Полный текст диссертации (размещена 31.03.2015)
реклама
1 ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России На правах рукописи Семенов Альберт Геннадьевич Кариопатология и апоптозно-пролиферативные изменения мононуклеарных клеток человека при иксодовом клещевом боррелиозе 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, Е.Н. Ильинских Томск - 2015 г. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.1. Характеристика геномной нестабильности и цитогенетических нарушений, индуцированных бактериями. . . . . . . . . . 13 1.2. Регуляция клеточного цикла и стабильность генома. . . . . . . . . 17 1.3. Образование реактивных метаболитов кислорода и азота и их роль в индукции цитогенетических нарушений. . . . . . . . . . . . . 21 1.4. Роль провоспалительных цитокинов в исходах иммунного ответа при иксодовом клещевом боррелиозе. . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. 24 Пути апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток в ходе иммунного ответа на патоген и активационноиндуцированная клеточная смерть. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. . . . . . . . . . . . . 36 2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУПП ЛЮДЕЙ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.2.1. Получение культур мононуклеарных клеток периферической крови. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.2.2. Определение малонового диальдегида в плазме крови. . . . . . . 39 2.2.3. Характеристика антигенов боррелий, использованных для стимуляции культур мононуклеарных клеток. . . . . . . . . . . . . . . 41 2.2.4. Реакция бластной трансформации лимфоцитов. . . . . . . . . . . . . 2.2.5. Анализ клеток с кариопатологией и патологическими формами митозов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.6. 41 42 Метод лазерной проточной цитометрии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 2.2.6.1. Определение числа клеток в различных фазах клеточного цикла и состоянии апоптоза. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3 2.2.6.2. Определение числа клеток в состоянии апоптоза. . . . . . . . . . . . 43 2.2.7. Определение концентрации иммуноцитокинов в супернатантах. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.8. 45 Цитогенетические методы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.2.8.1. Хромосомный анализ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.2.8.2. Дифференциальная окраска хромосом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2.3. ЭКСПЕРИМЕНТЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO. . . . . . . . . . . . . . 47 2.3.1. Изучение антиген-индуцированных цитогенетических нарушений и апоптоза в условиях in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2.3.2. Изучение эффектов цитохалазина D на апоптотический ответ мононуклеарных клеток в условиях in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . 2.4. 48 СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. . . . . 50 3.1. КАРИОПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ. . . . . . . . . . . . . 50 3.1.1. Характеристика цитогенетических нарушений в лимфоцитах больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2. 50 Полиморфизм хромосомы 9 в лимфоцитах периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом. . . . . . . . . . 53 3.1.3. Экспериментальное моделирование цитогенетических нарушений, индуцированных в условиях in vitro корпускулярным антигеном боррелий в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 3.1.4. Характеристика патологических форм митозов и кариопатологических изменений в лимфоцитах больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом. . . . . . . . . . . . . . . 63 3.1.5. Экспериментальное моделирование патологии митоза, индуцированной в условиях in vitro корпускулярным антигеном 4 боррелий в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 3.2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ И АПОПТОЗ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ IN VITRO В ОТВЕТ НА СТИМУЛЯЦИЮ АНТИГЕНОМ БОРРЕЛИЙ ИЛИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ МИТОГЕНОМ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 3.2.1. Характеристика бластной трансформации лимфоцитов в ответ на корпускулярный боррелиозный антиген у больных различными клиническими формами острого иксодового клещевого боррелиоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 3.2.2. Сравнительная характеристика реакции бластной трансформации лимфоцитов в ответ на стимуляцию корпускулярным антигеном боррелий или неспецифическим митогеном у больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 3.2.3. Характеристика пролиферации и апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом в ответ на стимуляцию корпускулярным антигеном боррелий в условиях in vitro с использованием метода проточной цитометрии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 3.2.4. Экспериментальное моделирование апоптоза, индуцированного в условиях in vitro инактивированным корпускулярным антигеном боррелий, в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 3.2.5. Характеристика пролиферации и апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом в ответ на стимуляцию неспецифическим митогеном в условиях in vitro с использованием метода проточной цитометрии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 5 3.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ В ОТВЕТ НА СТИМУЛЯЦИЮ КОРПУСКУЛЯРНЫМ АНТИГЕНОМ БОРРЕЛИЙ ИЛИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ МИТОГЕНОМ В УСЛОВИЯХ IN VITRO У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 3.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА В ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 4.1. Кариопатологические изменения в лимфоцитах периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом. . . . . 4.2. 99 Апоптоз и пролиферативный ответ мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 ВЫВОДЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ. . . . . . . . . 118 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Установлено, что вирусы, бактерии и даже гельминты могут вызывать кариопатологические изменения и цитогенетические нарушения как в организме человека и животных, так и в культурах клеток [7, 21, 38, 56, 91, 122]. При развитии инфекционного процесса в организме повышение интенсивности мутагенных процессов может быть обусловлено как эффектами самого возбудителя и его токсинов, так и иммунным ответом и связанным с ним образованием реактивных метаболитов кислорода и азота [29, 35, 53, 108]. На примере различных воспалительных и инфекционных заболеваний показана взаимосвязь между повреждениями ДНК, уровнем окислительного стресса с образованием эндогенных оксидантов, клеточным старением и апоптозом, происходящих в лимфоцитах и других клетках, которые сами являются мишенью для патогенов в очагах воспаления [146, 174, 213]. При этом формируется феномен нестабильности генома, ассоциированный с высоким уровнем цитогенетических нарушений в иммуноцитах и их гибелью путем апоптоза, что играет важную роль в модуляции иммунного ответа, развитии вторичных иммунодефицитов и хронического течения инфекции [22, 109]. Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) – острое природно-очаговое трансмиссивное инфекционное заболевание, вызванное спирохетами рода Borrelia, с поражением различных органов и систем, имеющее склонность к хроническому течению [32]. Известно, что взаимодействие антигенов боррелий с фагоцитами индуцирует респираторный взрыв, пролиферативный ответ Т-лимфоцитов, активную продукцию провоспалительных цитокинов (интерферона-γ, фактора некроза опухоли-α), и повышенный апоптоз иммуноцитов [210], однако связь этих процессов с цитогенетическими нарушениями в мононуклеарных клетках периферической крови остается неизученной. 7 Изучение апоптоза привело к осознанию того факта, что он представляет собой активную форму реакции клеток не только на заведомо неблагоприятные воздействия, но и на физиологические, каковыми в случае лимфоцитов являются антигены и митогены. Соотношение пролиферации и апоптоза при этом служит важнейшим параметром реакции на антигены, поскольку оно определяет её результативность с точки зрения развития иммунного ответа [4]. По-видимому, выбор индивидуальной клеткой направления реакции является вероятностным процессом, однако соотношение двух альтернативных форм реакции может контролироваться внутри- и внеклеточными факторами [4]. Известно, что значительное число внеклеточных и внутриклеточных патогенов индуцируют апоптоз клеток-мишеней, в то время как некоторые другие инфекционные агенты, напротив, подавляют апоптоз. Апоптоз представляет собой процесс, который, прежде всего, необходим для разрешения острого воспаления путем устранения поврежденных или гиперстимулированных клеток при инфекционном процессе, а также представляет собой успешную стратегию иммунной системы, направленную на элиминацию возбудителя [130, 222]. Этот механизм так называемой активационно-индуцированной клеточной смерти (АИКС) служит для контроля аутоиммунных реакций и поддержания оптимального пула лимфоидных клеток [130]. С другой стороны, ингибирование апоптоза и АИКС можно рассматривать как адаптивный механизм, приводящий к повышению выживания патогенов и к нарушению их элиминации из организма [222]. Характер и последствия кариопатологических изменений, цитогенетических нарушений и соотношения пролиферативного ответа и апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови при иксодовом клещевом боррелиозе, а также роль боррелий и их антигенов в их формировании изучены недостаточно. Цель и задачи исследования. Установить особенности и выявить общие закономерности кариопатологических изменений, а также апоптоза и 8 пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови у человека при иксодовом клещевом боррелиозе. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Дать характеристику различных типов кариопатологических изменений в лимфоцитах периферической крови больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом, а также здоровых реконвалесцентов этого заболевания. 2. Оценить с использованием современных методов пролиферацию и апоп- тоз мононуклеарных клеток периферической крови больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом, а также здоровых реконвалесцентов, в ответ на их стимуляцию специфическим корпускулярным антигеном боррелий или неспецифическим митогеном. 3. Оценить в условиях in vitro секрецию ключевых цитокинов (интерлейки- на-4, интерферона-γ, фактора некроза опухоли- и интерлейкина-6) мононуклеарными клетками периферической крови больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом, а также здоровых реконвалесцентов, в ответ на их стимуляцию специфическим корпускулярным антигеном боррелий или неспецифическим митогеном. 4. Определить взаимосвязь между частотой лимфоцитов с кариопатологиче- скими изменениями в периферической крови больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом и уровнями секреции ключевых цитокинов, индукции апоптоза, а также показателями активности оксидативного стресса. 5. Смоделировать в условиях in vitro взаимодействие инактивированного корпускулярного антигена боррелий с культурой мононуклеарных клеток и изучить его эффекты на апоптоз, пролиферацию, продукцию ключевых цитокинов и индукцию кариопатологических изменений. Научная новизна работы. Впервые с использованием рутинных и дифференциальных методов окраски дана подробная характеристика различных типов кариопатологических изменений в лимфоцитах больных ост- 9 рым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом, свидетельствующих о цитогенетической нестабильности иммунокомпетентных клеток. Доказано, что в периферической крови больных ИКБ существенно повышена не только частота лимфоцитов со структурными аберрациями хромосом преимущественно хроматидного типа (разрывов и фрагментов), но и клеток с микроядрами, патологией митоза, анеуплоидией и полиплоидией, а также с аномально увеличенной вторичной перетяжкой в околоцентромерном районе хромосомы 9. С использованием современных методов проточной цитометрии впервые установлено, что у больных острым иксодовым клещевым боррелиозом стимуляция культур мононуклеаров инактивированным корпускулярным боррелиозным антигеном Borrelia garinii индуцирует активную пролиферацию, о чем свидетельствует рост числа клеток в фазах синтеза ДНК и митоза (в S- и G2/M-фазах), при одновременном увеличении уровня клеток в состоянии апоптоза, что тесно ассоциировано с процессами цитогенетической нестабильности, оксидативного стресса (на примере повышения концентрации малонового диальдегида в плазме крови) и с преобладанием секреции провоспалительных цитокинов (интерферона-γ и фактора некроза опухоли-). С другой стороны, принципиально новыми являются данные, полученные в культурах больных хроническим иксодовым клещевым боррелиозом, свидетельствующие о четко выраженной тенденции к росту показателей пролиферативной активности мононуклеарных клеток, при одновременном подавлении апоптоза как в ответ на стимуляцию специфическим боррелиозным антигеном, так и на неспецифический митоген фитогемагглютинин, что наряду с цитогенетической нестабильностью иммуноцитов и секрецией ими преимущественно провоспалительных цитокинов, может играть существенную роль в процессе хронизации иксодового клещевого боррелиоза. Впервые показано, что в условиях in vitro корпускулярный антиген боррелий B. garinii в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров индуцирует дозозависимый апоптоз и появление того же спек- 10 тра кариопатологических изменений, что и в клетках периферической крови больных острым иксодовым клещевым боррелиозом. Теоретическое и практическое значение. Полученные знания фундаментального характера, касающиеся эффектов, которые оказывает инактивированный корпускулярный антиген боррелий на процессы апоптоза, пролиферации и индукции кариопатологических нарушений иммуноцитов в условиях in vitro, а также роли цитогенетической нестабильности и соотношения апоптоз/пролиферация иммунокомпетентных клеток в исходах инфекционного процесса у больных иксодовым клещевым боррелиозом, существенно расширяют современные представления о патогенезе острой и хронической форм этого заболевания и могут быть использованы для разработки принципиально новых методических подходов ранней диагностики, оценки тяжести течения и прогностических критериев хронизации иксодового клещевого боррелиоза. Материалы работы могут быть использованы в учебнометодическом процессе на медицинских и медико-биологических факультетах ВУЗов. Внедрение результатов работы в практику. Результаты исследования используются в обучении студентов по теме лекции и практического занятия «Патогенные спирохеты» на кафедре микробиологии и вирусологии, в разделе «Мутагенез» на кафедре биологии и генетики, а также в рамках темы «Клещевые инфекции (клещевой энцефалит, иксодовые клещевые боррелиозы, эрлихиозы» на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Повышение в периферической крови больных острым и хроническим ик- содовым клещевым боррелиозом уровней лимфоцитов с различными типами кариопатологических изменений, включая микроядра, патологию митоза, структурные аберрации хроматидного типа, анеуплоидию и полиплоидию, ассоциировано с развитием оксидативного стресса и доминированием продукции провоспалительных цитокинов. 11 2. Взаимодействие корпускулярного антигена боррелий с мононуклеарными клетками здоровых доноров в условиях in vitro индуцирует их апоптоз, секрецию преимущественно провоспалительных цитокинов и появление того же спектра кариопатологических изменений, что и в клетках периферической крови больных острым иксодовым клещевым боррелиозом. 3. Факторами, предрасполагающими к развитию хронической формы иксо- дового клещевого боррелиоза, являются цитогенетическая нестабильность иммунокомпетентных клеток в сочетании с подавлением их апоптоза и стимуляцией пролиферации и продукции провоспалительных цитокинов (интерферона-γ, фактора некроза опухоли- и интерлейкина-6) в ответ на специфический антиген боррелий. Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на VIII-ой межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 70-летию медикопрофилактического факультета Омской государственной медицинской академии (Омск, 2008); V-ой региональной научно-практической конференции, посвященной памяти А.Ф. Родина (Северск, 2009); II-ом, III-ем и IV-ом Ежегодных Всероссийских конгрессах по инфекционным болезням (Москва, 2010, 2011, 2012); VII-ой международной научно-практической конференции «Современные аспекты патогенеза, клиники, диагностики, лечения и профилактики протозоозов, гельминтозов и арахноэнтомозов человека, животных и растений (Витебск, Беларусь, 2010); научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии – 2011» (Санкт-Петербург, 2011); XII-ом Российском конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011); III-ей международной студенческой научно-практической конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2011); юбилейной научнопрактической конференции «Инфекционные болезни: проблемы, достижения и перспективы», посвященной 115-летию кафедры инфекционных бо- 12 лезней Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (СанктПетербург, 2011); VIII-ой международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород-Москва, 2011); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы бактериологии» (Томск, 2011); XVII-ом и ХIХ-ом Всемирных конгрессах по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Нью-Йорк, США, 2012; Дубаи, ОАЭ, 2013); международной научной конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами», посвященной 75-летию открытия вируса клещевого энцефалита (Иркутск-Листвянка, 2012); IV-ой и V-ой международных научных конференциях «SCIENCE4HEALTH 2012: Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2012, 2013); юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной инфектологии», посвященной 90-летию организации кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета (Иркутск, 2013). Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, из них 9, включая 4 полнотекстовых статьи (одна в зарубежной печати), в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура работы. Диссертация изложена на 145 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 247 источников, из которых 63 отечественных и 184 зарубежных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 22 рисунками. 13 ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика геномной нестабильности и цитогенетических нарушений, индуцированных бактериями В научной литературе имеются сообщения, свидетельствующие о возможности различных инфекционных агентов, в том числе вирусов, бактерий, простейших и гельминтов, вызывать цитогенетические нарушения [7, 30, 56, 74, 192]. Ещё в 1970-е годы использование экспериментальной модели на животных было впервые установлено, что различные типы иммунологических реакций и воспалительный процесс, включая отторжение трансплантанта аллогенного лоскута или анафилактический шок, сопровождаются существенным увеличением числа клеток с перестройками хромосом в костном мозге и региональных лимфатических узлах [20, 57]. При развитии инфекционного процесса в организме повышение интенсивности мутагенных процессов может быть обусловлено как эффектами самого возбудителя и его токсинов, так и иммунным ответом и связанным с ним образованием реактивных метаболитов кислорода и азота [10, 29, 35, 53, 108]. При этом формируется феномен нестабильности клеточного генома, который индуцируется многими экзо- и эндогенными факторами. Наряду с этим, высокий уровень цитогенетических нарушений в клетках крови и их гибель путем апоптоза могут быть индуцированы дисфункцией ДНК-репаративных клеточных механизмов и антиоксидантной системы [109]. При инфицировании культур клеток микоплазмами (Mycoplasma fermentas, M. hominis и др. виды) или уреаплазмами (Ureaplasma urealyticum) установлено существенное повышение частоты структурных нарушений хромосом, главным образом, за счет появления хроматидных разрывов, а 14 также увеличения числа гипоплоидных и полиплоидных клеток [52, 206]. Эффекты микоплазм зависели от трёх факторов: длительности контаминации, вида микоплазмы и свойств клеточных культур. Микоплазмы также индуцировали появление эндоредупликации, фрагментации хромосом, обменов и новых, несвойственных данному кариотипу, вариантов «маркерных» хромосом [50, 52]. В ряде исследований было показано значительное повышение частоты хроматидных и хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови больных инфекциями, вызванными микобактериями лепрой (Mycobacterium leprae) и активным туберкулезом (Mycobacterium tuberculosis) [18, 19, 48, 120]. У больных активным туберкулезом также было установлено значительное угнетение бластной трансформации лимфоцитов на ФГА [18, 19]. В работах G.K. Manna, Gupta S. [176] и G.K. Manna, T.K. Ghosh [178] было показано, что введение мышам культуры живых или инактивированных нагреванием золотистых стафилоккоков (Staphylococcus aureus) или стрептококков (Streptococcus faecalis) индуцировало значительное повышение числа клеток с цитогенетическими нарушениями. И.Н. Ильинских с соавт. [19] было установлено, что добавление в культуры лимфоцитов здоровых доноров живых стрептококков (S. pyogenes) или стрептолизина-О приводило к появлению клеток с кариолизисом, кариопикнозом и хроматидными аберрациями, а также с патологическими митозами в виде отставания хромосом в метафазе или анафаз с мостами. Более того, у больных стрептококковой ангиной или скарлатиной в острый период заболевания зарегистрировано достоверное повышение уровней эритроцитов с микроядрами, а также лимфоцитов с аберрациями хромосом и с полиплоидией в периферической крови по сравнению показателями у здоровых лиц, что авторы исследования связывали с активацией процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) и с накоплением гидроперекисных продуктов, обладающих мутагенным действием [19, 26, 27]. Установлено, что взаимо- 15 действие липополисахарида (компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий) с лигандом Толл-подобного рецептора типа 4 (TLR4 от англ. Toll-like receptor 4) опосредованно через экспрессию ядерного фактора транскрипции NF-κB (от англ. nuclear factor-kappa B) индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов, активацию индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и синтез реактивных метаболитов кислорода и азота, которые коррелируют с увеличением показателя числа клеток с микроядрами при воспалении [175, 181, 205]. Микроядра представляют собой небольшие внутрицитоплазматические структуры, состоящие из фрагмента хромосомы или из отставшей целой хромосомы, которые формируются на стадии ана- и телофазы в результате либо структурных аберраций хромосом, либо при патологических митозах, а утрата клеткой микроядра может приводить к анеуплоидии [217]. В экспериментах, проведенных G.K. Manna [177, 179] и G.K. Manna A. Sadhukhan [180] было установлено существенное повышение числа клеток с хромосомными аберрациями и микроядрами в костном мозге мышей после введения животным культур живых или убитых нагреванием грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae, включая Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Serratia marcescens и Escherichia coli. Частота метафаз с цитогенетическими нарушениями зависела от дозы введенных бактерий [177, 179, 180]. Кроме того, значительное увеличение числа лимфоцитов с хромосомными аберрациями было установлено в крови больных брюшным тифом [60] и шигеллезом [18]. Л. В. Китаевой [21] обнаружено достоверное повышение числа клеток с микроядрами в слизистой оболочке фундального отдела желудка больных хроническим гастритом, инфицированных Н. pylori, по сравнению с неинфицированными пациентами. Цитолетальные токсины (ЦЛТ) различных патогенных и условнопатогенных грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Haemophilus ducreyi, Shigella dysenteriae, Campylobacter sp., Helicobacter sp., Salmonella enterica и S. typhi), а также ко- 16 либактин, который продуцируется комменсальными штаммами E. coli, считаются первыми бактериальными токсинами, для которых были доказаны генотоксические свойства [106, 123]. Установлено, что ЦЛТ состоит из трех субъединиц, две из которых – CdtA и CdtC связываются с плазматической мембраной клетки-мишени, а белок CdtB, аналогичный по строению и свойствам ДНКазе I млекопитающих, проникает внутрь ядра клетки, где вызывает повреждение ДНК, арест клеточного цикла и апоптоз [91, 111, 162]. Установлено, что ЦЛТ и колибактин грамотрицательных бактерий могут индуцировать в клетках двунитевые разрывы ДНК, экспрессию генов p53 и ингибитора циклин-зависимой киназы p21, фосфорилирование гистона H2AX, задержку клеточного цикла с признаками незавершенной ДНК репарации, приводящей к хромосомным мостам в анафазе и к хромосомным аберрациям [114, 122, 203]. Индуцированная ЦЛТ геномная нестабильность ассоциирована с нарушенным ответом на повреждение ДНК и с отсутствием эффективного контроля сверочных точек клеточного цикла, что сопровождается появлением различных кариопатологических и цитогенетических нарушений [99]. Доказано, что в пролиферирующих энтероцитах, подвергнутых воздействию колибактина, длительно сохраняются микроядра, анеуплоидия, кольцевые хромосомы и хромосомные мосты в анафазе [122]. Нelicobacter pylori в культивируемых эпителиальных клетках желудка подавляет механизмы «мисмэтч» и эксцизионной репарации ДНК [138, 139], индуцирует двунитевые разрывы и фрагментацию ДНК [66, 118], а также существенно повышает уровни мутаций в клетках желудка у экспериментально-зараженных трансгенных Big Blue мышей [100, 117]. В экспериментах in vitro было показано, что в нормальных и раковых клетках, которые выживали после воздействия ЦЛТ грамотрицательных бактерий, были обнаружены признаки клеточного старения. Эти клетки имели фенотип, включающий постоянную активацию механизмов ответа на повреждение ДНК, в том числе появление фокусов фосфорилированного гистона H2AX и экспрессию ИЛ-6 [75]. 17 1.2. Регуляция клеточного цикла и стабильность генома Известно, что для того чтобы защитить геном от повреждений ДНК, индуцированных эндогенными и экзогенными факторами, клетки активируют целый комплекс механизмов, который получил название «ответ на повреждение ДНК» или DDRs (от англ. DNA damage responses), направленный на контроль в сверочных точках клеточного цикла и на репарацию ДНК, что минимизирует вероятность возникновения геномной нестабильности, а также инициации и прогрессии опухоли [237]. Диплоидное состояние клеток млекопитающих поддерживается контролирующим механизмом, в котором участвуют комплекс циклинзависимых киназ (Cdk) и субъединиц белков-циклинов (Cyc), функционирующего в течение всего клеточного цикла и предотвращающего появление и/или пролиферацию клеток с аберрантной ДНК [112]. Инициация репликации ДНК контролируется системой, которая предотвращает повторное удвоение ДНК в двух типах сверочных точек: в сверочной точке повреждения ДНК (в G1/S точке) и в сверочной точке сборки веретена деления клетки (в M-точке), где определяется целостность диплоидного генома или правильность расхождения вновь образованных сестринских хроматид [112]. Киназа ATM (от англ. ataxia telangiectasia mutated), с мутацией гена которой связан наследственный синдром атаксии-телеангиэктазии, а также киназа ATR (ATM и Rad3-related) могут инициировать активацию сверочной точки повреждения ДНК (G1/S точки) [101]. ATM киназы активируются при двуцепочечных разрывах ДНК, тогда как ATR киназы отвечают на патологические однонитевые повреждения. ATM и ATR киназы фосфорилируют и активируют другие эффекторные киназы Chk2 и Chk1 (от англ. checkpoint kinase 2 и 1), которые, в свою очередь, фосфорилируют белки, вызывающие арест клеточного цикла за счет инактивации Cdc25A фосфорилазы, которая необходима для активации циклин-зависимой киназы Cdk2/CycЕ, а также стимулируют p53 путь, инициирующий старение и апоп- 18 тоз дефектной клетки в G1/S-фазах [101]. В G2-фазе дефекты реплицированной ДНК и хромосомы с разрывами активируют G2/M сверочную точку. В результате чего ATM и/или ATR-зависимые сигнальные пути задерживают вхождение такой клетки в митоз, инактивируя Cdc25C фосфорилазу, которая необходима для активации циклин-зависимой киназы Cdk1/CycB. Известно, что геномная нестабильность подразделятся на хромосомную нестабильность (ХНС) и микросателитную нестабильность (МНС) [163, 164]. Последняя, главным образом, связана с дефицитом репарации ДНК. В то время как, механизмы возникновения ХНС, включая анеуплоидию и полиплоидию, изучены в гораздо меньшей степени. У человека полиплоидизация в норме встречается только в ограниченном числе типов клеток, например, в мегакариоцитах и гепатоцитах, но чаще полиплоидию связывают с некоторыми патологическими процессами, включая канцерогенез и воспаление [112]. Известно, что полиплоидия может быть результатом одного из трех событий – слияния клеток, эндомитоза или блокирования веретена деления [97, 163, 164]. Слияние клеток с образованием многоядерных (полиплоидных) клеток чаще всего ассоциировано с вирусной инфекцией (например, папилломавирус человека, ВИЧ и др.), а также с эффектом некоторых цитокинов [64, 184]. Деление подобных клеток генерирует образование промежуточных бинуклеаров, которые затем, в результате деления, могут давать дочерние тетраплоидные или многоядерные клетки [64]. Возникновение физиологической полиплоидии в мегакариоцитах и гепатоцитах обусловлено эндомитозом, при котором происходит анафаза и телофаза, но отсутствует цитокинез [112]. При этом происходит два и более последовательных раунда репликации (эндоредупликация) хромосомной ДНК, приводя к образованию полиплоидных клеток. Механизм эндомитоза, по-видимому, связан с субоптимальным уровнем активности циклинзависимой киназы Cdk1/CycB и преждевременной деградацией белка циклина Cyclin B [221]. 