды для бактериального выращивания, включают, например: Hydroxyapatite; Superdex 75 или 200; Superose 6 или 12; Sephacryl
S; Sephadex G или Sephadex LH; Mono Q или Mono S; Q-Sepharose; DEAE Sepharose или CM Sepharose;
Sepharose XL; ATP-Sepharose; Hi Trap Blue; Blue Sepharose; DNA Cellulose или Sepharose 2B, 4B или 6В,
выпускаемые Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden или Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, U.S.A.
Ферменты, использующие ATP, могут быть изолированы путем фракционирования методом колоночной хроматографии в виде проточных или элюированных фракций гидроксиапатитовых и АТРагарозных колонок. В процессе такого фракционирования ферменты, использующие АТР, такие как аденозинтрифосфатаза или аденилаткиназа адсорбируются на колонке и могут быть в дальнейшем удалены
либо очищены (См., например, Markaryan et al., J. Bacteriol., 183, стр. 3345- 3352, 2001).
В одном примере осуществления настоящего изобретения АТР-независимые цитотоксические
фракции изолируют в виде проточных фракций Q-Sepharose колонок (QSFT). Q-Sepharose является четвертичным амониевым сильным анионообменником. Такие колонки можно приобрести у Amersham
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden. Супернатант или иные колоночные фракции, такие как гидроксиапатитовая колоночная проточная фракция (HAFT) или АТР-агарозная колоночная проточная фракция (AAFT), обычно не проявляют высокую АТР-независимую цитотоксичность.
Характеризация АТР-независимых цитотоксических факторов
Согласно другому аспекту настоящего изобретения фракционированные среды для выращивания
тестировали с целью определения присутствия АТР-независимых цитотоксических факторов. Степень
некроза клеток может быть измерена на основе секреции межклеточной ферментной лактатдегидрогеназы (LDH) в соответствии с описанием в Zaborina et al., Infection and Immunity, 67, 5231-5242 (1999) and
Zaborina et al., Microbiology, 146,2521-2530 (2000), содержание которого включено для всех целей на основании этой ссылки.
Способность АТР-независимых цитотоксических факторов вызывать апоптоз можно наблюдать с
помощью митосенсорной ApoAlert конфокальной микроскопии с использованием набора митохондрального мембранного сенсора MITOSENSOR™ APOLERT™ (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California,
U.S.A.). При проведении анализа здоровые, неапоптотические клетки флуоресцируют красным цветом, в
то время как апоптотические некрозные клетки флюоресцируют зеленым цветом. Сочетание красного и
зеленого цветов создает желтые флюоресцирующие клетки, представляющие собой апоптотические
умирающие клетки. (см. Zaborina et al., Microbiology, 146, 2521-2530 (2000), содержание которого включено для всех целей путем ссылки.)
Апоптозу способствует активация каскада ферментов известных как каспазы, являющиеся цистеиновыми протеазами, расщепляющимися на аспаргиновых остатках. Следовательно, апоптоз также может
быть обнаружен путем измерения двух важных активностей каспазы, а именно, активности каспазы-9 и
каспазы-3, которые, как известно, активируются в процессе апоптоза путем олигомеризации цитохрома
с, выделенного из митохондрий, цитозольным белком Apaf-1 с использованием способа, описанного в
Zou et al., J. Biol. Chem., 274: 11549-11556 (1999), содержание которого включено для всех целей путем
ссылки.
Апоптоз также можно наблюдать путем обнаружения фрагментирования ядерной ДНК, вызванного
апоптозом, с использованием, например, набора фрагментирования APOLERT DNA (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.). Данный анализ основан на методе dUTP ник-мечения по концам
(TUNEL) с участием концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы (Tdt), где Tdt катализирует включение
флюоресцеина-dUTP на свободных 3'-гидроксильных концах фрагментированной ДНК в клетках, в которых протекает апоптоз. Включение флюоресцеина-dUTP в фрагментрированную ядерную ДНК создает
флюоресценцию зеленого цвета, обнаруживаемую с помощью конфокальной микроскопии.
В одном примере осуществления настоящего изобретения фракционированные среды для выращивания тестируют с целью определения способности таких фракций вызывать апоптоз или задержку клеточного роста. Такие способы являются эффективными при идентификации и характеристики АТРнезависимых цитотоксических факторов.
Идентификация АТР-независимых цитотоксических факторов
В другом примере осуществления настоящего изобретения предлагаются охарактеризованные цитотоксические факторы, проявляющие цитотоксичность, запускающую АТР-независимый апоптоз, или
которые вызывают задержку клеточного роста. Изобретатели обнаружили, что QSFT фракция P. aeiuginosa и В. cepacia обогащена двумя белками - азурином и цитохромом C551. Идентификация этих двух
-7-
009897
белков основана на их разделении на SDS-PAGE и идентификации их N-концевых аминокислотных последовательностей. В противоположность этому SDS-PAGE анализ фракции QSFT M bovis позволяет
обнаружить полосу бычьего сывороточного альбумина (BSA) толщиной 65 кДа, являющегося компонентом среды 7Н9, используемой для выращивания М bovis, a также несколько полос с молекулярной массой более чем 45 кДа, но не те полосы, которые характерны для цитохрома или азурина (см. пример 9).
Азурин и (или) цитохром C551 и фракции QSFT проявляют цитотоксичность, запускающую апоптоз,
по отношению к фагоцитарным клеткам. Использование только одного цитохрома С551 вызывает задержку клеточного роста. Очищенная смесь азурина и цитохрома С551 или фракция QSFT В. cepacia, обработанная смесью антител антиазурина и антицитохрома С551, проявляет значительно пониженную макрофагальную цитотоксичность. В противоположность этому фракция QSFT M. bovis, предварительно обработанная антителами антиазурина и антицитохрома С551, проявляет крайне незначительное снижение цитотоксичности, подтверждающее тот факт, что фракция QSFT M. bovis содержит цитотоксические факторы, отличающиеся от азурина или цитохрома C551. Следовательно, различные патогены секретируют различные цитотоксические факторы, вызывающие апоптоз или сдерживающие клеточный рост, все из которых являются превосходными объектами для разработки лекарственных препаратов.
АТР-независимые цитотоксические факторы
I. Соединения купредоксинов
Эти низкомолекулярные медьсодержащие белки (купредоксины) голубой окраски являются белками (10-20 кДа), обеспечивающими перенос электрона и участвующими в бактериальных редокс-цепях,
фотосинтезе или в выполнении иных функций, роль которых еще неясна. Ион меди связан только белковой матрицей. Особо деформированная планарная тригональная геометрия из двух лигандов гистидина и
одного лиганда цистеина вокруг атома меди создает исключительно специфические электронные свойства центра связывания метала и обусловливает интенсивную голубую окраску. Для ряда купредоксинов
уровень кристаллографического разрешения был охарактеризован от среднего до высокого.
Азурин
Азурины являются медьсодержащими белками 128 аминокислотных остатков, принадлежащих семейству купредоксинов, участвующих в реакциях переноса электрона в некоторых растениях и бактериях. Азурины включают купредоксины из P. aeruginosa (PA) (SEQ ID NO: 1), A. xylosoxidans и А. denitrificans. (Murphy, L. M. et al., J. Mol. Biol., т. 315, стр. 859-71 (2002), содержание которых включено для всех
целей для ссылки.) Несмотря на то что последовательная гомология между азуринами изменяется в пределах 60-90%, структурная гомология между этими молекулами является высокой. Все азурины имеют
характерный β-сэндвич с так называемым Greek key мотивом, а единственный атом меди всегда расположен в одном и том же месте белка. Кроме того, азурины обладают в основном нейтральным гидрофобным «пэтчем», окружающим центр связывания меди (Murphy et al.).
Пластоцианины
Пластоцианины являются растворимыми белками эукариотных растений, содержащими одну молекулу меди на молекулу, и в оксидированной форме имеют голубую окраску. Они содержатся в хлоропласте, в котором они выполняют функцию носителей электронов. Со времени определения структуры тополевого пластоцианина в 1978 г. структуру водорослевых (Scenedesmus, Enteromorpha, Chlamydomonas)
и растительных (фасоль обыкновенная) пластоцианинов определяли с использованием либо кристаллографического метода, либо метода ядерно-магнитного резонанса, а тополевая структура была улучшена
до разрешающей способности 1,33 A. SEQ ID NO: 2 демонстрирует аминокислотную последовательность
пластоцианина из Phormidium laminosum.
Несмотря на расхождение в последовательностях среди пластоцианинов водорослей и сосудистых
растений (например, 62% идентичность последовательностей между Chlamydomonas и тополевыми белок ами), трехмерные структуры сохраняются (например, среднеквадратическое отклонение 0,76 А позиций С альфа между Chlamydomonas и Poplar-белками). Структурные характеристики включают деформированное тетраэдрическое место связывания меди на одном конце антипараллельного восьмитяжевого
бета-цилиндра, ярко выраженный негативный «пэтч» и плоскую гидрофобную поверхность. Центр соединения атома меди оптимизирован для выполнения его функций переноса электрона, и предполагается, что негативный и гидрофобный «пэтчи» участвуют в распознавании партнеров, участвующих в физиологической реакции. Химическая модификация, кросс-сшивка и эксперименты сайт-специфического
мутагенеза подтвердили важность негативных и гидрофобных «пэтчей» в связывающих взаимодействиях
с цитохромом f, а также подтвердили модель двух функционально существенных путей переноса электрона в пластоцианине. Один предполагаемый путь переноса электрона является относительно коротким
(приблизительно 4А) и включает лиганд меди, подвергшийся воздействию растворителя His-87 в гидрофобном «пэтче», в то время как второй путь намного длиннее (приблизительно 12-15 А) и включает почти консервативный остаток conserved residue Tyr-83 в негативном «пэтче» (Redinbo et al., J. Bioenerg.
Biomembr., т. 26 (1), стр. 49-66 (1994), содержание которого включено для всех целей на основании этой
ссылки.)
Рустицианины
Рустицианины являются медьсодержащими одноцепочечными полипептидами голубой окраски,
-8-
009897
полученными из тиобацилл. Рентгеновская кристаллическая структура оксидированной формы крайне
стабильного и обладающего высоким окислительным действием купредоксин рустицианина из Thiobacillus ferrooxidans (SEQ ID NO: 3) была определена путем многоволновой аномальной дифракции и повышена до разрешающей способности 1,9А. Рустицианины состоят из центральной бета-сэндвич складки,
состоящей из шести- и семитяжевого бета-листа. Как и другие купредоксины, ион меди скоординирован
по кластеру четырех консервативных остатков (His 85, Cysl38, His143, Metl48), структурированных в
виде деформированного тетраэдра. (Walter, R. L. et al., J. Mol. Biol., т. 263, стр. 730-51 (1996) содержание
которого включено для всех целей на основании этой ссылки.)
