эффекты наноразмерных частиц лития на опухолевый рост и
реклама
ВЛИЯНИЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ КАРБОНАТА ЛИТИЯ НА ИНТАКТНУЮ МЫШЕЧНУЮ ТКАНЬ И ОПУХОЛЕВЫЙ РОСТ Н.П. Бгатова, Ю.И. Бородин, В.В. Макарова, А.А. Пожидаева, Л.Н. Рачковская, В.И. Коненков ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (директор – академик В.И. Коненков), г. Новосибирск 630117, г. Новосибирск, ул.Тимакова, 2, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН n_bgatova@ngs.ru В эксперименте на мышах линии СВА изучали влияние наноразмерных частиц карбоната лития на структуру мышечной ткани и развитие перевиваемой в область бедра экспериментальной гепатокарциномы – 29. Выявили некротические изменения всех структурных компонентов мышцы при внутримышечном введении наноразмерных частиц карбоната лития интактным животным. Было показано, что после отмены препарата развиваются процессы регенерации мышечных волокон, сопровождающиеся значительным возрастанием содержания макрофагов, микрососудов, активацией фибробластов и полным восстановлением структуры органа. Введение наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста обусловливает некроз опухолевых клеток, деструкцию сосудистого русла, привлечение нейтрофилов и макрофагов в область опухолевого роста. После отмены препарата развитие опухоли продолжается на фоне сниженного содержания сосудов, меньших размеров опухолевых клеток и деформации структуры их ядер. Ключевые слова: наноразмерные частицы карбоната лития, мышечная ткань, опухолевые клетки Г-29 Одной из актуальных проблем современной биологии и медицины является проблема подавления опухолевого роста и метастазирования. Для ее решения разрабатываются различные подходы и медицинские технологии, в частности, с использованием наноразмерных структур. Известно, что соединения лития (хлористый литий, карбонат лития) могут оказывать влияние на сигнальные пути и регуляцию клеточного цикла [9]. Выявлено, что литий действуя через подавление активности гликоген-синтетазы киназы-3β, может оказывать влияние на развитие апоптоза, активность фактора роста сосудов, хемотаксис нейтрофилов, способствовать увеличение циркулирующих CD34+ гемопоэтических стволовых клеток [3, 6, 7]. В последнее время появляются работы показывающие эффективность использования лития для подавления опухолевого роста [9, 10]. Соединения лития рассматривают как потенциальные агенты таргетной терапии, способные замедлить рост опухоли. В тоже время с развитием нанотехнологий выявляются новые, более выраженные свойства наноразмерных структур, по сравнению с исходными формами. Поэтому целью данной работы было исследование биологического действия наноразмерных частиц карбоната лития на структуру мышечной ткани и развитие перевиваемой в область бедра экспериментальной гепатокарциномы – 29. Методика исследования Экспериментальное исследование проведено на мышах-самцах линии СВА массой 18-20 г в возрасте 3-х месяцев. Животных содержали на стандартной диете со свободным доступом к воде и пище. Работу с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». В эксперименте использовано 4 группы животных. В 1 группу вошли интактные мыши; во 2 группу — животные, получавшие однократно и пятикратно внутримышечные инъекции в правое бедро в объеме 0,1 мл взвеси наноразмерных частиц карбоната лития, приготовленных на стерильном 0,85 % водном растворе хлорида натрия в дозе 0,037 мг на животное. Внутримышечное введение наноразмерных частиц карбоната лития было принято для моделирования процесса доставки препарата к месту имплантации опухолевых клеток. В 3-ю группу вошли животные с развитием опухолевого процесса. Для индукции опухолевого процесса использовали клетки гепатокарциномы-29 (Г-29). Гепатокарцинома29 получена и верифицирована сотрудниками Института цитологии и генетика СО РАН [2] и любезно предоставлена для нашего исследования. Клетки Г-29 перевивали мышам линии СВА в брюшную полость, через 10 суток производили забор асцитической жидкости, суспендировали в 10-кратном объеме физиологического раствора и вводили по 0,1 мл интактным животным в мышцу правого бедра [2]. Животным 4 группы после индукции опухолевого процесса по периферии опухолевого роста вводили наноразмерные частицы карбоната лития в выше указанной дозе однократно и пятикратно. Забор материала для исследований проводили через 3, 7, 13 и 30 суток эксперимента. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом методом кранио-цервикальной дислокации. Для светооптического исследования биологические образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине и подвергали стандартной обработке для получения парафиновых блоков. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Ван Гизону. Для исследования в электронном микроскопе образцы мышечной ткани бедра и опухоли фиксировали в 1% растворе ОsO4 на фосфатном буфере (pH=7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм окрашивали толуидиновым синим и изучали под световым микроскопом “LEICA DME”. Ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм контрастировали насыщенным 2 водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 1010. Полученные микрофотографии морфометрировали с помощью компьютерной программы Image J. Цифровые данные обрабатывали с использованием общепринятых методов статистики, вычисляя среднюю арифметическую величину (М), ошибку репрезентативности средней величины (m) и уровень значимости различий средних величин (р) на основании t-критерия Стьюдента для уровня достоверности 95% (p < 0,05). Результаты исследования При введении наноразмерных частиц карбоната лития в мышечную ткань бедра интактным животным в месте введения наблюдали повышенное количество макрофагов, деструкцию мышечных волокон и сосудов (рис. 1а). Данная картина имела место после однократного и 5-ти кратного внутримышечного введения наноразмерных частиц карбоната лития. При анализе мышечной ткани через 5 суток после окончания введения лития отмечали большое содержание кровеносных микрососудов в межмышечном пространстве, объемная плотность которых была увеличена в 4 раза (p < 0,05), по сравнению с соответствующим показателем в контроле (рис. 1 б,в). В вакуолярном аппарате макрофагов выявляли фагосомы с частицами лития (рис. 1г). Наблюдали повышенное содержание фибробластов с хорошо развитой системой мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума (рис. 1г) и фиброз межмышечных пространств (рис. 1д). В этот период исследования имели место участки регенерация мышечных волокон с образованием и слиянием миотубов (рис. 1е). К 30-м суткам эксперимента происходило полное восстановление структуры мышечной ткани. Известно, что одним из основных механизмов токсического действия наноразмерных частиц металлов является окислительный стресс, который развивается за счет инициирования наночастицами реактивных форм кислорода и накопления малонового диальдегида [5]. Действительно, ранее нами было показано усиление активности процессов перекисного окисления липидов в мышечной ткани бедра при внутримышечном введении наноразмерных частиц карбоната лития: концентрация ТБК-активных продуктов увеличивалась в 2 раза по сравнению с контролем [1]. В связи с полученными данными о том, что введение наноразмерных частиц карбоната лития приводит к деструкции ткани в месте введения, было проведено исследование их влияния на опухолевые клетки и развитие гепатокарциномы-29. Уже после однократного введения наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста отмечали некроз опухолевых клеток и повышенное содержание макрофагов в опухоли (рис. 2а,б). В цитоплазме макрофагов выявляли фагосомы с частицами карбоната лития (рис. 2в). 3 В то время, как при развитии опухоли без воздействия лития не отмечали некроза опухолевых клеток, но имели место фигуры митоза, а численная плотность макрофагов была на 40% меньше (рис. 2 б,г). В данной группе животных через 13 суток эксперимента в области опухолевого роста клетки располагались плотно, имели крупные размеры, в их микроокружении не наблюдали макрофагов (рис. 2д). Определение объемной плотности кровеносных микрососудов в опухоли выявило ее возрастание в 4,5 раза на 3-и 7-е сутки развития опухоли. На 13-е сутки исследования объемная плотность кровеносных микрососудов в опухоли снизилась на 40%, превышая контрольный уровень в 2,5 раза и опять возросла на 30-е сутки эксперимента (рис. 3а). Через 30 суток после имплантации клеток гепатокарциномы-29 в область бедра экспериментальным животным, опухолевые клетки образовывали подобие печеночных балок, окруженных «синусоидами». (рис. 3 б,в). Опухолевые клетки имели большие размеры и светлые ядра с крупными ядрышками (рис. 3 г). Через 5- суток после окончания введения наноразмерных частиц карбоната лития в структуре опухолевой ткани сохранялись очаги некроза опухолевых клеток, наличие нейтрофилов и макрофагов среди опухолевых клеток (рис. 