19 В случае блокирования веретена деления диплоидный набор удваивается вследствие нерасхождения сестринских хроматид в анафазе. Такой тип нарушений получил название К-митоза по аналогии с таковым после воздействия на клетку колхицина, который блокирует веретено деления [163, 164]. Установлено, что полиплоидные гепатоциты, индуцированные частичной гепатэктомией, а также при токсическом или лекарственном гепатите, имеют признаки оксидативного повреждения ДНК, активации ПОЛ, истощения антиоксидантных систем, снижения активности репликации ДНК, а также индукции старения и апоптоза [82, 204]. Предполагают, что наличие оксидативного повреждения ДНК в условиях митогенной стимуляции способно приводить к полиплоидии [134]. На примере воспалительных заболеваний толстого кишечника (неспецифического язвенного колита) показана взаимосвязь между клеточным старением, повреждениями ДНК и уровнем окислительного стресса или макрофагальной инфильтрации с образованием эндогенных оксидантов в очагах воспаления [174]. У больных с воспалительными заболеваниями легких уровни эпителиальных клеток с тетра- и анеуплоидией, гиперамплификацией центросом и мультиполярными митозами были сопоставимы с частотой полиплоидии в опухолевых клетках и прямо коррелировали с выраженностью воспаления [213]. Механизмы и последствия полиплоидизации клеток при воспалительном процессе до сих пор мало изучены. Известно, что неправильная форма ядра и признаки старения клеток характерны для наследственного синдрома прогерии Гатчинсона-Гилфорда, связанного с мутацией в гене ламина А. Вместе с тем, механизмы, приводящие к аналогичным изменениям в стареющих клетках, до сих пор не достаточно ясны [196, 246]. Установлено, что изменения морфологии ядер в стареющих клетках является проявлением патологического митоза, включая абортивный или незавершенный митоз [196]. Абортивным называют митоз, протекающий без сегрегации хромосом и цитокинеза, что приводит к обра- 20 зованию полиплоидных интерфазных клеток [110, 219]. Подобный тип патологических митозов обычно наблюдается в культуре клеток, подвергнутых воздействию либо веществ, нарушающих сборку веретена деления, либо агентов, повреждающих ДНК (например, сублетальных доз пероксида водорода), что, как правило, приводит к старению и апоптозу клеток [77, 219]. Известно, что пероксид водорода (H2O2), который вызывает окислительный стресс и преждевременное старение клеток, также может быть ответственным и за их полиплоидизацию с участием механизмов, аналогичных тем, которые происходят в очагах воспаления [196]. В стареющих клетках частота патологических митозов, сопровождающихся нарушением сборки веретена деления или прикрепления микротрубочек к кинетохорам хромосом, прямо коррелирует с образованием дополнительных центросом и с ростом дефектов выстраивания хромосом в экваторе клетке [197]. Эти данные показывают, что формирование хромосомной нестабильности в стареющих клетках и клетках, находящихся в состоянии окислительного стресса, ассоциировано с нарушением удвоения центросом [197]. Кроме того, установлено, что стареющие клетки могут активно продуцировать провоспалительные цитокины, которые сами по себе являются стимуляторами окислительного стресса [226]. Например, стромальные фибробласты в очагах воспаления демонстрируют признаки старения и активно продуцируют провоспалительные цитокины ИЛ-6 и ИЛ-8 [92]. Известно, что тетра- и последующая поли- и анеуплоидизация инициируется в результате нарушения функционирования различных белков, регулирующих клеточный цикл [112]. В частности, имеются данные о том, что p53 может быть функционально инактивирован в результате повышенной продукции провоспалительных цитокинов, что способствует стимуляции пролиферации клеток, нарушению в числе центросом и поли- и анеуплоидизацией клеток [116, 234]. В отличие от раковых клеток, для которых также характерна полиплоидия, в культуре нормальных лимфоцитов, обработанных соединениями, которые вызывают дисфункцию веретена деления клетки, число кле- 21 ток с патологией митоза и полиплоидией положительно коррелирует с уровнем клеток в состоянии апоптоза [147]. Установлено, что образование двунитевых разрывов и связанных с ними хромосомных и хроматидных разрывов тесно ассоциировано с процессом репарации ДНК [87]. В настоящее время предполагают, что хромосомные аберрации образуются по механизму образования первичных разрывов ДНК и неправильного их воссоединения («breakage-and-reunion» или «breakage-first» модели хромосомных аберраций), поэтому их формирование тесно связано с процессом репарации негомологичных концевых соединений двунитевых разрывов, а также гомологичным рекомбинационным воссоединением двунитевых разрывов [87]. Механизм образования хроматидных разрывов пока остается не ясным. [86]. Хроматидные разрывы, по-видимому, формируются за счет более сложного механизма, поскольку существует несоответствие между уровнями воссоединения двунитевых разрывов и исчезновением хроматидных разрывов [86]. Считается, что спонтанные и индуцированные хроматидные разрывы происходят из двунитевых разрывов ДНК и процесса меж- внутрихроматидных перестроек [86, 87]. 1.3. Образование реактивных метаболитов кислорода и азота и их роль в индукции цитогенетических нарушений Реактивные метаболиты кислорода (в особенности супероксид-анион радикал, O2-) и оксид азота (NO) являются мощными антимикробными агентами и важными регуляторными молекулами врожденного иммунного ответа, которые синтезируются в очаге воспаления в нейтрофилах, моноцитах, макрофагах и некоторых других клетках. Установлено, что провоспалительный цитокины, бактериальный липополисахарид, а также поверхностные липопротеины B. burgdorferi OspA и OspB индуцируют повышенную продукцию супероксид-анион радикала (O2-) и экспрессию индуцибельной синтазы оксида азота iNOS (от англ. inducible nitric oxide synthase) в фагоцитах 22 [156, 200]. Согласно данным H.B. Мандраковой с соавт. [36] у больных острым ИКБ уровень стабильных метаболитов NO в сыворотке крови и моче был достоверно выше по сравнению с контролем и реконвалесцентами. На примере некоторых патогенов, включая боррелии, была показана тесная корреляционная связь между способностью иммуноцитов продуцировать высокие уровни NO и естественной резистентностью к этим возбудителям [156, 194, 200]. С другой стороны, к настоящему времени установлено, что острый и хронический воспалительный процесс при различных инфекционных заболеваниях или действии некоторых химических канцерогенов (например, асбеста), индуцирует повышение активности окислительных ферментов, таких как iNOS, НАДФ-оксидаза и миелопероксидаза, что приводит к продукции высоких концентраций взаимодействующих с ДНК реактивных соединений кислорода и азота, вызывая образование в клетках 8-оксо-7,8-дигидро-2'дезоксигуанозина и 8-нитрогуанина [10, 29, 35, 53, 108, 223]. Чрезмерная продукция этих свободных радикалов может приводить к смещению в балансе между оксидантами и антиоксидантами, вызвать нитрозативный и оксидативный стресс, который играет значительную роль в повреждении биомолекул, таких как ДНК, РНК, липиды и белки, индуцируя мутации, геномную нестабильность, эпигенетические изменения, дисфункцию белков и апоптоз клеток [223]. В частности, маркер оксидативного повреждения ДНК – 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин, образующийся в очагах воспаления, является потенциально мутагенным повреждением ДНК, приводящим к трансверсии пары G : C (Гуанин : Цитозин) на T : A (Тимин : Аденин) или к G → T трансверсии в ходе репликации ДНК [85]. Чрезмерная продукция оксида азота и его взаимодействие с супероксид анион радикалом кислорода (О2–) приводит к генерации пероксинитрита (ONOO−), который индуцирует образование индикатора нитрозативного повреждения ДНК – 8-нитрогуанина [136], вызывающего спонтанную депуринизацию ДНК, формирование апуриновых сайтов, G → T трансверсий, а 23 также приводящего к ошибкам ДНК полимераз в ходе репликации и к большому числу точковых мутаций [109, 223]. Доказано, что у трансгенных SJL мышей существенно повышается частота мутаций гена lacZ в клетках органа-мишени, где была предварительно индуцирована повышенная продукция NO [132]. Методами иммуногистохимии установлено, что в очагах воспаления повышенная секреция макрофагами NO сопровождается появлением признаков апоптоза и накоплением его продукта – нитротирозина в близрасположенных окружающих клетках [132]. Показано, что бактерия H. pylori, которая считается основной причиной хронического гастрита и карциномы желудка, активирует фагоциты, продуцирующие реактивные соединения кислорода и азота, что индуцирует повреждение ДНК в эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка, а также усиливает секрецию различных провоспалительных цитокинов, участвующих в воспалительном ответе [137]. Установлено, что биомаркеры перекисного окисления липидов (ПОЛ) – малоновый диальдегид (МДА) и 4-гидрокси-2-нонэнал (ГНЭ) образуются из полиненасыщенных жирных кислот в норме в результате различных физиологических процессов [145, 220]. Однако, известно, что при воспалительном процессе концентрация МДА и ГНЭ повышается в 2-3 раза из-за стимуляции их синтеза реактивными метаболитами кислорода [78]. Известно, что реактивные метаболиты кислорода, в том числе пероксид водорода, супероксид-анион радикал (O2-) и гидроксильный радикал (OH-), не только повреждают ДНК, но и ингибируют репликацию ДНК и часто индуцируют апоптоз [159, 169]. Индуцированное свободными радикалами повреждение ДНК приводит к накоплению в клетках супрессорного белка р53, обладающего проапоптотическим действием и вызвающего остановку клеточного цикла на стадии G1 [6, 227]. Помимо этого, возможен и другой механизм гибели клеток, в котором NO-опосредованные геномные повреждения запускают повышенную экспрессию ядерного энзима поли(АДФ)рибозополимеразы (PARP), что приво- 24 дит к быстрому истощению его субстрата НАД+, а, следовательно, к подавлению синтеза АТФ, нарушению функционирования клетки и её гибели [193, 207]. Более того, установлено, что повышенный уровень разрывов ДНК и последующая активация PARP происходит в культуре макрофагов, подвергнутых воздействию липополисахарида или интерферона-γ (ИФН-γ) [65, 207], а также в культурах L929 клеток [69] или фибробластов [150], стимулированных фактором некроза опухоли-α (ФНО-α). Доказано, что провоспалительные цитокины (ИФН-γ, ФНО-α и интерлейкин (ИЛ)-1β) в очагах хронического воспаления и в опухолевой ткани не только активируют iNOS и синтез реактивных метаболитов кислорода и азота, но и вызывают ингибирование ДНК-репарации, что способствует аккумуляции повреждений ДНК [149]. Таким образом, установлено, что токсические продукты окислительного стресса, повышенное образование которых характерно для ИКБ, оказывают цитостатический эффект, вызванный повреждением мембран, белков или ДНК, что приводит к гибели клеток путем апоптоза или некроза [159]. 1.4. Роль провоспалительных цитокинов в исходах иммунного ответа при иксодовом клещевом боррелиозе Известно, что у некоторых индивидуумов острый ИКБ протекает субклинически. Как правило, у этих людей имеется врожденный иммунный ответ, который приводит к полной элиминации возбудителя. У других больных врожденный иммунный ответ не в состоянии полностью элиминировать боррелии, но программы приобретенного иммунного ответа запускают активацию Т-хелперов типа 1 или 2, что может привести или не привести к элиминации возбудителя [191]. 25 Крупные популяции моноцитов, активированные макрофаги и зрелые дендритные клетки, которые, как известно, способны индуцировать мощный врожденный иммунный ответ и играют центральную роль в активации приобретенного иммунного ответа против боррелий, чаще всего обнаруживаются в области кольцевидной мигрирующей эритемы [102]. В ходе врожденного иммунного ответа антигены возбудителя распознаются рецепторами, такими как Толл-подобные рецепторы (TLR) на мононуклеарных фагоцитах, что запускает секрецию цитокинов и хемокинов, а также ответ лимфоцитов на инфекционный агент [68, 154]. Активированные Т-лимфоциты, которые привлекаются в воспалительный очаг, в свою очередь активируют мононуклеарные фагоциты, модулируют их секреторные и эффекторные функции опосредовано через секрецию ИФН-γ и экспрессию CD40 лигандов (CD40L) [68, 154]. Показано, что живые и инактивированные нагреванием боррелии, добавленные в культуры мононуклеарных клеток периферической крови, активно фагоцитировались моноцитами и дендритными клетками в условиях in vitro [143, 209], а также индуцировали повышение экспрессии компонентов NF-B-зависимого сигнального каскада, включающего провоспалительные цитокины (ИФН-γ, ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНО-α) что, повидимому, играет существенную роль в развитии ранних стадий иммунного ответа, а также в исходе заболевания [81, 113, 148, 215]. К настоящему времени можно считать установленным, что взаимодействие фагоцитов с антигенами боррелий опосредованное Толл- подобными рецепторами типа 2 и типа 1 (TLR2 и TLR1) приводит к активации фактора транскрипции NF-κB, а также к активации пути p38 митогенактивированной протеинкиназы (MAPK) [202], который играет центральную роль в дифференцировке Т-клеток, развитии апоптоза, респираторного взрыва в фагоцитах, продукции провоспалительных цитокинов ИФН-γ, ФНО-α и других функций при развитии иммунного ответа [104]. 26 Кроме того, I. Kang с соавт. [241] в экспериментах на мышах показали, что у животных, устойчивых к боррелиозу, отмечался ранний мощный ответ с участием ИФН-γ, который затем в динамике сменялся ростом ИЛ-4, тогда как у мышей с Лайм-артритом доминировал ответ ИФН-γ и другие признаки воспалительного процесса. Все эти данные прямо указывали на то, что Тхелпер типа 1-опосредованный ответ с участием провоспалительных цитокинов играет существенную роль в развитии хронического Лайм-артрита, в то время как ответ Т-хелперов типа 2 имеет протективное значение, особенно, в исходе воспалительного процесса в суставах [241]. J. Sjöwall с соавт. [151], были получены данные, свидетельствующие о существенном значении ответа цитокинов Т-хелперов типа 1 в ранней эрадикации возбудителя в ходе врожденного иммунного ответа и в клинических исходах боррелиоза. В стимулированных живыми боррелиями культурах дендритных клеток, полученных от группы асимптомных серопозитивных больных (со спонтанным выздоровлением), отмечалось существенное повышение продукции ФНО- и ИЛ-12 по сравнению с соответствующими показателями в группах с подострым нейроборрелиозом и с серонегативным контролем что, по мнению авторов, могло свидетельствовать о том, что случае врожденного иммунитета сильный ответ Т-хелперов типа 1 играет решающую роль в благополучном исходе заболевания [151]. Известно, что ФНО- и ИЛ-12 являются важными цитокинами врожденного иммунного ответа и имеют провоспалительные и антибактериальные эффекты [244]. Все эти данные могут свидетельствовать о том, что активная продукция клетками ФНО- наряду с ИФН-γ имеет существенное значение для эрадикации боррелий в ранний период после заражения. Однако, несмотря на то, что воспалительный процесс играет ключевую роль в освобождении тканей от инфекционного агента, неконтролируемое, в особенности хроническое, воспаление и чрезмерная продукция провоспалительных цитокинов сами по себе могут быть причиной значительного повреждения тканей и органов [191]. Эксперименты с использованием 27 зараженных животных сделать вывод о том, что более слабый первичный ответ макрофагов, дендритных клеток и нейтрофилов против боррелий, приводит к их диссеминации по организму, что связано с запуском сильного, но неадекватного воспалительного ответа, направленного на предотвращение развития персистенции боррелий, который сопровождается выраженным повреждением органов и тканей, включая суставы [191]. Кроме того, было установлено, что число ФНО- и ИФН-γсекретирующих дендритных клеток, определенных методом ELISPOT, в культурах больных хроническим ИКБ было существенно повышено, что повидимому, можно объяснить дефектами в процессе, ответственном за подавление воспаления, в результате чего продукция провоспалительных цитокинов на высоком уровне приобретает персистентный характер [151]. В этой связи, можно отметить несколько механизмов ответственных за поддержание хронического воспаления при боррелиозах. Во-первых, установлено, что в группе хронических больных число дендритных клеток, продуцирующих регуляторный противовоспалительный цитокин ИЛ-10 было очень низким или совсем отсутствовало [151]. Кроме того, в последние годы было показано, что хронический Лайм-артрит может быть индуцирован не только с участием ответа Т-хелперов типа 1 и ИФН-γ, но и ещё Т-хелперами типа 17 и ИЛ-17, с которыми ранее связывали развитие ревматоидного артрита [191]. Более того, B. burgdorferi способны индуцировать повышенную продукцию ИЛ-17 Т-хелперами типа 17 в условиях in vitro, что, в свою очередь, стимулирует продукцию других провоспалительных цитокинов, включая ИЛ-1, ФНО- и ИЛ-6 и поддерживает персистентный воспалительный ответ [80, 191]. Кроме того, показано, что в очагах хронического воспаления ИЛ-6 способствует аккумуляции мононуклеарных клеток и подавляет апоптоз активированных Т-лимфоцитов [79]. Доказано, что длительное сохранение повышенной продукции ИЛ-6, обладающего провоспалительными свойствами, непосредственно связано с переходом острого воспаления в хрони- 28 ческий или аутоиммунный процесс, включая аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, болезнь Крона или псориаз [131, 144]. 1.5. Пути апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток в ходе иммунного ответа на патоген и активационно-индуцированная клеточная смерть Значительное число внеклеточных и внутриклеточных патогенов индуцируют апоптоз клеток-мишеней, в то время как некоторые другие инфекционные агенты напротив подавляют апоптоз. Апоптоз инфицированных иммуноцитов, который, в отличие от некроза, как правило, не приводит к воспалительным последствиям и повреждению других клеток, можно рассматривать как успешную стратегию иммунной системы, направленную на элиминацию возбудителя [222]. С другой стороны, ингибирование апоптоза, напротив, можно рассматривать как адаптивный механизм, приводящий к повышению выживания патогенов и к нарушению их элиминации из организма [222]. Влияние на апоптоз иммуноцитов считается ключевой стратегией инвазии, используемой внутриклеточными патогенами, включая возбудитель туберкулеза Mycobacterium tuberculosis [146]. Предполагают, что в определенных условиях фагоцитированные микобактерии для того чтобы размножаться и персистировать в макрофагах способны задерживать их апоптоз и подавлять провоспалительную активацию этих клеток [146]. В проблеме персистирующих инфекций неясным остаётся вопрос о причинах, приводящих при одном и том же возбудителе к разным исходам болезни: в одних случаях развивается циклическое течение с элиминацией патогена, в других формируется хронический воспалительный процесс. Такие особенности хронической инфекции обусловлены состоянием иммунной системы организма, от адекватности которой зависят течение и исход заболевания [2, 3, 15, 16, 43] 29 При этом особый интерес к структурно-функциональному статусу лимфоцитарных клеток обусловлен не только тем фактом, что иммунная система, как очевидно, принимает непосредственное участие в реализации инфекционного процесса, но и тем, что иммунокомпетентные клетки сами являются мишенью для действия возбудителей инфекционных заболеваний [2, 3, 14, 15, 16, 43]. Многоклеточные организмы выработали определенную стратегию ответа поврежденных клеток на стрессовые факторы окружающей среды: в тех случаях, если выраженность повреждений средняя, клетки обычно пытаются репарировать возникшие нарушения, а в ситуации, когда повреждения слишком серьезны и их не возможно ликвидировать, пораженные клетки элиминируются путем апоптоза [4]. Изучение апоптоза привело к осознанию того факта, что он представляет собой активную форму реакции клеток не только на заведомо неблагоприятные воздействия, но и на физиологические факторы, каковыми в случае лимфоцитов являются антигены и митогены. Соотношение пролиферации и апоптоза при этом служит важнейшим параметром реакции на антигены, поскольку оно определяет её результативность с точки зрения развития иммунного ответа или формирования иммунологической толерантности [4]. По-видимому, выбор индивидуальной клеткой направления реакции является вероятностным процессом, однако соотношение двух форм реакции может контролироваться внутриклеточными механизмами и подвергаться воздействию внешних по отношению к клетке факторов [4]. То обстоятельство, что соотношение между уровнем пролиферации и апоптоза лимфоцитов, варьирует в культурах полученных от разных людей, и изменяется при патологических процессах, позволяет говорить о том, что оно может характеризовать индивидуальные особенности иммунного ответа [63]. Предполагают, что к ведущим механизмам вторичных иммунодефицитов, возникающих при инфекционном процессе или вызванных не инфек- 30 ционными факторами (ионизирующая радиация, ксенобиотики и др.), является усиление апоптоза иммунокомпетентных клеток [22]. Показано, что дефектность в координации апоптоза может приводить к серьезным нарушениям в иммунной системе как в сторону его подавления при аутоиммунной патологии или при иммуноонкопатологии, так и в сторону чрезмерного усиления запрограммированной клеточной гибели при иммунодефицитах [22]. Индукция апоптоза нормальных Т-лимфоцитов при одновременной защите от клеточной гибели инфицированных клеток и сохранении персистенции патогена происходит с участием определенных белков некоторых вирусов: вируса иммунодефицита человека (белок Tat), вируса ЭпштейнаБарр (LMP-1 белок), аденовируса (E1B белок) или вируса коровьей оспы (белок серпин) [40, 95, 128]. Установлено, что в культурах мононуклеарных клеток, полученных от больных хроническим гепатитом С, по сравнению со здоровым контролем, существенно увеличены уровни растворимых sFas и sFasL и подавлена экспрессия Fas-рецепторов на поверхности клеток, что коррелирует с вирусной нагрузкой и тяжестью синдрома цитолиза и свидетельствует о подавлении апоптоза лимфоцитов, способствующего поддержанию персистентного воспалительного ответа у больных людей [94]. Некоторые внеклеточные и внутриклеточные бактерии и их липопротеины (палочка Serratia marcescens, вызывающая нозокомиальную инфекцию, грамположительная бактерия Corynebacterium diphtheriae, липопротеины микобактерий туберкулеза Mycobacterium tuberculosis, возбудителей шигеллеза Shigella flexneri или лептоспироза Leptospira interrogans) способны дисрегулировать апоптоз у человека [22, 107, 158]. Апоптоз рассматривается как одна из важнейших причин дисфункции моноцитов и лимфоцитов при бактериальном сепсисе [44, 173, 185]. Установлено, что сепсис, особенно протекающий в тяжелой форме и сопровождающийся развитием «иммунного паралича», ассоциирован с интенсивным апоптозом циркулирующих лимфоцитов [161]. 31 Таким образом, несомненно, что показатель апоптоза может служить критерием тяжести иммунодефицитного процесса. Увеличение спонтанного или индуцированного апоптоза Т-лимфоцитов можно рассматривать как лабораторный показатель апоптотического иммунодефицита [22]. Динамический процесс поддержания оптимального пула периферических Т-лимфоцитов, с одной стороны, включает регулярное его пополнение либо за счет выхода Т-клеток, прошедших селекцию в тимусе, либо за счет постоянной пролиферации периферических Т-лимфоцитов в ответ на различные стимулы (антигены и митогены), а, с другой стороны, включает постоянное снижение числа периферических Т-клеток в результате их апоптотической гибели. В результате этого формируется поддержание баланса общего числа Т-клеток приблизительно на постоянном уровне [130]. Покоящиеся Т-лимфоциты устойчивы к апоптозу – возможно, под влиянием антиапоптотического белка Bcl-2 или родственных молекул. По мере активации и последовательного вступления в клеточный цикл Т-лимфоциты становятся значительно более чувствительными к апоптозу через специализированные и неспециализированные триггерные механизмы. В иных условиях запуск апоптоза клеток-мишеней происходит в результате повреждающего действия реактивных метаболитов кислорода и азота, литических продуктов (перфорина, гранзима В и др.) цитолитических Т-лимфоцитов, теплового шока, мутагенов, токсических агентов (ксенобиотиков) или гормонов [22, 130]. Апоптоз представляет собой процесс, который, прежде всего, необходим для разрешения воспаления путем устранения поврежденных или гиперстимулированных клеток при воспалительных процессах [130]. Известно, что для поддержания толерантности к собственным антигенам и гомеостаза иммунной системы важное значение имеет делеция Т-лимфоцитов вне тимуса, когда после активации антигеном большинство Т-клеток погибает в результате апоптоза. Этот механизм служит для контроля аутоиммунных реакций и поддержания оптимального пула лимфоидных клеток [130]. 