Псевдоазурины
Псевдоазурины представляют собой семейство медьсодержащих одноцепочечных полипептидов
голубой окраски. Аминокислотная последовательность псевдоазурина, полученная из Achrorraobacter
cycloclastes, проиллюстрирована в SEQ ID NO: 4. Ренгенографический структурный анализ псевдоазурина показывает, что он имеет структуру аналогичную структуре азуринов, хотя между этими белками существует низкая гомология последовательности. Между общей структурой псевдоазуринов и азуринов
имеется два существенных различия. По отношению к азуринам в псевдоазуринах имеется карбоксиконцевое удлинение, состоящее из двух альфа-спиралей. В межпептидной области азурин содержит удлиненную петлю (эта петля укорочена в псевдоазуринах), формирующую клапанный фрагмент, содержащий короткую альфа-спираль. Единственное существенное различие в месте соединения атома меди заключается в конформации МЕТ боковой цепи и длины связи Met-S меди, которая существенно короче в
псевдоазурине, чем в азурине.
II. Цитохром C551
Цитохром С551 из P. aeruginosa (Pa-C551) является мономерным редокс-белком 82 аминокислотных
остатков (SEQ ID NO: 5), участвующих в диссимилятивной денитрификация в качестве физиологического электронного донора нитритредуктазы. Функциональные свойства Pa-C551 были глубоко исследованы.
Реакции с нефизиологическими низкомолекулярными неорганическими редокс-реактантами и с другими
макромолекулами, такими как медьсодержащие белки голубой окраски, эукаритоным цитохромом с и
нитратредуктазой физиологического партнера обеспечили проведение теста на белок-белковый перенос
электрона.
Трехмерная структура Ра-С551, входящая в бактериальный класс I цитохромов, демонстрирует единичный низкоспиновый гем с легированием His-Met и типичной полипептидной складкой, которая, тем
не менее, оставляет кромки пиррольных колец II и III гема открытыми (Cutruzzola et al., J. Inorgan. Chem.,
vol 88, стр. 353-61 (2002), содержание которого включено для всех целей на основании этой ссылки). Отсутствие омега-петли 20 остатков, которая присутствует в классе I цитохромов, вызывает дальнейшее
открытие геминовой кромки на уровне пропионата 13. Распределение заряженных остатков на поверхности Pa-C551 является исключительно анизотропическим: одна сторона богаче кислотными остатками, в то
время как на другой стороне имеется кольцо позитивных боковых цепей, главным образом, лизинов,
расположенных на границе гидрофобных «пэтчей», окружающих геминовую щель. Этот «пэтч» содержит остатки Glyll, Va113, Alal4, Met22, Val23, Pro58, lle59, Pro60, Pro62, Pro63 и Ala65. Анизотропное
распределение зарядов приводит к большому дипольному моменту, являющемуся важным фактором для
формирования комплекса переноса электрона.
О распределении зарядов, описанных выше для Pa-C551, сообщалось в отношении других белков,
участвующих в переносе электрона и их акцепторов электронов. Более того, модификация остатков путем сайт-специфического мутагенеза внутри гидрофобного или заряженного «пэтча» продемонстрировала важность поверхностной комплементарности для связывания и переноса электрона в отношении различных белок ов. В качестве примера подтверждение значимости гидрофобного «пэтча» для свойств переноса электронов азурина из Р. aeruginosa было получено по результатам проведенных исследований по
мутантам остатков Met44 и Met64, измененных на положительно и отрицательно заряженные аминокислоты. (Cutruzzola et al.)
Индукция апоптоза или задержка роста раковых клеток с помощью АТР-независимых цитотоксических факторов
В настоящем изобретении предлагаются способы использования АТР-независимых цитотоксических факторов с целью индуцирования апоптотического некроза клеток или задержки клеточного роста в
раковых клетках. АТР-независимые цитотоксические факторы, такие как соединения купредоксина и
цитохром С551 могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с патологическим нарушением некроза клеток. Хорошо известно, что раковые клетки не подвержены апоптозу. Согласно одному
аспекту настоящего изобретения введение цитотоксического фактора или активного вещества, стимулирующего секрецию цитотоксического фактора в количестве, достаточном для стимулирования апоптоза
раковых клеток или задержки клеточного роста, явится эффективным для уменьшения размера опухоли
in vivo и замедления роста опухоли. Например, проведенные тесты для сравнения эффективности азурина and цитохрома С551 с известными средствами против злокачественной меланомы [5-(3,3'-N,N'диметилтриазен-l-ил)-имидазол-4-карбоксиамид] (DTIC) показывают, что смесь азурина и цитохрома
С551 создает сильнодействующий нетоксичный состав, стимулирующий регрессию опухоли in vivo у бес-9-
009897
тимусных мышей.
В одном примере осуществления настоящего изобретения предлагается способ, в котором лечение с
использованием соединения купредоксина, например азурина, вызывает апоптотический некроз клеток в
раковых клетках. Не ограничиваясь определенной теорией, считается, что цитотоксическая активность
соединения купредоксина обусловлена его способностью формировать комплекс с белком р53, подавляющим опухоль, и стабилизировать его. р53 действует как «подавляющий опухоль» ген, и его недостаточная выработка или инактивация, обусловленная мутацией, может привести к развитию опухоли.
Время полужизни р53 в клетке обычно составляет только несколько минут. Стабилизация р53 обеспечивает существенную генерацию реактивных видов кислорода (ROS), являющихся сильнодействующими стимуляторами апоптоза. Азурин образует комплекс с р53, стабилизирует его и повышает его
внутриклеточный уровень, вызывая тем самым апоптоз по каспаза-3 и капаза-9-зависимым митохондриальным путям (Yamada, Т. et al., Infec. Immun., т. 70, стр. 7054-62 (2002), содержание которого включено
для всех целей данной ссылкой).
Редокс-активность азурина не является важным фактором для его цитотоксической активности. Наоборот, генерация реактивных видов кислорода в процессе формирования комплекса является стимулирующим фактором для апоптоза. (Goto, M. et al., Mol. Microbiol., 47, стр.549-59 (2003), содержание которого включено для всех целей этой ссылки). Например, апо-азурин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, но не содержащий атом меди, обладает значительно более низкой редоксактивностью по сравнению с азурином, но проявляет существенную цитотоксическую активность.
Важность формирования комплекса с р53 проиллюстрирована на основе различий цитотоксической
активности двух мутантных азуринов, С 112D (SEQ ID NO. 6) и двойного мутанта М44КМ64Е (SEQ ID
NO. 7). Связывание меди с остатком Cys-112 является важным для редокс-активности. Мутант C112D,
являющийся недостаточным для сочетания с медью, обладает редокс-активностью, составляющей приблизительно 0,01% от активности азурина, однако проявляет существенную цитотоксичность. При сравнении мутант М44КМ64Е обладает редокс-активностью, составляющей приблизительно 2% от активности азурина, но проявляет незначительную цитотоксичность.
Молекула азурина содержит гидрофобный «пэтч», т.е. место взаимодействия физиологических
партнеров - цитохрома С551 и нитритредуктазы. (Cutruzzola et al.) Мутант C112D, в котором гидрофобный
«пэтч» является неизменным, способен формировать комплексы с р53 и повышать его внутриклеточный
уровень. Тем не менее, двойной мутант М44КМ64Е, в котором электрический диполь создан в гидрофобном «пэтче», не способен формировать такие стабильные комплексы. Следовательно, место взаимодействия с цитохромом С551 и нитритредуктазой также является важным для формирования комплекса с
р53.
Были использованы методы центрифугирования с градиентом плотности глицерина и снижения
глютатион S-трансферазы (GST) (пулдаун методы pull-down methods) для демонстрации взаимодействия
соединений купредоксина с р53. (Yamada et al. (2002)), содержание которого включено для всех целей на
основании настоящей ссылки.) Как известно, р53 образует олигомерные комплексы и осадки гибридного
белка GST-p53 при различных фракциях глицерина, таких как 5, 10, 15, 20 или 25% глицерин, в то время
как осадки азурина при 5% глицерина. Предварительное инкубирование азурина с гибридным белком
GST-p53 с последующим центрифугированием в градиенте плотности глицерина продемонстрировало
присутствие азурина во всех фракциях глицерина, что указывает на его связь с р53. Мутант C112D, но не
мутант М44КМ64Е, продемонстрировал аналогичную связь. (Yamada et al. (2002)).
Предварительное инкубирование гибридного белок a GST-p53 с мутантным азурином М44КМ64Е
изменило олигомеризацию р53, в результате чего большинство GST-p53 было обнаружено при 5-10%
глицерине, где также был обнаружен мутантный азурин. Это указывает на то, что гидрофобный «пэтч»
азурина также участвует во взаимодействии с р53. Потеря гидрофобности азурина не только приводит к
потере цитотоксичности, но также препятствует процессу олигомеризации. Несмотря на то, что мутант
М44КМ64Е демонстрирует незначительное стимулирование апоптоза, он все же проявляет существенное
ингибирование развития клеточного цикла. Таким образом, изменение характера комплекса р53купредоксин способна изменить специфичность р53 от апоптоза до задержки клеточного роста.
Действие азурина зависит от опухолевой клетки, имеющей функциональный подавляющий опухоль
ген р53. Тем не менее, цитотоксические факторы также могут вызвать замедление роста клеток, имеющих недостаточный подавляющий опухоль ген р53. Например, цитохром С551 не воздействует на р53, но
существенным образом повышает уровень подавляющего опухоль белка р16. С551 ингибирует развитие
клеточного цикла на макрофагах, а также повышает эффект азурина. Кроме того, сочетания цитотоксических факторов, таких как азурин и С551 (или М44КМ64Е) позволяют достичь более эффективного ингибирования развития опухоли путем стимулирования как апоптоза, так и задержки клеточного роста.
Ввиду того, что режим действия цитохрома С551 не зависит от состояния р53 в клетке, предлагается
способ регрессии рака в 50% видов раковых заболеваний человека, характеризующихся недостатком подавляющего опухоль гена р53. Дополнительно к С551 другие цитохромы, например, цитохром f из цианобактерий также проявляет цитотоксичность.
- 10 -
009897
Цитотоксические факторы при лечении инфекционных болезней
В другом примере осуществления настоящего изобретения характеристика цитотоксических факторов может быть полезной для идентификации новых веществ, ингибирующих некроз клеток, например
при инфекционном заболевании. Например, ингибирование секреции или активности цитотоксического
фактора, использующего АТР, либо выработки АТР может снизить или устранить цитотоксическую активность проявляемую вызывающим заболевание патогеном.
Соответственно, надлежащее введение соединения, ингибирующего секретирование или активность
цитотоксического фактора, позволяет получить эффективный инструмент для противоинфекционного
развития. Примеры активных веществ, являющихся эффективными для ингибирования цитотоксических
факторов, вызывающих некроз клеток, могут включать антитела для цитотоксических факторов, а также
аналоги АТР, предотвращающие активацию ферментов, использующих АТР. Примеры цитотоксических
факторов и активных веществ для ингибирования или стимулирования секреции или экспрессии цитотоксических факторов включают ферменты, использующие АТР, редокс-белки, активаторы выработки
АТР, ингибиторы выработки АТР, активаторы редокс-белков и ингибиторы редокс-белков, но не ограничены ими.