2е). Опухолевые клетки имели меньшие размеры, чем при развитии опухоли без воздействия лития. Определение объемной плотности кровеносных микрососудов в опухоли при введении наноразмерных частиц лития выявило ее возрастание в 2 раза на 3-и сутки и увеличение в 3 раза на 7-е сутки развития опухоли. На 13-е сутки исследования объемная плотность кровеносных микрососудов в опухоли превышала контрольный уровень в 2,5 раза и снизилась на 35%, превышая контрольный уровень на 73% на 30-е сутки эксперимента (рис. 3а). Сравнительный анализ с сосудистым руслом при развитии опухоли без введения частиц лития выявил меньшую объемную плотность сосудов на 3, 7-е и 30-е сутки эксперимента и сходные значения на 13-е сутки развития опухоли (рис. 3а). На 30-е сутки исследования у животных, получавших инъекции наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста не отмечали балочного строения опухоли, отмечали меньшее развитие сосудистой сети, сохранялось присутствие макрофагов, наблюдали опухолевые клетки с деформированными, вакуолизированными ядрами (рис. 3 д,е). Популяция опухолевых клеток гепатомы-29 является чрезвычайно злокачественной, обладая высокой пролиферативной активностью [2]. При содержании в питательной среде в течение суток количество клеток Г-29 возрастало в 20 раз. Поэтому имеющая место клеточная гибель при введении наноразмерных частиц карбоната лития происходила на фоне быстрой пролиферации уцелевших клеток. Однако структура формирующейся в данном случае опухоли отличалась меньшей «зрелостью» и деформацией ядер опухолевых клеток от 4 развивающейся у животных группы сравнения. По-видимому, это было связано со свойством лития выступать в качестве ингибитора экспрессии гликоген-синтетазы киназы-3β, которая, как известно, регулирует широкий диапазон клеточных функций, включая метаболизм гликогена, транскрипцию, трансляцию, регуляцию цитоскелета, внутриклеточный везикулярный транспорт, развитие клеточного цикла и апоптоз [4]. Меньшие размеры опухолевых клеток и деформация их ядер могли быть связаны с описанными в литературе эффектами ингибиторов экспрессии гликоген-синтетазы киназы-3β - нарушением синтеза ДНК, уменьшением пролиферации клеток, блокадой экспрессии генов S-стадии клеточного цикла [8]. Различия в биологических эффектах карбоната лития на мышечную ткань интактных животных и опухолевый рост, по-видимому, обусловлены многофункциональностью гликоген-синтетазы киназы-3β и ее важной ролью в различных сигнальных путях, определяющих развитие в условиях нормы и при патологии [4,6]. Таким образом, внутримышечное введение наноразмерных частиц карбоната лития интактным животным приводит к деструкции мышечных волокон и последующей их регенерации с возрастанием количества макрофагов, значительным развитием сосудов, активацией фибробластов и полным восстановлением структуры органа. Введение наноразмерных частиц карбоната лития по периферии роста экспериментальной гепатокарциномы-29 в области бедра животных обусловливает некроз опухолевых клеток и сосудов, привлечение нейтрофилов и макрофагов к опухоли. В данном случае развитие опухоли происходит на фоне сниженного содержания сосудов, меньших размеров опухолевых клеток и деформации структуры их ядер. Литература 1. Бородин Ю.И., Бгатова Н.П., Шедина В.В. и др. Развитие деструктивных процессов при введении наноразмерных частиц лития и серебра интактным животным в предполагаемую область моделирования опухолевого процесса // Лечебная и восстановительная медицина. – Новосибирск: НИИКЭЛ СО РАМН. 2010. С. 18-24. 2. Каледин В.И., Жукова Н.А., Николин В.П. и др. Гепатокарцинома-29 – метастазирующая перевиваемая опухоль мышей, вызывающая кахексию // Бюл. экспер биол. 2009. Т. 148, № 12. С. 664-669. 3. Focosi D., Azzarà A., Kast R.E. et al. Lithium and hematology: established and proposed uses // J. Leukoc. Biol.2009. Vol. 85. P. 20 - 28. 4. Force T., Woodgett J.R. Unique and overlapping functions of GSK-3 isoforms in cell differentiation and proliferation and cardiovascular development. J Biol Chem. 2009. Vol. 284. P. 9643–9647. 5 5. Jiang J., Oberdrster G., Elder A. et al. Does nanoparticle activity depend upon size and crystal phase? // Nanotoxicology 2008. Vol. 2, № 1. P. 33 – 42. 6. Kast R.E. How lithium treatment generates neutrophilia by enhancing phosphorylation of GSK-3, increasing HIF-1 levels and how this path is important during engraftment // Bone Marrow Transplant.2008. Vol. 41, N 1. P. 23-26. 