Антитела к двуспиральной ДНК (Crithidia luciliae) РНИФ Crithidia
реклама
Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 1 _________________________________________________________________________________________________ Регистрационное удостоверение ФС №2006/1519 от 03.10.2006 г. Антитела к двуспиральной ДНК (Crithidia luciliae) РНИФ Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT Номера по каталогу: FA 1572-1003 FA 1572-1005 FA 1572-1010 FA 1572-2005 FA 1572-2010 Набор на 30 определений (10 предметных стекол × 3 зоны) Набор на 50 определений (10 предметных стекол × 5 зон) Набор на 100 определений (10 предметных стекол × 10 зон) Набор на 100 определений (20 предметных стекол × 5 зон) Набор на 200 определений (20 предметных стекол × 10 зон) ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ Диссеминированная красная волчанка. НАЗНАЧЕНИЕ Набор предназначен для качественного или полуколичественного in vitro определения человеческих антител к двуспиральной ДНК в сыворотке или плазме крови человека. ПРИНЦИП МЕТОДА В наборы Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT включены предметные стекла с биочиповыми реакционными зонами, поверхность которых покрыта мазками простейшего класса жгутиковых Crithidia luciliae. Стекла инкубируют на первой стадии реакции с образцами разведенной сыворотки или плазмы крови пациента. Имеющиеся в положительных образцах специфические антитела классов IgA, IgG и IgM связываются с соответствующими антигенами. На второй стадии связавшиеся антитела выявляют флуоресцентным окрашиванием, которое происходит в результате инкубации стекол с меченными флюоресцеином антителами к соответствующим иммуноглобулинам человека. Характер свечения оценивается с помощью флуоресцентного микроскопа. МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ Необходимые реагенты и материалы, входящие в набор FA 1572-1005 на 50 определений Формат Символ Компоненты набора 1. Предметные стекла, каждое с 5 биочипами, покрытых мазками Crithidia SLIDE 10 шт. luciliae 2. Конъюгат меченные флюоресцеином антитела к IgG человека (козы); готовый к CONJUGATE 1 × 1,5 мл использованию 3. Положительный контроль содержащий аутоантитела к двуспиральной ДНК, человека; готовый к POS CONTROL 1 × 0,1 мл использованию 4. Отрицательный контроль NEG CONTROL 1 × 0,1 мл не содержит аутоантител, человека; готовый к использованию 5. Соли для ФСБ (фосфатно-солевого буферного раствора, PBS), рН 7,2 PBS 2 шт. 6. Твин 20 TWEEN 20 2 × 2,0 мл 7. Среда для заливки; GLYCEROL 1 × 3,0 мл готовая к использованию 8. Покровные стекла (62 мм × 23 мм) 12 шт. COVERGLASS 1 шт. 9. Инструкция к набору Серия Температура хранения Для in vitro диагностики Невскрытый набор использовать до Отдельные предметные стекла поставляются вместе с покровными стеклами (например, номер по каталогу FB 1572-1005). Также можно заказать дополнительно положительный контроль (например, номер по каталогу CА 1572-0101) и отрицательный контроль (например, номер по каталогу CА 1000-0101). Для проведения теста необходимы шаблоны-подложки TRAY, которые не включены в состав набора. Их можно заказать у фирмы EUROIMMUN: ZZ 9999-0110 для предметных стекол, включающих до 10 зон. ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ НАБОРА Предметные стекла должны храниться при температуре от минус 40 °С (не ниже) до 8 °С, остальные реагенты набора - при температуре 2-8 °С. При соблюдении условий хранения стабильность набора гарантируется в течение 18 месяцев со дня изготовления. ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 2 _________________________________________________________________________________________________ УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ Обращайтесь с исследуемыми образцами, контролями и предметными стеклами как с потенциально инфицированными материалами. Все реагенты и материалы, являющиеся отходами, должны утилизироваться в соответствии с действующими нормативами. ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ (реакционные зоны 5 × 5 мм) Техника TITERPLANE разработана фирмой EUROIMMUN с целью стандартизации иммунологических анализов: образцы или меченые антитела вначале наносят на реакционные зоны специального шаблонаподложки. Затем в углубления шаблона-подложки помещают предметные стекла с биочипами, так что сразу все биочипы приходят в соприкосновение с каплями жидкости, и реакция со всеми биочипами начинается одновременно. Расположение и высота капель точно заданы геометрией всей системы. Все жидкости заключены в огороженное пространство, поэтому не нужна обычно используемая в таких случаях ”влажная камера”. Таким образом, можно инкубировать в идентичных условиях любое количество образцов, размещая их один за другим. Подготовка Подготовка реагентов и образцов сыворотки или плазмы крови описаны на стр. 3 и 4 данной инструкции. Нанесение Нанесите по 25 мкл разведенного образца сыворотки или плазмы крови в каждую реакционную зону шаблона-подложки. Избегайте образования пузырьков воздуха. Нанесите до начала инкубации все образцы, исследуемые в данной постановке анализа (до 200 капель). Для удобства используйте полистироловый шаблон для нанесения. Инкубация образцов (1-я стадия) Начните все реакции одновременно, поместив предметные стекла с биочипами в соответствующие углубления шаблона-подложки. Следите, чтобы каждый образец контактировал с биочипом на предметном стекле и чтобы отдельные образцы не соприкасались друг с другом. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С). Промывка Ополосните предметные стекла в течение 1 секунды под струей буфера ФСБ-Т (используйте стакан или колбу), поместите их сразу в промывочную кювету, содержащую ФСБ-Т, и промывайте в течение как минимум 5 минут. По возможности используйте встряхивание на шейкере орбитального типа. После промывки максимум 16 слайдов вылейте буфер и залейте новую порцию. Нанесение Нанесите по 20 мкл меченных флюоресцеином антител к глобулинам человека в каждую реакционную зону чистого шаблона-подложки. Все капли реагента должны быть нанесены до начала 2-й инкубации. Для нанесения используйте пипеткустеппер. Перед использованием меченые антитела необходимо перемешать с помощью пипетки. Для экономии времени можно нанести конъюгат на отдельный шаблон-подложку пока идет инкубация с разведенными образцами сыворотки или плазмы крови. Инкубация конъюгата (2-я стадия) Извлеките одно предметное стекло с биочипом из кюветы с буфером ФСБ-Т, в течение пяти секунд бумажной салфеткой протрите только заднюю сторону и края по длине стекла и сразу поместите предметное стекло с биочипами в углубления шаблона-подложки. Не высушивайте области между реакционными зонами. Следите, чтобы каждая капля конъюгата контактировала с биочипом на предметном стекле. Затем ту же процедуру проделайте со следующими предметными стеклами. С этого момента предохраняйте стекла от воздействия прямых солнечных лучей. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С). Ополосните предметные стекла в течение 1 секунды под струей буфера ФСБ-Т (используйте стакан или колбу), поместите их сразу в промывочную кювету, содержащую ФСБ-Т, и промывайте в течение как минимум 5 минут. По возможности используйте встряхивание на шейкере циркуляторного типа. Для контрастного окрашивания на каждые 150 мл фосфатного буфера можно добавить 10 капель красителя Эванса голубого. После промывки максимум 16 слайдов вылейте буфер и залейте новую порцию. Нанесите среду для заливки на покровное стекло – капли объемом 10 мкл на Заливка каждую реакционную зону. Используйте полистироловый шаблон для заливки. Извлеките одно предметное стекло с биочипами из кюветы с буфером ФСБ-Т, бумажной салфеткой протрите заднюю сторону, все четыре края стекла, а также всю поверхность вокруг, но не между реакционными зонами. Положите предметное стекло биочипами вниз на подготовленное покровное стекло. Сразу проверьте, чтобы покровное стекло попало в прорези предметного стекла. При необходимости скорректируйте положение стекол. ___________________________________________________________________________________________ Промывка © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 3 _________________________________________________________________________________________________ Учет результатов Флюоресценцию оценивают с помощью микроскопа. Объектив: для срезов органов 20х, для инфицированных клеток 20х, для клеточных субстратов 40х. Фильтр возбуждения: 488 нм, цветоделительное устройство: 510 нм, блокирующий фильтр: 520 нм. Источник света: ртутная лампа, 100 ватт, EUROIMMUN LED, EUROStar Bluelight. ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ Примечание. Реагенты каждой серии подобраны друг к другу, поэтому не следует смешивать в одном анализе реагенты разных серий. После первого использования все реагенты стабильны до истечения указанного срока годности при хранении при температуре 2-8°С и предохранении от микробной контаминации, если ниже не оговорены особые условия хранения. - Предметные стекла с биочипами Предметные стекла готовы к использованию. Снимите предохраняющую упаковку со стекла только после того, как стекло прогреется до комнатной температуры во избежание конденсации влаги и повреждения субстрата. Промаркируйте стекла фломастером с мягким стержнем. Не дотрагивайтесь до биочипов. После вскрытия упаковки предметные стекла с биочипами должны быть проинкубированы в течение 15 минут. Если предохраняющая упаковка повреждена, стекло нельзя использовать для диагностики. - Меченные флюоресцеином вторичные антитела (ФИТЦ) Меченые антитела готовы к использованию. Перед использованием меченые антитела необходимо тщательно перемешать с помощью пипетки. Конъюгат чувствителен к свету. Предохранять от воздействия солнечных лучей. - Положительный и отрицательный контроли Контроли готовы к использованию. Перед использованием контроли необходимо тщательно перемешать с помощью пипетки. - ФСБ-Т 1 упаковку «Соли для ФСБ» следует растворить в 1 л дистиллированной воды (оптимальной является вода для вливаний, вода для инъекций) и смешать с 2 мл твина 20. Приготовленный ФСБ-Т стабилен в течение 1 недели при хранении при