сравнительная характеристика иммуногистохимической
реклама
кл і н і ч н і дослідження А.И. Курченко Национальный медицинский университет, Киев Ключевые слова: атопический дерматит, иммуногистохимия, Т-лимфоциты, клетки Лангерганса. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЙ КАРТИНЫ ОЧАГОВ ПОРАЖЕНИЙ КОЖИ У БОЛЬНЫХ С IgE-ЗАВИСИМОЙ И IgE-НЕЗАВИСИМОЙ ФОРМами АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА Резюме. Несмотря на различия в патогенетических механизмах развития IgE-зависимой и IgE-независимой форм атопического дерматита (АД), выявлены поразительные сходства в клинических проявлениях, гистологической и иммуногистохимической картинах. Для дальнейшего анализа этого противоречия наша работа была направлена на детальное иммуногистохимическое изучение клеточного инфильтрата очага поражения при IgE-зависимой и IgE-независимой формах АД с применением большой панели моноклональных антител. Наши результаты свидетельствуют, что активация Т-лимфоцитов в очаге поражения больных различными формами АД может обусловить одинаковую иммуногистохимическую картину очага воспаления и, очевидно, не зависит от экзогенного антигена. ВВЕДЕНИЕ Атопический дерматит (АД) — это генетически обусловленное системное хроническое рецидиви­ рующее заболевание кожи, клинически проявляю­ щееся первично возникающим зудом, воспалением, лихеноидными папулами и лихенификацией. Ве­ дущую роль в патогенезе АД играют недавно откры­ тые генетически обусловленные иммунологические нарушения в организме, а также факторы окружаю­ щей среды, непосредственно влияющие на форми­ рование атопического индивида. Учитывая совре­ менные взгляды, АД можно рассматривать как ге­ нетически детерминированную IgE-опосредованную реакцию гиперчувствительности замедленного типа, которая формируется под действием различ­ ных триггерных факторов и проявляется различной интенсивностью на протяжении жизни пациента (Leung D.Y., 1999). Термин «атопический дерматит», предложенный Wise и Sulzberger в 30-х гг. ХХ в., подчеркивал ассо­ циативную связь аллергического заболевания кожи с проявлениями аллергического ринита и бронхи­ альной астмы. Различные названия, такие как атопическая экзема, нейродермит, эндогенная эк­ 114 зема и др., предложенные ранее для определения АД, отражали отсутствие консенсуса исследовате­ лей по вопросам механизмов развития этого забо­ левания (Sulzberger M., 1983). У большинства больных с клиническими появ­ лениями АД отмечают высокую концентрацию в сыворотке крови общего и аллергенспецифического IgE. У этих пациентов чаще всего отмечают положи­ тельную реакцию на большинство кожных аллерги­ ческих тестов с известными аллергенами. ­У многих больных проявления АД ассоциируются с клиничес­ кими проявлениями ринита и бронхиальной астмы. Чаще всего у этих пациентов отмечают наследствен­ ный анамнез проявлений этих заболеваний у родс­ твенников (Werfel T., Kapp A., 1998). Однако среди пациентов с выраженными внеш­ ними клиническими признаками АД много лиц, у которых никогда не наблюдают повышения кон­ центрации общего и аллергенспецифического IgE в крови. У таких больных АД чаще всего выявляют отрицательные реакции на все известные аллергены в аллерготестах, и пациенты никогда не отмечали у себя и у родственников проявлений ринита и брон­ хиальной астмы. Эта категория пациентов была у к ра ї н с ь к и й м е д и ч н и й ч асо п и с – № 1 ( 5 1 ) – І / I I 2 0 0 6 клінічні дослідження выделена в особую группу АД, обозначенную как неаллергическая (в отечественной литературе — псевдоаллергическая) форма АД (Wollenberg A., Bieber T., 2000). Недавно для определения