Фармацевтические композиции, включающие цитотоксические факторы
Фармацевтические композиции, включающие цитотоксические факторы, могут быть изготовлены с
использованием любых известных технологий, например, с использованием технологий смешивания,
растворения, гранулирования, дражерования, эмульгирования, инкапсулирования, поглощения или лиофилизирования. В основном чистый цитотоксический фактор или иное вещество могут быть включены в
фармацевтически приемлемый носитель, хорошо известный в данной области техники. Такие носители
позволяют изготовить препарат в виде таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, геля, сиропа, взвеси, суспензии и т.п. Приемлемые наполнители также могут включать, например, добавки и препараты
целлюлозы. Другие наполнители могут включать, например, ароматизаторы, красители, разрыхлители,
загустители и иные приемлемые добавки, активаторы или связующие вещества.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы при лечении заболеваний, связанных с некрозом клеток, или при его профилактике. В основном чистый цитотоксический фактор может быть введен в количестве достаточном для профилактики или лечения заболевания,
связанного с некрозом клеток. Обычно организм-хозяин является млекопитающим, таким как человек
или животное.
Введение композиций, включающих цитотоксические факторы
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены путем использования
любого приемлемого способа, например орально, буккально, ингаляционно, подъязычно, ректально, вагинально, трансуретрально, назально, местно, чрезкожно, т.е., трансдермально или парентерально (включая внутривенное, внутримышечное, подкожное и внутрикоронарное введение). Композиции и их фармацевтические лекарственные формы могут быть введены в любом количестве, являющимся эффективным для достижения поставленной цели. В частности, вводится в терапевтически эффективном количестве.
В различных примерах осуществления композиция цитотоксических факторов включает носители и
наполнители (включая буферные растворы, углеводы, маннитол, белки, полипептиды или аминокислоты,
такие как глицин, антиоксидатны, бактериостаты, хелатные добавки, суспендирующие агенты, загустители и (или) консерванты, но не ограниченные ими), воду, масла, солевые растворы, водные растворы
декстрозы и глицерина, другие фармацевтически приемлемые дополнительные вещества в целях соответствия физиологическому состоянию, такие как буферные вещества, регулирующие тонус вещества,
смачивающие вещества и т.д. Следует признать, что, несмотря на то что любой приемлемый носитель,
известный специалистам в данной области техники, может быть использован для введения композиций в
соответствии с настоящим изобретением, тип носителя будет зависеть от способа введения. Соединения
также могут быть инкапсулированы внутри липосом на основе использования хорошо известных технологий. В качестве носителей для фармацевтических составов в соответствии с настоящим изобретением
могут быть также применены биоразложимые микросферы. Описание приемлемых биоразложимых микросфер изложено, например, в патентах США №№ 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883;
5853763; 5814344 и 5942252.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением можно стерилизовать с использованием известных способов стерилизации или подвергнуть стерильной фильтрации. Полученные водные растворы
можно упаковывать для применения в исходном виде или могут быть лиофилизировать, при этом лиофилизированный препарат комбинируют со стерильным раствором до его введения.
Композиции цитотоксических факторов в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться
различными способами, в том числе путем инъекций (например, интрадермально, подкожно, внутримышечно, интраперитонеально и т.д.), ингаляций, местно, суппозитарно, с использованием чрезкожного
пластыря или орально.
При инъекционном введении цитотоксический фактор может быть получен в водных растворах,
предпочтительно в физиологически совместимых буферных растворах, таких как раствор Хэнкса, рас- 11 -
009897
твор Рингера или физиологический солевой буферный раствор. Раствор может содержать рецептурные
вещества, например суспендирующие, стабилизирующие и (или) диспергирующие вещества. Кроме того,
композиция цитотоксических факторов может иметь порошкообразную форму для включения ее в состав
приемлемого растворителя, например стерильной апирогенной воды до его применения.
При ингаляционном введении цитотоксические факторы могут вводиться в виде аэрозольного спрея
из баллончика или аэрозольного аппарата с применением приемлемого газа-вытеснителя, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, двуокиси углерода или иного приемлемого газа. В случае аэрозоли, подаваемой под давлением, дозировочное устройство может быть снабжено клапаном для подачи
дозированного количества аэрозоли. Могут быть изготовлены, например, желатиновые капсулы или ампулы, содержащие порошковую смесь белков и приемлемой порошковой основы, такой как лактоза или
крахмал для применения в ингаляторах или инсуффляторах.
При местном введении композиция цитотоксических факторов может быть получена в виде растворов, гелей, мазей, кремов, суспензий и т.д., которые хорошо известны в данной области техники. В ряде
примеров осуществления введение производится с помощью чрезкожного пластыря. При суппозитарном
введении (например, ректально или вагинально) композиции цитотоксических факторов могут быть также получены в составах, содержащих известные суппозитарные основы.
При оральном введении композиция цитотоксических факторов может быть получена путем смешивания цитотоксического фактора с фармацевтически приемлемыми носителями хорошо известными в
данной области техники. Может быть использован твердый носитель, такой как маннитол, лактоза, стеарат магния и т.д.; такие носители обеспечивают получение хемотаксина в виде таблеток, пилюль, драже,
капсул, жидкости, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для их приема вовнутрь пациентом, принимающим лечение. Для оральных твердых лекарственных форм, например таких как порошки, капсулы и
таблетки, приемлемые наполнители включают добавки, такие как сахара, препараты целлюлозы, гранулирующие вещества и связывающие вещества.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие цитотоксические факторы, могут быть вставлены в
векторы и использованы в качестве векторов генной терапии. Векторы генной терапии могут быть введены пациенту, например, путем внутривенной инъекции, местно (Nabel et al., Патент США №. 5328 470
1994. США) или путем стереотаксической инъекции (Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA, т. 91, стр. 30547 (1994). Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать приемлемый растворитель или матрицу с замедленным высвобождением лекарственного вещества, в которую внедрен носитель для доставки гена. В альтернативном случае, когда полный вектор для доставки гена может быть
получен неповрежденным из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, вырабатывающих систему для доставки
гена.
Другие удобные носители, хорошо известные в данной области техники, также включают многовалентные носители, такие как бактериальный капсулярный полисахарид, декстран или генно-инженерный
вектор. Кроме того, композиция с замедленным высвобождением, включающая молекулы цитотоксических факторов, обеспечивает высвобождение цитотоксических факторов в течение длительного периода
времени таким образом, чтобы без композиции с замедленным высвобождением цитотоксический фактор был выведен из организма пациента и (или) разрушен, например, протеазами или путем проведения
простого гидролиза до проявления или повышения терапевтического эффекта.
Точный рецептурный состав, способ введения и дозировка определяются лечащим врачом с учетом
состояния пациента. Доза и интервал времени между приемами могут регулироваться индивидуально
для обеспечения уровней плазмы активного цитотоксического фактора, которые являются достаточными
для поддержания терапевтического эффекта. Как правило, требуемый цитотоксический фактор вводится
в смеси с фармацевтическим носителем, выбранным в зависимости от требуемого способа введения и
обычной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции, используемые в соответствии с
настоящим изобретением, могут быть получены известными способами с применением одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включающих наполнители и вспомогательные вещества, облегчающие переработку цитотоксического фактора, активных веществ для ингибирования или
стимулирования секреции цитотоксических факторов или их смесей в препараты для терапевтического
применения.
В одном примере осуществления доставка цитотоксического фактора осуществляется в виде ДНК
таким образом, чтобы полипептид вырабатывался in situ. В одном примере осуществления ДНК является
«безоболочечной», как описывают, например, Ulmer et al., Science, т. 259, стр.-1745-49 (1993) и рассматривает Cohen, Science, т. 259, стр. 1691-92 (1993). Усвоение безоболочечной ДНК может быть повышено
путем нанесения ДНК на носитель, например, биоразложимые сферические частицы, которые эффективно переносятся в клетки. При применении таких способов ДНК может присутствовать внутри любой из
широкого диапазона систем доставки, известных специалистам в данной области техники, включая системы экспрессии нуклеиновых кислот и системы экспрессии бактерий и вирусов. Способы включения
ДНК в такие системы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области техники. (См., например, W090/11092, W093/24640, WO 93/17706 и патент США № 5736524).
- 12 -
009897
Векторы, используемые для челночной транспортировки генетического материала от организма к
организму, могут быть разделены на два основных класса: клонирующие векторы воспроизводят плазмиду или бактериофаг с областями, являющимися несущественными для распространения в соответствующей клетке-хозяине и в которые может быть введена чужеродная ДНК; чужеродная ДНК воспроизводится и распространяется, как если бы она являлась компонентом вектора. Вектор экспрессии (например, плазмида, дрожжи и геном вируса животных) используется для введения чужеродного генетического материала в клетку-хозяин или ткань с целью транскрипции или трансляции чужеродной ДНК, например ДНК цитотоксического фактора. В векторах экспрессии введенная ДНК функционально связана
с такими элементами, как промоторы, сигнализирующие клетке-хозяину транскрибировать вставленную
ДНК. Некоторые промоторы являются исключительно эффективными, например индуцируемые промоторы, регулирующие транскрипцию гена в ответ на специфические факторы. Функциональное связывание полинуклеотида цитотоксического фактора с индуцируемым промотором позволяет регулировать
экспрессию полипептида цитотоксического фактора или фрагментов. Примеры классических индуцируемых промоторов включают промоторы, реагирующие на α-интерферон, тепловой удар, ионы тяжелых металлов и стероиды, например глюкокортикоиды (Kaufman, Methods Enzymol., т. 185, стр. 487-511
(1990)) и тетрациклин. Другие требуемые индуцируемые промоторы включают промоторы, не являющиеся эндогенными для клеток, в которые вводится конструкция, но, тем не менее, реагирующие в тех
клетках, когда экзогенно подается стимулирующее вещество. В целом, эффективными векторами экспрессии часто являются плазмиды. Тем не менее, рассматриваются другие формы векторов экспрессии,
такие как вирусные векторы (например, воспроизведение дефектных ретровирусов, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов).
Выбор вектора обусловливается используемым организмом или клетками и желаемым предназначением вектора. В целом, векторы включают единичные последовательности, области начала репликации, маркерные гены, элементы энхансера, промоторы и последовательности, терминирующие транскрипцию.
Комплекты, включающие цитотоксические факторы
Согласно одному аспекту изобретения предлагается комплект, содержащий один или несколько
следующих компонентов, находящихся в упаковке или таре: (1) биологически активная композиция,
включающая цитотоксический фактор; (2) фармацевтически приемлемый адьювант или наполнитель; (3)
аппарат для введения, например шприц; и (4) инструкции по введению. Также рассматриваются примеры
осуществления, в которых два или несколько компонентов (1) - (4) находятся в одной и той же таре.
При поставке комплекта различные компоненты композиции могут быть упакованы в отдельную
тару и смешаны непосредственно перед употреблением.
Раздельная упаковка компонентов обеспечивает их длительное хранение без потери функций активных компонентов.
Реагенты, включенные в комплекты, могут поставляться в таре любого вида таким образом, чтобы
сохранялся срок годности различных компонентов и чтобы они не были адсорбированы или изменены
материалом тары. Например, герметичные стеклянные ампулы могут содержать лиофилизированный
цитотоксический полипептид, либо полинуклеотид, либо буферные растворы, которые были упакованы в
нейтральной, нереакционной атмосфере газа, такого как азот. Ампулы могут быть изготовлены из любого приемлемого материала, такого как стекло, органические полимеры, например поликарбонат, полистирол и т.д., керамика, металл или любой иной материал, обычно используемый для хранения аналогичных реагентов. Другие примеры приемлемой тары включают простые бутылки, которые могут быть
изготовлены из аналогичных веществ, как и ампулы, и мягкую упаковку, имеющую внутреннее покрытие из фольги, например из алюминия или сплава. Другие виды тары включают пробирки, пузырьки,
флаконы, бутылки, шприцы и т.д. Тара может быть снабжена стерильным входным отверстием, и как
бутылки снабжена пробкой, которую можно проколоть иглой шприца для подкожных впрыскиваний.