32 Апоптоз Т-лимфоцитов может быть происходить в результате передачи сигналов по двум основным путям [72, 89]. Известно, что в ходе антигенной активации Т-клетки приобретают цитокиновые рецепторы, от стимуляции которых различными цитокинами может зависеть рост и выживание этих клеток. Когда воспалительный ответ угасает и продукция цитокинов подавляется, то это приводит к апоптозу активированных Т-лимфоцитов. В этом случае, процесс апоптоза происходит через, так называемый, «митохондриальный» путь [73]. Апоптоз сопровождается активацией ряда генов, один из которых ген ИЛ-1β-конвертирующих ферментоподобных протеаз (ICE от англ. interleukin-1-β-converting enzyme). Продукты генов bax и bad взаимодействуют с антиапоптотическим протеином Bcl-2, приводя к его инактивации, тем самым, индуцируя повышение проницаемости наружной митохондриальной мембраны и высвобождение цитохрома с из митохондрий, который формирует комплекс с адаптер-молекулой Apaf-1, что активирует прокаспазу-9 и образует, так называемую, апоптосому. Экспрессия генов с-myc и p53, которые активируются в ответ на повреждение ДНК, также имеет значение в инициации процесса апоптоза [73]. Второй механизм апоптоза Т-лимфоцитов, известен как активационно-индуцированная клеточная смерть (АИКС или AICD от англ. activation-induced cell death), который активируется в результате повторной стимуляции Т-клеточных рецепторов (TCR от англ. T cell receptor) антигеном [88]. Известно, что индукция АИКС ассоциирована с взаимодействием лигандов Fas (FasL/CD95L), которые экспрессированы на цитотоксических Тклетках, моноцитах и нейтрофилах, с трансмембранными белкамирецепторами Fas (CD 95/APO-1), представленными на большинстве типов клеток, включая активированные (нецитотоксические) Т- и В-лимфоциты [157]. Fas/CD95-рецепторы, согласно классификации относят к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNF-R). Известно, что при взаимодействии FasL с рецептором Fas происходит олигомеризация Fas с участием Fas-ассоциированных с доменами смерти протеинов (белка FADD от 33 англ. Fas-associated death domain protein) приводящая к формированию апоптоз-индуцирующего сигнального комплекса DISC (от англ. death-inducing signal complex), что приводит к активации прокаспазы-8 запускающую процесс апоптоза в клетке [160, 208]. Однако, с другой стороны, было показано, что активация прокаспазы-8 может происходить при распознавании Тклеточным рецептором (TCR) комплекса антиген-MHC (MHC – главный комплекс гистосовместимости) на поверхности антигенпрезентирующей клетки, что приводит к процессу обратному апоптозу – к пролиферации и активации Т-лимфоцитов. При этом происходит стимуляция белка c-FLIP (клеточный FADD-подобный ИЛ-1β-конвертирующий фермент- ингибиторный протеин от англ. – cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1-β-converting enzyme-inhibitory protein) и повышение экспрессии цитоплазматического фактора транскрипции NF-κB, инициирующего пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на антиген [208]. Мутации у трансгенных мышей или наследственные мутации у людей, имеющих дефекты Fas/CD95-рецепторов или FasL, ассоциируются с подавлением процесса апоптоза лимфоцитов и с развитием аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома у человека [187] или с прогрессирующей лимфоаденопатией и спленомегалией у экспериментальных животных [172]. По-видимому, оба вышеназванных сигнальных пути апоптоза («митохондриальный» путь и Fas/FasL-ассоциированный путь АИКС) играют частично дублирующую и перекрестную роль в процессе программированной клеточной гибели Т-клеток и в поддержании гомеостаза лимфоцитов, а их относительный вклад в той или иной ситуации зависит от того, какой характер – острый или хронический имеет иммунный ответ [72]. В случае острого иммунного ответа, апоптоз преимущественно запускается в результате подавления продукции цитокинов в фазу разрешения иммунного ответа на инфекционный патоген или введенный иммуноген [157, 229]. В то же время, инициация АИКС в результате повторной стимуляции Т-клеточных рецепторов (TCR) активированных Т-лимфоцитов в условиях in vitro или неодно- 34 кратного введения антигена экспериментальным животным, по-видимому, имитирует постоянную стимуляцию TCR, которая встречается при хроническом иммунном ответе на персистирующий инфекционный агент [157, 229]. Этот вывод нашел своё подтверждение и в экспериментах, проведенных в последние годы, где было показано, что снижение острого Тклеточного ответа на вирус простого герпеса-1 у трансгенных животных происходило только за счет инициации «митохондриального» пути апоптоза, тогда как в случае хронической инфекции, вызванной мышиным γгерпесвирусом в процессе апоптоза антиген-стимулированных Т- лимфоцитов были задействованы оба механизма – Fas-опосредованный и «митохондриальный» [72]. Таким образом, было установлено, что оба сигнальных пути апоптоза эффекторных Т-лимфоцитов вносят свой вклад в предотвращение развития хронического инфекционного процесса и аутоиммунной патологии » [72]. Известно, что для больных хроническим ИКБ-ассоциированным артритом также как и при ревматоидном артрите, характерен аллель HLA-DR4, что дает основание предположить, что хронизация ИКБ может быть ассоциирована с персистенцией возбудителя и аутоиммунным процессом [230]. Вместе с тем, в экспериментах продемонстрирована способность боррелий образовывать атипичные и цистные формы и персистировать в макрофагах, что может обеспечить патогенетический механизм хронического течения Лайм-боррелиоза [186]. Первым сообщением, свидетельствующим о том, что возбудитель инфекционного заболевания может оказывать влияние на баланс про- и антиапоптотических сигналов, послужили данные о стимуляции апоптоза макрофагов Shigella flexneri [244]. A.O. Aliprantis с соавт. [235] было впервые показано, что боррелиозные липопротеины имеют проапоптотический эффект и способствуют индукции цитокинов. Апоптоз клеток был опосредован Fas-ассоциированными доменами смерти и каспазой 8. В результате экспериментов было показано, что добавление живых B. afzelii существенно стимулирует апоптоз в культуре фибробластов [235]. В тоже время, 35 лирует апоптоз в культуре фибробластов [235]. В тоже время, Bartonella henselae и, в особенности Coxiella burnetii, напротив, индуцировали значительное подавление апоптоза клеток в те же сроки культивирования [96]. Установлено, что боррелии, заключенные в фагосомы способны индуцировать определенные цитозольные сигналы, которые приводят к усилению NFκB зависимой продукции провоспалительных цитокинов, активации лимфоцитов, сборке инфламасомы и к индукции апоптоза [210]. В последние годы было показано, что фагоцитоз бактерий может запускать прежде всего внутренние пути апоптоза [76, 190, 211]. Поэтому апоптоз моноцитов, инициированный фагоцитированными боррелиями, также может быть следствием, прежде всего, активации внутренних путей программированной клеточной гибели [210]. В то же время, это предположение ни в коем случае не исключает в процессе инициации апоптоза ни участия экзогенных путей, которые могут быть запущены вследствие активации клеток при фагоцитозе, ни эффектов компонентов боррелий, которые возможно непосредственно способны выполнять роль цитозольных апоптотических сигналов [84, 126]. Кроме того, известно, что реактивные продукты азота и кислорода, которые генерируются в процессе фагоцитоза могут выполнять внутриклеточную сигнальную функцию [129, 218] и приводить к патоген-индуцированному апоптозу фагоцитов [126]. 36 ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУПП ЛЮДЕЙ Всего в настоящее исследование было включено 43 больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом (ИКБ). Пациентов из группы острым ИКБ обследовали в динамике. В группу диагнозом острого ИКБ было включено 22 больных в возрасте от 19 до 59 лет (43,142,71 лет), госпитализированных в клинику инфекционных болезней ГБОУ ВПО Сибирского государственного медицинского университета (СибГМУ) МЗ РФ в течение 2009-2010 гг. на 1-3 неделю заболевания (группа IA), из числа которых 12 пациентов имели эритемную серопозитивную, а 10 больных – эритемную серонегативную формы заболевания (таблица 1). Таблица 1. Распределение больных острым иксодовым клещевым боррелиозом (группа IA) в зависимости от пола и клинического варианта Эритемная клиническая форма Пол Серонегативная Серопозитивная женский 6 (60 %) 6 (50 %) мужской 4 (40 %) 6 (50 %) 10 12 Всего Кроме того, обследовано 20 пациентов из этой же группы в возрасте от 19 до 59 лет (43,552,85 лет) в период реконвалесценции острого ИКБ в динамике через 3 месяца после эффективного курса антибиотикотерапии (группа IB). Выздоровление больных было подтверждено отсутствием клинической симптоматики и отрицательными результатами серологического обследования в течение одного года диспансерного наблюдения. Для лабо- 37 раторного подтверждения диагноза ИКБ использовался метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с определением специфических IgM и IgG в динамике (наборы D-1454 и D-1452, ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово, РФ), а также метод ПЦР с использованием набора D-1498 «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato» (ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово, РФ). Метод ИФА также использовался для исключения клещевого энцефалита с определением антигена и специфических IgM и IgG (наборы D-1154 D-1152 и D-1156, ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово, РФ). Из анамнеза у этих групп пациентов было выяснено, что никто из них ранее не болел ИКБ или другими клещевыми инфекциями и не подвергался укусам клещей в течение последних 5 лет. Группа II включала 21 больного хроническим ИКБ в возрасте от 26 до 60 лет (47,242,53 лет) в стадии субкомпенсации заболевания, с преимущественными поражением опорно-двигательного аппарата, госпитализированных в МАУЗ МСЧ «Строитель», г. Томск. Контрольная группа (группа III) состояла из 23 здоровых лиц в возрасте от 24 до 56 лет (41,342,38 лет), не подвергавшихся ранее укусам клещей, не болевших иксодовым клещевым боррелиозом и не имевшим в крови специфических антител к антигенам боррелий или вируса клещевого энцефалита. Это были клинически здоровые люди без субъективных и объективных признаков поражения внутренних органов, сопоставимые с другими группами по возрасту и полу (таблица 2). Все обследованные нами лица подписали информированное согласие на участие в данном исследовании. Исследование было одобрено Этическим комитетом ГБОУ ВПО «Сибирского государственного медицинского университета» Минздрава РФ (протокол № 68 от 30.03.2009 г.) и проводилось в соответствии со стандартами Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (2000 г) и «Правилами клинической практики в РФ» (Приказ Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г). 38 Таблица 2. Распределение реконвалесцентов (группа IB) острого иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ), больных хроническим ИКБ (группа II), а также лиц из контрольной группы (группа III) в зависимости от пола Реконвалесценты Больные хрониче- Контрольная ским ИКБ группа (группа IB) (группа II) (группа III) женский 11 (55 %) 11 (52,4 %) 12 (52,2 %) мужской 9 (45 %) 10 (47,6 %) 11 (47,8 %) 20 21 23 Пол Всего 2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.2.1. Получение культур мононуклеарных клеток периферической крови При поступлении в стационар до назначения антибиотиков у всех обследованных лиц было взято 25 мл венозной крови. В качестве антикоагулянта в пробирки был добавлен гепарин, за исключением метода определения в плазме крови малонового диальдегида (МДА), когда использовали этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Для получения культур in vitro мононуклеарные клетки были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Клетки инкубировали во флаконах (около 1,0106 клеток/мл) в среде RPMI-1640 («ПанЭко», г. Москва, РФ) с добавлением антибиотика (100 мкг/мл гентамицина) при 37 оС в присутствии 5% СО2. Полученные культуры мононуклеарных клеток использовались в дальнейшем для различных методов исследования. Численность групп обследованных лиц при использовании различных методов исследования указана в таблице 3. Анализ РБТЛ, определение продукции цитокинов в супернатантах культур лимфоцитов и малонового диальдегида (МДА) в плазме крови были 39 проведены у всех больных (с эритемной серонегативной и серопозитивной клиническими формами), включенных в группу IA. Методы анализа кариопатологических изменений и патологических митозов, хромосомного анализа и проточной цитометрии были использованы в острый период заболевания (группа IA) только среди больных эритемной серопозитивной формой ИКБ. Как показали данные анамнеза большинство обследованных нами больных хронической формой ИКБ (группа II) также имели эритему в острый период болезни. Стимуляция мононуклеарных клеток 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) («ПанЭко», РФ) проводилась в течение 24 ч для определения концентрации иммуноцитокинов в супернатантах, в течение 52 ч для хромосомного анализа или в течение 72 ч для постановки реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) и определения числа клеток в состоянии апоптоза и уровня пролиферативного ответа лимфоцитов методом проточной цитометрии. Кроме того, клетки стимулировали корпускулярным антигеном Borrelia garinii в течение 144 ч для оценки РБТЛ, определения числа клеток в состоянии апоптоза и уровня пролиферативного ответа лимфоцитов методом проточной цитометрии или в течение 24 ч для определения концентрации цитокинов в супернатантах. 2.2.2. Определение малонового диальдегида в плазме крови Содержание в плазме крови (в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА) маркера перекисного окисления липидов – малонового диальдегида (МДА) определяли флуориметрически согласно Ю.А. Владимирову и А.И. Арчакову (1972) в реакции с тиобарбитуровой кислотой [8]. 40 Таблица 3. Методы исследования и численность групп Больные Реконвалес- Больные Методы острым центы хроническим исследования ИКБ ИКБ ИКБ (группа IA) (группа IB) (группа II) (группа III) 22 12 11 14 22 20 21 23 12 10 12 13 12 10 12 13 РБТЛ стимуляция боррелиозным АГ стимуляция ФГА Анализ кариопатологических изменений и патологических форм митоза Хромосомный анализ Метод проточной цитометрии Контроль – набор FITC BrdU Flow Kit стимуляция боррелиозным 8 8 9 9 АГ стимуляция 7 7 7 7 ФГА – набор APOBrdU Kit (стимуляция 9 7 7 – боррелиозным АГ или ФГА) Анализ продукции 22 20 21 23 цитокинов МДА в плазме 22 20 21 23 крови Примечание: АГ – антиген; МДА – малоновый диальдегид; РБТЛ – реакция бласттрансформации; ФГА – фитогемагглютинин; BrdU – бромдезоксиуридин 41 2.2.3. Характеристика антигенов боррелий, использованных для стимуляции культур мононуклеарных клеток Для стимуляции мононуклеарных клеток использовали инактивированный корпускулярный антиген B. garinii, который был получен из коллекции штаммов боррелий отдела разработки и экспериментального производства препаратов НПО «Вирион» филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ (Томск, РФ). Выбор вида боррелий B. garinii обусловлен его широким распространением на территории Западной Сибири [54]. Боррелии предварительно культивировали в среде Barbour-Stoenner-Kelly-Н (BSK Н, Sigma, США) при 32 оС, а затем инактивировали нагреванием (60 оC в течение 40 мин) Максимальная концентрация боррелий в пробах составила около 2 109 спирохет/мл. 2.2.4. Реакция бластной трансформации лимфоцитов Для постановки спонтанной и ФГА-стимулированной реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) клетки культивировали в течение 72 ч., а для постановки спонтанной и стимулированной инактивированным боррелиозным антигеном РБТЛ культуры инкубировали в течение 144 ч. После окончания культивирования готовили мазки, которые фиксировали в этаноле и окрашивали азур II-эозином. Для оценки РБТЛ применялся стандартный морфологический метод с анализом не менее 1000 клеток в препаратах [13, 55]. Предварительное определение оптимальной концентрации корпускулярного антигена, необходимой для стимуляции пролиферативного ответа лимфоцитов in vitro, проводили в РБТЛ смешивая клетки с инактивированными боррелиями в соотношениях 1:5, 1:10, 1:20 и 1:50, в соответствии с методикой описанной в работах J. Sjöwall [151] и S. Perticarari с соавт. [150]. 42 2.2.5. Анализ клеток с кариопатологией и патологическими формами митозов Для изучения атипичных форм митоза в препаратах для анализа РБТЛ вначале подсчитывали общее количество митозов на 3000 просмотренных клеток, а затем среди выявленных делений определяли частоту встречаемости различных типов патологических митозов [1, 7]. Кроме того, в этих же препаратах проводился анализ клеток с кариопатологическими изменениями, включая появление бинуклеаров и многоядерных клеток, клеток с микроядрами, клеток с деформацией ядер [19, 233]. 2.2.6. Метод лазерной проточной цитометрии 2.2.6.1. Определение числа клеток в различных фазах клеточного цикла и состоянии апоптоза Для оценки числа клеток в состоянии апоптоза и уровня пролиферативного ответа лимфоцитов нами был использован метод лазерной проточной цитометрии с детекцией иммунофлуоресцентно окрашенных клеток, инкорпорировавших бромдезоксиуридин (БДУ) с использованием набора «FITC BrdU Flow Kit» («BD Pharmingen», США) [124]. Культуры мононуклеарных клеток, стимулированных ФГА, были получены, как описано выше, с последующей инкубацией в течение 72 ч. Кроме того, культуры мононуклеарных клеток стимулировали корпускулярным боррелиозным антигеном в течение 144 ч. БДУ был добавлен в конечной концентрации 10 мкмоль/мл культуры мононуклеарных клеток в срок за 12 ч до конца инкубации. Подготовка проб для анализа проводилась согласно инструкции производителя набора. Сначала меченные БДУ клетки, предварительно собранные в пробирки (1,0106 клеток на пробу), подвергали трехкратной фиксации и обработке, приводящей к повышению проницаемости клеточных мембран с использованием «BD Cytofix/Cytoperm» и «BD Cytoperm Plus» буферов. После чего 43 ресуспендированные клетки в течение 1 ч при 37 оС обрабатывали ДНКазой (30 мкг на пробу), чтобы выявить эпитопы инкорпорированного БДУ, а затем при комнатной температуре в течение 20 мин окрашивали анти-БДУ антителами, меченными флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ), которые разводили в BD Perm/Wash буфере (1:50). Для выявления общего содержания клеточной ДНК использовали 7-амино-актиномицин D (7-ААD; 20 мкг на пробу). Анализ числа (%) клеток, одновременно окрашенных 7-ААD (канал FL3) и анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами (канал FL1) проводился с помощью проточного цитометра «FACSCalibur» и программы «CellQuest» («Becton Dickinson», США) на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО СибГМУ МЗ РФ. Поскольку, аналог тимидина БДУ инкорпорируется в синтезируемую ДНК в течение фазы синтеза (S) клеточного цикла, то пул клеток, окрашенный анти-БДУ антителами, соответствует этой фазе клеточного цикла. Одновременная окраска клеток на общее содержание ДНК с использованием 7-ААD позволяет с помощью двухцветной лазерной проточной цитометрии определить число мононуклеарных клеток in vitro, инкорпорировавших БДУ и находящихся в состоянии апоптоза (суб-G0/G1-фаза) или в различных фазах клеточного цикла: в G0/G1-фазах, в фазе синтеза или S-фазе, а также в фазах митоза и подготовки к митозу (G2/M-фазы). 2.2.6.2. Определение числа клеток в состоянии апоптоза Кроме того, для более точного определения числа клеток в культурах, находящихся в фазе апоптоза был использован набор APO-BRDU Kit («BD Pharmingen», США), который позволяет выявлять последний этап апоптоза – фрагментацию ДНК вследствие активации эндонуклеаз [183]. Метод основан на использовании фермента дезоксинуклеотидил трансферазы (TdT), который катализирует добавление бром-дезоксиуридин трифосфатов (Br- 44 dUTP) к 3-гидроксильным группам в местах разрывов ДНК, после чего инкорпорированные Br-dUTP выявляются с помощью ФИТЦ-меченных антиБДУ антител. Подготовка проб для анализа проводилась согласно протоколу производителя набора. Культуры ФГА-стимулированных клеток, выращенные как описано выше в течение 72 ч (без предварительного добавления БДУ в культуры), в концентрации 2,0106 клеток на пробу ресуспендировали и фиксировали на льду 1% параформальдегидом в течение 50 мин, после чего обрабатывали охлажденным 70% этанолом и замораживали при -20 оС в течение 10 дней. Оттаявшие клетки, полученные от больных и контрольных людей, а также клетки позитивного и негативного контроля, которые поставляются вместе с набором, повторно ресуспендировали и промывали в BD Wash буфере, после чего клетки обрабатывали в течение 60 мин при 37 о С раствором для мечения ДНК, содержащим TdT фермент (0,75 мкл на пробу) и Br-dUTP (8 мкл на пробу). Клетки повторно промывались специальным буфером и окрашивались в темноте в течение 30 мин анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами (5 мкл на анализ). Затем клетки обрабатывали пропидиум йодид/РНКаза-содержащим окрашивающим буфером (0,5 мл на пробу) для определения общего содержания ДНК. Анализ числа (%) клеток, одновременно окрашенных пропидиум йодидом и ФИТЦ, проведенный с помощью проточного цитометра FACSCalibur и программы CellQuest («Becton Dickinson», США), позволяет идентифицировать клетки, находящиеся в состоянии апоптоза, и отличить их от неапоптотически погибших клеток, которые не могут инкорпорировать Br-dUTP. 45 2.2.7. Определение концентрации иммуноцитокинов в супернатантах Спонтанные и стимулированные корпускулярным боррелиозным антигеном или ФГА уровни продукции интерлейкина-4 (ИЛ-4), интерферона- (ИФН), фактора некроза опухоли- (ФНО-) и ИЛ-6 в пг/мл в супернатантах 24часовых культур мононуклеарных клеток периферической крови были определены с помощью твердофазного ИФА в соответствии с инструкциями, предлагаемыми производителем тест-систем (ООО «Протеиновый контур» ProCon TNF- и ProCon IL-6 г. Санкт-Петербург, РФ и «Invitrogen Co» IFN-γ и IL-4 Human ELISA Kits, США). Оптическую плотность регистрировали с помощью иммунологического анализатора «Униплан» (ЗАО «Пикон», РФ) при длине волны 450 нм. 2.2.8. Цитогенетические методы 2.2.8.1. Хромосомный анализ Для хромосомного анализа культуральная смесь в расчёте на 1 флакон состояла из 1,0 мл цельной гепаринизированной крови, 6 мл cреды RPMI1640 («ПанЭко», г. Москва, РФ) с добавлением 1,0 мл инактивированной эмбриональной телячей сыворотки («Sigma», США), 100 МЕ/мл бензилпенициллина и 100 мкг/мл гентамицина, а также 0,1 мл раствора ФГА в концентрации 10 мкг/мл («ПанЭко», г. Москва, РФ). Культуральную смесь разливали по флаконам по 2 мл в каждом (около 1,0106 клеток/мл), которые инкубировали в термостате в присутствии 5% СО2 при 37 С в течение 52 ч. [42, 98]. Колхицин добавляли в культуры за 2 ч до фиксации клеток в концентрации 0,5 мкг/мл культуральной смеси. Культуры сливали в центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин., надосадочную жидкость убирали, осадок ресуспендировали и добавляли к нему свежую подогретую до 37 С среду RPMI-1640. Гипотоническую обра- 46 ботку проводили, добавляя к осадку раствор 0,55 хлорида калия, подогретого до 37 С в течение 15 мин. По окончании гипотонизации пробирки снова центрифугировали, надосадочную жидкость отсасывали пипеткой. Фиксировали клетки в трех сменах охлажденного свежеприготовленного фиксатора (3 части этанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты). Перед приготовлением препаратов осадок клеток тщательно ресуспендировали в 0,5 мл последней смены фиксатора, раскапывали пипеткой на предварительно охлажденные предметные стекла и высушивали. Препараты окрашивали азур II-эозином. У каждого человека или варианта опыта в условиях in vitro анализировали не менее 200 метафаз. Изучение хромосом проводили при увеличении 10100 с помощью микроскопа «Prima Star iLED» («Carl Zeiss», Германия), оснащенного цифровой камерой «AxioCam» («Carl Zeiss», Германия). Метафазные пластинки с цитогенетическими нарушениями фотографировали при помощи цифровой камеры, переносили полученные изображения в компьютер и анализировали с помощью программы «AxioVision» модуль «Karyo» для кариотипирования. Отбор метафазных пластинок осуществлялся с учетом следующих требований: целостность метафазной пластинки, четкость окраски, отсутствие или небольшое число поперечных наложений хромосом, средняя степень их конденсации. При изучении характера структурных аберраций хромосом учитывали хроматидные и хромосомные разрывы, одиночные и парные фрагменты, обмены, центрические кольца, дицентрики и другие ассиметричные транслокации [59]. 2.2.8.2. Дифференциальная окраска хромосом Для дифференциального окрашивания хромосом использовали технику G-бэндов [225]. Препараты помещали в 0,025 раствор трипсина при комнатной температуре на 10-15с, промывали в этиловом спирте (70, 96, 100), высушивали и окрашивали раствором азур II-эозина по Романовско- 47 му-Гимзе, приготовленном на фосфатном буфере при рН 6,8. Для выявления гетерохроматиновых блоков нами использован С-метод окраски с обработкой препаратов гидроксидом бария [232]. Идентификация хромосом человека проводилась в соответствии с международной системой цитогенетической номенклатуры ISCN [153]. Исследования проводили на базе кафедры биологии и генетики СибГМУ. 2.3. ЭКСПЕРИМЕНТЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO 2.3.1. Изучение антиген-индуцированных цитогенетических нарушений и апоптоза в условиях in vitro Кроме того, был проведён ряд экспериментов в условиях in vitro с целью изучения способности инактивированного корпускулярного антигена B. garinii индуцировать в культурах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров (группа II) цитогенетические нарушения, кариопатологические изменения или апоптоз. Для предварительного подбора оптимальной дозы инактивированных боррелий, они были добавлены до начала инкубирования в культуры лимфоцитов и смешаны с клетками в соотношениях 1:10, 1:20 или 1:50, в соответствии с методикой описанной в работе S. Perticarari с соавт. [171]. Для изучения числа клеток с цитогенетическими нарушениями или с патологией митоза ФГА-стимулированные культуры с добавлением или без добавления корпускулярного антигена боррелий (стимулированные и интактные культуры) инкубировали, как было описано выше, в течение 72 ч. В результате проведенного эксперимента была выбрана оптимальная концентрация инактивированного антигена (соотношение клеток в культуре и боррелий – 1:10, то есть приблизительно 1,0 106 клеток к 1,0 107 боррелий). Для изучения числа клеток в состоянии апоптоза с помощью проточной цитометрии и набора APO-BRDU Kit («BD Pharmingen», США) стимулированные и не стимулированные (интактные) инактивированным корпуску- 48 лярным боррелиозным антигеном культуры мононуклеарных клеток культивировали без добавления ФГА в течение 24 ч. 2.3.2. Изучение эффектов цитохалазина D на апоптотический ответ мононуклеарных клеток в условиях in vitro С целью блокирования фагоцитоза и оценки его эффекта на уровень апоптоза клеток в стимулированных и не стимулированных инактивированным корпускулярным боррелиозным антигеном культурах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей, клеточные суспензии были предварительно инкубированы в течение 1 ч с добавлением или без добавления цитохалазина D («Sigma-Aldrich», США) до внесения в культуры инактивированных боррелий (соотношение клеток и боррелий – 1:10). Дополнительное культивирование проводилось в течение 12 ч. Цитохалазин D (вызывает разрушение филаментов актина и блокирует фагоцитоз) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) («Sigma-Aldrich», США) и вносили в культуры в концентрации 10 мкг/мл. В контрольные культуры добавляли только ДМСО. Число клеток в состоянии апоптоза определяли с помощью проточной цитометрии и набора APO-BRDU Kit («BD Pharmingen», США) как было описано выше. 2.4. СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Для статистической обработки данных использовали стандартный пакет программ «Statistica 6.0» и «Microsoft Office Exel 2007». Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для оценки различий между выборками в случае нормального распределения применяли t-тест Стьюдента или парный критерий Стьюдента (в случае зависимых групп). Полученные результаты представлены как выборочное среднее арифметическое ( X ) 49 и ошибка среднего (m). В остальных случаях для определения статистической значимости различий между независимыми или зависимыми группами были использованы непараметрические критерии Манна–Уитни или Уилкоксона соответственно [12, 31], а результаты были представлены как медиана (Mе) и [Q1 ; Q3], где Q1 и Q3 – первый и третий квартили. Для определения статистической значимости различий между независимыми группами (IA, IB или II группы от III контрольной группы; IA или IB группы от II группы) был использован непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для определения достоверности различий между зависимыми группами (между IA и IB группами; между спонтанными и стимулированными уровнями в каждой из групп) применялся критерий Уилкоксона [12, 31]. Для выявления зависимостей между изучаемыми параметрами проводили ранговую корреляцию Спирмена. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез в исследовании принимался равным 0,05. 50 ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. КАРИОПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ 3.1.1. Характеристика цитогенетических нарушений в лимфоцитах больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом В таблице 4 приведены результаты оценки цитогенетического статуса у больных острой эритемной серопозитивной формой иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ), а также у этих же пациентов в период реконвалесценции и группы больных хроническим ИКБ. Из структурных аберраций хромосом (рисунок 1а) в лимфоцитах больных острым ИКБ (группа IA) установлено шестикратное, по сравнению с показателями контрольной группы (группа III), повышение числа хроматидных разрывов (5,600,28% против 0,910,08%, p<0,001), среди которых преобладали хроматидные делеции и одиночные фрагменты, а также рост в 5 раз частоты хромосомных разрывов (1,62 0,14% против 0,32 0,05%, p<0,001). Вместе с тем, нами не были обнаружены более сложные хромосомные аберрации типа меж- и внутрихромосомных обменов, включая кольцевые или дицентрические хромосомы. Изучение частоты клеток с измененным числом хромосом в наборе в культурах лимфоцитов периферической крови больных острым ИКБ показало существенное повышение, по сравнению с соответствующими значениями в группе III, числа гипоплоидных (3,90 0,24% против 1,32 0,10%, p<0,001) и полиплоидных (3,70 0,17% против 0,25 0,03%, p<0,001) лимфоцитов (рисунок 1б), а также появление метафазных пластинок с эндоредупликацией, которые отсутствовали в культурах, полученных от реконвалесцентов ИКБ и здоровых доноров (таблица 4). 