этой формы АД был предложен термин IgE-независимый АД (SchmidGrendelmeier P. et al., 2001). IgE-независимая форма АД может быть охарактеризована следующими критериями: 1) клинический фенотип АД у таких больных должен соответствовать критериям, предложенным J.M. Hanifin и G. Rajka (1980); 2) отсутствие ассоциации клинических прояв­ лений АД с другими атопическими заболеваниями, такими как ринит и бронхиальная астма; 3) наличие отрицательных кожных проб с извест­ ными пищевыми аллергенами и аэроаллергенами; 4) нормальный уровень общего IgE в сыворотке крови больных; 5) отсутствие специфических IgE-антител к из­ вестным аллергенам. Однако схожесть клинической и гистологичес­ кой картины IgE-зависимой и IgE-независимой форм АД при очевидных различиях в патогенезе этих заболеваний заставляет ученых искать новые дифференциальные критерии. Цель нашей работы — иммуногистохимическое исследование клеточных инфильтратов пораженной кожи больных с IgE-зависимой и IgE-независимой формой АД для определения возможных дифферен­ циальных специфических особенностей. объект и методы исследования В исследовании участвовали 35 пациентов в воз­ расте от 18 до 55 лет с клиническими проявлениями АД. В 1-ю группу вошли 18 человек с IgE-зависимой формой АД, диагноз которых соответствовал крите­ риям, предложенным J.M. Hanifin и G. Rajka (1980), с атопическим анамнезом и высокой концентрацией общего IgE в сыворотке крови. Во 2-ю группу вошли 17 человек с IgE-независи­ мой формой АД, диагноз которых также соответ­ ствовал критериям, предложенным J.M. Hanifin и G. Rajka (1980), но без атопического анамнеза и по­ вышенного уровня общего IgE в сыворотке крови. После информированного согласия у всех паци­ ентов была взята биопсия диаметром до 3 мм2 для дальнейшего иммуногистохимического обследова­ ния. Иммуногистохимическое исследование прово­ дили при помощи АВС-иммунопероксидазного метода на серийных криостатных срезах толщиной 5–7 мкм с использованием панели моноклональных антител с реактогенной направленностью против большого спектра дифференцировочных антигенов и маркеров активации: CD1а, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11с, CD19, CD22, CD45RO, CD45RA, CD54, HLA-DR и CD25. Визуализацию иммуногистохими­ ческой реакции антиген — антитело осуществляли при помощи непрямого авидин-стрептовидинового иммунопероксидазного метода. Результаты и их обсуждение Как оказалось, у больных с IgE-зависимой фор­ мой АД CD1а+ дендритные клетки составили при­ мерно 20% клеточного инфильтрата. Однако боль­ шинство клеток дермы в основном состояло из Т-лимфоцитов, несущих различные специфические субпопуляционные маркеры, и клеток моноцитарномакрофагального ряда, инфильтрирующих кожу. Основная масса Т-лимфоцитов была представлена CD4+ Т-лимфоцитами, однако выявлены и предста­ вители Т-клеточной субпопуляции с фенотипом CD8+. Большая часть инфильтрирующих дерму кле­ ток у больных с IgE-зависимой формой АД экспрес­ сировала маркеры активации, такие как HLA-DR и рецептор IL-2 (IL-2R) (CD25) (рис. 1, 2, 3). Рис. 1. Т-клеточный состав дермального инфильтрата у больных­ с IgE-зависимой и IgE-независимой формой АД Рис. 2. Дендритные клетки, В-лимфоциты и макрофаги дермального инфильтрата больных с IgE-зависимой и IgE-независимой формой АД Рис. 3. Активированные клетки дермального инфильтрата больных с IgE-зависимой и IgE-независимой формой АД український м е д и ч н и й ч асо п и с – № 1 ( 5 1 ) – І / I I 2 0 0 6 115 кл і н і ч н і дослідження Основную массу активированных клеток на серийных криостатных срезах составили Т-лимфо­ циты. Плотность эпидермальных