Другие виды тары могут быть снабжены двумя отделениями, разделенными легко удаляемой мембраной,
после удаления которой обеспечивается смешивание компонентов. Удаляемые мембраны могут быть
изготовлены из стекла, пластика, резины и т.д.
Комплекты также могут быть снабжены инструкциями. Инструкции могут быть отпечатаны на бумаге или ином носителе и (или) могут поставляться в виде машиночитаемого носителя, такого как гибкий диск, CD-ROM, DVD-ROM, Zip диск, видеопленка, аудиопленка и т.д. Детальные инструкции могут
быть не связаны физически с комплектом; вместо этого пользователю может быть дано указание обратиться к веб-сайту в Интернете, указанному производителем или дистрибьютором комплектов, либо инструкции могут направляться по электронной почте.
Стимулирование и ингибирование секреции цитотоксических факторов
Идентификация и характеристика цитотоксических факторов также может привести к разработке
способов стимулирования секреции цитотоксических факторов. Как было показано, патогенные организмы секретируют большое количество цитотоксических факторов в присутствии белков млекопитающих. Этот принцип может быть модифицирован в организме человека с целью создания новых способов
стимулирования требуемого или ингибирования нежелательного производства цитотоксических факто- 13 -
009897
ров. Такие способы являются эффективными для ингибирования или стимулирования апоптоза клеток
или инициирования задержки клеточного роста. Понимание цитотоксических факторов, а также их исследование и разработка также обеспечивают разработку лекарственных препаратов и скрининга активных веществ и соединений, приемлемых для модулирования активности или секреции цитотоксических
факторов. Понимание механизма секреции, связанного с секрецией цитотоксических факторов в клетках,
создает новые дополнительные пути разработки и создания эффективных ингибиторов или стимуляторов
цитотоксических факторов. Разграничение и идентификация присутствия рецепторов для белков животных также могут быть использованы в качестве средства дифференциации между вирулентными и авирулентными микроорганизмами, которые могут обеспечить специфичный подход при лечении заболевания.
Модификация цитотоксических факторов
Цитотоксические факторы также могут быть химически модифицированы или генетически изменены с целью получения вариантов, у которых отсутствует фермент, использующий АТР, или редоксактивность, но которые сохраняют токсичность. Мутации и (или) процессинг цитотоксических факторов
обеспечивают получение цитотоксических веществ с изменяющимися составами, которые также демонстрируют функциональную активность. В частности, процессированные производные с высокой эффективностью и низкой антигенностью могут быть получены из исходного цитотоксического фактора. Такие
модифицированные или измененные цитотоксические факторы также включены в объем настоящего
изобретения.
Различные производные цитотоксических факторов могут быть синтезированы с применением
стандартных способов. Производные представляют собой аминокислотные последовательности, сформированные из нативных соединений либо непосредственно, либо путем модификации, либо путем частичного замещения. Аналоги представляют собой аминокислотные последовательности, имеющие
структуру аналогичную, но не идентичную нативному соединению, однако отличающуюся от нее в отношении определенных компонентов или боковых цепей. Аналоги могут быть синтезированы или могут
иметь различное эволюционное происхождение.
Производные и аналоги могут иметь полную или неполную длину, если производное или аналог
содержат модифицированную аминокислоту. Производные или аналоги цитотоксических факторов
включают молекулы, содержащие области, которые, в основном, являются подобными цитотоксическим
факторам как минимум приблизительно на 65, 70, 75, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности по аминокислотной последовательности идентичного размера или при сравнении с совмещенной последовательностью, в которой совмещение реализуется по гомологическому алгоритму.
Дополнительно к естественным аллельным вариантам цитотоксических факторов изменения могут
быть проведены путем мутации в цитотоксические факторы, вызывающие изменения в аминокислотных
последовательностях кодированных цитотоксических факторов, которые не изменяют в значительной
степени цитотоксическую активность. «Неосновной» остаток аминокислоты является остатком, который
может быть преобразован из последовательностей цитотоксических факторов дикого типа без изменения
биологической активности, в то время как «основной» остаток аминокислоты является необходимым для
такой биологической активности. Например, прогнозируется, что аминокислотные остатки, сохраняемые
среди цитотоксических факторов настоящего изобретения, практически не поддаются изменению. Аминокислоты, для которых могут быть произведены консервативные замещения, хорошо известны в данной
области техники.
Эффективные консервативные замещения приведены в табл. 1 «Предпочтительные замещения».
Консервативные замещения, обеспечивающие замену аминокислоты одного класса другой аминокислотой того же типа, подпадают под объем изобретения при условии, что замещение существенным образом
не изменяет биологическую активность соединения.
- 14 -
009897
Таблица 1. Предпочтительные замещения
Неконсервативные замещения, воздействующие на: (1) структуру главной цепи полипептида, такую
как β-лист или α-спиральную конформацию, (2) заряд, (3) гидрофобность или (4) большую часть боковой цепи целевого места связывания, могут модифицировать функцию цитотоксического фактора. Остатки разделены на группы, исходя из общих свойств боковой цепи, как показано в табл. 2. Неконсервативные замещения приводят к замене одного представителя этих классов на другой класс. Замещения
могут быть внедрены в консервативные места замещений или более предпочтительно в неконсервативные места.
Таблица 2. Классы аминокислот
Варианты полипептидов могут быть изготовлены с применением известных в данной области техники способов, таких как олигонуклеотидный (сайт-специфический) мутагенез, аланиновое сканирование и PCR мутагенез. Сайт-специфический мутагенез (Carter, Biochem J., т. 237, стр. 1-7 (1986); Zoller and
Smith, Methods Enzymol., т. 154, стр. 329-50 (1987)), кассетный мутагенез, мутагенез рестрикционного
выбора (Wells et al., Gene, т. 34, стр. 315-23 (1985)) или другие известные способы могут быть применены
для обработки клонированной ДНК с целью получения варианта ДКН цитотоксического фактора.
Цитотоксическая активность мутантов C112D и М44КМ64Е цитотоксического фактора описана
выше. Кроме того, в примере 19 показана цитотоксическая активность ряда химерных мутантов азурина,
- 15 -
009897
полученных с применением метода сайт-специфического мутагенеза в соответствии с описанием в примере 18. В настоящем изобретении также могут использоваться цитотоксические факторы, такие как апоазурин, в которых отсутствует атом меди. Как апо-азурин, так и мутант C112D проявляют значительную
цитотоксическую активность, в то время как мутант М44КМ64Е не проявляет ее. Тем не менее, мутант
М44КМ64Е все же вызывает существенное ингибирование прогрессии клеточного цикла.
В одном примере осуществления настоящего изобретения используются мутировавшие цитотоксические факторы, сохраняющие способность формировать комплекс с р53 и стабилизировать р53 и, следовательно, вызывать апоптоз. В другом примере осуществления настоящего изобретения используются
мутировавшие цитотоксические факторы, такие как мутант М44КМ64Е, обладающие способностью
взаимодействовать с р53 и вызывать задержку клеточного роста.
Более полное понимание настоящего изобретения может быть получено со ссылкой на нижеприведенные конкретные примеры. Примеры описываются исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают объема изобретения. Изменения формы и замена эквивалентов рассматриваются в зависимости от обстоятельств или целесообразности. Несмотря на то что в настоящем описании использовались
конкретные термины, такие термины являются описательными и не используются в целях ограничений.
Могут быть предложены изменения и варианты настоящего изобретения, не выходящие за пределы существа и объема изобретения, и, таким образом, могут быть введены только те ограничения, которые
определены в прилагаемой формуле.
Примеры
Пример 1. Стимулирование секреции цитотоксических факторов белками млекопитающих.
Клинические и экзогенные изоляты (по пять каждого) В. cepacia выращивали в бульоне протеозного
пептонно-дрожжевого экстракта (ППД) с добавлением и без добавления α2-макроглобулина (1 мг/мл).
После выращивания в течение 10 ч при 34°С на шейкере часть среды для выращивания из каждой культуры центрифугировали и супернатант фильтровали через 0,22 мкм миллипористый фильтр для удаления
целых клеток и остатков. Далее отфильтрованный супернатант тестировали на активность аденилаткиназы в соответствии с описанием в Melnikov A. et al, Mol. Microbiol., 36: 1481-1493 (2000). Аденилаткиназа
переносит концевой фосфат с [Y-32P] АТР на AMP, при этом получают ADP. Продукты этой реакции
далее были обнаружены с применением метода тонкослойной хроматографии. Секреция аденилаткиназы
была минимальной в том случае, когда клетки В. cepacia выращивали в бульоне протеозного пептоннодрожжевого экстракта (ППД). Тем не менее, секреция из клинических изолятов, но не в отношении экзогенных изолятов, стимулировалась в присутствии α2-макроглобулина.
Иммуннофлюоресцентная микроскопия с антителом анти-α2-макроглобулина показала, что клинические изоляты имеют рецепторы, связывающие α2-макроглобулин, в то время как такие рецепторы отсутствуют у экзогенных изолятов. Клинические и экзогенные изоляты В. cepacia выращивали при отсутствии и в присутствии 1 мг/мл α2-макроглобулина в бульоне в течение 1 ч. Посторонний α2макроглобулин удаляли путем промывания фосфатно-солевым буферным раствором. Клетки инкубировали в течение 2 ч с антителами α2-макроглобулина, конъюгированными флуоресцеинизотиоцианатом
(FITC), полученными путем введения инъекции α2-макроглуболина кроликам. После промывания фосфатно-солевым буферным раствором клетки, обработанные антителами, конъюгированными FITC, сгущали в 16% параформальдегиде, наносили на покрытое поли-L-лизином предметное стекло и исследовали с применением конфокальной микроскопии. Флуоресцировали только клинические изоляты, проявившие повышенную секрецию цитотоксических факторов в присутствии α2-макроглобулина (зеленые
флуоресцирующие клетки), тем самым демонстрируя присутствие рецепторов для α2-макроглобулина.
Пример 2. Киллинг АТР-зависимого макрофага отфильтрованным супернатантом или фракциями
колоночной хроматографии, полученными из среды для выращивания В. cepacia.
Клинический штамм В. cepacia (штамм 38 - коллекционный номер 95828, D. G. Allison, University of
Manchester Institute of Science and Technology, Manchester, UK) выращивали в ТВ бульоне (10 г Бактотриптона, 3 г бакто-мясного экстракта на литр воды) при 34°С на качалке до OD550HM (оптической плотности), составляющей 1,3. Далее среду для выращивания центрифугировали и фильтровали через 0,22 мкм
миллипористый фильтр для удаления целых клеток и остатков. Клетки макрофагов изолировали от клеточных линий J774 и выращивали в среде RPMI-1640 (GIBRO-BRL, Grand Island, N. Y.) в соответствии с
описанием Zaborina О. et al., Infect. Immun. 67: 5231-5242 (1999). Отфильтрованную среду для выращивания добавляли последовательно к гидроксиапатитовым, АТР-агарозным и Q-сефарозным колонкам. Проточную фракцию из гидроксиапатитовой колонки (HAFT) фракционировали на АТР-агарозной колонке
(AAFT). Далее AAFT фракцию фракционировали на Q-сефарозной колонке (QSFT).