51 Таблица 4. Частота цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови (%) больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом ( X ±m) Показатель Больные острым ИКБ (группа IA) n=12 2883 7,31±0,34* Реконвалесценты Больные ИКБ хроническим ИКБ (группа IB) (группа II) n=10 n=12 2164 2482 1,42±0,10^# 6,18±0,46* Контрольная группа (группа III) n=13 2675 1,28±0,10 Число проанализированных метафаз Частота клеток со структурными нарушениями хромосом, % Число хромосом с нарушениями, % 7,44±0,33* 1,45±0,11^# 6,35±0,47* 1,32±0,11 с хроматидными разрывами, фрагментами 5,60±0,28* 1,19±0,11^# 4,97±0,49* 0,91±0,08 с хромосомными разрывами, фрагментами 1,62±0,14*## 0,19±0,03^# 1,21±0,11* 0,32±0,05 с обменами 0,21±0,03* 0,08±0,01^ 0,17±0,02* 0,10±0,02 Частота клеток с измененным числом хромо- 8,91±0,25* 2,61±0,15*^# 7,91±0,29* 1,82±0,13 сом в наборе, % В том числе: гипоплоидных клеток 3,90±0,24*# 1,71±0,12**^# 2,74±0,26* 1,32±0,10 гиперплоидных клеток 0,20±0,02# 0,20±0,02# 1,23±0,13* 0,25±0,03 полиплоидных клеток 3,70±0,17*## 0,70±0,08*^# 3,18±0,15* 0,25±0,03 эндоредупликацией 1,11±0,05# 0 0,76±0,08 0 Всего клеток с цитогенетическими наруше16,22±0,51* 4,03±0,22*^# 14,09±0,45* 3,10±0,18 ниями, % Примечание: ИКБ – иксодовый клещевой боррелиоз; n численность группы. Значимость различий обозначена знаками: «*» (p<0,01) или «**» (p<0,05) – отличие групп IA и IB или II от группы III; «^» (p<0,01) – отличие между группами IA и IB; «#» (p<0,01) или «##» (p<0,05) – отличие групп IA или IB от группы II. 52 а б Рисунок 1. Цитогенетические нарушения в культурах лимфоцитов больных острым иксодовым клещевым боррелиозом: а – метафазная пластинка со структурными аберрациями хромосом (хроматидная делеция, одиночный и парный фрагменты хромосом); б – полиплоидная клетка. Окраска азур IIэозином по Романовскому–Гимза. Ув. 1000. 53 У больных ИКБ в периоде реконвалесценции в динамике через 3 мес. после проведения курса антибиотикотерапии (группа IB), уровни клеток с перечисленными выше структурными аберрациями хромосом не имели достоверных отличий от значений в контрольной группе III (p>0,05), а число лимфоцитов с анеуплоидией и полиплоидией ещё сохранялись немного выше, чем в контроле (p<0,01). Кроме того, показано, что в лимфоцитах периферической крови больных хроническим ИКБ частота хромосом со структурными аберрациями (таблица 4), включая хроматидные разрывы и фрагменты (4,970,49%), существенно не отличалась от соответствующих показателей в острый период болезни (5,600,28%, p>0,05), и продолжала сохраняться на уровне, значительно превышающем значения в контроле (0,910,08%, p<0,001). Помимо этого, уровни клеток с гипоплоидией (2,74 0,26%) и полиплоидией (3,18 0,15%) в культурах лимфоцитов больных из группы II также оставались на повышенным уровне, по сравнению с контролем (1,32 0,10% и 0,25 0,03%, p<0,001), но были достоверно ниже, чем результаты, полученные в группе больных острым ИКБ (3,90 0,24% при p=0,003 и 3,70 0,17%, p=0,03), а частота гиперплоидных лимфоцитов (1,23 0,13%) значительно превышала (p<0,001) соответствующий показатель как в контроле (0,25 0,03%), так и в группе IA (0,20 0,02%). 3.1.2. Полиморфизм хромосомы 9 в лимфоцитах периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом Кроме перечисленных выше цитогенетических нарушений, все обследованные нами больные острым ИКБ (группа IA) имели метафазные пластинки с одной или двумя гомологичными хромосомами с увеличенными районами вторичной перетяжки (рисунок 2а). Дифференциальная окраска 54 хромосом G-методом позволила идентифицировать хромосому 9, имеющую увеличенный район вторичной перетяжки (рисунок 2 б). Известно, что в перицентромерном районе длинного плеча 9-й хромосомы располагается один из наиболее крупных гетерохроматиновых блоков, имеющий выраженный межиндивидуальный полиморфизм, который, как считалось ранее, может иметь только наследственный характер и отличается исключительной стабильностью в разных тканях индивидуума [51]. Блок гетерохроматина в этой области при G-окраске выявляется плохо, но может быть хорошо визуализирован с использованием С-метода. Кроме того, показано, что наследственно обусловленные изменения гетерохроматина перицентромерных областей хромосом встречаются крайне редко [51]. В результате проведенного исследования нами установлена нестабильность околоцентромерного района хромосомы 9 у больных острым ИКБ (таблица 5). Если по результатам хромосомного анализа у всех обследованных больных выявлено от 4 до 24 % клеток с одной (6,55 ± 1,01 %) или даже двумя (3,75 ± 1,51 %) гомологичными хромосомами 9 в наборе с увеличенной вторичной перетяжкой, то при обследовании той же группы людей в период реконвалесценции ни один из индивидуумов не имел подобных изменений. Стоит также отметить, что в лимфоцитах больных хроническим ИКБ (группа III) хромосомы с увеличенным районом вторичной перетяжки обнаружены не были. Полученные результаты также показывают отсутствие в контроле клеток с хромосомами, имеющими увеличенную вторичную перетяжку. Поэтому нами был сделан вывод: обнаруженные изменения в лимфоцитах у больных с острым ИКБ, по-видимому, не носят наследственный характер. 55 а б Рисунок 2. Метафазные пластинки в культуре лимфоцитов больного острым иксодовым клещевым боррелиозом (группа IA): а – рутинная окраска красителем Романовского–Гимза метафазной пластинки с двумя гомологичными хромосомами с увеличенной вторичной перетяжкой; б – раскладка дифференциально окрашенных G-методом хромосом, позволяющая идентифицировать хромосому 9, имеющую увеличенную вторичную перетяжку. Ув. 1000. 56 Применение С-метода дифференциальной окраски хромосом не выявило наличия крупных гетерохроматиновых блоков в околоцентромерном районе 9-й хромосомы в лимфоцитах этих больных (рисунок 3). Таблица 5. Частота лимфоцитов с полиморфизмом хромосомы 9 в культурах мононуклеарных клеток периферической крови больных острым иксодовым клещевым боррелиозом, % ( X ± m) Показатель Больные Реконвалес- Контрольная острым ИКБ центы группа (группа IA) (группа IВ) (группа III) (n = 12) (n = 10) (n = 13) 2883 2164 2675 10,11 ± 1,23 0 0 6,55 ± 1,01 0 0 3,75 ± 1,51 0 0 Число проанализированных метафаз Число клеток с увеличенным районом вторичной перетяжки хромосомы 9, % В том числе: в одной из гомоло- гичных хромосом в наборе в двух гомологичных хромосомах в наборе Примечание: ИКБ – иксодовый клещевой боррелиоз; n численность группы. 57 Рисунок 3. Метафазная пластика дифференциально окрашенных С-методом хромосом в культуре лимфоцитов больного острым иксодовым клещевым боррелиозом. Ув. 1000. 3.1.3. Экспериментальное моделирование цитогенетических нарушений, индуцированных в условиях in vitro корпускулярным антигеном боррелий в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров Кроме того, был проведён ряд экспериментов с изучением способности инактивированного корпускулярного антигена B. garinii индуцировать в условиях in vitro цитогенетические аберрации в результате добавления этого антигена в культуры мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров (группы III). Для предварительного подбора оптимальной дозы антигена в стимулированные фитогемагглютинином (ФГА) культуры лимфоцитов инактивированные боррелии добавляли в начале культивирования, смешивая клетки с корпускулярным антигеном в соотношениях 1:10 или 58 1:20. На рисунке 4 показано, что повышение дозы антигена, который вносили в культуры лимфоцитов здоровых людей, приводило к достоверному увеличению числа клеток с различными типами цитогенетических нарушений, включая, хроматидные и хромосомные структурные аберрации, а также гипо- или полиплоидию. На рисунках 5 и 6, а также в таблице 6 показаны результаты изучения частоты хромосом со структурными аберрациями (на 100 клеток) и числа лимфоцитов с измененным числом хромосом в наборе после добавления в культуры инактивированного корпускулярного антигена боррелий B. garinii в дозе 1:10. Анализ типов цитогенетических нарушений показал, что добавление в культуры здоровых доноров инактивированных боррелий индуцировало рост тех же типов аберраций, что и в культурах, полученных от больных острым ИКБ, включая существенное повышение частоты клеток с хроматидными или хромосомными разрывами и фрагментами (рисунок 5), а также достоверное увеличение числа гипоплоидных и полиплоидных клеток (рисунок 6) по сравнению с интактным контролем. Нельзя не отметить тот факт, что в экспериментах с добавлением в ФГА-стимулированные культуры здоровых людей (группа III) инактивированных нагреванием боррелий установлено появление в метафазных пластинках хромосомы 9 с увеличенной вторичной перетяжкой в околоцентромерном районе, то есть обнаруженные изменения были аналогичны тем, что мы наблюдали в лимфоцитах периферической крови больных острым ИКБ (таблица 6). На основании проведенных экспериментов нами была выдвинута гипотеза о способности боррелий и их антигенов прямо или опосредованно вызывать повреждение ДНК и индуцировать развитие оксидативного стресса и связанного с ним ответа, сопровождающегося изменением морфологической структуры, а, возможно, также и активности гетерохроматина перицентромерного района хромосомы 9. 59 8 Частота клеток с цитогенетическими нарушениями, % p = 0,02 Соотношение клеток и антигена боррелий B. garinii 1:10 7 p = 0,007 6 5 4 p = 0,02 3 Соотношение клеток и антигена боррелий B. garinii 1:20 p = 0,03 2 1 0 с с хроматидными хромосомными с гипоплоидией с полиплоидией разрывами разрывами Рисунок 4. Частота клеток (%) с различными типами цитогенетических нарушений ( X ±m), индуцированных in vitro в результате добавления в ФГАстимулированные культуры лимфоцитов периферической крови контрольной группы III (n=13) различных доз инактивированного корпускулярного антигена B. garinii с соотношением клеток и боррелий 1:10 или 1:20. Значимость различий между исследуемыми группами обозначена как p; n численность группы. Частота клеток со структурными аберрациями хромосом, % 60 6 p < 0,001 В интактных культурах здоровых людей (группа III) 5 4 3 2 p < 0,001 1 0 с хроматидными разрывами с хромосомными разрывами с обменами В культурах здоровых людей после добавления инактивиро ванного антигена боррелий B. garinii (1:10) Рисунок 5. Частота хромосом (%) со структурными аберрациями ( X ±m), индуцированных in vitro после добавления в ФГА-стимулированные культуры лимфоцитов периферической крови контрольной группы III (n=13) инактивированного корпускулярного антигена B. garinii с соотношением клеток и боррелий 1:10. Значимость различий между исследуемыми группами обозначена как p; n численность группы. 61 Частота клеток с измененным числом хромосом в наборе, % 4 p < 0,001 В интактных культурах здоровых людей (группа III) 3 p < 0,001 2 В культурах здоровых людей после добавления инактивиров анного антигена боррелий B. garinii (1:10) 1 0 с гипоплоидией с гиперплоидией с полиплоидией Рисунок 6. Частота клеток (%) с измененным числом хромосом в наборе ( X ±m), индуцированных in vitro после добавления в ФГА- стимулированные культуры лимфоцитов периферической крови контрольной группы III (n=13) инактивированного корпускулярного антигена B. garinii с соотношением клеток и боррелий 1:10. Значимость различий между исследуемыми группами обозначена как p; n численность группы. 62 Таблица 6. Число клеток с цитогенетическими нарушениями и полиморфизмом хромосомы 9 (%), индуцированных инактивированным корпускулярным антигеном боррелий в ФГА-стимулированных культурах лимфоцитов периферической крови здоровых людей (группа III) ( X ± m) Культуры лимфоцитов Интактный Стимулированные Показатель контроль боррелиями (n = 13) (n = 13) 2675 2682 1,28 ± 0,10 5,23 ± 0,47* 1,32 ± 0,11 5,32 ± 0,53* с хроматидными разрывами 0,91 ± 0,08 4,33 ± 0,51* с хромосомными разрывами 0,32 ± 0,05 0,77 ± 0,09* 1,82 ± 0,13 5,55 ± 0,52* гипоплоидных клеток 1,32 ± 0,10 3,0 ± 0,27* гиперплоидных клеток 0,25 ± 0,03 0,33 ± 0,05 полиплоидных клеток 0,25 ± 0,03 2,22 ± 0,35* 3,10 ± 0,18 10,87 ± 0,59* 0 7,44 ± 1,10 Число проанализированных метафаз Частота клеток со структурными нарушениями хромосом, % Число хромосом с нарушениями, % Частота клеток с измененным числом хромосом в наборе, % В том числе: Всего, % Число клеток с увеличенным районом вторичной перетяжки хромосомы 9, % Примечание: ФГА – фитогемагглютинин; n численность группы. Значимость различий между группами отмечены знаком «*» если p < 0,001. 63 3.1.4. Характеристика патологических форм митозов и кариопатологических изменений в лимфоцитах больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом Формирование анеуплоидии и полиплоидии в культурах лимфоцитов, полученных от больных острым (группа IA) и хроническим (группа II) ИКБ, может быть связано с появлением отставших хромосом в делящихся клетках. Анализ атипичных форм митозов в ФГА-стимулированных культурах, полученных от больных острым и хроническим ИКБ (таблица 7), показал существенное повышение числа клеток с отставанием хромосом в метафазе (2,98 ± 0,34 % и 3,17 ± 0,36 %) (рисунок 8) или в ана- и телофазе (1,12 ± 0,09 % и 0,94 ± 0,09 %) (рисунок 9), а также частоты клеток с многогрупповой метафазой (1,04 ± 0,11 % и 0,82 ± 0,11 %) (рисунок 10) или с многополюсным митозом (0,96±0,08 % и 1,14 ± 0,08 %) по сравнению с соответствующими значениями этих показателей в контрольной группе (0,40±0,08 %, 0,30±0,04 %, 0,20±0,03 % и 0,22±0,03 %, при p<0,001 во всех случаях) или в группе IB реконвалесцентов (p<0,001). Все вышеперечисленные показатели в группе IB не имели достоверных отличий (p>0,05) от контроля (группа III). Анализ клеток с кариопатологическими изменениями (таблица 7) показал значительное увеличение в ФГА-стимулированных культурах больных острым и хроническим ИКБ лимфоцитов с микроядрами (4,82 ± 0,35 % и 3,74 ± 0,46 %) (рисунок 11) по сравнению с группами контроля (0,75 ± 0,12 %, p < 0,001) и реконвалесцентов (1,19 ± 0,15 %, p<0,001). 64 Таблица 7. Частота клеток с кариопатологией и патологическими митозами (%) в фитогемагглютининстимулированных лимфоцитах периферической крови больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом ( X ±m) Больные острым ИКБ Показатель (группа IA) n=12 6,10±0,46* Реконвалесценты Больные ИКБ хроническим ИКБ (группа IB) (группа II) n=10 n=12 0,79±0,09**^# 6,07±0,41* Частота клеток с патологией митоза, % В том числе: с отставанием хромосом в метафазе 2,98±0,34* 0,25±0,05^# 3,17±0,36* с отставанием хромосом в ана- и те1,12±0,09* 0,21±0,03^# 0,94±0,09* лофазе с многогрупповой метафазой 1,04±0,11* 0,18±0,02^# 0,82±0,11* с многополюсным митозом 0,96±0,08* 0,16±0,03^# 1,14±0,08* Частота клеток с кариопатологическими изменениями, % 20,47±0,44*# 3,57±0,21*^# 9,57±0,77* В том числе: с микроядрами 4,82±0,35* 1,19±0,15**^# 3,74±0,46* с кариопикнозом 6,50±0,31*# 1,18±0,07*^# 0,73±0,13 с кариорексисом 5,26±0,38*# 1,06±0,13*^## 0,69±0,09 бинуклеары 3,90±0,33*# 0,14±0,01^# 4,41±0,64* Примечание: ИКБ – иксодовый клещевой боррелиоз; n численность группы. Значимость различий Контрольная группа (группа III) n=13 1,13±0,11 0,40±0,08 0,30±0,04 0,20±0,03 0,22±0,03 1,98±0,15 0,75±0,12 0,52±0,11 0,60±0,09 0,11±0,02 обозначена знака- ми: «*» (p<0,01) или «**» (p<0,05) – отличие групп IA и IB или II от группы III; «^» (p<0,01) – между группами IA и IB; «#» (p<0,01) или «##» (p<0,05) – отличие групп IA или IB от группы II. 65 Рисунок 8. Клетка с отставанием хромосом в метафазе в культуре фитогемагглютинин-стимулированных лимфоцитов больного острым иксодовым клещевым боррелиозом. Окраска азур II-эозином. Ув. 1000. Рисунок 9. Клетка с отставанием хромосом в ана- и телофазе в культуре фитогемагглютинин-стимулированных лимфоцитов больного хроническим иксодовым клещевым боррелиозом. Окраска азур II-эозином. Ув. 1000. 66 Рисунок 10. Клетка с многогрупповой метафазой в культуре фитогемагглютинин-стимулированных лимфоцитов больного острым иксодовым клещевым боррелиозом. Окраска азур II-эозином. Ув. 1000. Кроме того, в культурах больных групп IA и II было обнаружено значительное увеличение числа не только полиплоидных, но и бинуклеарных клеток (3,90 ± 0,33 % и 4,41 ± 0,64 %) как по сравнению с контролем (0,11 ± 0,02 %, p<0,001), так и по сравнению с группой реконвалесцентов (0,14 ± 0,01 %, p<0,001). Некоторые из этих бинуклеаров имели микроядра (рисунок 12). Кроме того, в ФГА-стимулированных культурах больных острым (группа IA), но не хроническим ИКБ (таблица 7) было отмечено значительное, по сравнению с контролем, повышение частоты клеток с косвенными признаками апоптоза – кариопикнозом (6,50±0,31% против 0,52±0,11 %, p<0,001) и кариорексисом (5,26 ± 0,38 % против 0,60 ± 0,09 %, p<0,001) (рисунок 13). 67 Рисунок 11. Клетка с микроядром в культуре фитогемагглютининстимулированных лимфоцитов больного острым иксодовым клещевым боррелиозом. Окраска азур II-эозином. Ув. 1000. Рисунок 12. Бинуклеарная клетка с микроядром в культуре фитогемагглютинин-стимулированных лимфоцитов больного хроническим иксодовым клещевым боррелиозом. Окраска азур II-эозином. Ув. 1000. 68 Эти показатели в группе реконвалесцентов ИКБ (группа IB) через 3 мес после курса антибиотикотерапии (таблица 7) оставались все ещё на достоверно более высоком уровне, чем в контроле (1,18±0,07% против 0,52±0,11 %, p<0,001 для кариопикноза и 1,06 ± 0,13 % против 0,60 ± 0,09 %, p=0,007 для кариорексиса). Рисунок 13. Клетка с кариопикнозом и кариорексисом в культуре фитогемагглютинин-стимулированных лимфоцитов больного острым иксодовым клещевым боррелиозом. Окраска азур II-эозином. Ув. 1000. Более того, установлено, что в отличие от групп IA и IB, в культурах лимфоцитов, полученных от больных хроническим ИКБ (таблица 7), несмотря на значительно повышенное число клеток с патологией митоза или кариопатологией, частота лимфоцитов с кариопикнозом (0,73±0,13% против 0,52±0,11 %) и кариорексисом (0,69 ± 0,09 % против 0,60 ± 0,09 %) не имела существенных отличий от соответствующих показателей у здоровых доноров (p>0,05). 69 3.1.5. Экспериментальное моделирование патологии митоза, индуцированной в условиях in vitro корпускулярным антигеном боррелий в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров Анализ различных типов патологий митоза (рисунок 14), индуцированных добавлением в ФГА-стимулированные культуры лимфоцитов здоровых доноров (группа III) инактивированных боррелий (в соотношении клеток и спирохет 1:10) показал существенное повышение по сравнению с соответствующими показателями в интактном контроле, числа многогрупповых метафаз (1,91±0,18% против 0,20±0,12 %, p<0,001) и многополюсных митозов (1,55±0,19% против 0,22±0,08 %, p<0,001), а также частоты делений клеток с отставанием хромосом в метафазе (4,60±0,71% против 0,40±0,23 %, p<0,001) или ана- и телофазе (2,83±0,38% против 0,30±0,16 %, p<0,001). Таким образом, спектр типов цитогенетических нарушений и патологии митоза, индуцированных корпускулярным боррелиозным антигеном в условиях in vitro, был аналогичен тому, что мы определили в культурах лимфоцитов, полученных от больных острым ИКБ. 70 6 Частота клеток с патологией митоза, % p < 0,001 В интактных культурах здоровых людей (группа III) 5 4 p < 0,001 3 p < 0,001 p < 0,001 с МГМет с МП митозом 2 1 В культурах здоровых людей после добавления инактивиров анного антигена боррелий B. garinii (1:10) 0 с отставанием с отставанием хромосом в Мет хромосом в АнаТел Рисунок 14. Частота клеток (%) с различными типами патологии митоза ( X ±m), индуцированных in vitro после добавления в ФГА- стимулированные культуры лимфоцитов периферической крови контрольной группы III (n=13) инактивированного корпускулярного антигена B. garinii с соотношением клеток и боррелий 1:10. Мет – метафаза; МГМет – многогрупповая метафаза; МП митоз – многополюсный митоз; Ана-Тел – ана- и телофаза. Значимость различий между исследуемыми группами обозначена как p; n численность группы. 71 3.2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ И АПОПТОЗ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ IN VITRO В ОТВЕТ НА СТИМУЛЯЦИЮ АНТИГЕНОМ БОРРЕЛИЙ ИЛИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ МИТОГЕНОМ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ 3.2.1. Характеристика бластной трансформации лимфоцитов в ответ на корпускулярный боррелиозный антиген у больных различными клиническими формами острого иксодового клещевого боррелиоза В результате предварительного подбора концентрации корпускулярного боррелиозного антигена для стимуляции культур мононуклеарных клеток с помощью реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) было установлено, что соотношение клеток и боррелий 1:10 является оптимальным для пролиферативного ответа лимфоцитов in vitro. На основании данных клинической картины и серологических тестов все обследованные нами больные острым ИКБ (22 человека) были разделены на 2 группы, включающие пациентов с эритемной серонегативной (10 больных), а также с эритемной серопозитивной (12 больных) клиническими формами заболевания. Результаты изучения спонтанной и стимулированной инактивированным корпускулярным боррелиозным антигеном или митогеном ФГА бласттрансформации лимфоцитов в культурах, полученных от больных различными клиническими формами острого ИКБ, приведены в рисунках 15а и 15б. Установлено, что через 144 ч стимуляции боррелиозным антигеном в лимфоцитах периферической крови большинства больных с различными клиническими формами острого ИКБ, наблюдается существенное увеличение числа бласттрансформированных клеток по сравнению с соответствующими показателями в группе здоровых доноров (группа III) (p<0,001). 72 а б Рисунок 15. Показатель реакции бластной трансформации лимфоцитов (%) в не стимулированных (среда RPMI-1640) и в стимулированных (а) инактивированным корпускулярным антигеном боррелий (БАГ) B. garinii (соотношение клеток и боррелий 1:10) или (б) митогеном ФГА культурах периферической крови больных эритемной серонегативной (ЭрСн, n=10) или эритемной серопозитивной (ЭрСп, n=12) формами острого ИКБ, а также контроля (n=14 или n=23). Значимость различий между исследуемыми группами (использован критерий Манна–Уитни): p 1 – отличие ЭрСн или ЭрСп форм от контроля; p2 – между спонтанным и стимулированным уровнями показателя в каждой группе; p3 – между ЭрСн и ЭрСп формами. Горизонтальная черта соответствует медиане (Me [Q1;Q3]). 73 С другой стороны, ответ на 72-часовую стимуляцию митогеном ФГА в культурах больных острым ИКБ оказался значительно ниже, чем в контроле (p>0,05). Однако, изучение особенностей трансформации лимфоцитов как в ответ на антиген, так и на митоген в зависимости от клинической формы острого ИКБ не выявило существенных отличий (p>0,05) между двумя группами больных (рисунки 15а и 15б). 3.2.2. Сравнительная характеристика реакции бластной трансформации лимфоцитов в ответ на стимуляцию корпускулярным антигеном боррелий или неспецифическим митогеном у больных острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом При анализе результатов РБТЛ (Me [Q1;Q3], где Ме – медиана, Q1 и Q3 – первый и третий квартили) было установлено (рисунок 16), что 144часовая стимуляция инактивированным корпускулярным антигеном боррелий культур, полученных от больных в острый и хронический периоды заболевания (15,83 % [13,78; 18,52] и 19,11 % [14,40; 24,00]), а также от реконвалесцентов (6,51% [2,49; 9,30]), приводила к существенному росту трансформации лимфоцитов в бластные клетки по сравнению соответствующими показателями в контроле (0,54 % [0,41; 0,66], p < 0,001). У больных острым и хроническим ИКБ, а также в группе реконвалесцентов, в отличие от контрольной группы здоровых лиц, стимуляция культур мононуклеарных клеток сопровождалась существенным повышением числа бластных трансформированных клеток по сравнению с соответствующими спонтанными значениями (p < 0,001). После стимуляции антигеном культур лимфоцитов реконвалесцентов (6,51% [2,49; 9,30], группа IB), пролиферативный ответ клеток был существенно ниже, чем в соответствующих культурах, полученных от больных с острым (15,83 % [13,78; 18,52], p = 0,006) и, особенно, с хроническим течением заболевания (19,11 % [14,40; 24,00], p < 0,001). 74 Рисунок 16. Показатель реакции бластной трансформации лимфоцитов (%) в нестимулированных (среда RPMI-1640) и в стимулированных инактивированным корпускулярным антигеном боррелий B. garinii (БАГ) с соотношением 1:10 клеток и бактерий в 144-часовых культурах периферической крови больных острым ИКБ (группа IA, n=22), здоровых реконвалесцентов ИКБ (группа IB, n=12), больных хроническим ИКБ (группа II, n=11) и контроля (группа III, n=14). Здесь и в рисунке 17 для определения достоверности различий между независимыми группами был использован критерий Манна–Уитни, а между зависимыми группами – критерий Уилкоксона. Значимость различий между исследуемыми группами: p 1 – отличие групп IA, IB или II от группы III (контроля); p 2 – между спонтанным и стимулированным уровнями показателя в каждой группе; p 3 – отличие групп IA или IB от группы II; p 4 – различие между группами IA и IB. Горизонтальная черта соответствует медиане (Me [Q1;Q3]). 75 Спонтанный уровень бластной трансформации лимфоцитов в культурах мононуклеарных клеток больных хроническим ИКБ (2,65 % [2,15; 3,73]) был значительно выше соответствующих спонтанных значений в контроле (0,35 % [0,25; 0,51], p < 0,001) и в группе реконвалесцентов (0,87 % [0,71; 1,03], p < 0,001). Таким образом, наиболее высокие показатели спонтанной и стимулированной РБТЛ были характерны для групп больных острым и хроническим ИКБ. Стимуляция в течение 72 ч митогеном ФГА культур мононуклеарных клеток периферической крови больных острым ИКБ (рисунок 17) приводила к достоверно более низким значениям бластной трансформации лимфоцитов (38,86 % [29,12; 47,71]) по сравнению с контролем (70,35 % [58,94; 78,75], p < 0,001), а также с группами IB и II (62,16 % [45,59; 66,25], p = 0,009; 54,78 % [42,25; 59,51], p = 0,03). В фазу реконвалесценции уровни ФГА-стимулированной РБТЛ имели тенденцию к росту по сравнению с острым периодом заболевания и существенно не отличались от значений в контрольной группе (p > 0,05). В тоже время, у больных хроническим ИКБ уровни спонтанной бластной трансформации были существенно выше (3,20% [2,29; 4,89]), чем в группе реконвалесцентов и в контроле (1,0% [0,70; 1,28] и 0,64% [0,35; 1,02] p < 0,001), а уровни ФГА-стимулированной РБТЛ достоверно не отличались от соответствующего показателя в группе реконвалесцентов, но были достоверно ниже, чем в контроле (54,78 % [42,25; 59,51] против 70,35 % [58,94; 78,75], p = 0,028). 76 Рисунок 17. Показатель реакции бластной трансформации лимфоцитов (%) в нестимулированных (среда RPMI-1640) и в фитогемагглютинин (ФГА)стимулированных 72-часовых культурах периферической крови больных острым ИКБ (группа IA, n=22), здоровых реконвалесцентов ИКБ (группа IB, n=20), больных хроническим ИКБ (группа II, n=21) и контроля (группа III, n=23). Горизонтальная черта соответствует медиане (Me [Q1;Q3]). 77 3.2.3. Характеристика пролиферации и апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом в ответ на стимуляцию корпускулярным антигеном боррелий в условиях in vitro с использованием метода проточной цитометрии Соотношение пролиферации и апоптоза лимфоцитов может служить важнейшим параметром их реакции на антигены или митогены, поскольку оно определяет её результативность с точки зрения развития иммунного ответа. Активная пролиферация мононуклеарных клеток через 144 ч культивирования в ответ на корпускулярный антиген боррелий у больных острым и хроническим ИКБ, по сравнению с контрольной группой, была установлена с помощью метода двухцветной лазерной проточной цитометрии иммунофлуоресцентно окрашенных клеток, инкорпорировавших бромдезоксиуридин (БДУ) (таблица 8), который позволяет определить число мононуклеарных клеток in vitro, находящихся в состоянии апоптоза или в различных фазах клеточного цикла (в G0/G1 фазах, в фазах синтеза (S) или митоза (G2/M)). В стимулированных культурах лимфоцитов, полученных от больных острым и хроническим ИКБ (результаты представлены как Ме [Q1 ; Q3], где Ме – медиана, Q1 и Q3 – первый и третий квартили), было отмечено увеличение популяций клеток, находящихся в S-фазе (18,50% [16,66; 19,70] для группы IA и 28,19% [18,33; 32,93] для группы II) или в фазах G2/M (5,25% [3,52; 5,88] для группы IA и 6,12% [4,35; 7,58] для группы II), по сравнению с соответствующими контрольными значениями (1,96% [0,88; 3,31] и 0,73% [0,49; 1,43] для группы III, p < 0,001). Одновременно в этих группах больных было установлено существенное уменьшение числа клеток в фазах G0/G1 по сравнению с контролем (53,48% [47,19; 57,77] для группы IA или 58,12 % [52,18; 61,87] для группы II против 76,34% [71,23; 83,05] в контроле, при p = 0,001 и p = 0,004 соответственно). 