CD1а+-клеток Лан­ герганса у больных с IgE-зависимой формой АД отмечали в пределах 18,7 клеток на 0,1 мм2. Почти все эпидермальные Т-лимфоциты (с плотностью 6,8 клеток на 0,1 мм 2 ) представляли собой CD4+-хелперную популяцию. Среди этой популя­ ции отмечали клетки с фенотипом CD45RО. CD8+ Т-лимфоциты и клетки с фенотипом CD45RА «на­ ивных» Т-лимфоцитов в эпидермисе больных с IgE-зависимой формой АД отсутствовали. При иммуногистохимическом исследовании очага поражения у больных с IgE-независимой формой АД выявлены практически идентичные изменения. Основная масса клеток дермального компонента экпрессировала на своей поверхности основные маркеры Т-лимфоцитов: CD2-антиген (~70%), CD3-антиген (~80%), CD5 (~75%) и CD4 (~75%). Небольшое количество клеток (~18%) экс­ прессировали CD8+-маркер (рис. 1). Моноклональные антитела CD45RA использо­ вали в нашем исследовании для определения в ка­ честве специфического маркера «наивных» Т-лим­ фоцитов. Количество клеток, экспрессирующих CD45RA, в дерме больных с IgE-независимой фор­ мой АД составляло ~5%. В отличие от этого, основ­ ная масса клеток дермального клеточного инфиль­ трата (~75%) экспрессировала маркер клеток памя­ ти CD45RО (рис. 1). Количество CD1а+-клеток Лангерганса у боль­ ных с IgE-независимой формой АД, так же, как и больных с IgE-зависимой формой АД, составляло ~20% клеток дермального инфильтрата. Хорошо были представлены также клетки моноцитарномакрофагального ряда (~55%), экспрессирующие на своей поверхности маркер CD11с (рис. 2). Большое количество клеток, инфильтрирующих дерму у больных с IgE-независимой формой АД, экспрессировали такие маркеры активации, как HLA-DR и CD25. Значительную часть этих клеток составляли Т-лимфоциты (рис. 3). В эпидермисе больных с IgE-независимой фор­ мой АД плотность CD1а+-клеток Лангерганса со­ ставляла 15 клеток на 0,1 мм2. Плотность CD3+ Т-лимфоцитов составляла примерно 5,7 клеток на 0,1 мм2. Эпидермальные Т-лимфоциты в очаге по­ ражения больных с IgE-независимой формой АД экспрессировали исключительно маркер CD4 Т-лимфоцитов-хелперов. Количество клеток, экс­ прессирующих активационный маркер HLA-DR у больных с IgE-независимой формой АД, также было идентично количеству аналогичных клеток у боль­ ных с IgE-зависимой формой АД. Необходимо от­ метить, что экспрессия CD54 (ІСАМ-1 — адгезив­ ной молекулы), выявляемая фокально, как на клетках дермального инфильтрата, так и на керати­ ноцитах в эпидермисе, идентична у больных с различными формами АД. 116 Несмотря на совершенно разные механизмы патогенеза, IgE-зависимая и IgE-независимая фор­ ма АД оказались в основном сходны по своим кли­ ническим, гистологическим и иммуногистохими­ ческим признакам (Kalinke U., Wuthrich B., 1997). С патогенетической точки зрения на сегодняшний день еще трудно объяснить, почему антигенспеци­ фическая (IgE-зависимая) активация Т-лимфоци­ тов приводит к сходному типу воспаления, которое развивается в коже больных с IgE-независимой формой АД при отсутствии причинного аллергена (Walker C. et al., 1993). Для этого мы решили тщательно исследовать два типа кожной реакции (IgE-зависимой и IgE-незави­ симой) у больных с различными формами АД, ис­ пользуя большую панель моноклональных антител, направленных против многочисленных поверх­ ностных антигенов резидентных и мигрирующих в кожу Т-лимфоцитов и антигенпредставляющих клеток. Результаты наших исследований свидетель­ ствуют, что даже интенсивное имуногистохимичес­ кое окрашивание клеток эпидермального и дермаль­ ного компонентов пораженной кожи больных с IgE-зависимой и IgE-независимой формами АД не позволяет найти