106 макрофагов добавляли в ячейки в планшете с 96 ячейками и инкубировали в течение двух часов
в инкубаторе в атмосфере СО2 для присоединения. 2 мкг белка из супернатанта или проточной фракции
из каждой из вышеперечисленных колонок добавляли в ячейки и планшеты инкубировали в 4 ч в присутствии или при отсутствии 1,0 мМ АТР. Степень некроза макрофагальных клеток далее измеряли по
секреции внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы (LDH) в соответствии с описанием Zaborina
О. et al., Infect. Immun., 67: 5231-5242 (1999). Степень киллинга макрофагов в присутствии или при от- 16 -
009897
сутствии 1,0 мМ АТР отфильтрованного супернатанта (SUP) и фракциями колонок HAFT, AAFT и QSFT
приведена на фиг. 1. Все анализы были проведены с трехкратным повторением и указаны планки погрешностей («усы»).
Пример 3. Киллинг АТР-независимых макрофагов отфильтрованным супернатантом или фракциями колоночной хроматографии, полученными из среды для выращивания В. cepacia.
Супернатант (SUP) и фракции колоночной хроматографии (HAFT, AAFT и QSFT) среды для выращивания В. cepacia аналогичны тем, что использовались в примере 2. Изоляцию макрофагов проводили
аналогичным образом, как и в примере 2. Степень некроза макрофагальных клеток определяли на основе
секреции LDH, как и в примере 2, и она проиллюстрирована на фиг. 2. Только фракция QSFT проявляет
высокую АТР-независимую цитотоксичность по отношению к макрофагам.
Пример 4. Индукция апоптоза в макрофагах, вызываемая цитотоксическим фактором P. Aeruginosa.
P. aeruginosa выращивали в среде Луриа при 37°С в течение 12 ч до оптической плотности OD550HM,
составляющей 1,2. Далее среду для выращивания центрифугировали и фильтровали супернатант через
фильтр 0,22 мкм. Сбор супернатанта (SUP) и фракций колоночной хроматографии (HAFT, AAFT и
QSFT) производили аналогичным образом, как и в примере 2. Макрофаги получали, как и в примере 2. 2
мкг белка из супернатанта или одной из проточных фракций добавляли к 1×105 макрофагам в 200 мкл
среды RPMI, и смесь инкубировали в течение ночи. Индукцию апоптоза в макрофагах либо необработанных, либо обработанных инкубированием в течение ночи SUP или фракциями HAFT, AAFT или
QSFT измеряли с помощью конфокальной микроскопии с применением набора ApoAlert Mitochondria
Membrane Sensor (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.) в соответствии с описанием
Zaborina О. et al., Microbiology 146:2521-2530(2000).
При проведении этого анализа здоровые, неапоптотические клетки флуоресцируют красным цветом, в то время как апоптотические мертвые клетки флюоресцируют зеленым цветом. Сочетание красного и зеленого цветов создает желтые флюоресцирующие клетки, представляющие собой апоптотические
умирающие клетки. Необработанные макрофаги или макрофаги, обработанные в течение ночи фракциями SUP, HAFT или AAFT, флуоресцировали главным образом красным цветом, указывая на отсутствие
апоптотического некроза клеток. Макрофаги, обработанные в течение ночи фракцией QSFT, флуоресцировали главным образом зеленым цветом, что указывало на апоптотический некроз большинства макрофагов. Хронометрирование показало, что апоптоз наступил приблизительно через 6 часов (на что указывает сочетание красной и зеленой флуоресценции, создающей зеленый цвет клеток) и завершился через
12-16 ч.
Пример 5. Индукция апоптоза в мастоцитах, вызываемая цитотоксическими факторами В. cepacia.
Мастоциты получали, используя способ, описанный Melnikov A. et al., Mol. Microbiol. 36: 1481-1493
(2000). Фракционированную среду для выращивания В. cepacia приготавливали, как и в примере 2. Индукцию апоптоза в мастоцитах, вызываемую цитотоксическим фактором В. cepacia, определяли с использованием конфокальной микроскопии, в соответствии с описанием в примере 4.
Необработанные мастоциты или мастоциты, обработанные в течение ночи супренатантом и фракциями HAFT или AAFT среды для выращивания В. cepacia, флуоресцировали главным образом красным
цветом, что указывает на отсутствие апоптотического некроза клеток. Мастоциты, обработанные в течение ночи фракцией QSFT среды для выращивания В. cepacia, флуоресцировали главным образом зеленым цветом, что указывает на апоптотический некроз большинства мастоцитов.
Пример 6. Индуцкция апоптоза в макрофагах, вызываемая фракциями QSFT В. cepacia и М. Bovis.
Макрофаги получали как и в примере 2. Индукцию апоптоза в макрофагах, вызываемую цитотоксическими факторами В. cepacia и М. bovis, измеряли с использованием методов, изложенных в примере
4. Индукция апоптоза макрофагов наблюдалась при их обработке фракциями QSFT В. cepacia и М. bovis.
Пример 7. Измерение активности каспазы (каспазы-3 и каспазы-9) в цитозольных экстрактах макрофагов, обработанных фракцией QSFT В. cepacia
Макрофаги получали как и в примере 2. Макрофаги обрабатывали в течение ночи фракцией QSFT
В. cepacia с использованием способа, описанного в примере 2. Подготовку цитозольного экстракта макрофагов и анализ каспазы проводили как описано у Zaborina О. et al., Microbiology 146: 2521-2530 (2000).
Определение активности каспазы-3 было проведено с использованием Ас-DEVD-pNA (N-ацетилAsp-Glu-Val-Asp-p-N02-анилин) в качестве субстрата. Секрецию pNA (р-нитроанилин) определяли спектрофотометрически при 405 нм из субстрата каспазы-3 (200 мкм) после инкубирования в течение 15, 30,
45, 60, 75 и 90 мин при 37°С (фиг. 3А) с неидуцированным цитозольным экстрактом макрофагов, и цитозольный экстракт макрофагов инкубировали в течение ночи с фракцией QSFT В. cepacia (10 мкг белка), и
цитозольный экстракт макрофагов инкубировали в течение ночи с фракцией QSFT В. cepacia (10 мкг
белка) с добавлением ингибитора (DEVD-CHO). В каждом случае использовали 10 мкг цитозольного
белка макрофагов.
При проведении анализов каспазы-9 секрецию pNA из 200 мкМ субстрата каспазы-9 Ac-LEHD-pNA
(N-ацетил-Leu-Glu-His-Asp-р-NO2-анилин) определяли после 15, 30, 45, 60, 75 и 90 мин инкубирования
(фиг. 3В) с неиндуцированным цитозольным экстрактом макрофагов; цитозольный экстракт макрофагов
инкубировали в течение ночи с фракцией QSFT B. cepacia (10 мкг белка) и цитозольный экстракт макро- 17 -
009897
фагов инкубировали в течение ночи с фракцией QSFT В. cepacia (10 мкг белка) с добавлением ингибитора (LEHD-CHO). В каждом случае использовали 10 мкг цитозольного белка макрофагов.
DEVD-CHO и LEHD-CHO соответственно блокируют активность каспазы-3 и каспазы-9, и их можно приобрести у Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, U.S.A. Активности как каспазы-9,
так и каспазы-3 повышались при обработки макрофагов в течение ночи фракцией QSFT В. cepacia (фиг.
3А и В).
Указанные активности оставались на исключительно низком уровне для необработанных макрофагов или в присутствии ингибитора, что указывает на тот факт, что индукция апоптоза, вызываемая фракциями QSFT, включает активацию каспазы.
Пример 8. Анализ TUNEL для измерения ядерной фрагментация ДНК в макрофагах, обработанных
фракциями QSFT M. bovis или В. cepacia.
Фракционированная среда для выращивания В. cepacia была получена с использованием способа,
описанного в примере 2. М. bovis BCG выращивали в среде Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories, Maryland, U.S.A.) с добавлением 2% глицерина, 0,02% TWEEN®80 и ADC (альбумин/декстроза/цитрат) (поставляемые Difco Laboratories, Maryland, U.S.A.). Бактерии выращивали в течение нескольких дней при
32°С на шейкере до сбора клеток, выросших в культуре. Фракционированная среда для выращивания М.
bovis была получена с использованием способа, описанного в примере 2. Макрофаги получали, как и в
примере 2. Индукцию апоптоза в макрофагах, либо необработанных, либо обработанных в течение ночи
инкубированием с SUP или фракциями HAFT, AAFT или QSFT измеряли с помощью конфокальной
микроскопии путем обнаружения ядерной фрагментации ДНК, индуцированной апоптозом, с использованием набора ApoAlert DNA Fragmentation (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.).
Данный анализ основан на методе dUTP ник-мечения по концам (TUNEL) с участием концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы (Tdt), где Tdt катализирует включение флюоресцеина-dUTP на свободных 3'гидроксильных концах фрагментированной ДНК в клетках, в которых протекает апоптоз. Включение
флюоресцеина-dUTP в ядерную фрагментрированную ДНК создает флюоресценцию зеленого цвета, обнаруживаемую с помощью конфокальной микроскопии.
Макрофаги, обработанные фракциями либо QSFT M. bovis, либо В. cepacia, продемонстрировали
желто-зеленое ядро на красном цитоплазматическом фоне, что указывает на ядерную фрагментацию
ДНК. Наблюдалась незначительная фрагментация или ее полное отсутствие у необработанных макрофагов или у макрофагов, обработанных другими фракциями на колонках.
Пример 9. SDS-PAGE анализ белков в супернатанте и фракциях AAFT, HAFT и QSFT среды для
выращивания из P. aeruginosa, В. cepacia и М. Bovis.
SDS-PAGE сепарация продемонстрировала, что белки присутствуют в супернатанте и во фракциях
AAFT, HAFT и QSFT P. aeruginosa, В. cepacia и М. bovis. Средняя фракция QSFT из мукоидного штамма
8821 Р. aeruginosa показала присутствие двух полос: полосы 18 kDa, соответствующей азурину, путем
проведения N-концевого анализа и полосы 9 kDa, соответствующей цитохрому С551. Фракция QSFT B.
cepacia показала присутствие трех преобладающих полос: 75, 20 и 8 кДа. N-концевая аминокислотная
последовательность 10 аминокислот полосы 20 кДа (AHHSVDIQGN), определенная путем расщепления
белков по Эдману, продемонстрировала 80% гомологию последовательности к полосе N-концевой 10
аминокислотной последовательности азурина Р. aeruginosa, в то время как N-концевая аминокислотная
последовательность полосы 10 аминокислот полосы 8 kDa (EDPEVLFKNK) продемонстрировала 100%
совпадение с полосой цитохрома C551 P. aeruginosa. Таким образом, фракции QSFT, обладающие высокой
цитотоксической активностью как Р. aeruginosa и B. cepacia, продемонстрировали обогащение редоксбелок ами типа азурин и цитохром c551. В противоположность этому фракция QSFT M. bovis продемонстрировала толстую полосу 65 кДа бычьего сывороточного альбумина (BSA), являющегося составной
частью среды 7Н9, используемой для выращивания М. bovis, а также несколько полос с молекулярной
массой свыше 45 кДа, но не белки типа 8 кДа или 22 кДа цитохром C551 или азурин.