78 Таблица 8. Количественный анализ популяций лимфоцитов (%) в различных фазах клеточного цикла в стимулированных антигеном B. garinii (в соотношении 1:10) 144-часовых культурах периферической крови больных ИКБ (Me [Q1;Q3]) Группы Уровни S IA. Больные острым ИКБ n=8 IB. Здоровые реконвалесценты (через 3 мес. после терапии) n=8 II. Больные хроническим ИКБ n=9 III. Контроль n= 9 Спонтанный Стимулированный Спонтанный Число клеток, находящихся в фазах клеточного цикла, % p G2/M p G0/G1 3,32 [2,17; 4,66] p 1=0,03 18,50 [16,66; 19,70] p 1<0,001 p 2=0,011 p 3=0,043 p 3=0,005 p 4=0,011 p 1=0,003 p 2=0,011 p 3<0,001 p 4=0,011 0,83 [0,55; 1,59] 0,98 [0,48; 1,43] 5,25 [3,52; 5,88] 0,18 [0,12; 0,31] p 1=0,003 p 2=0,011 p 3=0,028 p 4=0,017 p 1=0,034 p 2=0,011 p 3=0,001 p 4=0,011 79,85 [78,45; 82,63] 53,48 [47,19; 57,77] 83,45 [81,0; 90,10] 71,19 [66,33; 74,09] ― p 1=0,001 p 2=0,011 p 4=0,017 p 2=0,011 p 3=0,012 p 4=0,011 Стимулированный 7,28 [5,38; 10,09] Спонтанный 5,78 [2,33; 6,23] p 1=0,008 1,67 [1,05; 2,38] p 1=0,002 85,40 [81,80; 88,50] ― 28,19 [18,33; 32,93] p 1<0,001 p 2=0,007 6,12 [4,35; 7,58] p 1<0,001 p 2=0,007 58,12 [52,18; 61,87] p 1=0,004 p 2=0,007 Стимулированный 1,83 [1,12; 2,65] p 1=0,043 p 1,22 0,34 90,10 ― ― ― [0,67; 2,33] [0,15; 0,52] [82,10; 95,20] 1,96 0,73 76,34 Стимулированный p 2=0,007 p 2=0,007 p 2=0,007 [0,88; 3,31] [0,49; 1,43] [71,23; 83,05] Примечание: Здесь и в рисунке 18 использованы критерии Манна–Уитни и Уилкоксона: p 1 – отличие групп IA, IB или II от группы III (контроля); p 2 – между спонтанным и стимулированным уровнями показателя в каждой группе; p 3 – отличие групп IA или IB от группы II; p 4 – различие между группами IA и IB. Спонтанный 79 У здоровых реконвалесцентов стимуляция культуры антигеном приводила к увеличению числа пролиферирующих клеток, находившихся, главным образом, в фазе синтеза, но полученные значения были существенно ниже соответствующих стимулированных уровней у больных острым и, особенно, хроническим ИКБ (7,28% [5,38; 10,09] против 18,50% [16,66; 19,70] для группы IA, p = 0,011; 7,28% [5,38; 10,09] против 28,19% [18,33; 32,93] для группы II, p < 0,001). Наиболее высокие уровни клеток в фазах S и G2/M были установлены для антиген-стимулированных культур больных с хроническим течением заболевания (таблица 9). Кроме того, в культурах больных хроническим боррелиозом, в которые не был добавлен антиген (спонтанный уровень), число клеток в S-фазе было достоверно выше (5,78% [2,33; 6,23]), по сравнению с соответствующими культурами реконвалесцентов (0,83% [0,55; 1,59], p = 0,005) и контрольной группы (1,22% [0,67; 2,33], p = 0,008). У больных хроническим ИКБ в нестимулированных культурах, в отличие от других обследованных групп, также было отмечено значительное увеличение по сравнению с контролем уровня клеток в G2/M фазах (1,67% [1,05; 2,38] против 0,34% [0,15; 0,52], p = 0,002). Главной особенностью ответа лимфоцитов в культурах больных хроническим ИКБ (рисунок 18) было значительное подавление стимулированного антигеном боррелий апоптоза лимфоцитов (7,22% [5,16; 8,61]), как по сравнению с контролем (15,24% [12,47; 19,65], p = 0,001), так и по сравнению с соответствующими значениями этого показателя в группе больных острым ИКБ (20,86% [20,02; 23,67], p= 0,0005) и у реконвалесцентов (18,15% [17,33; 19,10], p = 0,0005). Результаты исследования подтверждают предположение о том, что в культурах лимфоцитов больных хроническим ИКБ наблюдается повышенный пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на антигены возбудителя при одновременном подавлении апоптоза реактивных клеток, что, повидимому, отражает нарушение механизмов активационно- 80 индуцированной клеточной смерти и может лежать в основе развития персистентно активированного Т-клеточного иммунного ответа и хронического воспалительного процесса при этом заболевании. Рисунок 18. Количественный анализ популяции лимфоцитов в состоянии апоптоза (%), иммунофлуоресцентно окрашенных анти-БДУ ФИТЦмеченными моноклональными антителами и 7-AAD, в нестимулированных (среда RPMI-1640) и в стимулированных инактивированным корпускулярным антигеном боррелий (БАГ) B. garinii (в соотношении 1:10) в 144-часовых культурах периферической крови больных острым ИКБ (группа IA, n=8), здоровых реконвалесцентов ИКБ (группа IB, n=8), больных хроническим ИКБ (группа II, n=9) и контроля (группа III, n=9). Горизонтальная черта соответствует медиане (Me [Q1;Q3]). 81 Анализ клеток, инкорпорировавших Br-dUTP, одновременно окрашенных пропидиум йодидом и анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами (таблица 9), позволил определить число клеток, находящихся в последней стадии апоптоза и имеющих фрагментацию ДНК вследствие активации эндонуклеаз и отличить их от неапоптотически погибших клеток. Таблица 9. Количественный анализ популяций лимфоцитов (%), находящихся в состоянии апоптоза или неапоптотической гибели (некроза) в стимулированных инактивированным корпускулярным антигеном боррелий культурах мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом (Me [Q1;Q3]) Больные Больные Контрольная острым хроническим группа ИКБ ИКБ (группа IA) (группа II) (группа III) (n = 7) (n = 9) (n = 7) (n = 7) 1,86 18,03 5,62 13,51 [0,56; 2,03] [15,35; 20,40] [3,54; 8,11] [9,63; 15,67] p1 = 0,026 p1 = 0,0017 Число Интактный погибших контроль лимфоцитов Апоптоз, % p2 = 0,0008 Некроз, % 0,97 1,07 1,15 2,18 [0,12; 1,23] [0,53; 2,03] [0,37; 1,81] [0,79; 2,51] p1 > 0,05 p1 > 0,05 Примечание: Использован критерий Манна–Уитни. Указана значимость различий p1 групп IA или II от группы III (контроля), а также p2 – между группами IA и II; n численность группы. 82 У больных острым ИКБ в культурах лимфоцитов, стимулированных боррелиозным антигеном, число апоптотически погибших клеток было существенно больше, чем в соответствующих культурах, полученных от больных хроническим ИКБ (p = 0,0008) и в контроле (p = 0,026). В то же время, число неапоптотически погибших клеток в культурах, полученных от всех групп больных, было существенно ниже, чем апоптотических (p < 0,001), и не имело достоверных отличий от контрольных значений (p > 0,05). 3.2.4. Экспериментальное моделирование апоптоза, индуцированного в условиях in vitro инактивированным корпускулярным антигеном боррелий, в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров Анализ с помощью метода проточной цитометрии числа клеток, инкорпорировавших Br-dUTP и находящихся в состоянии апоптоза (рисунок 19), после добавления в не стимулированные ФГА культуры лимфоцитов различных доз антигена боррелий (с соотношением клеток и боррелий – 1:10, 1:20 или 1:50) показал, что повышение дозы антигена приводило к существенному росту частоты апоптотически погибших клеток по сравнению с интактным контролем. Однако, добавление ингибитора фагоцитоза цитохалазина D в культуры лимфоцитов перед их стимуляцией инактивированными корпускулярным антигеном приводило к подавлению апоптоза клеток, что свидетельствовало о роли фагоцитоза боррелий мононуклеарными клетками в развитии программированной клеточной гибели (рисунок 19). Таким образом, на основании проведенных исследований нами выдвинуто предположение о том, что боррелии и их антигены способны за счет опосредованных механизмов вызывать структурные хромосомные аберрации, анеуплоидию и полиплоидию, а также индуцировать апоптоз 83 лимфоцитов, что имеет значение для исхода инфекционного процесса и Число клеток в состоянии апоптоза, % взаимодействия возбудителя ИКБ с иммунной системой хозяина. p 1 = 0,011 p 2 = 0,049 35 p 1 = 0,011 p 2 = 0,011 30 25 p 1 = 0,011 20 p 1 = 0,035 p 3 = 0,011 15 10 5 0 Интактный контроль 1:10 Цх 1:20 1:50 Соотношение клетки : B. garinii АГ Рисунок 19. Количественный анализ популяции клеток (%), находящихся в состоянии апоптоза, иммунофлуоресцентно окрашенных пропидиум йодидом и анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами, индуцированных in vitro в результате добавления в культуры лимфоцитов периферической крови группы здоровых людей (n=8) различных доз инактивированного корпускулярного антигена (АГ) B. garinii с соотношением клеток и боррелий 1:10, 1:20 или 1:50, а также внесения в культуру ингибитора фагоцитоза цитохалазина D (ЦхD) и боррелий (1:10). p 1 – отличие каждой из групп (1:10, 1:20 или 1:50) от интактного контроля; p 2 – отличия между культурами с добавлением доз боррелий 1:50, 1:20 и 1:10; p 3 – отличия культуры с добавлением ЦхD+боррелии (1:10) от культуры с внесением только боррелий (1:10). Горизонтальная черта соответствует медиане (Me [Q1;Q3]). 84 3.2.5. Характеристика пролиферации и апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом в ответ на стимуляцию неспецифическим митогеном в условиях in vitro с использованием метода проточной цитометрии В результате определения методом проточной цитометрии числа иммунофлуоресцентно окрашенных клеток, инкорпорировавших БДУ (рисунок 20), в ФГА-стимулированных культурах, полученных от больных острым ИКБ (группа IA) было установлено достоверное уменьшение числа лимфоцитов в S- и G2/M-фазах клеточного цикла (таблица 10), при одновременном существенном увеличении числа клеток в G0/G1-фазах, по сравнению с соответствующими значениями в контроле (группа III), в группе реконвалесцентов (группа IB) и в группе больных хроническим ИКБ (группа II), что косвенно свидетельствует об аресте клеточного цикла в G1-фазе (результаты представлены как медиана (Mе) и [Q1 ; Q3], где Q1 и Q3 – первый и третий квартили). Так, например, в ФГА-стимулированных культурах лимфоцитов больных острым ИКБ, уровни лимфоцитов в S-фазе (9,01% [7,92; 9,97]) и G2/M-фазах (3,25% [2,67; 3,49]) были достоверно ниже, чем соответствующие результаты, полученные в контроле (21,61% [20,34; 23,23]), p = 0,001 и 5,94% [4,66; 6,74], p = 0,006), а также в группах реконвалесцентов (15,88% [15,0; 17,36]), p=0,017 и 6,86% [6,06; 7,74], p=0,017) и больных хроническим ИКБ (23,74% [18,67; 26,18]), p = 0,001 и 6,51% [6,17; 7,74], p = 0,002). Обращает на себя внимание то, что число делящихся клеток в Sи G2/M-фазах в ФГА-стимулированных культурах больных хроническим ИКБ (23,74% [18,67; 26,18]) и 6,51% [6,17; 7,74]) достоверно не отличается от соответствующих показателей в контроле (21,61% [20,34; 23,23]) и 5,94% [4,66; 6,74], p >0,05). 85 а б Рис 20. Региональные гейты количественного анализа популяций иммунофлуоресцентно окрашенных инкорпорировавших БДУ лимфоцитов (%), находящихся в различных фазах клеточного цикла или в состоянии апоптоза в ФГА-стимулированных культурах периферической крови: а – больных острым ИКБ (группа IA, n=7); б – в контроле (группа III, n=7). Региону 6 (R6) соответствует клетки в состоянии апоптоза (в суб-G0/G1 фазе), R3 – в фазах клеточного цикла G0/G1, R4 – в фазе синтеза S, R5 – в фазах G2/M. Данные о сигналах 7-ААD показаны на x-оси, а данные о сигналах клеток, меченных анти-БДУ ФИТЦ моноклональными антителами (antiBrdU FITC) отражены на y-оси. 86 Таблица 10. Количественный анализ популяций лимфоцитов (%) в различных фазах клеточного цикла в ФГА стимулированных 72-часовых культурах периферической крови больных ИКБ (Me [Q1;Q3]) Группы Уровни Спонтанный IA. Больные острым ИКБ n=7 IB. Здоровые реконвалесценты (через 3 мес. после терапии) n=7 II. Больные хроническим ИКБ n=7 III. Контроль n= 7 Число клеток, находящихся в фазах клеточного цикла, % S p G2/M p G0/G1 3,17 p 1=0,012 1,37 p 1=0,004 80,71 [2,79; 3,38] p 3=0,047 [1,06; 1,70] [79,78; 84,0] Стимулированный 9,01 [7,92; 9,97] Спонтанный 1,31 [0,53; 1,57] Стимулированный Спонтанный Стимулированный Спонтанный Стимулированный 15,88 [15,0; 17,36] 6,17 [3,68; 7,95] 23,74 [18,67; 26,18] p 1=0,001 p 2=0,017 p 3=0,001 p 3=0,035 p 4=0,017 p 1=0,012 p 2=0,017 p 3=0,035 p 4=0,017 p 1=0,004 p 2=0,017 p p 1=0,004 3,25 [2,67; 3,49] p 1=0,006 p 2=0,017 p 3=0,002 65,51 [62,19; 66,20] 0,45 [0,43; 1,17] p 3=0,008 p 4=0,027 84,41 [81,95; 89,91] p 4=0,017 6,86 [6,06; 7,74] p 2=0,017 p 4=0,017 61,45 [57,96; 63,68] p 2=0,017 1,85 [1,63; 2,34] 6,51 [6,17; 7,74] p 1=0,004 78,62 [76,82; 81,88] 56,31 [56,26; 58,39] p 1=0,0017 p 2=0,011 1,60 [1,03; 1,80] ― 0,51 [0,37; 0,76] ― 21,61 [20,34; 23,23] p 2=0,017 5,94 [4,66; 6,74] p 2=0,017 88,52 [86,70; 90,80] 57,15 [56,48; 59,68] p 1=0,004 p 2=0,017 p 3=0,004 p 2=0,017 ― p 2=0,017 Примечание: ФГА – фитогемагглютинин. Здесь и в рисунке 21 использованы критерии Манна–Уитни и Уилкоксона: p 1 – отличие групп IA, IB или II от группы III (контроля); p 2 – между спонтанным и стимулированным уровнями показателя в каждой группе; p 3 – отличие групп IA или IB от группы II; p 4 – различие между группами IA и IB. 87 В нестимулированных (спонтанных) культурах лимфоцитов, число делящихся клеток в фазе синтеза у больных острым ИКБ (3,17% [2,79; 3,38]) и в G2/M-фазах (1,37% [1,06; 1,70]) оказалось достоверно выше, чем соответствующие значения в контроле (1,60% [1,03; 1,80], p = 0,012 и 0,51% [0,37; 0,76], p = 0,004) и в группе реконвалесцентов (1,31% [0,53; 1,57], p=0,017 и 0,45% [0,43; 1,17], p=0,027). Однако, уровни спонтанно делящихся лимфоцитов в S-фазе, полученных от больных из группы IA (3,17% [2,79; 3,38]) и в контроле (1,60% [1,03; 1,80]), были значительно ниже по сравнению с группой больных хроническим ИКБ (6,17% [3,68; 7,95], p=0,047 и p=0,004 соответственно). Клетки в нестимулированных культурах больных хроническим ИКБ, находящихся в G2/M-фазах, также пролиферировали интенсивнее, чем в контроле (1,85% [1,63; 2,34] против 0,51% [0,37; 0,76], p =0,004). Наиболее высокие уровни клеток в состоянии апоптоза в нестимулированных и стимулированных ФГА культурах (рисунок 21) были выявлены в группе больных острым ИКБ (12,40% [10,45; 13,98] и 19,31% [16,68; 21,68]) по сравнению с группой реконвалесцентов (7,94% [4,27; 9,66] и 11,67% [9,39; 13,87], p=0,017 и p=0,027), с контролем (6,51% [2,99; 7,79] и 12,38% [10,80; 13,75], p=0,002 и p=0,006) и, в особенности, по сравнению с группой больных хроническим ИКБ (7,14% [4,33; 9,16] и 8,12% [7,59; 9,46], p=0,004 и p=0,0017), что могло свидетельствовать об интенсивной элиминации генетически поврежденных клеток. Число клеток в состоянии апоптоза у больных хроническим ИКБ было самым низким и, в отличие от других групп, не имело достоверных различий между спонтанными и стимулированными культурами (7,14% [4,33; 9,16] и 8,12% [7,59; 9,46], p>0,05). Более того, в отличие от группы реконвалесцентов, стимуляция ФГА культур лимфоцитов группы больных хроническим ИКБ приводила к существенному подавлению числа апоптотически погибших клеток по сравнению с соответствующим показателем в контроле (8,12% [7,59; 9,46] против 12,38% [10,80; 13,75], p= 0,012). 88 Число клеток в состоянии апоптоза, % 26 p 1 = 0,006 p 2 = 0,042 p 3 = 0,0017 24 22 20 p 1 = 0,002 p 3 = 0,004 p 2 = 0,027 p 3 = 0,021 p 4 = 0,027 18 p 2 = 0,017 16 p 1 = 0,012 p 4 = 0,017 14 12 10 8 6 4 2 0 RPMI ФГА Группа IA RPMI ФГА Группа IB RPMI ФГА RPMI ФГА Группа II Группа III Рисунок 21. Количественный анализ лимфоцитов в состоянии апоптоза (%), иммунофлуоресцентно окрашенных анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами и 7-ААD (на общее содержание ДНК), в нестимулированных ФГА (среда RPMI-1640) или в ФГА- стимулированных культурах периферической крови больных острым ИКБ (группа IA, n=7), здоровых реконвалесцентов ИКБ (группа IB, n=7), больных хроническим ИКБ (группа II, n=7) и контрольной группы (группа III, n=7). Горизонтальная черта соответствует медиане (Me [Q1;Q3]). 89 Анализ Br-dUTP-инкорпорировавших клеток, окрашенных пропидиум йодидом и анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами (рисунок 22 и таблица 11), позволил определить число клеток, находящихся в последней стадии апоптоза и имеющих фрагментацию ДНК вследствие активации эндонуклеаз и отличить их от неапоптотически погибших клеток. У больных острым ИКБ в стимулированных ФГА культурах лимфоцитов число апоптотически погибших клеток было значительно больше, чем в соответствующих культурах здоровых людей (16,10% [12,31; 17,89] против 7,45% [5,62; 9,18], p = 0,0012). В то же время, число неапоптотически погибших клеток в культурах, полученных от больных острым ИКБ, было существенно ниже, чем в состоянии апоптоза и достоверно не отличалось от контрольных значений (2,13% [1,56; 3,11] против 2,81% [1,62; 4,89] в контроле, p > 0,05). Стоит отметить, что число клеток в состоянии апоптоза в ФГАстимулированных культурах, полученных от больных хроническим ИКБ (таблица 11), было значительно ниже по сравнению с соответствующими значениями у больных острым ИКБ (4,02% [1,88; 5,02] против 16,10% [12,31; 17,89], p=0,0008). Кроме того, достоверные отличия между показателями, полученными от больных хроническим ИКБ и от контроля, были установлены только для апоптотически погибших клеток (4,02% [1,88; 5,02] против 7,45% [5,62; 9,18], p = 0,025), но не для некротически погибших (2,36% [1,04; 3,47] против 2,81% [1,62; 4,89], p > 0,05). 90 а б Рисунок 22. Региональные гейты количественного анализа популяций лимфоцитов (%), иммунофлуоресцентно окрашенных пропидиум йодидом (PI) и анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами, позволяющего идентифицировать число клеток, погибших путем апоптоза или некроза (неапоптотические клетки) в ФГА-стимулированных культурах периферической крови: а – больных острым ИКБ (n=9); б – контрольной группы (n=7). 91 Таблица 11. Количественный анализ (%) популяций лимфоцитов (Me [Q1;Q3]) иммунофлуоресцентно окрашенных пропидиум йодидом (PI) и анти-БДУ ФИТЦ-меченными моноклональными антителами, находящихся в состоянии апоптоза или неапоптотической гибели (некроза) в ФГАстимулированных культурах мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом. Больные Больные Контрольная острым хроническим группа ИКБ ИКБ (группа IA) (группа II) (группа III) (n = 7) (n = 9) (n = 7) (n = 7) 1,86 16,10 4,02 7,45 [0,56; 2,03] [12,31; 17,89] [1,88; 5,02] [5,62; 9,18] p1 = 0,0012 p1 = 0,025 Число Интактный погибших контроль лимфоцитов Апоптоз, % p2 = 0,0008 Некроз, % 0,97 2,13 2,36 2,81 [0,12; 1,23] [1,56; 3,11] [1,04; 3,47] [1,62; 4,89] p1 > 0,05 p1 > 0,05 p2 > 0,05 Примечание: ИКБ – иксодовый клещевой боррелиоз; Ме – медиана; Q1 и Q3 – первый и третий квартили. Для определения достоверности различий между группами использовался критерий Манна–Уитни. Указана значимость различий p1 групп IA или II от группы III (контроля), а также p2 – между группами IA и II; n численность группы. 92 3.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ В ОТВЕТ НА СТИМУЛЯЦИЮ КОРПУСКУЛЯРНЫМ АНТИГЕНОМ БОРРЕЛИЙ ИЛИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ МИТОГЕНОМ В УСЛОВИЯХ IN VITRO У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ В 24-часовых супернатантах культур мононуклеарных клеток периферической крови, полученных от больных различными клиническими формами ИКБ, нами было проведено определение базальных и стимулированных инактивированным корпускулярным боррелиозным антигеном или ФГА концентраций интерферона (ИФН)- и интерлейкина (ИЛ)-4 (таблица 12), а также фактора некроза опухоли (ФНО)- и ИЛ-6 (таблица 13). В результате было установлено, что спонтанная и стимулированная антигеном боррелий трансформация лимфоцитов у больных острым и хроническим ИКБ, сопровождалась значительным повышением содержания ИФН- в супернатантах по сравнению с контролем (p<0,001 во всех случаях) и реконвалесцентами (p=0,005 и p=0,0002 для группы IA; p<0,001 и p<0,001 для группы II). Стимуляция ФГА культур больных острым ИКБ также приводила к существенно более высоким концентрациям продукции ИФН- по сравнению с контролем (p<0,001) и с группой реконвалесцентов (p<0,001). Уровень ФГА- стимулированной продукции этого провоспалительного цитокина в группе больных хроническим ИКБ оказался существенно выше, чем у реконвалесцентов (p<0,001) и в контроле (p=0,002). 93 Таблица 12. Продукция интерферона (ИФН)- и интерлейкина (ИЛ)-4 в стимулированных или нестимулированных корпускулярным антигеном боррелий (БАГ) B. garinii или митогеном фитогемагглютинином (ФГА) 24-часовых культурах лимфоцитов периферической крови больных ИКБ (Me [Q1;Q3]) ИЛ-4, пг/мл ИФН-, пг/мл Группы Уровни БАГ ФГА БАГ ФГА IA. 44,73 *# 3,43 # Спонтанный Больные [13,46; 67,68] [2,51; 6,09] острым 1894,83*# 9,67 # Стимулиро282,16 *# 5,41 # ИКБ [1018,62; [5,84; ванный [138,42; 463,54] [3,47; 8,33] n =22 3515,64] 17,27] IB. Здо18,92 *^# 2,62^ Спонтанный ровые [11,29; 24,65] [1,37; 4,32] рекон425,56 *^# 18,17 ^^# Стимулиро81,47 **^# 4,59 # валес[206,81; [6,39; ванный [54,94; 121,89] [2,48; 7,17] центы 631,51] 39,02] II. 163,43* 2,04 Спонтанный Больные [110,62; 243,74] [1,43; 2,91] хрони942,05* Стимулиро446,23* 1,08* 4,02* ческим [698,40; ванный [178,76; 755,71] [0,59; 1,56] [2,79; 7,86] ИКБ 11,87 2493,35] 2,87 Спонтанный III. Кон[6,90; 12,91] [1,66; 4,19] троль 515,27 16,78 Стимулиро57,00 3,51 n=23 [365,21; [6,81; ванный [32,67; 80,58] [1,61; 5,87] 983,08] 28,05] Примечание: Здесь и в таблице 13 значимость различий обозначена знаками: «*» (p<0,01) или «**» (p<0,05) – отличие групп IA и IB или II от группы III; «^» (p<0,01) и «^^» (p<0,05) – между группами IA и IB; «#» (p<0,01) или «##» (p<0,05) – отличие групп IA или IB от группы II. 94 Таблица 13. Продукция фактора некроза опухоли (ФНО)- и интерлейкина (ИЛ)-6 в стимулированных или нестимулированных корпускулярным антигеном боррелий (БАГ) B. garinii или митогеном фитогемагглютинином (ФГА) 24часовых культурах лимфоцитов периферической крови больных ИКБ (Me [Q1;Q3]) ФНО-, пг/мл Группы Уровни БАГ ФГА IA. Больные острым ИКБ n =22 IB. Здоровые реконвалесценты n=20 II. Больные хроническим ИКБ III. Контроль n=23 Спонтанный Стимулированный Спонтанный Стимулированный Спонтанный Стимулированный Спонтанный Стимулированный 238,72 * [126,80; 395,30] 1380,64 * 1752,63 *# [808,31; [945,92; 1743,29] 3261,36] 73,50 ^# [60,94; 98,49] 556,34 ^# [261,78; 799,78] 411,32^# [174,62; 623,75] 319,73 * [93,17; 673,42] 1718,44 * 963,10* [730,21; [463,59; 2171,56] 1731,62] 51,92 [36,79; 91,98] 571,96 352,67 [212,24; [128,54; 603,79] 884,23] ИЛ-6, пг/мл БАГ ФГА 25,56 *# [11,26; 49,33] 2596,95* 3169,53* [1003,31; [1486,46; 3990,54] 5843,14] 10,75 *^# [6,33; 21,07] 450,65 ^# [178,09; 1202,98] 799,41 ^# [319,57; 1377,55] 365,11* [218,18; 520,45] 2709,31 * 3791,59 * [1296,92; [1491,4; 3407,27] 6711,19] 3,67 [2,14; 8,81] 770,35 1052,12 [457,24; [764,32; 976,73] 1295,81] 95 С другой стороны, в супернатантах культур больных острым ИКБ уровни спонтанной и антиген- или ФГА-стимулированной продукции ИЛ-4 не отличались от соответствующих значений в контроле (p>0,05), а у больных хроническим ИКБ концентрации антиген- или ФГА-стимулированной секреции этого цитокина были даже существенно ниже, чем в контрольной группе (1,08 пг/мл [0,59; 1,56] против 3,51 пг/мл [1,61; 5,87], p=0,0001; 4,02 пг/мл [2,79; 7,86] против 16,78 пг/мл [6,81; 28,05], p<0,001), а также чем в группах больных острым ИКБ (p<0,001) и реконвалесцентов (p<0,001). Стоит так же отметить, что стимуляция культур боррелиозным антигеном в группах больных острым ИКБ и реконвалесцентов не приводила к существенному повышению секреции этого цитокина по сравнению с соответствующими спонтанными уровнями (таблица 12). Положительный ответ на стимуляцию ФГА, сопровождающийся достоверным ростом секреции ИЛ-4, по сравнению со спонтанными уровнями был отмечен у больных острым ИКБ (9,67 пг/мл [5,84; 17,27] против 3,43 пг/мл [2,51; 6,09], p = 0,0001), у реконвалесцентов (18,17 пг/мл [6,39; 39,02] против 2,62 пг/мл [1,37; 4,32], p=0,0003) и больных хроническим ИКБ (4,02 пг/мл [2,79; 7,86] против 2,04 пг/мл [1,43; 2,91], p= 0,0018), а также в группе здоровых лиц (16,78 пг/мл [6,81; 28,05] против 2,87 пг/мл [1,66; 4,19], p < 0,001). Кроме того, нами было установлено значительное повышение спонтанных и антиген- или ФГА-стимулированных концентраций провоспалительных цитокинов – ФНО- и ИЛ-6 в супернатантах культур больных острым и хроническим ИКБ по сравнению с соответствующими значениями в контроле (p<0,001 во всех случаях) (таблица 13). Примечательно, что для периода реконвалесценции было характерно значительное снижение уровней спонтанной и антиген- или ФГА-стимулированной продукции ФНО- и ИЛ-6 по сравнению с результатами полученными в культурах лимфоцитов больных острым (p = 0,001, p = 0,005, p = 0,0001 для ФНО-; p = 0,008, p = 0,0005, p = 0,0002 для ИЛ-6) и/или хроническим боррелиозом (p = 0,001, p = 0,005, p = 0,0006 для ФНО-; p <0,001 во всех случаях для ИЛ-6). 96 На основании выявленных закономерностей нами было выдвинуто предположение, о том, что в культурах мононуклеарных клеток больных острым и хроническим ИКБ доминирует ответ Т-хелперов типа 1, сопровождающийся активной продукцией провоспалительных цитокинов (ИФН-, ФНО- и ИЛ-6). Кроме того, в группе больных острым ИКБ были выявлены значимые положительные корреляционные зависимости между числом лимфоцитов, находящихся в состоянии апоптоза, и уровнями спонтанной и антиген- стимулированной продукции ИФН- (r= +0,85 при p=0,006; r= +0,82 при p=0,011) и ФНО- (r= +0,89 при p=0,009; r= +0,86 при p=0,005) в супернатантах соответствующих культур. В ангтиген-стимулированных и нестимулированных культурах, полученных от больных хроническим ИКБ, концентрации ИЛ-6 отрицательно коррелировали с числом клеток в состоянии апоптоза (r= 0,77 при p=0,015; r= 0,83 при p=0,005). Уровни спонтанной или стимулированной боррелиозным антигеном секреции провоспалительных цитокинов ИФН-γ, ФНО- и ИЛ-6 в группе больных острым ИКБ положительно коррелировали со значениями показателя активности перекисного окисления липидов в плазме крови – МДА (r=+0,68 при p=0,0004 и r=+0,66 при p=0,0007 для ИФН-γ; r=+0,82 при p<0,001 и r=+0,52 при p=0,013 для ФНО-; r =+0,70 при p=0,0002 и r=+0,48 при p=0,025 для ИЛ-6). В культурах больных острым ИКБ уровни лимфоцитов с цитогенетическими нарушениями положительно коррелировали с концентрацией ФНО- (r=+0,74, p=0,005) в супернатантах, а частота клеток с полиплоидией и анеуплоидией находилась в прямой корреляционной зависимости от уровней секреции ИФН- (r=+0,77, p=0,003). Кроме того, между числом клеток с цитогенетическими нарушениями и уровнями их апоптотической гибели в культурах лимфоцитов, полученных от больных острым ИКБ, были установлены положительные (r= +0,90, p=0,002), а в культурах, полученных от больных 97 хроническим ИКБ, отрицательные (r= 0,81, p=0,007) корреляционные зависимости. 3.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА В ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ В таблице 14 приведены результаты определения концентрации показателя перекисного окисления липидов – малонового диальдегида (МДА) в плазме крови больных различными клиническими вариантами ИКБ. Таблица 14. Концентрации малонового диальдегида (МДА) в плазме крови больных ИКБ (Me [Q1;Q3]) Группы МДА, мкмоль/л p 2,76 [1,88; 4,45] p1<0,001 IA. Больные острым ИКБ, n =22 IB. Здоровые реконвалесценты, n=20 p2=0,0012 1,19 [0,94; 1,90] p3=0,0003 хроническим ИКБ, 2,51 [2,17; 3,37] p1<0,001 n=21 III. Контроль, n=23 1,05 [0,46; 1,51] — II. Больные Примечание: ИКБ – иксодовый клещевой боррелиоз. p 1 – отличие групп IA, IB или II от группы III (контроля); p 2 – отличие групп IA или IB от группы II; p 3 – различие между группами IA и IB. 98 Установлено, что больные острым и хроническим ИКБ имеют достоверно более высокое содержание МДА в плазме крови, по сравнению с контролем (p<0,001 в обоих случаях) и группой реконвалесцентов (p=0,0003 и p=0,0012). В период выздоровления концентрации МДА в плазме существенно не отличались от соответствующих значений в группе здоровых лиц (p>0,05). У больных острым и хроническим ИКБ показатель МДА положительно коррелировал с уровнями цитогенетических нарушений в культурах лимфоцитов периферической крови соответствующих пациентов (r=+0,91 при p<0,001; r=+0,71 при p=0,009). 99 ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.1. Кариопатологические изменения в лимфоцитах периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом В лимфоцитах периферической крови обследованных нами групп больных острым и хроническим ИКБ было выявлено существенное повышение числа клеток со структурными аберрациями хромосом (разрывов и фрагментов) по сравнению с контролем и реконвалесцентами, в большинстве своём, хроматидного и в меньшей степени хромосомного типов. Полученные нами данные в некоторых аспектах были аналогичны результатам Н. П. Пироговой с соавт. [61] и Л.В. Бабаевой [5], которые также выявили достоверное повышение по сравнению с контролем общего количества клеток с хромосомными аберрациями и числа хромосомных нарушений на клетку на фоне сниженной активности системы репарации ДНК в лимфоцитах периферической крови больных острым и хроническим ИКБ. Так же как и в нашем исследовании, согласно данным Н. П. Пироговой с соавт. [61], структурные аберрации в клетках больных ИКБ были представлены в основном нарушениями хроматидного типа, частота которых в 2,5 раза превышала частоту аберраций хромосомного типа. Отметим однако, что в отличие от полученных нами результатов кроме парных фрагментов и разрывов, в работе Н. П. Пироговой с соавт. [61] было установлено появление лимфоцитов с более сложными хромосомными аберрациями типа меж- и внутрихромосомных обменов, включая кольцевые или дицентрические хромосомы, которые обычно характерны для эффектов ионизирующего излучения [168]. Возможно, что эти различия связаны с тем, что обследованные нами больные ИКБ не подвергались рентгеновскому обследованию в течение не менее 3 месяцев до взятия крови на хромосомный анализ. 