существенных отличий в доли суб­ популяций Т-лимфоцитов. Однако обнаруженное нами повышение экспрессии клетками дермального инфильтрата маркеров активации HLA-DR и CD25 у больных с IgE-зависимой формой АД все же дает основание предполагать наличие более специфич­ ных иммуногистохимических дифференциальных отличий между различными формами АД. Более ранние работы по этой проблеме выявили некоторые разногласия во взглядах. Часть ученых в своих исследованиях установили уменьшение ко­ личества CD1а+-клеток Лангерганса в эпидермисе больных АД (Wollenberg A. et al., 1995). Однако другая исследовательская группа ссылается на стой­ кое увеличение количества CD1а+-клеток в эпидер­ мисе (Курченко А.И., Дранник Г.Н., 2000). Результаты наших исследований подтверждают, что CD1а+-клетки Лангерганса эпидермиса содержат­ ся не только в увеличенном количестве, но и в акти­ визированном состоянии, экспрессируя на своей поверхности HLA-DR-антиген. Эту активизацию основных антигенпредставляющих клеток отмечали как у больных с IgE-зависимой, так и с IgE-независимой формой АД. Однако требует дальнейшего изучения роль этих клеток в развитии различных форм АД. Об этом свидетельствуют данные о более сильной акти­ вации этих клеток в случае IgE-зависимой формы АД (Kapp A., Werfel T., 1999). В последнее время отмечают определенный кон­ сенсус во взглядах относительно присутствия Т-лим­ фоцитов в пораженной коже больных АД. Большин­ ство ученых в своих исследованиях установили, что основную массу клеточных инфильтратов у больных с различными формами АД составляют CD4+ Т-лим­ фоциты. Однако существуют различные взгляды на возможные причины и механизмы миграции этих у к ра ї н с ь к и й м е д и ч н и й ч асо п и с – № 1 ( 5 1 ) – І / I I 2 0 0 6 клінічні дослідження клеток из кровяного русла в пораженную кожу боль­ ных с IgE-зависимой и IgE-независимой формами АД (Akdis C.A. et al., 1999). Остается невыясненным также, чем определяется способность этих клеток синтезировать различные типы цитокинов in situ в зависимости от формы и стадии заболевания. В этой связи большая роль отводится изучению открытых недавно Т-регуляторных лимфоцитов с маркером CD4+CD25+, инфильтрирующих пораженную кожу больных АД. Выявленная нами повышенная экс­ прессия CD25+-маркера на клетках пораженной кожи больных АД дает основание предполагать зна­ чительную долю CD4+CD25+-клеток (AbernathyCarver K.J. et al., 1995), участвующих в развитии IgE-зависимой формы АД. ВЫВОДЫ 1. Несмотря на абсолютно разные механизмы развития, IgE-зависимая и IgE-независимая форма АД оказались в основном сходны по клиническим и иммуногистохимическим признакам. 2. Выявленное нами повышение экспрессии клетками дермального инфильтрата маркеров ак­ тивации HLA-DR и CD25 у больных с IgE-зависи­ мой формой АД дает основание предполагать о наличии более специфичных иммуногистохими­ ческих дифференциальных отличий между различ­ ными формами АД. ЛИТЕРАТУРА Курченко А.И., Дранник Г.Н. (2000) Иммуногистохими­ ческие особенности воспалительного инфильтрата поражен­ ной кожи больных атопическим дерматитом. Імунологія та алергологія, 1: 38–43. Abernathy-Carver K.J., Sampson H.A., Picker L.J., Le­ung D.Y. (1995) Milk-induced eczema is associated with the expansion of T cells expressing cutaneous lymphocyte antigen.