Пример 10. Некроз клеток в макрофагах, обработанных азурином/цитохромом C551.
Очищенный азурин и цитохром C551 (Sigma Chemicals, St. Louis U.S.A.) добавляли к макрофагам,
полученным как и в примере 2, и смесь инкубировали в течение 2 ч. Уровни концентрации азурина и
цитохрома C551 являлись такими же, как и на фиг. 4. Числа обозначают количество белка в мкг. Некроз
макрофагов измеряли на основе секреции межклеточной ферментной лактатдегидрогеназы (LDH) с использованием способа примера 2. Как азурин, так и цитохром C551 вызывали некроз макрофагов. Сочетание азурина и цитохрома C551 вызвало более обширный некроз макрофагов. Буферный контроль (буфер)
показан справа (фиг. 4).
Пример 11. Индукция апоптоза в макрофагах, обработанных азурином/цитохромом C551.
Макрофаги получали, как и примере 2. Макрофаги обрабатывали азурином/цитохромом С551 (50/25
мкг) в течение 4 и 6 ч, и затем исследовали с помощью конфокальной микроскопии, используя комплект
ApoAlert Mitochondria Membrane Sensor, как и в примере 4, с целью определения степени апоптоза. Макрофаги продемонстрировали повышающиеся уровни апоптоза при увеличении длительности инкубации
в присутствии смеси азурина и цитохрома C551. Контрольные макрофаги без обработки (обработанные
фосфатно-солевым буферным раствором в течение 6 ч) не проявили апоптоз.
- 18 -
009897
Пример 12. Цитотоксичность смеси азурина/цитохрома C551 или фракций QSFT, полученных из B.
cepacia или М. bovis, в макрофагах после предварительной обработки антителами антиазурина и антицитохрома C551.
Макрофаги получали, как и в примере 2. Макрофаги обрабатывали очищенной смесью азурина/цитохрома C551 (50/25 мкг) или фракциями QSFT В. cepacia или М. bovis в присутствии или при отсутствии смеси антител антиазурина и антицитохрома C551, подготовленной в кроликах. Антитела смешивали в соотношении 1:1, и смешанные антитела (1, 2, 3 или 4 мг) использовали для обработки макрофагов.
Степень некроза макрофагов определяли на основе секреции LDH, как и в примере 2. На фиг. 5
проиллюстрировано снижение цитотоксичности по отношению к макрофагам, обработанным смесью
азурина/цитохрома C551 (А + С) или фракцией QSFT, полученной из В.cepacia (Bc-QSFT), в присутствии
антител антиазурина и антицитохрома C551. Такое снижение не наблюдалось с фракцией QSFT, полученной из М. bovis (Mb-QSFT).
Следовательно, при обработке смеси азурина/цитохрома C551 или фракции QSFT В. cepacia смесью
антител антиазурина и антицитохрома C551 и при дальнейшем анализе на цитотоксичность макрофагов,
цитотоксичность в значительной степени была снижена. В противоположность этому, если фракции
QSFT M. bovis, у которой, как ранее было продемонстрировано путем проведения анализа SDS-PAGE,
отсутствуют полосы азурина и цитохрома C551 (пример 9), предварительно обрабатывают антителами
антиазурина/антицитохрома C551, то при проведении дальнейшего анализа на цитотоксичность наблюдается крайне незначительное снижение цитотоксичности.
Пример 13. Индукция апоптоза в линиях опухолевых клеток с помощью фракции QSFT В. cepacia и
азурина/цитохрома C551 согласно измерениям конфокальной микроскопии.
Клеточные линии легочной карциномы Н460, рака яичника РА-1, рака груди NCF, рака толстой
кишки НТ-29 и лейкемии НТ-1080 были получены из Американской типовой коллекции культур микроорганизмов (Manassas, VA, U.S.A.). Клеточные линии рака груди MDD7 и MN1 были получены от Andrei
Gudkov, Ph. D., Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH U.S.A.). Клеточные линии рака груди UISOBCA-9 и меланомы UISO-MEL-1, MEL-2, MEL-6 и MEL-29 выращивали и сохраняли в соответствии с
методикой, описанной в Rauth, S. et al., In vitro Cellular and Developmental Biology, 30a (2): 79-84 (1994) и
Rauth, S. et al., Anticancer Research, 14 (6): 2457-2463 (1994). Приблизительно 1×105 каждого типа клеток
культивировали в течение ночи в планшете со слоем dTC3 толщиной 0,15 мм (Bioptech, Butler, PA,
U.S.A.) в присутствии фракции QSFT В. cepacia (5 мкг белок а) или смеси азурина/цитохрома С551 (50/25
мкг). Далее клетки исследовали с помощью конфокальной микроскопии, как и в примере 4, с целью определения степени апоптоза. Как фракция QSFT B. cepacia, так и смесь азурина/цитохрома C551. индуцировала обширный апоптоз в клетках легочной карциномы Н460, рака толстой кишки НТ-29, лейкемии
НТ-1080, рака яичника РА-1, рака груди MDD7, NCF и MN1 и меланомы USIO-MEL-1, MEL-2, MEL-6 и
MEL-29 после инкубации в течение ночи. В каждом случае клетки, необработанные цитотоксическим
фактором (добавление фосфатно-солевого буферного раствора), не проявили обширного апоптоза.
Пример 14. Индукция апоптоза в клеточной линии меланомы USIO-Mel-6 с помощью фракции
QSFT М. bovis согласно измерениям TUNEL анализа.
Клетки меланомы USIO-Mel-6 были подготовлены в соответствии с описанием Rauth, S. et al., Anticancer Research, 14 (6): 2457-2463 (1994). Фракция QSFT M. bovis была получена в соответствии с примером 8. Клетки меланомы, обработанные фракцией QSFT M. bovis (5 мкг белок а), и необработанные контрольные клетки инкубировали в течение 12 ч. Индукцию апоптоза измеряли путем проведения TUNEL
анализа с целью обнаружения ядерной фрагментации ДНК, вызванной апоптозом, как в примере 8. Клетки меланомы, обработанные фракцией QSFT M. bovis, продемонстрировали желто-зеленое ядро на красном цитоплазматическом фоне, что указывает на ядерную фрагментацию
ДНК. Наблюдалась незначительная фрагментация или ее полное отсутствие у необработанных клеток меланомы.
Пример 15. Снижение роста опухолевых клеток меланомы (USIO-Mel-2) у бестимусных мышей после обработки азурином/цитохромом C551.
Приблизительно 106 клеток USIO-Mel-2 вводили инъекционно подкожно бестимусным мышам (поставляемым Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland U.S.A.). Небольшие
опухоли развивались приблизительно через три недели. Затем один раз в неделю мышам вводили интраперитонеально инъекции известного лекарственного препарата против меланомы, DTIC [5-(3,3'-N, Nдиметилтриазен-1-yl)-имидазол-4-карбоксимид] (7,5 мкг) (см. Ahlmais et al., Cancer 63: 224-7 (1989)), или
три раза в неделю вводили внутрибрюшинно инъекции больших (150 мкг азурина/75 мкг цитохрома С551)
и малых (10 мкг азурина/5 мкг цитохрома С551) доз смеси азурина/цитохрома С551 или контрольного буферного раствора (цитратного буфера) в течение 4 недель. Объем опухоли определяли в интервалах у
контрольной группы мышей, у мышей, прошедших лечение с применением DTIC, и у мышей, получавших большие и малые дозы азурина/цитохрома C551.
На фиг. 6 проиллюстрировано увеличение размера опухоли у контрольной группы бестимусных
мышей, у мышей, прошедших лечение с применением DTIC, и у мышей, получавших дозы азурина/цитохрома C551, и на фиг. 7 приведены данные увеличения и потери веса у таких мышей. Последую- 19 -
009897
щие инъекции больших доз в размере 150 мкг азурина/75 мкг цитохрома C551 позволили замедлить рост и
уменьшить размер опухоли по сравнению с DTIC. На фиг. 7 показано, что инъекция либо DTIC, либо
смеси азурина/цитохрома C551 не повлияли на увеличение веса мышей. На протяжении экспериментального периода у всех мышей наблюдалось увеличение веса.
Пример 16. Влияние последующей инъекции азурина и фракции QSFT М. bovis у бестимусных
мышей на размер опухоли после введения опухолевых клеток меланомы (Mel-6).
Приблизительно 106 клеток USIO-Mel-6 вводили путем инъекции подкожно 3 бестимусным мышам
(поставляемым Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland U.S.A.). Небольшие
опухоли развивались приблизительно через три недели. Одной мыши инъекционно вводили интраперитонеально фосфатно-солевой буферный раствор (контроль), второй мыши инъекционно вводили фракцию QSFT M. bovis (5 мкг белок а) и третьей мыши инъекционно вводили смесь фракции QSFT M. bovis
(5 мкг белок а) и азурина (50 мкг). Фракция QSFT M. bovis получали в соответствии с примером 8. Размеры (объем опухоли) опухолей у контрольной мыши, у мыши, проходившей лечение фракцией QSFT
M. bovis, и у мыши, проходившей лечение смесью QSFT М. bovis и азурина, были определены через 30
дней. Эти данные приведены на фиг. 8. У обеих мышей, прошедших лечение, наблюдалось снижение
роста опухоли по сравнению с контрольной мышью.
Пример 17. Индукция азурином апоптоза и регрессии клеток рака груди человека.
Клеточные линии груди человека MCF-7 (р53+/+) и MDA-MB-157 (р53-/-) были получены из базовой коллекции культур микроорганизмом Отделения хирургической онкологии университета шт. Иллинойс, Чикаго. Нормальные клетки груди (MCF-1OF) и клетки кожи были получены из этого же источник.
Клетки HBL100 были предоставлены Dr. Nita J. Mahile, Department of Biochemistry and Molecular Biology,
Mayo Clinics, Rochester, MN. Клетки выращивали либо в среде MEM с добавлением соли Эрла, 10% FBS,
пенициллина/стрептомицина, либо в среде Macoy's 5A. Клетки выращивали при 37°С в атмосфере с 6%
содержанием СО2.
Ген, кодирующий азурин, Pseudomonas aeruginosa амплифицировали и клонировали в pUCl9. Азурин очищали от Е. coli JM109 в соответствии с описанием Yamada, T. et al., Infect. Immun., т. 70, стр.
7054-62 (2002), содержание которой включено для всех целей данной ссылкой.
Цитотоксичность азурина по отношению к клеточным линиям определяли путем проведения анализа МТТ в соответствии с описанием Yamada et al., (2002). На фиг. 9 показана цитотоксичность азурина в
отношении клеток MCF-7 и MDA-MB-157, обработанных азурином различной концентрации в течение
72 ч. После 72 ч обработки азурин при концентрации 28,5 мкМ (400 мкг/мл) индуцировал некроз 50%
клеток в клетках MCF-7 в течение 72 ч. При аналогичных условиях проведения эксперимента клеткам
MDA-MB-157 потребовалось 57 мкМ (800 мкг/мл) для 50% некроза клеток.