100 Кроме того, в исследовании Н. П. Пироговой с соавт. [61] в культурах мононуклеарных клеток периферической крови больных в острый период ИКБ, но не в хроническую фазу заболевания, были выявлены лимфоциты с разрывами хромосом в области центромер. При этом какой-либо интерпретации механизмов этого типа нарушений в лимфоцитах больных ИКБ приведено не было. В проведенном нами исследовании было впервые обнаружено, что похожие типы нарушений в одной или двух гомологичных хромосомах являются не разрывами, а районами с увеличенными районами вторичной перетяжки, которые встречались только в клетках больных острым ИКБ, но отсутствовали у тех же пациентов в период реконвалесценции, а также в лимфоцитах больных хроническим ИКБ. Более того, дифференциальная окраска хромосом G- и С-методами впервые позволила определить, что практически все эти нарушения локализовались в хромосоме 9, которая, у некоторых людей имеет наследственно-ассоциированный крупный блок гетерохроматина в перицентромерной области. Блок гетерохроматина в этой области при G-окраске плохо выявляется, но может быть хорошо визуализирован с использованием С-метода. Тем не менее, применение С-метода дифференциальной окраски хромосом не позволило нам выявить наличие какого-либо крупного гетерохроматинового блока в области центромеры 9-ой хромосомы в метафазных пластинках больных острым ИКБ, что, предположительно, свидетельствует о том, что этот участок приобрел свойства эухроматина. В перицентромерном районе длинного плеча 9-й хромосомы располагается один из наиболее крупных гетерохроматиновых блоков, имеющий выраженный межиндивидуальный полиморфизм, который, как считалось ранее, может иметь только наследственный характер и отличается исключительной стабильностью в разных тканях индивидуума [51]. Размер вторичных перетяжек в аутосомах 1, 9 и 16 варьирует в широких пределах. У отдельных индивидов этот район настолько велик, что при рутинной окраске может выглядеть как протяженный истонченный проксимальный участок длинного плеча. Показано, что наследственно обусловленные изменения гетерохроматина пери- 101 центромерных областей хромосом встречаются достаточно редко [51]. В нормальной популяции с малой частотой (4–9 %) у отдельных субъектов в хромосомном наборе может присутствовать только одна из хромосом 1, 9 или 16 с очень крупным перицентромерным С-блоком гетерохроматина [51]. Известно, что перицентромерный полиморфизм хромосомы 9 может включать не только изменение размеров гетерохроматиновых блоков, но и перицентрические инверсии, а также С-негативные или G-позитивные дополнительные блоки в пределах участка гетерохроматина. Наличие подобных наследуемых изменений в перицентромерной области связывают с различными патологиями развития и умственной отсталостью [105]. На данный момент доказано, что в условиях старения в поздних пассажах культур первичных фибробластов или воздействия на клетки различных стрессовых факторов, включая гипертермию, окислительный стресс, тяжелые металлы или другие химические соединения, происходит экспрессия белков теплового шока HSP (от англ. heat shock proteins) [142, 242]. Они функционируют как молекулярные шапероны, моделируя сборку, транспорт и фолдинг других белков, а также играют важную роль в регуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток [71]. Современные исследования доказали, что в условиях стресса, находящийся в цитоплазме транскрипционный фактор гена теплового шока HSF 1 после фосфорилирования перемещается в ядро клетки, где он взаимодействует со специфическим субклассом сателлитных III последовательностей ДНК в перицентромерных районах гетерохроматина хромосомы 9 (9q11–q12), 12 и 15 человека, что сопровождается транскрипционной активностью РНК полимеразы II и формированием гранул ядерного стресса [231]. Таким образом, установлено, что в условиях стресса участок гетерохроматина, который ранее считался молчащим, становится транскрипционно активным и приобретает свойства эухроматина [231, 243]. Доказан так же факт обратимости этого процесса. Биологическое значение данного явления остается не совсем ясным. Поэтому, не исключено, что выявленное нами увеличение района вторичной перетяжки хромосомы 9, которое не было ассоциировано с круп- 102 ным блоком гетерохроматина и имело обратимый характер при исследовании в динамике у больных ИКБ в острый период и в фазу реконвалесценции, может быть связано с ответом клеток на стрессовые факторы, характерные для инфекционного процесса при этом заболевании и обусловлено транскрипционной активностью РНК полимеразы II и формированием гранул ядерного стресса в перицентромерном районе гетерохроматина. До недавнего времени традиционно считалось, что генетический материал, в зависимости от степени конденсации и «активности», можно классифицировать на гетеро- и эухроматин. В настоящее время выделяют так называемый факультативный гетерохроматин, содержащий «молчащие» гены, и конститутивный гетерохроматин, преимущественно локализованный в околоцентромерных районах, который в основном содержит различные повторяющиеся ДНК сателлитные последовательности, функционально связанные с регуляцией активности генов [140]. Установлено, что центромерный гетерохроматин, расположенный вблизи центромер, обеспечивающих места прикрепления для микротрубочек веретена во время деления клетки, играет фундаментальную роль в событиях, приводящих к надежному расхождению хромосом [90, 121]. Районы центромерного и перицентромерного гетерохроматина, активность которых регулируются эпигенетически, являются критичными для завершения митоза [135]. Таким образом, к настоящему времени стало очевидным, что конститутивный гетерохроматин в перицентромерных и центромерных регионах в определенной ситуации может перейти в состояние готовности к транскрипции [93]. В отличие от других исследователей [5, 61], которые анализировали только структурные хромосомные нарушения, нами впервые была проанализирована частота встречаемости клеток с измененным числом хромосом в наборе в лимфоцитах периферической крови больных ИКБ. Установлено, что в ФГА-стимулированных культурах больных острым и хроническим ИКБ число полиплоидных, гипоплоидных клеток и клеток с эндоредупликацией было значительно выше, чем в группах контроля и реконвалесцентов. 103 В культурах лимфоцитов, полученных от больных острым и хроническим ИКБ, было установлено существенное повышение частоты клеток с патологией митоза, включая отставание хромосом в мета-, ана- или телофазе, многогрупповые метафазы или многополюсный митоз, а также достоверное увеличение числа бинуклеаров или клеток с микроядрами. Более того, в настоящем исследовании было впервые доказано, что добавление инактивированного корпускулярного антигена боррелий B. garinii в ФГА- стимулированную культуру лимфоцитов здоровых людей индуцирует различные типы кариопатологических изменений: микроядра, патологию митоза и структурные аберрации хромосом, а также анеуплоидию, полиплоидию и увеличенный район вторичной перетяжки хромосомы 9, аналогичные тем цитогенетическим нарушениям, которые мы определили в мононуклеарных клетках периферической крови, полученных от больных острым ИКБ. Установлено, что образование многоядерной клетки в культуре макрофагов или фибробластов обычно связано с делением ядра без последующего цитокинеза или со слиянием клеток. Формирование подобных клеток in vivo может происходить при ответе на чужеродное тело, в очаге воспаления, при раке и старении ткани [141]. С помощью экспериментальной модели на зараженных мышах, а также в биоптатах кожи людей с мигрирующей кольцевидной эритемой было показано, что для боррелиоза в очагах воспаления характерно появление многоядерных клеток, в цитоплазме которых были обнаружены фагоцитированные боррелии [28, 115]. Эффекты добавления в культуры цитокинов или антицитокиновых антител на процесс формирования многоядерных гигантских клеток изучены во многих экспериментах. A.K. McNally [182]. сообщили о том, что образование двух различных морфологических вариантов многоядерных гигантских клеток может быть индуцировано разными цитокинами: клетки типа Ланганса, имеющие небольшое число ядер, образуются с участием ИФН-γ из моноцитов, а гигантские клетки типа инородных тел с большим числом ядер формируются с участием ИЛ-4 [182, 184]. Установлено, что пептидогликан бактериальной 104 клеточной стенки, а также живые или убитые микобактерии, в сочетании с ИФН-γ, гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) и ИЛ-3, рассматриваются как совокупность факторов, индуцирующих образование в условиях in vitro Ланганс-подобных многоядерных клеток гранулем из CD14+/CD16– моноцитов [133, 184, 198]. Механизм формирования этих клеток связан с их слиянием, для чего необходим контакт между моноцитом (макрофагом) и микобактериями и их фагоцитоз, а также активация TLR2рецепторов [133, 188]. Подобный механизм образования многоядерных и полиплоидных клеток с участием ИФН-γ в культурах больных ИКБ возможен и в настоящем исследовании. Косвенным подтверждением этого является наличие достоверной положительной корреляции между концентрацией ИФН-γ в супернатантах и числом полиплоидных или бинуклеарных клеток в культурах лимфоцитов, полученных от больных ИКБ. Кроме того, предполагают, что наличие оксидативного повреждения ДНК в условиях митогенной стимуляции способно приводить к полиплоидии и другим цитогенетическим нарушениям [134]. В настоящем исследовании у больных острым и хроническим ИКБ было установлено достоверное повышение в плазме крови концентрации малонового диальдегида (МДА) – одного из продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что свидетельствовало об активации образования повреждающих ДНК реактивных метаболитов кислорода у этих больных. Более того, у больных острым и хроническим ИКБ нами впервые была подтверждена корреляционная зависимость между концентрацией в плазме крови МДА и уровнями структурных хромосомных нарушений в лимфоцитах, а также между показателем МДА и уровнями спонтанной или стимулированной боррелиозным антигеном секреции провоспалительных цитокинов ИФН-, ФНО- и ИЛ-6. По данным H.B. Мандраковой с соавт. [36] у больных острым ИКБ тоже была установлена прямая корреляционная зависимость между содержанием метаболитов оксида азота (NO) сыворотки крови и ИФН-γ, а также ФНО-, что указывало на существенную связь продукции метаболитов NO и функционированием цитокиновой сети. 105 Экспериментально установлено, что некоторые продукты ПОЛ, включая МДА, также как и реактивные метаболиты кислорода и азота, могут взаимодействовать с ДНК, вызывая мутагенный эффект [169]. Показано, что взаимодействие B. burgdorferi с мышиными макрофагами костного мозга или клетками Купфера приводит к активному фагоцитозу боррелий, индукции секреции NO и супероксид-анион радикала (O2-), которое было значительно более выраженным, чем аналогичные показатели, индуцированные Leptospira interrogans [156, 214]. Установлено, что уже в ранний период заболевания боррелии активно взаимодействуют с макрофагами, нейтрофилами и лимфоцитами, с чем связано развитие мощного воспалительного ответа и генерации реактивных метаболитов кислорода и азота, образование продуктов ПОЛ, цитокинов и других медиаторов [165]. Различными исследователями в организме больных боррелиозами (в плазме крови или в моче) было установлено существенное повышение продуктов ПОЛ, таких как МДА, 4-гидрокси-2-нонэнал (ГНЭ), изопростены и нейропростены [165, 166]. Анализ сыворотки крови и, в особенности, ликвора, полученных от больных острым ИКБ, показал существенное увеличение концентрации нитратов и нитритов [24], а также повышение показателей ПОЛ в плазме, включая содержание диеновых конъюгатов и МДА [24, 25, 33, 34, 58]. В случае выздоровления в период реконвалесценции показатели ПОЛ имели тенденцию к нормализации. Подобная динамика в процессах ПОЛ описана не только при ИКБ, но и при других инфекционных заболеваниях [9, 41]. Кроме того, в культурах лимфоцитов больных ИКБ уровни лимфоцитов со структурными аберрациями хромосом положительно коррелировали с концентрацией провоспалительных цитокинов ФНО- и ИЛ-6 в супернатантах. В настоящее время установлено, что при остром или хроническом воспалительном процессе, сопровождающемся активной секрецией иммуноцитами провоспалительных цитокинов, происходит повышенное образование эндогенных факторов повреждающих ДНК, таких как реактивные метаболиты кислорода и азота, что может привести к геномной нестабильности, которая является ре- 106 зультатом нарушения регуляции ответа на повреждение ДНК [237]. В частности, результаты экспериментов показывают, что ФНО- – провоспалительный цитокин, являющийся регулятором активности индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), способствующий повышению продукции реактивных радикалов кислорода и азота, индуцирует образование маркера оксидативного повреждения ДНК – 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозина и геномную нестабильность в первичной культуре эндотелиальных клеток [201]. Установлено, что уровень повышения концентрации провоспалительных цитокинов и степень активности макрофагов коррелируют с увеличением показателя числа клеток с микроядрами, что объясняет появление подобных клеток при воспалении [205]. Известно, что микроядерный тест не уступает по чувствительности другим методам учета повреждений ДНК и является одним из современных методов изучения нестабильности генома в соматических клетках человека [21, 38, 217]. Появление повышенного числа клеток с микроядрами сигнализирует о наличии повреждений хромосом, о снижении жизнеспособности клеток и нарушении их функциональной активности, а также может быть ассоциировано с апоптозом [239]. В проведенном нами исследовании в острый период заболевания была продемонстрирована положительная корреляционная связь между уровнем клеток с цитогенетическими нарушениями и их апоптотической гибелью. В то же время, в культурах мононуклеарных клеток, полученных от пациентов с хронической инфекцией, уровни цитогенетически поврежденных лимфоцитов отрицательно коррелировали с числом клеток в состоянии апоптоза. Известно, что ответ клетки на повреждение ДНК включает множество механизмов репарации ДНК, а также ответ в сверочных точках клеточного цикла с участием киназ ATM-Chk2 и ATR-Chk1, что приводит либо к гибели клетки путем апоптоза, либо к долгосрочному аресту клеточного цикла, с которым связано особое состояние клетки, известное как клеточное старение [236]. Установлено, что в стареющих клетках наблюдается повышенная экспрессия некоторых генов, регулирующих митоз или сверочные точки клеточного цикла, а также 107 сегрегацию хромосом, что приводит к нарушению расхождения хромосом при делении клетки и сопровождается нарушением морфологии ядра [70, 196]. Добавление в культуру фибробластов пероксида водорода (H2O2), что используется в качестве экспериментальной модели изучения последствий оксидативного стресса, на третьи сутки приводит к преждевременному старению этих клеток, формированию гипертетраплоидных клеток, клеток с патологическим митозом, в том числе клеток с абортивным и незавершенным митозом [196]. Изучение морфологии ядер этих клеток показало, появление множества микроядер, увеличение числа ядер, имеющих неправильные форму или фрагментацию, а также формирование бинуклеаров с признаками нарушения цитокинеза, патологических митозов с отставшими хромосомами в гипертетраплоидной субпопуляции [196]. Кроме того, полиплоидные (тетраплоидные) клетки являются нестабильными и могут подвергаться двум последовательным биполярным мейозоподобным делениям с образованием гаплоидного набора, триплоидии или анеуплоидии в результате неравномерной сегрегации хромосом [245]. Появление полиплоидных клеток, по-видимому, связано с абортивным митозом вследствие отсутствия расхождения хромосом, а образование клеток с фрагментированными ядрами обусловлено неравномерной сегрегацией хромосом между дочерними клетками. Формирование клеток с деформированными ядрами может быть ассоциировано с хромосомными мостами [196]. В различных исследованиях было показано, что клеточный цикл клеток, подвергнутых воздействию H2O2, или бактериального цитолетального токсина (ЦЛТ) грамотрицательных бактерий (H. pylori и др.), блокируется в G1- или G2фазу клеточного цикла при прохождении сверочных точек в ответ на повреждение ДНК и большинство таких клеток погибает путем апоптоза [106, 152, 196]. Хотя пока не доказано, что боррелии обладают какими-то факторами патогенности похожими на ЦЛТ грамотрицательных бактерий, в настоящее время известно, что эти спирохеты способны активно проникать внутрь Т- и Влимфоцитов [119, 171], а также фагоцитироваться моноцитами/макрофагами 108 [209, 210], вызывая, как было установлено в наших исследованиях, выраженное повышение продукции реактивных метаболитов кислорода, провоспалительных цитокинов, апоптоз и цитогенетические нарушения в иммуноцитах, наподобие тех, что индуцирует H. pylori. 4.2. Апоптоз и пролиферативный ответ мононуклеарных клеток периферической крови больных иксодовым клещевым боррелиозом Изучение апоптоза иммунокомпетентных клеток привело к осознанию того факта, что он представляет собой активную форму реакции клеток не только на неблагоприятные воздействия, но и на физиологические, включая антигены и митогены. Соотношение пролиферации и апоптоза при этом служит важнейшим параметром реакции на антигены, поскольку оно определяет её результативность с точки зрения развития иммунного ответа. В культурах, полученных от больных острым и хроническим ИКБ, нами было впервые установлено, что стимуляция мононуклеарных клеток инактивированными боррелиями B. garinii приводила к существенному росту числа активно пролиферирующих клеток в фазах синтеза ДНК и митоза (в S- и G2/M-фазах). Накопление в супернатантах этих культур больных острым и хроническим ИКБ преимущественно провоспалительных цитокинов (ИФН-γ, ФНО- и ИЛ-6) может свидетельствовать об активации пролиферативного ответа CD4+ Т-хелперов типа 1. К аналогичному выводу пришли J. Oksi с соавт. [113], A. Pohl-Koppe соавт. [212], А.С. Бараулина с соавт. [45, 46] и V. von Baehr с соавт. [240], которые показали, что в условиях in vitro в культурах мононуклеаров, полученных от больных острым и хроническим Лайм-боррелиозом, наблюдается существенное повышение спонтанного и стимулированного убитыми боррелиями B. burgdorferi пролиферативного ответа мононуклеарных клеток периферической крови и продукции ими ИФН-γ, но не ИЛ-4 по сравнению с контролем, что могло свидетельствовать о значительном доминировании цитокиновой про- 109 дукции Т-хелпер типа 1 у больных с острым и хроническим течением заболевания [81, 113]. Вместе с тем, у больных острым ИКБ стимуляция пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на специфический боррелиозный антиген, сопровождалась существенным увеличением их апоптоза. Добавление инактивированных боррелий B. garinii в культуру клеток, полученных от здоровых людей, тоже индуцировало апоптоз, интенсивность которого прямо зависела от дозы антигена. В исследованиях, проведенных H.B. Мандраковой (2005), у больных острым ИКБ было установлено увеличение уровней цитотоксических и активированных клеток. Однако, активация системы клеточного иммунитета была существенно ограничена высоким уровнем готовности лимфоцитов периферической крови или ликвора к Fas-зависимому апоптозу [36, 37, 125]. Помимо всего прочего, с помощью метода проточной цитометрии нами было показано, что стимуляция клеток неспецифическим митогеном ФГА в культурах, полученных от больных острым ИКБ, приводила к существенному подавлению их пролиферации и росту апоптоза, о чем косвенно также свидетельствовало обнаружение при кариопатологическом анализе существенного увеличения числа клеток с кариопикнозом и кариорексисом в ФГАстимулированных культурах. С другой стороны, в культурах пациентов с хроническим течением заболевания, напротив, имела место четко выраженная тенденция к росту показателей пролиферативной активности лимфоцитов, при одновременном подавлении апоптоза как в ответ на стимуляцию боррелиозным антигеном, так и на митоген ФГА. Эти результаты совпадали с данными, полученными А.С. Бараулиной с соавт. [45, 46], которые также свидетельствовали о достоверном снижении ответа на стимуляцию митогеном ФГА у пациентов острым ИКБ, по сравнению со здоровыми донорами. В то же время, митоген-стимулированный пролифераливный ответ у больных хроническим боррелиозом оказался существенно выше, чем в контроле [113]. 110 Кроме того, в настоящем исследовании было установлено, что добавление в культуру мононуклеарных клеток, стимулированную корпускулярным антигеном боррелий B. garinii, ингибитора фагоцитоза цитохалазина D приводило к существенному подавлению апоптоза клеток, что свидетельствовало о тесной связи между фагоцитозом боррелий и гибелью клеток путем апоптоза. Современные исследования указывают на то, что некоторые бактерии, ранее считавшиеся, также как и боррелии, исключительно внеклеточными патогенами, оказались способны проникать внутрь клеток и индуцировать их апоптоз. Например, установлено, что грамотрицательная палочка Serratia marcescens, вызывающая нозокомиальную инфекцию, а также внеклеточнопаразитирующая грамположительная бактерия Corynebacterium diphtheriae обладают способностью проникать в эпителиальные клетки, что приводит к их апоптотической гибели [107, 158]. В различных исследованиях, помимо этого, было показано, что липопротеины микобактерий туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), возбудителя шигеллеза Shigella flexneri или лептоспироза Leptospira interrogans, по-видимому так же как и боррелий, индуцируют TLR2- опосредованный апоптоз макрофагов и моноцитов, стимулируют секрецию NO, ФНО- и FasL, а также повышают экспрессию рецепторов клеточной гибели – Fas и рецепторов фактора некроза опухоли TNFR1 и TNFR2 [189, 199, 216]. Живые или инактивированные нагреванием боррелии, но не их лизаты, в условиях in vitro активно фагоцитируются моноцитами и дендритными клетками [143, 209, 210]. В экспериментах S. Perticarari, [171], A.R. Cruz с соавт. [210] и S. Grygorczuk с соавт. [125] в условиях in vitro было показано, что фагоцитированные боррелии способны индуцировать активацию определенных программ в мононуклеарных клетках человека, которые приводят к усилению продукции провоспалительных цитокинов (ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-6 и ИЛ-1β) и вызывают дозозависимый апоптоз моноцитов и Т-клеток. Так же как и в проведенном нами исследовании, в работе M.W. Moore с соавт. (2007) было установлено, что подавление фагоцитоза боррелий с помощью цитохалазина D 111 предотвращало гибель мононуклеарных клеток и снижало продукцию провоспалительных цитокинов в супернатантах культур [209, 210]. A.R. Cruz с соавт. [210] было высказано предположение о том, что цитозольные сигналы, индуцированные фагоцитированными боррелиями, могут приводить как апоптозу, так и к активации клетки. По-видимому, выбор индивидуальной клеткой направления реакции в сторону апоптоза или пролиферации носит альтернативный характер и является вероятностным процессом, однако соотношение этих двух форм реакции может контролироваться внутриклеточными механизмами и подвергаться воздействию внешних по отношению к клетке факторов [4, 130, 235]. То обстоятельство, что соотношение между уровнем пролиферации и апоптоза лимфоцитов, варьирует в культурах полученных от разных людей, и изменяется при патологических процессах, позволяет говорить о том, что оно может характеризовать индивидуальные особенности иммунного ответа и его дисбаланс является важнейшей причиной развития вторичных иммунодефицитов и хронизации инфекционного процесса [63]. Апоптоз инфицированных иммуноцитов можно рассматривать как успешную стратегию иммунной системы, направленную на элиминацию возбудителя [222]. С другой стороны, ингибирование апоптоза в острый период инфекционного процесса, напротив, считается адаптивным механизмом, приводящим к повышению выживания патогенов и к усилению их диссеминации [222, 235]. В тоже время, известно, что в период разрешения воспаления, поврежденные или гиперстимулированные иммуноциты, такие как нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты, должны элиминироваться через апоптотические пути, что позволяет контролировать продолжительность острого ответа на патогенны и предотвращает развитие аутоиммунных реакций [130, 224]. В проведенном нами исследовании было установлено, что в отличие от острого периода болезни, у больных хроническим ИКБ стимуляция культур мононуклеарных клеток корпускулярным антигеном боррелий или неспецифическим митогеном приводила не только к усилению пролиферации клеток, 112 но и к существенному подавлению апоптоза этих клеток. В добавление к сказанному, нами было отмечено достоверное повышение числа пролиферирующих мононуклеарных клеток в S- и G2/M-фазах в нестимулированных (спонтанных) культурах, полученных от больных хроническим ИКБ, по сравнению с контрольной группой, что не было обнаружено в отношении реконвалесцентов. Не исключено, что это может свидетельствовать о присутствии в периферической крови больных хроническим ИКБ антигенов боррелий или каких-то других факторов, стимулирующих пролиферацию лимфоцитов. Известно, что Fas/CD95-рецепторы при хроническим боррелиозе экспрессированы на некоторых клетках синовиальной оболочки, включая макрофаги, дендритные клетки, фибробласты и лимфоциты [127, 155]. Хотя Fas/CD95-рецепторы традиционно рассматриваются как рецепторы, инициирующие апоптоз и активационно-индуцированную клеточную смерть (АИКС), проведенные в последние годы исследования показали, что в определенной ситуации их повышенная экспрессия может привести к активации ядерного фактора транскрипции NF-κB и к пролиферации Т-лимфоцитов, фибробластов и других клеток [127, 155, 195]. Показано, что при хроническом Лайм-артрите в дендритных клетках синовиальной оболочки повышена экспрессия c-FLIPL, белка Fas-ингибитора, что сопровождается не только резистентностью этих клеток к апоптозу (и АИКС), но и их активной пролиферацией, а стимуляция FasL дендритных клеток приводит к повышению продукции ИЛ-12, ФНО-α и других провоспалительных цитокинов [170, 238]. В исследованиях S. Grygorczuk с соавт. [67, 103, 125] установлено что, стимуляция митогеном или боррелиями культур мононуклеаров, полученных от больных хроническим Лайм-боррелиозом, приводит к подавлению апоптоза активированных Т-лимфоцитов, что может свидетельствовать о формировании персистентного воспалительного ответа. Кроме того, в группе больных острым ИКБ нами были выявлены значимые положительные корреляционные зависимости между значениями числа лимфоцитов, находящихся в состоянии апоптоза и уровнями спонтанной про- 113 дукции ИФН- и ФНО- в супернатантах соответствующих культур. В тоже время, в культурах, полученных нами от больных хроническим ИКБ, концентрации ИЛ-6 отрицательно коррелировали с уровнями апоптотически погибших клеток. Установлено, что ИЛ-6 может оказывать двоякое действие: при остром воспалении он выполняет защитную противовоспалительную функцию, однако при хроническом процессе скорее обладает провоспалительными свойствами [144]. В очагах хронического или аутоиммунного воспаления, в том числе и при боррелиозе, ИЛ-6 способствует аккумуляции мононуклеарных клеток и подавляет апоптоз активированных Т-лимфоцитов [79]. Показано, что фибробласты в очагах воспаления или в клетки, подвергнутые в условиях in vitro воздействию ЦЛТ грамотрицательных бактерий, имели признаки старения и фенотип, включающий постоянную активацию механизмов ответа на повреждение ДНК, в том числе образование фосфорилированного гистона γH2AX и экспрессию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 [75, 92]. В проведенном нами исследовании было также установлено, что стимуляция инактивированным корпускулярным антигеном боррелий или митогеном ФГА культур лимфоцитов, полученных от больных острым или хроническим ИКБ, приводит к значительному повышению секреции клетками провоспалительных цитокинов – ИФН-γ, ФНО- и ИЛ-6 по сравнению с соответствующими показателями в группах контроля и реконвалесцентов, при одновременном подавлении продукции противовоспалительного цитокина – ИЛ-4 в ответ на стимуляцию клеток корпускулярным антигеном боррелий у больных хроническим ИКБ, что могло свидетельствовать о доминировании ответа Т-хелперов типа 1. В исследовании О.