7. Kim H.K., Kim J.E., Chung J. et al. Lithium down-regulates the expression of CXCR4 in human neutrophils // J Trace Elem Med Biol. 2007. Vol. 21, N 3. P. 204-209. 8. Sun A., Shanmugam I., Song J. et al. Lithium suppresses cell proliferation by interrupting E2F–DNA interaction and subsequently reducing S-phase gene expression in prostate cancer. Prostate. 2007. Vol. 67. P. 976–988. 9. Wang J.S, Wang C.L, Wen J.F. et al. Lithium inhibits proliferation of human esophageal cancer cell line Eca-109 by inducing a G2/M cell cycle arrest // World J Gastroenterol. 2008. Vol. 14, N 25. P. 3982–3989. 10. Zhu Q., Yang J., Han S. et al. Suppression of glycogen synthase kinase 3 activity reduces tumor growth of prostate cancer in vivo // Prostate. 2011. Vol. 71, N 8. P. 835-845. 6 а б Объемная плотность микрососудов Vv 10 8 И+Li 6 4 2 0 К в 3 7 13 30 сутки г д е Рис. 1. Структура мышечной ткани при введении наноразмерных частиц карбоната лития в бедро интактным мышам линии СВА. а – макрофагальная инфильтрация и некроз мышечных волокон после однократного введения наноразмерных частиц карбоната лития. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 10х40. б – ангиогенез в межмышечном пространстве через 5 суток после 5-ти кратного введения наноразмерных частиц карбоната лития. Окраска толуидиновым синим. Увеличение 10х40. в – объемная плотность (Vv) кровеносных микрососудов в мышечной ткани бедра при введении наноразмерных частиц карбоната лития (И+Li). г – макрофаг с наноразмерными частицами лития в фагосомах и фибробласты со значительным содержанием в цитоплазме мембран гранулярной эндоплазматической сети. Увеличение х4000. д – фиброз межмышечных пространств после 5-ти кратного введения наноразмерных частиц карбоната лития. Окраска по Ван Гизону. Увеличение 10х40. е – регенерация мышечных волокон с образованием миотубов через 5 суток после 5-ти кратного введения наноразмерных частиц карбоната лития. Окраска по Ван Гизону. Увеличение 10х40. 7 Численная плотность макрофагов NA * # * 5 4 3 2 1 0 а б в K O О+Li г д е Рис. 2. Структура опухоли Г-29 в области бедра мышей линии СВА. а – некроз опухолевых клеток и повышенное содержание макрофагов после однократного введения наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста; б – возрастание численной плотности макрофагов после однократного введения наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста. К - контроль; Оопухоль Г-29; О+Li – опухоль после однократного введения наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста; * - p < 0,05 по сравнению с контролем; # p < 0,05 по сравнению с Г-29 без введения наноразмерных частиц лития. в – частицы карбоната лития в фагосоме макрофага. Увеличение х15000. г - отсутствие некроза опухолевых клеток через 7 суток после имплантации клеток Г-29 в область бедра. Окраска толуидиновым синим. Увеличение 10х90; д – плотное расположение клеток Г-29 через 13 суток после имплантации в область бедра. Окраска по Ван Гизону. Увеличение 10х10. е – некроз опухолевых клеток и мышечных волокон через 5 суток после 5-ти кратного введения наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста Окраска по Ван Гизону. Увеличение 10х10. 8 Объемная плотность микрососудов Vv 10 * 8 * 6 О * О+Li 4 2 0 К 3 7 13 30 сутки а б в г д е Рис. 3. Структура опухоли Г-29 в области бедра мышей линии СВА через 30 суток эксперимента а – объемная плотность (Vv) кровеносных микрососудов в опухоли Г-29. О - опухоль Г-29; О+Li - 20 суток после 5-ти кратного введения наноразмерных частиц карбоната лития по периферии опухолевого роста. * - p < 0,05 по сравнению с Г-29 без введения наноразмерных частиц лития. б - образование опухолевыми клетками «печеночных балок» и «синусоидов», пролиферация опухолевых клеток. Окраска толуидиновым синим. Увеличение 10х40; в – эндотелиальные клетки «синусоидов» опухоли Г-29. Увеличение х4000. г - структура ядра опухолевой клетки: крупное ядрышко и отсутствие гетерохроматина. Увеличение х8000. в – эндотелиальные клетки «синусоидов» опухоли Г-29. Увеличение х4000. д – отсутствие «синусоидов», балочного строения опухоли и деформация ядер опухолевых клеток через 20 суток после 5-ти кратного введения наноразмерных частиц карбоната лития. Окраска толуидиновым синим. Увеличение 10х90; е – наличие инвагинаций и гетерохроматиновых глыбок в ядре опухолевой клетки через 20 суток после 5-ти кратного введения наноразмерных частиц карбоната лития. Увеличение х8000. 9