С целью определения того вызывает ли азурин аналогичный некроз клеток в нормальных клетках
были протестированы две эпителиальные клеточные линии молочной железы (HBL 100 и MCF-1OF).
После 72 ч инкубации с 57 мкМ (800 мкг/мл) азурина только 20% клеток MCF-I и 18% клеток HBL 100
оказались нежизнеспособными. Жизнеспособность клеток определяли путем проведения водного протеолитического анализа титрования клеток 96 (cell titer 96 aqueous proteolytic assay) (Eilon, G. F. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., т. 45, стр. 183-91 (2001) с использованием набора от Promega (Madison, Wl).
Пример 18. Лечение азурином обеспечивает сокращение размера опухоли у бестимусных мышей,
получивших инъекции опухолевых клеток рака груди.
Приблизительно 500000 клеток MCF-7, полученных как и в примере 17, были инъекционно введены
в правое нижнее жировое тело молочной железы самкам бестимусных мышей, предварительно получавшим экстрадиол (поставляемый Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland
U.S.A.). Мыши были произвольно распределены на две группы по 10 мышей в каждой. Группа, проходившая лечение, получала ежедневно внутрибрюшинно 1 мг азурина в 1 мл нормального солевого раствора в течение 28 дней, в то время как контрольная группа получала ежедневно 1 мл солевого раствора
в течение 28 дней.
К лечению приступили через три дня после инокуляции MCF-7. Во время проведения эксперимента
проводилось ежедневное обследование мышей, и дважды в неделю измеряли 3-осевой объем опухоли и
вес тела. На 29-й день животные были умерщвлены, и была проведена полная аутопсия. Все опухоли и
внутренние органы были сохранены для проведения гистологического и иммуноцитохимического обследования.
Темпы роста объема опухолей у мышей, получавших ежедневно 1 мг азурина в течение 28 дней,
были существенно ниже, чем у животных в контрольной группе. Однофакторный анализ данных показал, что различие темпов роста опухолей в этих двух группах (сравнение мышей, получавших азурин, с
мышами контрольной группы) является значительным. Например, через 22 дня после начала курса лечения средний объем опухолей у мышей, проходивших лечение, составил только 22% от среднего объема
опухолей у контрольных мышей (т.е. 0,0267 см3 и 0,1240 см3 соответственно, Р=0,0179, тест KruskalWallis), что указывало на 78% замедление роста опухолей.
По завершению эксперимента на 29-й день средний объем опухолей у мышей в группе, получавшей
азурин, составил только 15% от среднего объема опухолей мышей контрольной группы. На фиг. 10 гра- 20 -
009897
фически показано изменение объемов опухолей во времени у двух групп, выраженное в см3.
При многовариантном подходе нелинейные модели со смешанным эффектом совпадали с данными.
Одна модель, подходящая для роста опухоли, являлась экспоненциальной во времени с коэффициентами,
которые представляли собой субъектно-специфические смешанные эффекты. Подобранная модель для
контрольной группы представляла собой следующее: объем опухоли = эксп {-4,23 + 0,06*время}, в то
время как модель для группы, проходившей лечение, представляла собой следующее: объем опухоли =
эксп {-4,23 + 0,03*время}. Различие было статистически существенным (Р=0,0456). В период лечения (28
дней) у мышей, проходивших лечение, не было выявлено каких-либо признаков токсичности, подтверждением чему является снижение веса и (или) иные обычно наблюдаемые признаки токсичности.
Оценка степени апоптоза в опухолях была проведена с использованием окраски TUNEL, как в примере 8. У мышей в группе, проходившей лечение азурином, отмечалось существенное увеличение апоптических показателей по сравнению с мышами контрольной группы, у которых редко встречались апоптические клетки.
Пример 19. Получение мутантов азурина.
Микроорганизмы и плазмиды
Ген азурина (азурин дикого типа) амплифицировали реакцией цепи полимеразы (PCR) в соответствии со
способом, описанном Kukimoto et al., FEBS Lett, т. 394, стр. 87-90 (1996), содержание которого включено для
всех целей данной ссылкой. PCR проводили с использованием геномной ДНК от штамма РА01 P. aeruginosa в
качестве матричной ДНК. В качестве прямого и обратного праймеров использовали 5'GCCCAAGCTTACCTAGGAGGCTGCTCCATGCTA-3' (SEQ ID NO: 8) и 5'-TGAGCCCCTGCAGGCGCCCATGαAAGCCCGGC-3' (SEQ ID NO: 9), в которых дополнительно вставленные рестрикционные сайты
HindIII и сайты PsfI подчеркнуты.
Фрагмент амплифицированной ДНК из 545 bp (комплементарная пара гетероциклических оснований ДНК), гидролизированный HindIII и PstI, был вставлен в соответствующие сайты pUC 19 таким образом, чтобы ген азурина был размещен ниже промотора lac для получения экспрессионной плазмиды
pUC 19-azuA. В качестве штамма-хозяина использовали Е. coli JM 109 для экспрессии гена азурина. Был
культивирован рекомбинантный штамм Е. coli в среде 2YT, содержащей 50 мкг мл-1 ампициллина, 0,1
мМ IPTG и 0,5 мМ CuSO4, в течение 16 ч при 37°С для получения азурина.
Сайт-специфический мутагенез гена азурина
Сайт-специфический мутагенез гена азурина был проведен с использованием набора QuickChange
Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA). Был разработан единичный набор олигонуклеотидов
для каждой мутации, а именно: для C112D: 5'-CAGTACATGTTCTTCGACACCTTCCCGGGCCAC-3'
(SEQ ID NO: 10) и 5'-TGGCCCGGGAAGGTGTCGAAGAACATGTACTGC-3' (SEQ ID NO: 11); для M44K:
5'-CCTGCCGAAGAACGTCAAGGGCCACAACTGGG-3 (SEQ ID NO: 12) и 5'-CCCAGTTGTGGCCCT
TGACGTTCTTCGGCAGG-3' (SEQ ID NO: 13); для М64Е: 5'-GGTCACCGACGGCGAGGCTT CCGGCCTGG3' (SEQ ID NO: 14) и 5'-CCAGGCCGGAAGCCTCGCCGTCGGTGACC-3' (SEQ ID NO: 15). Мутации были
подтверждены путем расшифровки последовательности ДНК.
Химерные мутанты азурина
Поиск аминокислотных остатков азурина, которые рассматривались как кандидаты для Т-клетокэпитопов, проводили с помощью программного обеспечения GENETYX (Software Development, Tokyo).
Было обнаружено семь предполагаемых антигенных эпитопов, ЕР1 - ЕР7: ЕР 1, 120TVDKS25 (SEQ ID
NO: 16); ЕР2, V49LSTAA54 (SEQ ID NO: 17); EP3, G58WT61 (SEQ ID NO: 18); EP4, G63HASG66 (SEQ ID
NO: 19); EP5, R79VIAH83 (SEQ ID NO:20); EP6, K85LIG88(SEQ ID NO:21); и ЕР7, M121KGTLT126(SEQ ID
NO: 22)
Аминокислотные последовательности азурина от различных микроорганизмов были получены из
GenBank и совмещены с помощью программного обеспечения GENETYX для сравнения аминокислот
вокруг предполагаемых сайтов эпитопов (ЕР) Т-клеток (фиг. 11 (а)). ЕР сайты, насчитывающие от 1 до 7,
показаны с планками погрешностей на верхней части последовательностей. PA, Pseudomonas aeruginosa
PAO1 (SEQ ID NO: 23); AF, Alcaligenes faecalis (SEQ ID NO: 24); AX, Achromobacter xylosoxidans ssp.
denitrificans I (SEQ ID NO: 25); BB, Bordetella bronchiseptica (SEQ ID NO: 26); MJ, Metylomonas sp. J (SEQ
ID NO: 27); NM, Neisseria meningitidis Z2491 (SEQ ID NO: 28); PF, Pseudomonas fiuorescen (SEQ ID NO:
29); PC, Pseudomonas chlororaphis (SEQ ID NO: 30); XE, Xylella fastidiosa 9a5c (SEQ ID NO: 31).
Замены аминокислот у предполагаемых антигенных эпитопов P. aeruginosa аминокислотами из других микробных азуринов были направлены на получение химерных азуринов, в которых были изменены
антигенные эпитопы. Химерные мутанты были построены совокупно путем сайт-специфического мутагенеза и замены рестрикционного фрагмента BstEII в гене азурина с использованием следующих олигонуклеотидов: для T21Q мутации в ЕР1, 5'-CAACACCAATGCCATCcagGTCGACAA GAGCTGCAAGC-3'
(SEQ ID NO: 32) и 5'-AGCTCTTGTCGACctgGATGGCATTGGTGT TGAACTGC-3' (SEQ ID NO: 33); для
T126K мутации в ЕР7, 5'-GAAGGGCACCCTGAag CTGAAGTGAT GCGCG-3' (SEQ ID NO: 34), и 5'GCGCATCACTTCAG ctTCAGGGT GCCCTTCATC-3' (SEQ ID NO: 35); для T52K/A53S мутаций в ЕР2,
5'-AACTGGGTACTGAGCAagtCCGCCGACATGCAGGGC-3' (SEQ ID NO: 36) и 5'-CTGCATGTCGGCGGactTGCTCAGTACCCAGTTG TG 3' (SEQ ID NO: 37); для G58PN591 мутаций в ЕР3, 5'- 21 -
009897
CCGCCGACATGCAGccCaTGGTCACC GACGGCATGGC-3' (SEQ ID NO: 38) и 5'-GCCATGCCGTCGGTGA
GCAtGggCTGCATGT CGGCGG-3' (SEQ ID NO: 39); для M591N60A мутаций в ЕР3, 5'-CATGCAGCCCATc
GcCACCGACGGCATGGC-3' (SEQ ID NO: 40) и 5'- CATGCCGTCGGTGgCgATGGG CTGCATGTCG-3' (SEQ
ID NO: 41); для S66A/G67A/H83F/K85P/L861 мутаций в ЕР4, EP5, и ЕР6, 5'-GTCACCGACGGCATG
GCTgCCGcCCTGGACAAGGATTACCTGAAGCCCGACGACAGCCGTGTCATCGCCttCACccGaTcATCGGC
TCGGGCGAGAAGG ACTCG-3' (SEQ ID NO: 42) и 5'GTCACCGAGTCCTTCTCGCCCGAGCCGATgAt
CggGGTGaaGGCGATGACACGGCTGTCGTCGGGCTTCAGTAATCCTTGTCCAGGgCGGcAGCCATGCC
GTCG-3' (SEQ ID NO: 43), в которых сайт BstEII был подчеркнут, были использованы для замены фрагментов BstEII из гена азурина дикого типа. Строчные буквы в олигонуклеотидах указывают на мутагенные нуклеотиды.
На фиг. 11 (b) проиллюстрирован азурин дикого типа и химерные мутантные азурины, полученные
с использованием вышеописанных способов. S1 (SEQ ID NO. 45), S2 (SEQ ID NO. 46), S3 (SEQ ID NO.