В. Воронковой с соавт. [11] также было выявлено существенное повышение базальной и митоген-стимулированной продукции культурой мононуклеарных клеток периферической крови больных острым ИКБ провоспалительного цитокина ФНО-, который обладает проапоптотическим эффектом, усиливает адгезивную способность нейтрофилов и моноцитов, фагоцитоз бактерий и О2-зависимый путь их киллинга [201]. 114 Установлено, что как живые, так и инактивированные нагреванием боррелии различных видов (B. burgdorferi: sensu stricto, B. garinii и B. afzelii), добавленные в культуры мононуклеарных клеток периферической крови больных острым боррелиозом, уже в первые 4-12 ч инкубации индуцировали повышенные уровни секреции провоспалительных цитокинов, таких как ИФН-γ, ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНО-α [81, 148, 215]. По данным большинства зарубежных исследователей у больных острым и хроническим Лайм-боррелиозом было отмечено существенное повышение спонтанной и антиген-стимулированной секреции ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-6 мононуклеарными клетками периферической крови в условиях in vitro [81, 113], а также накопление этих цитокинов в жидкости кожного окна в области кольцевидной мигрирующей эритемы больных острым боррелиозом [167]. С другой стороны, в период выздоровления было отмечено повышение продукции ИЛ-4 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе [81, 148]. По результатам российских исследователей, в сыворотке крови больных острым ИКБ отмечался высокий уровень концентраций цитокинов ИФН-γ, ИФН-, ФНО-, ИЛ-2 и ИЛ-6, уровни которых в динамике при выздоровлении существенно снижались [5, 17, 24, 36, 39, 47, 62]. Вместе с тем, в работах некоторых отечественных авторов, которые изучали динамику продукции цитокинов в условиях in vitro у больных ИКБ были получены результаты, противоречащие нашим данным. У пациентов с тенденцией к хронизации ИКБ показатели спонтанной и ФГА-стимулированной продукции ИЛ-4, оказались достоверно выше, а провоспалительного цитокина – ИФН-γ были существенно ниже, по сравнению со значениями аналогичных параметров у пациентов с выздоровлением ИКБ после перенесенного острого ИКБ, что, по мнению авторов, вероятно, являлось отражением активного участия в ответе Т-хелперов типа 2 [23, 45, 46, 49]. Не исключено, что подобные различия между полученными результатами могут быть связаны с тем, что в нашей работе, в отличие от исследований, проведенных А.С. Бараулиной с со- 115 авт. [45, 46, 49], в качестве стимулятора мононуклеарных клеток был использован корпускулярный антиген боррелий B. garinii, а не их ультразвуковой лизат. Считается, что активный ответ с участием Т-хелперов типа 1 и с высокой продукцией ИФН-γ наиболее характерен для всех внутриклеточных или фагоцитируемых патогенов, включая вирусы, некоторые бактерии и простейшие [228]. Вместе с тем, освобождение организма от этих возбудителей, как правило, сопровождается снижением антигенной стимуляции, что приводит к переключению на ответ Т-хелперов типа 2, который стимулируется продукцией ИЛ-4, что позволяет снизить риск связанного с провоспалительными цитокинами повреждения тканей [228]. Несмотря на это, в тех случаях, когда ответ Т-хелперов типа 1 не в состоянии привести к полной элиминации возбудителя, сохраняющаяся персистентная антигенная стимуляция в дальнейшем может индуцировать хронизацию провоспалительного ответа, который сопровождается повреждением тканей и органов. В случае ИКБ такого рода хроническая антигенная персистентная стимуляция может быть связана с сохранением цистных форм боррелий [83]. 116 ВЫВОДЫ 1. Острый и хронический иксодовый клещевой боррелиоз сопровождается существенным повышением уровней лимфоцитов периферической крови с различными типами кариопатологических изменений, включая микроядра, патологию митоза, структурные аберрации хромосом преимущественно хроматидного типа, анеуплоидию и полиплоидию, которые прямо зависели от уровней показателя активации перекисного окисления липидов малонового диальдегида. 2. Особенностями острого иксодового клещевого боррелиоза являются появление значительного числа лимфоцитов периферической крови с аномально увеличенной вторичной перетяжкой в околоцентромерном районе хромосомы 9 («маркерная» хромосома), а также сочетание существенного увеличения уровней клеток, имеющих кариопатологические изменения и находящихся в состоянии апоптоза, со слабовыраженной их пролиферацией в ответ на стимуляцию неспецифическим митогеном, но с активным пролиферативным ответом этих клеток на специфический корпускулярный антиген боррелий. 3. Для хронического иксодового клещевого боррелиоза, в отличие от острой формы болезни, характерен существенный рост как спонтанного, так и стимулированного неспецифическим митогеном или специфическим корпускулярным антигеном боррелий пролиферативного ответа мононуклеарных клеток периферической крови, при одновременном значительно выраженном подавлении их апоптоза, частота которого отрицательно коррелирует с числом лимфоцитов с кариопатологией. 4. Корпускулярный антиген боррелий Borrelia garinii в культурах мононуклеарных клеток здоровых доноров в условиях in vitro индуцирует дозозависимый апоптоз, появление того же спектра кариопатологических изменений, что и в клетках периферической крови больных острым иксодовым клещевым боррелиозом, а также доминирование секреции про- 117 воспалительных цитокинов (интерферона- и фактора некроза опухоли). 5. У больных острым иксодовым клещевым боррелиозом в культурах мононуклеарных клеток число клеток, находящихся в состоянии апоптоза, уровни лимфоцитов с кариопатологическими изменениями, а также концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови прямо зависили от активной секреции провоспалительных цитокинов. 118 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ АГ – антиген АИКС – активационно-индуцированная клеточная смерть (activation-induced cell death, AICD) АТФ – аденозинтрифосфат БДУ – бромдезоксиуридин ГНЭ – 4-гидрокси-2-нонэнал ДМСО – диметилсульфоксид ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИКБ – иксодовый клещевой боррелиоз ИЛ-1β – интерлейкин-1β ИЛ-2 – интерлейкин-2 ИЛ-4 - интерлейкин-4 ИЛ-6 – интерлейкин-6 ИЛ-12 – интерлейкин-12 ИФА – иммуноферментный анализ ИФН-β – интерферон-β ИФН-γ – интерферон-γ МДА – малоновый диальдегид НАД – никотинамид ПОЛ – перекисное окисление липидов ПЦР – полимеразная цепная реакция РБТЛ – реакция бласттрансформации ФГА – фитогемагглютинин ФИТЦ – флуоресцеин изотиоцианат ФНО-α – фактор некроза опухоли-α (TNF-α) ЦЛТ – цитолетальный токсин ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота 7-ААD – 7-амино-актиномицин D 119 Cdk – циклин-зависимые киназы c-FLIP – клеточный FADD-подобный ИЛ-1β-конвертирующий ферментингибиторный протеин; cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1-βconverting enzyme-inhibitory protein Cyc – белки-циклины DISC – апоптоз-индуцирующий сигнальный комплекс (death-inducing signal complex) FADD – Fas-ассоциированные с доменами смерти протеины (Fas-associated death domain protein) Fas/ FasL – Fas-рецепторы/Fas лиганды H2O2 – пероксид водорода HSF1 – транскрипционный фактор теплового шока 1 (heat shock transcription factor 1) IgM и IgG – иммуноглобулины классов M и G iNOS – индуцибельная синтаза оксида азота NF-κB – ядерный фактор-каппа В (nuclear factor-kappa B) NO – оксида азота O2- – супероксид-анион радикал OH- – гидроксильный радикал PARP – поли(АДФ)рибозилтрансфераза TCR – Т-клеточные рецепторы TLR – Толл-подобный рецептор (Toll-like receptor) TNFR – рецепторы фактора некроза опухоли TRADD – фактор некроза опухоли рецептор-ассоциированные с доменами смерти протеины (TNFR-receptor associated death domain protein) 120 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алов, И.А. Морфологические и прикладные аспекты патологии митоза / И. А. Алов // Архив патологии. – 1975. – Т. 37, № 12. – С. 3-14. 2. Анджапаридзе, О. Г. Персистенция вирусов / О. Г. Анджапаридзе, Ю. С. Борискин – М.: Медицина, 1984. – 254 с. 3. Анджапаридзе, О. Г. Роль клетки-хозяина при персистенции вирусов / О. Г. Анджапаридзе, Н. Н. Богомолова, Ю. С. Борискин // Вопросы вирусологии. – 1981. – №4. – С. 394-398. 4. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию / М. Ф. Никонова, М. М. Литвинова, А. А. Варфоломеева и др. // Иммунология. – 1999. – №2. – С. 20-23. 5. Бабаева, Л. В. Иммунный статус и кариопатические изменения лимфоцитов при иксодовом клещевом боррелиозе и инфекции-микст: автореф. дис. … канд. мед. наук / Л. В. Бабаева. – М., 2005. – 18 с. 6. Брюне, Б. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути / Б. Брюне, К. Сандау, А. фон Кнетен // Биохимия. – 1998. – Т. 63, №7. – С. 967-975. 7. Бужиевская, Т. И. Вирусиндуцированный мутагенез в клетках млекопитающих / Т. И. Бужиевская. – Киев: Наукова Думка, 1984. – 136 с. 8. Владимиров, Ю. А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков – М.: Наука, 1972. – 252с. 9. Водейко, Л. П. Эффективность применения антиоксидантных препаратов в комплексной терапии гриппа: автореф. дис. … канд. мед. наук / Л.П. Водейко. – СПб., 2000. – 21 с. 10. Волков, В. Т. Клиническое значение мембранодестабилизирующих процессов при сальмонеллезе: автореф. дис. … канд. мед. наук / В. Т. Волков. – СПб., 2002. – 22 с. 11. Воронкова, О. В. Характеристика нейтрофильного и моноцитарного паттерна периферической крови при иксодовом клещевом боррелиозе / О. В. 121 Воронкова, Н. П. Пирогова, В. В. Новицкий // Бюллетень СО РАМН. – 2003. – №1. – С. 28-37. 12. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – М.: Практика, 1998. – 459 с. 13. Гольдберг, Е. Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, В. П. Шахов – Томск: Изд-во Томского ун-та, 1992. – 272 с. 14. Жукова, О. Б. Нарушения иммунофенотипического и цитогенетического статуса лимфоцитов периферической крови при персистенции вирусов клещевого энцефалита и гепатитов В, С: автореф. дис. … канд. мед. наук / О. Б. Жукова. – Томск, 2000. – 18 с. 15. Засухина, Г. Д. Молекулярно-генетические механизмы патогенеза заболеваний человека, связанные с нарушениями процессов репарации повреждений ДНК / Г. Д. Засухина // Архив патологии. – 1987. – №1. – С. 3-9. 16. Засухина, Г. Д. Мутагенез, антимутагенез и репарация ДНК / Г. Д. Засухина, Т. А. Синелыцикова // Вестник РАМН. – 1993. – №1. – С. 9-14. 17. Значение цитокинового статуса в изучении иммунопатогенеза инфекционных болезней / В. А. Иванис, Е. В. Маркелова, Л. Ф. Скляр и др. // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2004. – №2. – С. 36-39. 18. Ильинских, Н. Н. Цитогенетический анализ последствий инфекционных заболеваний и вакцинаций в связи с иммунореактивностью организма: автореф. дис. … д-ра биол. наук / Н. Н. Ильинских. Ленинград, 1984. – 44 с. 19. Инфекционная кариопатология / под ред. Н.Н. Ильинских. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2005. – 168 с. 20. Керкис, Ю. Я. Гуморальные факторы естественного мутагенеза у млекопитающих и человека / Ю. Я. Керкис, С. В. Скорова // Итоги научных работ Института цитологии и генетики СО АН СССР. – 1973. – С. 22-23. 21. Китаева, Л. В. Цитогенетические нарушения в слизистой оболочке фундального отдела желудка у пациентов с хроническим гастритом / Л. В. Китаева // Экологическая генетика. – 2010. – Т. 8, №1. – С. 36-41. 22. Ковальчук, Л. В. Апоптогенные механизмы возникновения иммунодефи- 122 цитных заболеваний / Л. В. Ковальчук, А. Н. Чередеев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1999. – №5. – С. 47-52. 23. Колчина, А. С. Иммунопатогенетические основы хронизации иксодового клещевого боррелиоза : автореф. дис. ... канд. мед. наук / А. С. Колчина. – Томск, 2010. – 24 с. 24. Конькова-Рейдман, А. Б. Эпидемиологическая и клинико- иммунологическая характеристика иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с клещевым энцефалитом) в Южно-Уральском регионе России: автореф. дис. ... д-ра мед. наук / А. Б. Конькова-Рейдман. – Омск, 2011. – 43 с. 25. Кощевец, Е. С. Коррекция фенюльсом анемического синдрома и процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах при клещевых нейроинфекциях: автореф. дис. … канд. биол. наук / Е. С. Кощевец. – Томск, 2002. – 24 с. 26. Кравченко, И. Э. Клинико-иммунологический статус при ангине и его коррекция препаратом ксимедоном / И. Э. Кравченко, В. Х. Фазылов, О. Д. Зинкевич и др. // Казанский медицинский журнал. – 2004. – Т. 85, № 3. – С. 68-174. 27. Кравченко, И. Э. Патогенетическое обоснование и терапевтическая коррекция нестабильности клеточного генома при ангине как стрептококковой инфекции (клинико-экспериментальное исследование): автореф. … д-ра мед. наук / И. Э. Кравченко. – М., 2011. – 24 с. 28. Кударина, М.И. Морфология кожных проявлений болезни Лайма/ М.И. Кударина, Л.П. Ананьева, Л.А. Макаренко // Архив патологии. – 2001. – Т. 63, №3. – С. 50-52. 29. Кузьмина, Е. И. Перекисное окисление липидов и резистентность эритроцитов у детей, больных дифтерией / Е. И. Кузьмина, И. В. Орлов, В. В. Краснов // Российский педиатрический журнал. – 2001. – №2. – С. 21-24. 30. Кучерова, Н. П. Хромосомные изменения у больных гриппом / Н. П. Кучерова, Т. Ф. Бышовец, Л. Ю. Спектор // Микробиол. журн. – 1972. – №1. – 123 С. 45-47. 31. Лакин, Г. Ф. Биометрия: Учебное пособие для биол. спец. вузов — 4-е изд., перераб. и доп. / Г. Ф. Лакин. — М.: Высш. шк., 1990. — 352 с. 32. Лобзин, Ю. В. Лайм-боррелиоз (иксодовые клещевые боррелиозы) / Ю. В. Лобзин, А. Н. Усков, С. С. Козлов. – СПб.: Фолиант, 2000. – 160 с. 33. Любезнова, О. Н. Клинико-эпидемиологические особенности и перекисное окисление липидов при иксодовом клещевом боррелиозе / О. Н. Любезнова, С. А. Караваев // Сборник научных статей, тезисов, сообщений 57-й научной конференции молодых ученых и студентов. – 2002. – С. 105-106. 34. Любезнова, О. Н. Состояние процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при хроническом Лайм-боррелиозе / О. Н. Любезнова, С. А. Караваев // Сборник материалов Пироговской конференции студентов и молодых ученых. – М., 2004. – Т. 34, №3. – С. 18. 35. Маеда, X. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке / Х. Маеда, Т. Акаике // Биохимия. – 1998. – Т. 63, №7. – С. 10071019. 36. Мандракова, H. B. Оценка некоторых иммунологических параметров у больных иксодовым клещевым боррелиозом в Приморском крае / Н. В. Мандракова, А. И. Симакова, В. А. Иванис // Дальневосточ. мед. журн. – 2005. – №1. – С. 15-19. 37. Мандракова, Н. В. Клинико-иммунологические особенности течения острого иксодового клещевого боррелиоза в Приморском крае : автореф. дис. … канд. мед. наук. / Н. В. Мандракова. – Владивосток, 2005. – 20 с. 38. Микроядерный анализ в оценке цитогенетической нестабильности / под ред. Н.Н. Ильинских – Томск: Издательство ТГПУ, 2011. – 312 с. 39. Миноранская, Н. С. Системный цитокиновый ответ при боррелиозной инфекции / Н. С. Миноранская, Е. И. Миноранская // Журнал инфе кционной патологии. – 2010. – Т. 17, №3. – С. 98-99. 40. Мустафин, И. Г. Роль апоптоза лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-инфекции: автореф. дис. … д-ра мед. наук / И. Г. Мустафин. – Казань, 2005. – 28 с. 124 41. Нагоев, Б. С. Роль системы антиоксидантной защиты организма в патогенезе острых вирусных гепатитов / Б. С. Нагоев, М. Р. Иванова // Терапевтический архив. – 2003. – Т. 75, №11. – С. 15-16. 42. Назаренко, С.А. Тест-система внешнего контроля качества цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы: пособие для врачей / С.А. Назаренко, Е.О. Васильева. – Томск: «Печатная мануфактура», 2003. – 34 с. 43. Невницкий, Л. А. Программированная гибель клеток и апоптоз: значение для развития и функционирования иммунной системы / Л. А. Невницкий // Вестник РАМН. – 1998. – №6. – С. 43-50. 44. Норкин, М. Н. Роль апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойносептических заболеваний / М. Н. Норкин, О. Ю. Леплина // Медицинская иммунология. – 2000. – Т. 2, №1. – С. 35-42. 45. Особенности антиген-стимулированной цитокинопродукции в культуре клеток периферической крови пациентов с иксодовым клещевым боррелиозом / А. С. Бараулина, А. В. Черников, Е. Н. Кологривова и др. // Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т. 23, №3. – Выпуск 1. – С. 83. 46. Особенности продукции цитокинов при хронизации иксодового клещевого боррелиоза / А. С. Бараулина, Е. Н. Кологривова, О. Б. Жукова, и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2010. – №1. – С. 21-25. 47. Особенности содержания цитокинов в сыворотке крови больных иксодовым клещевым боррелиозом с различными клиническими проявлениями / О. А. Бургасова, А. Н. Усков, Н. Е. Гринченко и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. – №3. – С. 67-71. 48. Оценка цитогенетических изменений крови у больных туберкулезом легких / А. И. Ковязина, Л. И. Нузберг, К. Н. Яковенко и др. // Проблемы туберкулеза. – 1981. – № 7. – С. 13. 49. Признаки иммунной недостаточности у больных с иксодовым клещевым боррелиозом / А. С. Бараулина, Е. Н. Кологривова, Н. А. Пронина, B. C. и 125 др. // Российский аллергологический журнал. – 2008. – №1. – Прил. 1. – С. 30-31. 50. Прозоровский, С. В. Медицинская микоплазмология / С. И. Прозоровский, И. В. Раковская, Ю. В. Вульфович. – М.: Медицина, 1998. – 288 с. 51. Прокофьева-Бельговская, А. А. Гетерохроматические районы хромосом / А. А. Прокофьева-Бельговская. – М.: Наука, 1986. – 430 с. 52. Раковская, И.В. Микоплазмы человека и микоплазменные инфекции: лекция Ч.1 / И. В. Раковская // Клиническая лабораторная диагностика. – 2005. – №2. – С.25-32. 53. Роль оксида азота в генезе системных нарушений при инфекционной патологии /Л. И. Ратникова, В. А. Елисеев, С. А. Шип и др. // Журнал инфектологии. – 2010. – Т. 2, №4. – С. 101-102. 54. Рябченко, А. В. Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств: автореф. дис. … канд. мед. наук. / А. В. Рябченко – Новосибирск, 2009. – 21с. 55. Самойлина, Н. Л. Морфологический метод оценки бластной трансформации лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином / Н. Л. Самойлина // Лаб. дело. – 1970. – №8. – С. 455-463. 56. Семёнов, В. В. Нестабильность генома человека при вирусных заболеваниях и вакцинациях / В. В. Семёнов, Е. С. Кошпаева // Казанский медицинский журнал. – 2008. – Т. 89, №6. – С. 815-820. 57. Скорова, С. В. Влияние иммунологических реакций организма на частоту структурных мутаций хромосом: автореф. дис. … канд. биол. наук. / С. В. Скорова – Новосибирск, 1982. – 24 с. 58. Состояние некоторых показателей прооксидантной и антиоксидантной систем крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом с фоновым хроническим описторхозом / Л. В. Лукашова, А. М. Бортникова, Н. Г. Жукова и др. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции с 126 международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций». – Кемерово, 2008. – №5. – С. 101-102. 59. Спонтанный уровень хромосомных аберраций в культуре лейкоцитов человека / Н. П. Бочков, В. М. Козлов, Р. А. Пилосов и др. // Генетика. – 1968. – № 6. С. 196-198. 60. Фролов, А. К. Цитогенетические изменения в лимфоцитах периферической крови и иммунитет у больных брюшным тифом и хронических бактерионосителей / А. К. Фролов // Цитология и генетика. – 1996. – Т. 13, № 5. – С. 361-365. 61. Цитогенетический статус и фенотипические свойства лимфоцитов периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом / Н. П. Пирогова, В. В. Новицкий, М. Ю. Хлусова и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2005. – №3. – С. 43-48. 62. Цитокиновый профиль у больных с иксодовым клещевым боррелиозом / А. И. Симакова, Н. В. Мандракова, Е. В. Маркелова и др. // Цитокины и воспаление. – 2004. – Т3, №4. – С. 21-24. 63. Ярилин, А. А. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных / А. А. Ярилин, М. Ф. Никонова // Медицинская иммунология. – 2000. – Т. 2, №1. – С. 7-16. 64. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion / D. M. Duelli, H. M. Padilla-Nash, D. Berman et al. //Curr. Biol. – 2007. – Vol. 17, N5. – P. 431-437. 65. Activation of human monocyte – derived macrophages by interferon gamma is accompanied by increase of poly(ADP-ribose) polymerase activity / G. Berton, C. Sorio, C. Laudanna et al. // Biochim Biophys Acta. – 1991. – Vol. 1091, N1. – P. 101-109. 66. Activation of the DNA damage checkpoint and genomic instability in human precancerous lesions / V.G. Gorgoulis, L.V. Vassiliou, P. Karakaidos et al. // Nature. – 2005. – Vol. 434. N7035. – P. 907-913. 127 67. Activity of the caspase-3 in the culture of peripheral blood mononuclear cells stimulated with Borrelia burgdorferi antigens / S. Grygorczuk, J. Zajkowska, A. Panasiuk et al. // Przegl. Epidemiol. – 2008. – Vol. 62, N1. – P. 85-91. 68. Aderem, A. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response / A. Aderem, R. J. Ulevitch // Nature. – 2000. – Vol. 406, N6797. – P. 782-787. 69. Agarwal, S. Tumor necrosis factor-mediated cytotoxicity involves ADP- ribosylation / S. Agarwal, B. E. Drysdale, H. S. Shin // J. Immunol. – 1988 – Vol. 140, N12. – P. 4187-4192. 70. Analysis of gene expression patterns and chromosomal changes associated with aging /J. Geigl, S. Langer, S. Barwisch et al. // Cancer Res. – 2004. – Vol. 64, N23. – P. 8550-8557. 71. Anckar, J. Regulation of HSF1 function in the heat stress response: implications in aging and disease / J. Anckar, L. Sistonen // Annu Rev Biochem. – 2011. – Vol. 80. – P. 1089-1115. 72. Apoptosis Regulators Fas and Bim Cooperate in Shutdown of Chronic Immune Responses and Prevention of Autoimmunity / P.D. Hughes, G. T. Belz, K.A. Fortner et al. // Immunity. – 2008. – Vol. 28, №2. – P. 197-205. 73. Apoptosis regulators Fas and Bim synergistically control T-lymphocyte homeostatic proliferation / K. A. Fortner, P. Bouillet, A. Strasser et al. // Eur. J. Immunol. – 2010. – Vol. 40, N11. – P. 3043-3053. 74. Aula, P. Virus-associated chromosome breakage. A cytogenetic study of chickenpox, measles and mumps patients and of cells cultures infected with measles virus / P. Aula // Ann. Acad. Sci. Penn. 1965. – Vol. 82. – P. 64-75. 75. Bacterial intoxication evokes cellular senescence with persistent DNA damage and cytokine signaling / H. Blazkova, K. Krejcikova, P. Moudry et al. // J. Cell Mol. Med. – 2010. – Vol. 14, N1-2. – P. 357-367. 76. Bacterial pathogens modulate an apoptosis differentiation program in human neutrophils / S. D. Kobayashi, K. R. Braughton, A. R. Whitney et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol. 100, N19. – P. 10948-10953. 128 77. Ben-Porath, I. When cells get stressed: An integrative view of cellular senescence / I. Ben-Porath, R. Weinberg // J. Clin. Invest. – 2004. – Vol. 113. – P. 813. 78. Biomarkers / H. R. Griffiths, L. Møller, G. Bartosz et al. // Mol Aspects Med. – 2002. – Vol. 23, N1-3. – P. 101-208. 79. Blockade of interleukin 6 trans signaling suppresses T-cell resistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation: evidence in Crohn disease and experimental colitis in vivo / R. Atreya, J. Mudter, S. Finotto et al. // Nat. Med. – 2000. – Vol. 6, N5. – P. 583-588. 80. Borrelia burgdorferi potently activates bone marrow-derived conventional dendritic cells for production of IL-23 required for IL-17 release by T cells / J. Knauer, S. Siegemund, U. Müller et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. – 2007. – Vol. 49, N3. – P. 353-363. 81. Borrelia-specific interferon-gamma and interleukin-4 secretion in cerebrospinal fluid and blood during Lyme borreliosis in humans: association with clinical outcome / M. Widhe, S. Jarefors, C. Ekerfelt et al. // J. Infect. Dis. – 2004. – Vol. 189, N10. – P. 1881-1891. 82. Brodsky, W. Cell polyploidy: its relation to tissue growth and function / W. Brodsky, I. V. Uryvaeva // Int. Rev. Cytol. 1977. – Vol. 50. – P. 275-332. 83. Brorson, O. Transformation of cystic forms of Borrelia burgdorferi to normal, mobile spirochetes / O. Brorson, S. H. Brorson // Infection. – 1997. – Vol. 25, N4. – P. 240-246. 84. Brumell, J. H. Role of lipid-mediated signal transduction in bacterial internalization / J. H. Brumell, S. Grinstein // Cell Microbiol. – 2003. – Vol. 5, N5. – P. 287-297. 85. Bruner, S. D. Structural basis for recognition and repair of the endogenous mutagen 8-oxoguanine in DNA / S. D. Bruner, P. G. Normand, G. L. Verdine // Nature. – 2000. – Vol. 403, N6772. – P. 859-866. 129 86. Bryant, P. E. Progress towards understanding the nature of chromatid breakage / P. E. Bryant, L. J. Gray, N. Peresse // Cytogenet Genome Res. – 2004. – Vol. 104, N1-4. – P. 65-71. 87. Bryant, P. E. Repair and chromosomal damage / P. E. Bryant // Radiother. Oncol. – 2004. – Vol. 72, N3. – P. 251-256. 88. Budd, R. C. Activation-induced cell death / R. C. Budd // Curr Opin Immunol. – 2001. – Vol. 13, N3. – P. 356-362. 89. Budd, R. C. Death receptors couple to both cell proliferation and apoptosis / R. C. Budd // J. Clin. Invest. – 2002. – Vol. 109, N4. – P. 437-442. 90. Cell cycle control of centromeric repeat transcription and heterochromatin assembly / E. S. Chen, K. Zhang, E. Nicolas et al. // Nature. – 2008. – Vol. 451, N7179. – P. 734-737. 91. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: A new end to a known pathway / L. Guerra, K. Teter, B. N. et al. // Cell Microbiol. – 2005. – Vol. 7. – P. 921-934. 92. Cellular senescence: a link between cancer and age-related degenerative disease? / J. Campisi, J. K. Andersen, P. Kapahi et al. // Semin Cancer Biol. – 2011. – Vol. 21, N6. – P. 354-359. 93. Chan, F. L. Transcription in the maintenance of centromere chromatin identity / F. L. Chan, L. H. Wong // Nucleic Acids Res. – 2012. – Vol. 40, N22. – P. 11178-11188. 94. Characterization of soluble FAS, FAS ligand and tumour necrosis factor – alpha in patients with chronic HCV infection / S. Raghuraman, P. Abraham, H. D. Daniel et al. // J. Clin. Virol. – 2005. – Vol. 34, N1. – P. 63-70. 95. Characterization of the expanded T cell population in infectious mononucleosis: apoptosis, expression of apoptosis-related genes, and Epstein–Barr virus (EBV) status / C. S. Verbeke, U. Wenthe, W. F. Bergler et al. // Clin. Exp. Immunol. – 2000. – Vol. 120, N2. – P. 294-300. 130 96. Chmielewski, T. Inhibition of fibroblast apoptosis by Borrelia afzelii, Coxiella burnetii and Bartonella henselae / T. Chmielewski, S. Tylewska-Wierzbanowska // Pol. J. Microbiol. – 2011. – Vol. 60, N3. – P. 269-272. 97. Chow, J. DNA damage and polyploidization / J. Chow, R. Y. Poon // Adv. Exp. Med. Biol. – 2010. – Vol. 676. – P. 57-71. 98. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood / P. S. Moorhead, P. C. Nowel, W. J. Mellman et al. // Exp. Cell Res. – 1960. – Vol. 20. – P. 613-616. 99. Chronic exposure to the cytolethal distending toxins of Gram-negative bacteria promotes genomic instability and altered DNA damage response / R. Guidi, L. Guerra, L. Levi et al. // Cell Microbiol. – 2013. –Vol. 15, N 1. – P. 98-113. 100. Chronic Helicobacter pylori infections induce gastric mutations in mice / E. Touati, V. Michel, J.M. Thiberge et al. // Gastroenterology. – 2003. – Vol. 124, N5. P.1408-1419. 101. Ciccia, A. The DNA damage response: making it safe to play with knives / A. Ciccia, S. J. Elledge // Mol. Cell. – 2010. – Vol. 40, N2. – P. 179-204. 102. Coevolution of markers of innate and adaptive immunity in skin and peripheral blood of patients with erythema migrans / J. C. Salazar, C. D. Pope, T. J. Sellati et al. // J. Immunol. – 2003. – Vol. 171, N5. – P. 2660-2670. 103. Concentration of sFas and sFasL in the supernatant of PBMC culture from the patients with late lyme borreliosis / S. Grygorczuk, T. Chmielewski, J. Zajkowska et al. // Przegl. Epidemiol. – 2007. – Vol. 61, N1. – P. 51-58. 104. Control of Borrelia burgdorferi-specific CD4+-T-cell effector function by interleukin-12 and T-cell receptor-induced p38 mitogen - activated protein kinase activity / M. N. Hedrick, C. M. Olson, D. B. Conze et al. // Infect. Immun. – 2006. – Vol. 74, N10. – P. 5713-5717. 105. Correlation of clinical phenotype with a pericentric inversion of chromosome 9 and genetic counseling /O. Demirhan, A. Pazarbasi, D. Suleymanova-Karahan et al. // Saudi. Med. J. – 2008. – Vol. 29, N7. Р. 946-951. 131 106. Cortes-Bratti, X. The cytolethal distending toxins induce DNA damage and cell cycle arrest / X. Cortes-Bratti, T. Frisan, M. Thelestam // Toxicon. – 2001. – Vol. 39, N11. – P. 1729-1736. 107. Corynebacterium diphtheriae 67-72p hemagglutinin, characterized as the protein DIP0733, contributes to invasion and induction of apoptosis in HEp- 2 cells / P. S. Sabbadini, M. C. Assis, E. Trost et al. // Microb Pathog. – 2012. – Vol. 52, N3. – P. 165-176. 