­ J. Clin. Invest., 95(2): 913–918. Akdis C.A., Akdis M., Simon D., Dibbert B., Weber M., Gratzl S., Kreyden O., Disch R., Wuthrich B., Blaser K., Simon H.U. (1999) T cells and T cell-derived cytokines as pathogenic factors in the nonallergic form of atopic dermatitis. J. Invest. Dermatol., 113(4): 628–634. Hanifin J.M., Rajka G. (1980) Diagnostic features of atopic dermatitis. Acta Derm. Venereol. Suppl. (Stockh.), 92: 44–47. Kalinke U., Wuthrich B. (1997) Clinical and allergologicimmunologic parameters in patients with atopic dermatitis. A prospective study. Dermatology, 195: 191. Kapp A., Werfel T. (1999) Allergic inflammation: skin. Allergy; 54(Suppl. 56): 23–24. Leung D.Y. (1999) Pathogenesis of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol., 104(3 Pt 2): S99– S 108. Schmid-Grendelmeier P., Simon D., Simon H.U., Akdis C.A., Wuthrich B. (2001) Epidemiology, clinical features, and immunology of the «intrinsic» (non-IgE-mediated) type of atopic dermatitis (constitutional dermatitis). Allergy, 56(9): 841–849. Sulzberger M. (1983) Historical notes on atopic dermatitis: its names and nature. Semin. Dermatol., 2: 1–4. Walker C., Kagi M.K., Ingold P., Braun P., Blaser K., BruijnzeelKoomen C.A., Wuthrich B. (1993) Atopic dermatitis: correlation of peripheral blood T cell activation, eosinophilia and serum factors with clinical severity. Clin. Exp. Allergy, 23(2): 145–153. Werfel T., Kapp A. (1998) Environmental and other major provocation factors in atopic dermatitis. Allergy, 53(8): 731–739. Wollenberg A., Bieber T. (2000) Atopic dermatitis: from the genes to skin lesions. Allergy, 55(3): 205–213. Wollenberg A., Wen S., Bieber T. (1995) Langerhans cell phenotyping: a new tool for differential diagnosis of inflammatory skin diseases. Lancet, 346(8990): 1626–1627. ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ІМУНОГІСТОХІМІЧНОЇ КАРТИНИ ОСЕРЕДКІВ УРАЖЕНЬ ШКІРИ У ХВОРИХ НА IgE-ЗАЛЕЖНУ ТА IgE-НЕЗАЛЕЖНУ ФОРМи АТОПІЧНОГО ДЕРМАТИТУ А.І. Курченко Резюме. Незважаючи на відмінності в патогенетичних механізмах розвитку IgE-залежної та IgE-незалежної форм атопічного дерматиту (АД), виявлено вражаючу схожість у клінічних проявах, гістологічній та імуногістохімічній картинах. Для подальшого аналізу цього протиріччя наша робота була спрямована на докладніше імуногістохімічне вивчення клітинного інфільтрату осередку ураження при IgE-залежній та IgE-незалежній формах АД із застосуванням великої панелі моноклональних антитіл. Отримані нами результати свідчать, що активація Т-лімфоцитів в осередку ураження хворих на різні форми АД може зумовити однакову імуногістохімічну картину осередку запалення і, очевидно, не залежить від екзогенного антигену. Ключові слова: атопічний дерматит, імуногіс­ тохімія, Т-лімфоцити, клітини Лангерганса. COMPARATIVE IMMUNOHISTOLOGICAL DESCRIPTION OF CELLULAR INFILTRATES IN PATIENTS WITH IgE-DEPENDENT AND IgE-INDEPENDED FORM OF ATOPIC DERMATITIS A.I. Kurchenko Summary. IgE-dependent and IgE-independed forms of atopic dermatitis (AD), despite their different pathogenesis, displays a remarkable similarity with respect to clinical presentations, histology and immunohistolo­ gy. To further analyze this apparent contradiction, our study was designed to meticulously compare cellular infiltrates in IgE-depended and IgE-independed AD by immunostaining with a broad panel of monoclonal antibodies. Our results show that antIgEn recognition by specific memory T-cells can finally induce the same pattern of inflammation, including activation of T-cells obviously independent of exogenous antIgEn. Keywords: atopic dermatitis, immunohistology, T-lymphocytes, Langerhans cells. Адрес для переписки: Курченко Андрей Игоревич 01004, Киев, бульв. Тараса Шевченко, 13 Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, кафедра клинической иммунологии и аллергологии український м е д и ч н и й ч асо п и с – № 1 ( 5 1 ) – І / I I 2 0 0 6 117