47), S4 (SEQ ID NO. 50) и S6 (SEQ ID NO. 51) были построены совокупно в этом порядке путем сайтспецифического мутагенеза. WtS5 (SEQ ID NO. 52) и S3S5 (SEQ ID NO. 48) были построены путем замены фрагментов wt (SEQ ID NO. 44) BstEII азурина дикого типа (wtS5) и азурина S3 (S3S5) мутагенным
фрагментом BstEII соответственно. WtS5S4S6 (SEQ ID NO. 53) и S3S5S4S6 (SEQ ID NO. 49) были построены двумя циклами сайт-специфического мутагенеза с использованием гена wtS5 и гена S3S5 в качестве матричной ДНК соответственно. Введение мутаций было подтверждено путем расшифровки последовательности ДНК. Замененные аминокислоты показаны жирным шрифтом. Гены были выражены в
Е. coli в соответствии с вышеприведенным описанием для азурина дикого типа. Экспрессия S3S5S4S6 не
наблюдалась.
Азурины дикого типа и мутантные азурины очищали от периплаэматических фракций рекомбинантных клеток Е. coli с использованием колонки Q-Sepharose FF и колонки Superdex 75 (Amersham
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) в соответствии со способом, описанным Kukimoto et al. (1996).
Для получения апо-азурина азурин дикого типа обрабатывали 0,1 М MES буферной жидкостью с рН 6,0,
содержащей 0,2М тиомочевины, 0,25М NaCl и 1 мМ EDTA, в течение 16 ч. Выделившуюся медь удаляли
путем диализа в соответствии со способом, описанным van Pouderroyen et al., Biochemistry, т. 35, стр.
1397-1407 (1996).
Пример 20. Цитотоксическая активность азурина и мутантных азуринов.
Азурин дикого типа, апо-азурин, мутанты C112D и М44КМ64Е и химерные мутанты, полученные в
примере 19, использовались в анализах макрофагальной цитотоксичности. Макрофаги получали, как в
примере 2.
Приблизительно 1×105 клеток на ячейку высевали в культуральные планшеты с 96 ячейками в 200
мкл среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. После выращивания в течение ночи клетки промывали той же самой средой, которую затем заменяли новой средой,
содержащей азурин или мутантный азурин. После 24-часовой обработки 10 мкл 5 мг mi4 MTT [3-(4,5диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолийбромид)] раствор добавляли к культуре и инкубировали в
течение 2,5 ч при 37°С. Реакцию МТТ завершали путем добавления 40 мМ HCl в изопропаноле. Полученный МТТ формазан измеряли спектрофотометрически в соответствии с методом, описанным Mosmann, J. Immunol. Methods, т. 65, стр.55-63 (1983).
Цитотоксичность азурина и мутантных азуринов приведена на фиг. 12 (а) и 12 (b). На фиг. 12 (b)
также показана относительная эффективность переноса электрона мутантов, выраженная в процентах от
эффективности азурина дикого типа. В данном случае эффективность переноса электрона между оксидированным азурином и восстановленным цитохромом С551 была измерена путем лазерно-импульсного
фотолиза в соответствии с описанием Cutruzzola et al., Journal of Inorganic Biochemistry 88; 353-361,2002.
Пример 21. Апоптотическая активность азурина и мутантных азуринов.
С целью определения скорости апоптоза, вызванного азурином дикого типа или мутантами азурина,
изменение митохондриального потенциала измеряли путем проточной цитометрии (Becton Dickinson,
Inc., Franklin Lakes, NJ) с использованием набора ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor (Clontech
Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.). Изоляция макрофагов была проведена как в примере 2.
Приблизительно 1×106 клеток на одну ячейку высевалось в культуральные планшеты в шестью
ячейками в 2 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.
После выращивания в течение ночи клетки промывали той же самой средой, которую затем заменяли
новой средой, содержащей азурин или мутантный азурин. После 16-часовой обработки клетки окрашивали красителем MitoSensor и анализировали путем проточной цитометрии с помощью фильтра FL-1 в
соответствии с Инструкцией по эксплуатации фирмы-изготовителя.
На фиг. 13 показана апоптотическая активность азурина, апоазурина и мутантов C112D и
М44КМ64Е по отношению к макрофагальным клеткам. Апоптотическая скорость (%) выражена в виде
доли популяции клеток, которая сместилась от контрольной популяции к флюоресцирующей зеленым
цветом апоптотической популяции.
Пример 22. Цитотоксическая активность рустицианина, апорустицианина и псевдоазурина.
- 22 -
009897
Азурин дикого типа получали, как в примере 19. Рустицианин из Thiobacillus ferrooxidas и псевдоазурин из Aclzromobacter cycloclastes получали путем гиперэкспрессии их генов и колоночнохроматографического фракционирования в соответствии с описанием для азурина (Yamada et al. 2002;
Goto et al. 2003). Апо-рустицианин получали с использованием способа, описанного в примере 18. Клетки UISO-Mel-2 были получены, как и в примере 13.
Приблизительно 5×103 клеток на ячейку высевали в культуральные планшеты с 96 ячейками в 200
мкл среды MEM, содержащей 10% FBS при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. После выращивания
в течение ночи клетки промывали той же самой средой, которую затем заменяли либо буфером (PBS рН
7,4 или Tris-HCl рН 5,0), неочищенный образец (crude sample), содержащий рустицианин в Tris-HCl рН
5,0, либо апорустицианином в PBS рН 7,4. После 24 ч проводили анализ МТТ в соответствии с процедурой, описанной в примере 19. Цитотоксичность азурина дикого типа, рустицианина, апо-рустицианина и
псевдоазурина приведена на фиг. 14.
Пример 23. Цитотоксическая активность пластоцианина.
Азурин дикого типа получали, как и в примере 18. Пластоцианин из Phormidium laminosum получали путем гиперэкспрессии его гена и колоночно-хроматографического фракционирования в соответствии
с описанием процесса для азурина. Макрофаги изолировали, как и в примере 2.
Приблизительно 1×105 клеток на одну ячейку высевали в культуральные планшеты с 96 ячейками в
200 мкл среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. После
выращивания в течение ночи клетки промывали той же самой средой, которую затем заменяли новой
средой, содержащей азурин или мутантный азурин. После 24-часовой обработки 10 мкл 5 мг/мл MTT [3(4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолийбромид)] раствор добавляли к культуре и инкубировали
в течение 2,5 ч при 37°С. Реакцию МТТ завершали путем добавления 40 мМ HCI в изопропаноле. Полученный МТТ формазан измеряли спектрофотометрически в соответствии с методом, описанным Mosmann, J. Immunol. Methods, т. 65, стр.55-63 (1983). Цитотоксичность азурина дикого типа и пластоцианина приведена на фиг. 15.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение купредоксина, выбранного из псевдоазурина, пластоцианина и рустицианина и их
вариантов или производных, для получения медикамента для лечения рака путем стимулирования некроза клеток в раковой клетке.
2. Применение по п.1, в котором купредоксин, либо его модификация, либо его производное связывается с подавляющим опухоль протеином р53.
3. Применение по п.1 или 2, в котором купредоксин включает аминокислотную последовательность
SEQ ID NO:6.
4. Применение по п.1 или 2, в котором купредоксин включает аминокислотную последовательность
SEQ ID NO:7.
5. Применение по п.1 или 2, в котором купредоксин является пластоцианином.
6. Применение по п.5, в котором купредоксин является пластоцианином, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 либо аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:2.
7. Применение по п.1 или 2, в котором купредоксин является псевдоазурином.
8. Применение по п.7, в котором купредоксин является псевдоазурином, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 либо аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:4.
9. Применение по п.1 или 2, в котором купредоксин является рустицианином.
10. Применение по п.9, в котором купредоксин является рустицианином, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 либо аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:3.
11. Применение по любому из пп.1-10, в котором рак выбирают из группы, включающей меланому
человека, лейкемию, рак груди, рак яичника, рак легких, мезенхималыный рак, рак толстой кишки, рак
дыхательных путей и рак пищеварительного тракта.
12. Применение по п.11, в котором рак является раком груди.
13. Применение по любому из пп.1-12, дополнительно включающее применение цитохрома C551.
14. В основном чистый белок, который является мутантом и/или остатком купредоксина и индуцирует некроз клеток в раковых клетках, при этом купредоксин не является азурином из Pseudomonas
aeruginosa.
15. В основном чистый белок по п.14, в котором купредоксин выбирают из пластоцианина и рустицианина или псевдоазурина.
16. В основном чистый белок по п.15, который включает аминокислотную последовательность, по
меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:2-5 и
24-31.
- 23 -
009897
17. В основном чистый белок по п.14, который получают из Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes
faecalis; Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans; Bordetella bronchiseptica; Methylomonas sp.; Neisseria
meningitidis; Pseudomonas fluorescen; Pseudomonas chlorophis; Phormidium laminosum Thiobacillus ferrooxidas Achromobacter cycloclastes или Xylella fastidiosa.
18. В основном чистый белок по п.14, в котором мутантом является генетически измененная форма
купредоксина.
19. В основном чистый белок по п.14, в котором белок является химически модифицированным.
20. В основном чистый белок по п.14, в котором раковые клетки выбирают из группы, включающей
клетки меланомы человека, клетки лейкемии, клетки рака груди, клетки рака яичника, клетки рака легких, клетки мезенхимального рака, клетки рака толстой кишки, клетки рака дыхательных путей или
клетки рака пищеварительного тракта.
21. В основном чистый белок по п.14, который находится в фармацевтически приемлемом носителе.
22. В основном чистый белок по п.21, в котором фармацевтически приемлемый носитель является
пригодным для внутривенного введения.
23. В основном чистый белок по п.14, который имеет низкую антигенность.
24. В основном чистый белок по п.14, который связывается с подавляющим опухоль белком р53.
25. Фармацевтическая композиция, включающая один или более в основном чистых белков по любому из пп.14-24 в фармацевтически приемлемом носителе.
26. Фармацевтическая композиция по п.25, которая имеет низкую антигенность.
27. Фармацевтическая композиция по п.25, в которой белок получают из Pseudomonas aeruginosa,
Alcaligenes faecalis; Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans; Bordetella bronchiseptica; Methylomonas
sp.; Neisseria meningitidis; Pseudomonas fluorescen; Pseudomonas chlororophis; Phormidium laminosum,
Thiobacillus ferrooxidans Achromobacter cycloclastes или Xylella fastidiosa.
- 24 -
009897
Перечень последовательностей
- 25 -
009897
- 26 -
009897
- 27 -
009897
- 28 -
009897
- 29 -
009897
- 30 -
009897
- 31 -
009897
- 32 -
009897
- 33 -
009897
- 34 -
009897
- 35 -
009897
- 36 -
009897
- 37 -
009897
- 38 -
009897
- 39 -
009897
- 40 -
009897
- 41 -
009897
- 42 -
009897
- 43 -
009897
- 44 -
009897
- 45 -
009897
- 46 -
009897
Фиг. 1
- 47 -
009897
Фиг. 2
Фиг. 3
- 48 -
009897
Фиг. 4
Фиг. 5
- 49 -
009897
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
Фиг. 9
- 50 -
009897
Фиг. 10
Фиг. 11
- 51 -
009897
Фиг. 12
Фиг. 13
Фиг. 14
- 52 -
009897
Фиг. 15
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 53 -