108. Coussens, L. M. Inflammation and cancer / L. M. Coussens, Z. Werb // Nature. – 2002. – Vol. 420, N6917. – P. 860-867. 109. Critical roles for polymerase zeta in cellular tolerance to nitric oxide – induced DNA damage / X. Wu, K. Takenaka, E. Sonoda et al. // Cancer Research. – 2006. – Vol. 66, N2. – P. 748-754. 110. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy / C. Vogel, A. Kienitz, I. Hofmann et al. // Oncogene. – 2004. – Vol. 23. – P. 6845-6853. 111. Cytolethal distending toxin demonstrates genotoxic activity in a yeast model / D. C. Hassane, R. B. Lee, M. D. Mendenhall et al. // Infect. Immun. – 2001. – Vol. 69. – P. 5752-5759. 112. Davoli, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer / T. Davoli, T. de Lange // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. – 2011. – Vol. 27. – P. 585-610. 113. Decreased interleukin-4 and increased gamma interferon production by peripheral blood mononuclear cells of patients with Lyme borreliosis / J. Oksi, J. Savolainen, J. Pène et al. // Infect. Immun. – 1996. – Vol. 64, N9. – P. 3620-3623. 114. Delivery of cytolethal distending toxin B induces cell cycle arrest and apoptosis in gingival squamous cell carcinoma in vitro / K. Yamamoto, K. Tominaga, M. Sukedai et al. // Eur. J. Oral. Sci. – 2004. – Vol. 112. – P. 445-451. 115. Demonstration of antigen-specific T cells and histopathological alterations in mice experimentally inoculated with Borrelia burgdorferi / U. E. Schaible, M. D. Kramer, C. W. Justus // Infect. Immun. – 1989. – Vol. 57, N1. – P. 41-47. 132 116. Direct regulation of the centrosome duplication cycle by the p53-p21Waf1 /Cip1 pathway / P. Tarapore, H. F. Horn, Y. Tokuyama et al. // Oncogene. – 2001. – Vol. 20. – P. 3173-3184. 117. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon carcinogenesis in mice / L.B. Meira, J.M. Bugni, S.L. Green et al. // J Clin Invest. – 2008. –Vol. 118, N 7. P. 2516-2525. 118. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis / J. Bartkova, Z. Horejsí, K. Koed et al. // Nature. – 2005. – Vol. 434, N7035. – P. 864-870. 119. Dorward, D. W. Invasion and cytopathic killing of human lymphocytes by spirochetes causing Lyme disease / D. W. Dorward, E. R. Fischer, D. M. Brooks // Clin. Infect. Dis. – 1997. – Vol. 25, N1. – P. 2-8. 120. D'Souza, D. Cytogenetic studies in leprosy patients before and after chemotherapy / D. D'Souza, B. C. Das, I. M. Thomas // Hum. Genet. – 1991. – Vol. 87, N 6. – P 665-670. 121. Ekwall, K. Epigenetic control of centromere behavior / K. Ekwall // Annu. Rev. Genet. – 2007. – Vol. 41. – P. 63-81. 122. Escherichia coli induces DNA damage in vivo and triggers genomic instability in mammalian cells / G. Cuevas-Ramos, C. R. Petit, I. Marcq et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2010. – Vol. 107, N25. – P. 11537-11542. 123. Escherichia coli induces DNA double – strand breaks in eukaryotic cells / J. P. Nougayrede, S. Homburg, F. Taieb et al. // Science. – 2006. – Vol. 313. – P. 848-851. 124. Evaluation of four methods of DNA distribution data analysis based on bromdeoxyuridine / DNA bivariante data / Lacombe F., Beloc F., Bernard P. et al. // Cytometry. – 1988. – Vol. 9, N 3. – P. 245-253. 125. Expression of Fas receptor on human T lymphocytes under stimulation with Borrelia burgdorferi sensu lato – preliminary results / S. Grygorczuk, J. Osada, R. Swierzbińska et al. // Adv. Med. Sci. – 2010. – Vol. 55, N2. – P. 228-234. 133 126. Fas (CD95)-Fas ligand interactions are responsible for monocyte apoptosis occurring as a result of phagocytosis and killing of Staphylococcus aureus / J. Baran, K. Weglarczyk, M. Mysiak et al. // Infect. Immun. – 2001. – Vol. 69, N3. – P. 1287-1297. 127. Fas ligand deficiency impairs host inflammatory response against infection with the spirochete Borrelia burgdorferi / C. Shi, J. Wolfe, J. Q. Russell et al. // Infect. Immun. – 2006. – Vol. 74, N2. – P. 1156-1160. 128. Février, M. CD4+ T cell depletion in human immunodeficiency virus (HIV) infection: role of apoptosis / M. Février, K. Dorgham, A. Rebollo // Viruses. – 2011. – Vol. 3, N5. – P. 586-612. 129. Fialkow, L. Reactive oxygen and nitrogen species as signaling molecules regulating neutrophil function / L. Fialkow, Y. Wang, G. P. Downey // Free Radic Biol. Med. – 2007. – Vol. 42, N2. – P. 153-164. 130. Fortner, K. A.The death receptor Fas (CD95 /APO-1) mediates the deletion of T lymphocytes undergoing homeostatic proliferation / K. A. Fortner, R. C. Budd // J. Immunol. – 2005. – Vol. 175, N7. – P. 4374-4382. 131. Gabay, C. Interleukin-6 and chronic inflammation / C. Gabay // Arthritis Res. Ther. – 2006. Vol. 8, N2. – P 3. 132. Gal, A. Mutagenesis associated with nitric oxide production in transgenic SJL mice (mutationytransgenic miceypUR288) / A. Gal, G. N. Wogan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – Vol. 93. – P. 15102-15107. 133. Gasser, A. Generation of multinucleated giant cells in vitro by culture of human monocytes with Mycobacterium bovis BCG in combination with cytokine – containing supernatants / A. Gasser, J. Möst // Infect. Immun. – 1999. – Vol. 67, N1. – P. 395-402. 134. Gorla, G. R. Polyploidy associated with oxidative injury attenuates proliferative potential of cells / G. R. Gorla, H. Malhi, S. Gupta // J. Cell Science. – 2001. – Vol. 114. – P. 2943-2951. 134 135. Hall, L. E. Pericentric and centromeric transcription: a perfect balance required / L. E. Hall, S. E. Mitchell, R. J. O'Neill // Chromosome Res. – 2012. – Vol. 20, N5. – P. 535-546. 136. Halliwell, B. Oxygen and nitrogen are pro-carcinogens. Damage to DNA by reactive oxygen, chlorine and nitrogen species: measurement, mechanism and the effects of nutrition / B. Halliwell // Mutation Research. – 1999. – Vol. 443, N1-2. – P. 37-52. 137. Handa, O. Helicobacter pylori: a ROS-inducing bacterial species in the stomach / O. Handa, Y. Naito, T. Yoshikawa // Inflammation Research. – 2010. – Vol. 59, N12. – P. 997-1003. 138. Helicobacter pylori impairs DNA mismatch repair in gastric epithelial cells / J.J. Kim, H. Tao, E. Carloni et al. // Gastroenterology. 2002. – Vol. 123, N2. P. 542-553. 139. Helicobacter pylori infection induces genetic instability of nuclear and mitochondrial DNA in gastric cells / A.M. Machado, C. Figueiredo, E. Touati et al. // Clin Cancer Res. – 2009. – Vol. 15, N 9. – P. 2995-3002. 140. Highly conserved repetitive DNA sequences are present at human centromeres / D. L. Grady, R. L. Ratliff, D. L. Robinson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1992. – Vol. 89, N5. – P. 1695-1699. 141. Holt, D. J. Multinucleated giant cells from fibroblast cultures / D. J. Holt, D. W. Grainger // Biomaterials. – 2011. – Vol. 32, N16. – P. 3977-3987. 142. Human chromosome 1 satellite 3 DNA is decondensed, demethylated and transcribed in senescent cells and in A 431 epithelial carcinoma cells / N. I. Enukashvily, R. Donev, I. S. Waisertreiger et al. // Cytogenet Genome Res. – 2007. – Vol. 118, N1. – P. 42-54. 143. Human phagocytic cells in the early innate immune response to Borrelia burgdorferi / R. R. Montgomery, D. Lusitani, A. de Boisfleury Chevance et al. // J. Infect. Dis. – 2002. – Vol. 185, N12. – P. 1773-1779. 144. IL-6 transsignaling: the in vivo consequences / S. A. Jones, P. J. Richards, J. Scheller et al. // J. Interferon Cytokine Res. – 2005. – Vol. 25, N5. – P. 241-253. 135 145. Importance of the lipid peroxidation biomarkers and methodological aspects FOR malondialdehyde quantification / D. Grotto, L. Santa Maria, J. Valentini et al. // Química Nova. – 2009. – Vol. 32, N1. P 169. 146. Induction of apoptosis in human neutrophils by Mycobacterium tuberculosis is dependent on mature bacterial lipoproteins / A. Persson, R. Blomgran-Julinder, D. Eklund et al. // Microb. Pathog. – 2009. – Vol. 47, N3. – P. 143-50. 147. Induction of polyploidy and apoptosis after exposure to high concentrations of the spindle poison nocodazole / B. Verdoodt, I. Decordier, K. Geleyns et al. // Mutagenesis. – 1999. – Vol. 14, N5. – P. 513-520. 148. Inflammatory cytokine production predominates in early Lyme disease in patients with erythema migrans / L. Glickstein, B. Moore, T. Bledsoe et al. // Infect. Immun. – 2003. – Vol. 71, N10. – P. 6051-6053. 149. Inflammatory cytokines induce DNA damage and inhibit DNA repair in cholangiocarcinoma cells by a nitric oxide-dependent mechanism / M. Jaiswal, N. F. LaRusso, L. J. Burgart et al. // Cancer Research. – 2000. – Vol. 60, N1. – P. 184-190. 150. Inhibitors of ADP-ribose polymerase decrease the resistance of HER2 /neuexpressing cancer cells to the cytotoxic effects of tumor necrosis factor / A. Lichtenstein, J. F. Gera, J. Andrews et al. // J. Immunol. – 1991. – Vol. 146, N6. – P. 2052-2058. 151. Innate immune responses in Lyme borreliosis: enhanced tumour necrosis factor-alpha and interleukin-12 in asymptomatic individuals in response to live spirochetes / J. Sjöwall, A. Carlsson, O. Vaarala et al. // Clin. Exp. Immunol. – 2005. – Vol. 141, N1. – P. 89-98. 152. Irreversible cellular senescence induced by prolonged exposure to H2O2 involves DNA-damage-and-repair genes and telomere shortening / J. Duan, J. Duan, Z. Zhang et al. // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2005. – Vol. 37, N7. – P. 1407-1420. 153. ISCN (2005): An international system for human cytogenetic nomenclature / L.G. Shaffer, N. Tommerup // S. Karger, Basel. – 2005. – 130 p. 136 154. Iwasaki, A. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses / A. Iwasaki, R. Medzhitov // Nat. Immunol. – 2004. – Vol. 5, N10. – P. 987-995. 155. Kataoka, T. N-terminal fragment of c-FLIP(L) processed by caspase 8 specifically interacts with TRAF2 and induces activation of the NF-kappaB signaling pathway / T. Kataoka, J. Tschopp // Mol. Cell Biol. – 2004. – Vol. 24, N7. – P. 2627-2636. 156. Killing of Borrelia burgdorferi by macrophages is dependent on oxygen radicals and nitric oxide and can be enhanced by antibodies to outer surface proteins of the spirochete / M. Modolell, U. E. Schaible, M. Rittig et al. // Immunol. Lett. – 1994. – Vol. 40, N2. – P. 139-146. 157. Krammer, P. H. CD95's deadly mission in the immune system / P. H. Krammer // Nature. – 2000. – Vol. 407, N6805. – P. 789-795. 158. Krzymińska, S. Apoptosis of epithelial cells and macrophages due to nonpigmented Serratia marcescens strains / S. Krzymińska, K. Ochocka, A. Kaznowski // Scientific World Journal. – 2012. – Vol. 2012. – P. 679639. 159. Kulbacka, J. Oxidative stress in cells damage processes / J. Kulbacka, J. Saczko, A. Chwiłkowska // Pol. Merkur. Lekarski. – 2009. – Vol. 27, N157. – P. 4447. 160. Kumar, S. Caspase function in programmed cell death / S. Kumar // Cell Death Differ. – 2007. – Vol. 14, N1. – P. 32-43. 161. Lang, J.D. Lymphocytes, apoptosis and sepsis: making the jump from mice to humans / J.D. Lang, G. Matute-Bello // Crit Care. 2009. Vol. 13, N1. – P. 109. 162. Lara-Tejero, M. A bacterial toxin that controls cell cycle progression as a deoxyribonuclease I-like protein / M. Lara-Tejero, J. E. Galan // Science. – 2000. – Vol. 290. – P. 354-357. 163. Lengauer, C. Genetic instabilities in human cancers / C. Lengauer, K. W. Kinzler, B. Vogelstein // Nature. – 1998. – Vol. 396, N6712. – P 643–649. 164. Lengauer, C. Genetic instability in colorectal cancers / C. Lengauer, K. W. Kinzler, B. Vogelstein // Nature. – 1997. – Vol. 386, N6625. – P. 623-627. 137 165. Ligor, M. Application of medical and analytical methods in Lyme borreliosis monitoring / M. Ligor, P. Olszowy, B. Buszewski // Anal Bioanal Chem. – 2012. – Vol. 402, N7. – P. 2233-2248. 166. Lipid peroxidation products as potential bioindicators of Lyme arthritis / W. Łuczaj, A. Moniuszko, M. Rusak et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2011. – Vol. 30, N3. – P. 415-422. 167. Lipoprotein-dependent and-independent immune responses to spirochetal infection / J. C. Salazar, C. D. Pope, M. W. Moore et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2005. – Vol. 12, N8. – P. 949-958. 168. Lloyd, D.C. Frequencies of chromosomal aberrations induced in human blood lymphocytes by low doses X-rays / D. C. Lloyd, A. A. Edwards, A. A. Leonard // Int. J. Radiat. Biol. – 1988. – Vol. 53, N1. – P. 49-55. 169. Łuczaj, W. DNA damage caused by lipid peroxidation products / W. Łuczaj, E. Skrzydlewska // Cell Mol. Biol. Lett. – 2003. – Vol. 8, N2. – P. 391-413. 170. Lyme arthritis synovial gammadelta T cells instruct dendritic cells via fas ligand / C. Collins, J. Wolfe, K. Roessner et al. // J. Immunol. – 2005. – Vol. 175, N9. – P. 5656-5665. 171. Lymphocyte apoptosis co-cultured with Borrelia burgdorferi / S. Perticarari, G. Presani, M. Prodan et al. // Microb Pathog. – 2003. – Vol. 35, N4. – P. 139-145. 172. Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis / R. Watanabe-Fukunaga, C. I. Brannan, N. G. Copeland et al. // Nature. – 1992. – Vol. 356, N6367. – P. 314-317. 173. Ma, T. Study of the role of endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis signal pathway in sepsis-induced splenic lymphocyte apoptosis / T. Ma, L. Han, W. Q. Hu // Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. – 2009. – Vol. 21, N1. – P. 48-50. 174. Macrophages, nitric oxide and microRNAs are associated with DNA damage response pathway and senescence in inflammatory bowel disease / J. J. Sohn, A. J. Schetter, H. G. Yfantis et al. // PloS. One. – 2012. – Vol. 7, N9. – P. 44156. 138 175. Maeda, S. Distinct mechanism of Helicobacter pylori-mediated NF-κB activation between gastric cancer cells and monocytic cells / S. Maeda, M. Akanuma, Y. Mitsuno // Journal of Biological Chemistry. – 2001. – Vol. 276, N48. – P. 44856-44864. 176. Manna, G. K. Chromosome aberrations in mice by the bacterium, Streptococcus faecalis and the influence of penicillin on their frequency / G. K. Manna, S. Gupta // CIS (Japan). – 1978. – Vol. 24. – P. 8-10. 177. Manna, G. K. Chromosome aberrations in mice induced by the bacterium, Klebsiella pneumoniae and their alterrations by chloramphenicol injection / G. K. Manna, S. Gupta // CIS (Japan). – 1977. – Vol. 23. – P. 30-31. 178. Manna, G. K. Chromosome aberrations induced by Staphylococcus in partially hepatectomized mice and their reduction by Penicillin / G. K. Manna, T. K. Ghosh // Nucleus. – 1983. – Vol. 26, N 3. – P. 153-159. 179. Manna, G. K. Mouse bone marrow as a means of resting clastogenic agents / G. K. Manna // Nucleus. – 1986. – Vol. 29, N 3. – P. 141-168 . 180. Manna, G. K. The genotoxic potential of the bacterium, Serratia marcescens in mice as experimental model / G. K. Manna, A. Sadhukhan // Nat. Acad. Sci. Lett. – 1990. – Vol. 13, N7. – P. 273-288. 181. Mannick, E. E. Inducible nitric oxide synthase, nitrotyrosine, and apoptosis in Helicobacter pylori gastritis: effect of antibiotics and antioxidants / E. Mannick, L. E. Bravo, G. Zarama // Cancer Research. – 1996. – Vol. 56, N14. – P. 32383243. 182. McNally, A. K. Alpha subunit partners to beta1 and beta 2 integrins during IL4-induced foreign body giant cell formation / A. K. McNally, S. R. MacEwan, J. M. Anderson // J. Biomed. Mater. Res. A. – 2007. Vol. 82A. – P. 568-574. 183. Methods for distinguishing apoptotic from necrotic cells and measuring their clearance / D. V. Krysko, T. Vanden Berghe, E. Parthoens et al. // Methods Enzymol. – 2008. – Vol. 442. – P. 307-341. 139 184. Mizuno, K. Muramyl dipeptide and mononuclear cell supernatant induce Langhans-type cells from human monocytes / K. Mizuno, H. Okamoto, T. Horio // J. Leukoc. Biol. – 2001. – Vol. 70, N3. – P. 386-394. 185. Monocyte anergy in septic shock is associated with a predilection to apoptosis and is reversed by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ex vivo / M. A. Williams, S. Withington, A. C. Newland et al. // J. Infect. Dis. – 1998. – Vol. 178, N5. – P. 1421-1433. 186. Montgomery, R. R. The fate of Borrelia burgdorferi, the agent for Lyme disease, in mouse macrophages. Destruction, survival, recovery / R. R. Montgomery, M. H. Nathanson, S. E. Malawista // J. Immunol. – 1993. – Vol. 150, N3. – P. 909-915. 187. Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity / F. Rieux-Laucat, F. Le Deist, C. Hivroz et al. // Science. – 1995. – Vol. 268, N5215. – P. 1347-1349. 188. Mycobacterial lipomannan induces granuloma macrophage fusion via a TLR2dependent, ADAM9-and beta 1 integrin-mediated pathway / M. P. Puissegur, G. Lay, M. Gilleron et al. // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178, N5. – P. 3161-3169. 189. Mycobacterium tuberculosis 38-kDa lipoprotein is apoptogenic for human monocyte-derived macrophages / A. Sanchez, P. Espinosa, M. A. Esparza et al. // Scand. J. Immunol. – 2009. – Vol. 69, N1. – P. 20-28. 190. Mycobacterium tuberculosis promotes apoptosis in human neutrophils by activating caspase-3 and altering expression of Bax /BclxL via an oxygen – dependent pathway / N. Perskvist, M. Long, O. Stendahl et al. // J. Immunol. – 2002. – Vol. 168, N12. – P. 6358-6365. 191. Nardelli, D. T. Lyme arthritis: current concepts and a change in paradigm / D. T. Nardelli, S. M. Callister, R. F. Schell // Clin. Vaccine Immunol. – 2008. – Vol. 15, N1. – P. 21-34. 192. Nichols, W. W. Virus-induced chromosome abnormalities / W. W. Nichols // Ann. Rev. Microbiol. – 1970. – Vol. 24. – P. 479-500. 140 193. Nitric oxide activation of poly(ADP-ribose) synthetase in neurotoxicity / J. Zhang, V. L. Dawson, T. M. Dawson et al. // Science. – 1994. – Vol. 263, N5147. – P. 687-689. 194. Nitric oxide produced during murine listeriosis is protective / K. S. Boockvar, D. L. Granger, R. M. Poston et al. // Infect. Immun. – 1994. – Vol. 62, N3. – P. 1089-1100. 195. Non-apoptotic signaling pathways activated by soluble Fas ligand in serumstarved human fibroblasts. Mitogen-activated protein kinases and NF-kappaBdependent gene expression / J. H. Ahn, S. M. Park, H. S. Cho et al. // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, N50. – P. 47100-47106. 196. Ohshima, S. Abnormal mitosis in hypertetraploid cells causes aberrant nuclear morphology in association with H2O2-induced premature senescence / S. Ohshima // Cytometry Part A. – 2008. – Vol. 73, N9. – P. 808-815. 197. Ohshima, S. Cellular aging and centrosome aberrations / S. Ohshima, A. Seyama //Ann NY Acad Sci. – 2010. – Vol. 1197. – P. 108-117. 198. Okamoto, H. Human monocyte-derived multinucleated giant cells / H. Okamoto, K. Mizuno, T. Horio // Nihon Hansenbyo Gakkai Zasshi. – 2004. – Vol. 73, N3. – P. 245-251. 199. OmpA-like protein Loa22 from Leptospira interrogans serovar Lai is cytotoxic to cultured rat renal cells and promotes inflammatory responses / Y. Zhang, L. Bao, H. Zhu et al. // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). – 2010. – Vol. 42, N1. – P. 70-79. 200. Outer surface lipoproteins of Borrelia burgdorferi stimulate nitric oxide production by the cytokine-inducible pathway / Y. Ma, K. P. Seiler, K. F. Tai et al. // Infect. Immun. – 1994. – Vol. 62, N9. – P. 3663-3671. 201. Oxidative stress signalling: a potential mediator of tumour necrosis factor αinduced genomic instability in primary vascular endothelial cells / M. Natarajan, C. F. Gibbons, S. Mohan et al. // British Journal of Radiology – 2007. – Vol. 80. – P. 13-22. 141 202. p38 mitogen-activated protein kinase controls NF-kappaB transcriptional activation and tumor necrosis factor alpha production through RelA phosphorylation mediated by mitogen-and stress-activated protein kinase 1 in response to Borrelia burgdorferi antigens / C. M. Olson, M. N. Hedrick, H. Izadi et al. // Infect. Immun. – 2007. – Vol. 75, N1. – P. 270-277. 203. p53-independent expression of p21(CIP1 /WAF1) in plasmacytic cells during G(2) cell cycle arrest induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin / T. Sato, T. Koseki, K. Yamato et al. // Infect. Immun. – 2002. – Vol. 70, N2. – P. 528-534. 204. Partial hepatectomy-induced polyploidy attenuates hepatocyte replication and activates cell aging events / S. H. Sigal, P. Rajvanshi, G. R. Gorla et al. // Am. J. Physiol. – 1999 – Vol. 276. – P. 1260-1272. 205. Partial volume rat lung irradiation temporal fluctuations of in-field and outfield DNA damage and inflammatory cytokines following irradiation / V. I. Calveley, M. A. Khan, I. W. Yeung et al. // Int. J. Radiat. Biol. – 2005. – Vol. 81, N12. – P. 887-899. 206. Paton, G. R. Chromosome changes in human diploid cell cultures infected with Micoplasma / G.R. Paton, J. P. Jecobs, T. T. Perkjns // Nature. – 1965. – Vol. 207. – P. 43-45. 207. Peroxynitrite-mediated DNA strand breakage activates poly – adenosine diphosphate ribosyl synthetase and causes cellular energy depletion in macrophages stimulated with bacterial lipopolysaccharide / B. Zingarelli, M. O'Connor, H. Wong et al. // J. Immunol. – 1996. – Vol. 156, N1-P. 350-358. 208. Peter, M. E. The CD95(APO – 1 /Fas) DISC and beyond / M. E. Peter, P. H. Krammer // Cell Death Differ. – 2003. – Vol. 10, N1. – P. 26-35. 209. Phagocytosis of Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum potentiates innate immune activation and induces gamma interferon production / M. W. Moore, A. R. Cruz, C. J. LaVake et al. // Infect. Immun. – 2007. – Vol. 75, N4. – P. 2046-2062. 142 210. Phagocytosis of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease spirochete, potentiates innate immune activation and induces apoptosis in human monocytes / A. R. Cruz, V. M. Moore, C. J. La Vake et al. // Infect. Immun. – 2008. – Vol. 76, N1. – P. 56-70. 211. Phagocytosis-induced apoptosis in macrophages is mediated by up-regulation and activation of the Bcl-2 homology domain 3-only protein Bim / S. Kirschnek, S. Ying, S. F. Fischer et al. // J. Immunol. – 2005. – Vol. 174, N2. – P. 671-679. 212. Pohl-Koppe, A. Characterization of the cellular and humoral immune response to outer surface protein C and outer surface protein 17 in children with early disseminated Lyme borreliosis / A. Pohl-Koppe, A. Kaunicnik, B. Wilske // Med. Microbiol. Immunol. – 2001. – Vol. 189, N4. – P. 193-200. 213. Polyploidization and centrosome hyperamplification in inflammatory bronchi / D. Lothschütz, M. Jennewein, S. Pahl et al. // Inflamm. Res. – 2002. – Vol. 51. – P. 416-422. 214. Production of reactive oxygen species and expression of inducible nitric oxide synthase in rat isolated Kupffer cells stimulated by Leptospira interrogans and Borrelia burgdorferi / A. Marangoni, S. Accardo, R. Aldini et al. // World J. Gastroenterol. – 2006. – Vol. 12, N19. – P. 3077-3081. 215. Recognition of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease spirochete, by TLR7 and TLR9 induces a type I IFN response by human immune cells / M. M. Petzke, A. Brooks, M. A. Krupna et al. // J. Immunol. – 2009. – Vol. 183, N8. – P. 5279-5292. 216. Release of Toll-like receptor-2-activating bacterial lipoproteins in Shigella flexneri culture supernatants / A. O. Aliprantis, D. S. Weiss, J. D. Radolf et al. // Infect. Immun. – 2001. – Vol. 69, N10. – P. 6248-6255. 217. Report from the in vitro micronucleus assay working group / M. KirschVolders, T. Sofuni, M. Aarderma et al. // Environmental and molecular mutagenesis. – 2000. – Vol. 35, N5. – P. 167-172. 218. Reprogramming of the macrophage transcriptome in response to interferongamma and Mycobacterium tuberculosis: signaling roles of nitric oxide syn- 143 thase-2 and phagocyte oxidase / S. Ehrt, D. Schnappinger, S. Bekiranov et al. // J. Exp. Med. – 2001. – Vol. 194, N8. – P. 1123-1140. 219. Rieder, C. Stuck in division or passing through: What happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint / C. Rieder, H. Maiato // Dev. Cell. – 2004. – Vol. 7. – P. 637-651. 220. RLIP76 and Cancer / S. Awasthi, S. S. Singhal, Y. C. Awasthi et al. // Clin. Cancer Res. – 2008. – Vol. 14, N14. – P. 4372-4377. 221. Roads to polyploidy: the megakaryocyte example / K. Ravid, J. Lu, J. M. Zimmet et al. // J. Cell Physiol. – 2002. – Vol. 190. – P. 7-20. 222. Role of mycobacteria-induced monocyte /macrophage apoptosis in the pathogenesis of human tuberculosis / M. Bocchino, D. Galati, A. Sanduzzi et al. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. – 2005. – Vol. 9, N4. – P. 375-383. 223. Role of nitrative and oxidative DNA damage in inflammation-Related carcinogenesis / M. Murata, R. Thanan, N. Ma et al. // J. Biomed. Biotechnol. – 2012. – Vol. 2012. – P. 623019. 224. Savill, J. Apoptosis in resolution of inflammation / J. Savill // J. Leukoc. Biol. – 1997. – Vol. 61, N4. – P. 375-380. 225. Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes / M. A. Seabright // Lancet. – 1971. – Vol. 2, N 7731. – P. 971-972. 226. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor / J. P. Coppe, C. K. Patil, F. Rodier et al. // PloS. Biol. – 2008. – Vol. 6. – P. 2853-2868. 227. Smith, M. L. The two faces of tumor suppressor p53 / M. L. Smith, A.J. Jr. Fornace // Am. J. Pathol. – 1996. – Vol. 148, N4. – P. 1019-1022. 228. Spellberg, B. Type 1 /Type 2 immunity in infectious diseases / B. Spellberg, J. E. Jr. Edwards // Clin. Infect. Dis. – 2001. – Vol. 32, N1. – P. 76-102. 229. Sprent, J. T cell death and memory / J. Sprent, D. F. Tough // Science. – 2001. – Vol. 293, N5528. – P. 245-248. 144 230. Steere, A. C. Association of chronic Lyme arthritis with HLA-DR4 and HLADR2 alleles / A. C. Steere, E. Dwyer, R. Winchester // N. Engl. J. Med. – 1990. – Vol. 323, N4. – P. 219-223. 231. Stress-induced transcription of satellite III repeats / C. Jolly, A. Metz, J. Govin et al. // J. Cell Biol. – 2004. – Vol. 164, N1. – P. 25-33. 232. Summer, A. T. New technique for distinguishing between chromosomes / A. T. Summer, H. J. Evans, R. A. Buckland // Nature. – 1971. – Vol. 232, N 27. – P. 31-32. 233. Taatjes, D.J. Morphological and cytochemical determination of cell death by apoptosis / D. J. Taatjes, B. E. Sobel, R. C. Budd // Histochem. Cell Biol. – 2008. – Vol. 129, N 1. – P. 33-43. 234. Tetraploid state induces p53-dependant arrest of nontransformed mammalian cells in G1 / P. R. Andreassen, O. D. Lohez, F. B. Lacroix et al. // Mol. Biol. Cell. – 2001. – Vol. 12. – P. 1315-1328. 235. The apoptotic signaling pathway activated by Toll-like receptor-2 / A. O. Aliprantis, R. B. Yang, D. S. Weiss et al. // EMBO J. – 2000. – Vol. 19, N13. – P. 3325-3336. 236. The ATM-Chk2 and ATR-Chk1 pathways in DNA damage signaling and cancer / J. Smith, L. M. Tho, N. Xu et al. // Adv. Cancer Res. – 2010. – Vol. 108. – P. 73-112. 237. The biology of the cytolethal distending toxins / L. Guerra, X. Cortes-Bratti, R. Guidi et al. // Toxins (Basel). – 2011. – Vol. 3, N 3. – 172-190. 238. The caspase-8 inhibitor FLIP promotes activation of NF-kappaB and Erk signaling pathways / T. Kataoka, R. C. Budd, N. Holler et al. // Curr. Biol. – 2000. – Vol. 10, N11. – P. 640-648. 239. The level of aberrant cells in various tissues of bank vole depending on doses and radionuclide balance in organism / A. M. Voitovich, V. Y. Afonin, E. V. Krupnova // Tsitol. Genet. – 2003. – Vol. 37, N4. – P. 10-15. 145 240. The lymphocyte transformation test for borrelia detects active lyme borreliosis and verifies effective antibiotic treatment / V. von Baehr, C. Doebis, H. D. Volk et al. // Open Neurol. J. – 2012. – Vol. 6. – P. 104-112. 241. T-helper-cell cytokines in the early evolution of murine Lyme arthritis / I. Kang, S. W. Barthold, D. H. Persing et al. // Infect. Immun. – 1997. – Vol. 65, N8. – P. 3107-3111. 242. Transcription of Satellite III non-coding RNAs is a general stress response in human cells / R. Valgardsdottir, I. Chiodi, M. Giordano et al. // Nucleic. Acids. Res. – 2008. – Vol. 36, N2. – P. 423-434. 243. Transcriptional activation of a constitutive heterochromatic domain of the human genome in response to heat shock / N. Rizzi, M. Denergi, I. Chiodi et al. // Mol. Biol. Cell. – 2004. – Vol. 15, N2. – P. 543-551. 244. Trinchieri, G. The IL-12 family of heterodimeric cytokines. new players in the regulation of T cell responses / G. Trinchieri, S. Pflanz, R.A. Kastelein // Immunity. – 2003. – Vol. 19, N5. – P. 5641-5644. 245. Walen, K. H. Genetic stability of senescence reverted cells: genome reduction division of polyploidy cells, aneuploidy and neoplasia / K. H. Walen // Cell Cycle. – 2008. – Vol. 7, N11. – P. 1623-1629. 246. Walen, K. H. Human diploid fibroblast cells in senescence; cycling through polyploidy to mitotic cells. In Vitro Cell / K. H. Walen // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. – 2006. – Vol. 42, N7. – P. 216-224. 247. Zychlinsky, A. Shigella flexneri induces apoptosis in infected macrophages / A. Zychlinsky, M. C. Prevost, P. J. Sansonetti // Nature. – 1992. – Vol. 358, N6382. – P. 167-169.