температуре 2-8 °С и соблюдении правил использования. Если раствор ФСБ-Т помутнел или в нем появился пророст, использовать его нельзя. - Среда для заливки Готова к использованию. - Шаблоны-подложки Поверхность реакционных зон шаблона-подложки должна быть гидрофильна, а поверхность вокруг этих зон - гидрофобна. Если необходимо, протрите их обезжиривающим реагентом (например, Extran MA 01, “Merck”) и промойте большим количеством воды. Для дезинфицирования погрузите шаблон-подложку на 1 час в дезинфицирующий раствор (например, в 3% раствор Sekusept Extra, “Henkel”). После дезинфицирования промойте шаблон-подложку большим количеством воды и протрите ее фильтровальной бумагой. Внимание! Биочипы, покрытые антигенным субстратом, обработаны дезинфицирующим фиксирующим реагентом. Контроли были проверены на отсутствие антигена гепатита В, а также антител к вирусу гепатита С, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью методов иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлюоресценции. Однако, все компоненты тест-системы следует считать потенциально инфекционно опасными материалами и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры предосторожности. Часть реагентов содержит токсичный азид натрия. Избегайте контакта реагентов с кожей. ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ Исследуемые образцы Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека. Стабильность Исследуемые образцы сыворотки или плазмы крови могут храниться до 14 дней при температуре 2-8 °С. Разведенные образцы следует исследовать в течение одного рабочего дня. Рекомендуемые разведения образцов для качественного анализа Образцы сыворотки или плазмы крови пациентов разводят 1:10 буфером ФСБ-Т. Например, разведите 11,1 мкл исследуемого образца в 100 мкл ФСБ-Т и тщательно перемешайте (например, на вортексе в течение 4 секунд). Рекомендуемые разведения образцов для полуколичественного анализа Образцы сыворотки или плазмы крови пациентов разводят буфером ФСБ-Т. При разведении каждого из образцов в пробирку вносят 100 мкл ФСБ-Т и 11,1 мкл предыдущего более концентрированного ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 4 _________________________________________________________________________________________________ разведения, затем смесь перемешивают (например, на вортексе в течение 2 секунд). Для анализа фирма EUROIMMUN рекомендует использовать образцы, начиная с разведения 1:10. Разведение Схема разведения 1:10 100 мкл ФСБ-Т + 11,1 мкл неразведенного образца 1:100 100 мкл ФСБ-Т разведенного 1:10 + 11,1 мкл 11.1 образца, 11.1 1:1000 100 мкл ФСБ-Т + разведенного 1:100 11,1 мкл образца, После каждых двух шагов разведения следует сменить наконечники на новые для предотвращения переноса ... ... Не использовать для разведения образцов пациентов буфер содержащий бычий сывороточный альбумин. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Образец положительной реакции флюоресценции Высокий титр аутоантител к двуспиральной ДНК (dsDNA) может быть выявлен при использовании субстрата из НЕр-2 клеток и различных срезов тканей, но иммунофлуоресцентное исследование с этими субстратами не обладает достаточной чувствительностью. Таким образом, в качестве стандартного субстрата для выявления именно антител к dsDNA используются клетки простейшего жгутикового микроорганизма Crithidia luciliae. У основания жгутика в клетках критидий расположена гигантская митохондрия (кинетопласт), содержащая единственный ядерный антиген – двуспиральную ДНК. Антитела реагирующие с кинетопластом направлены только против dsDNA. При наличии антител выявляют четкое, гомогенное, частично кольцевое флуоресцентное свечение кинетопласта. Картина флуоресцентного свечения совпадает с таковой у положительной контрольной сыворотки. При отсутствии антител флуоресцентное окрашивание кенетопласта отсутствует. Клетки Crithidia luciliae должны четко идентифицироваться в каждом обследуемом поле, предпочтительно в нескольких областях. Реакцию клеточных ядер, базального тела (основания жгутика) или цитоплазмы не учитывают. Если положительный контроль не дает четкого флуоресцентного свечения или наблюдается явное флуоресцентное свечение отрицательного контроля, результаты анализа не учитывают, тест следует повторить. Качественный анализ Антитела dsDNA Оценка Отсутствие реакции при Отрицательная. В сыворотке пациента антитела к двуспиральной ДНК разведении 1:10 отсутствуют. Положительная реакция при Положительная. Указывает на системную красную волчанку. разведении 1:10 На сайте фирмы EUROIMMUN (www.euroimmun.com) можно найти множество примеров картин флуоресцентного свечения. Полуколичественный анализ Титр определяют как последнее разведение образца, при котором специфическая флюоресценция еще вполне отчетлива. При этом следует проводить сравнение с реакцией, полученной при эквивалентном разведении отрицательной сыворотки. Титр антител можно оценить по результатам флюоресценции, полученным при различных разведениях образца, используя следующую таблицу. 1:10 слабая умеренная сильная сильная сильная сильная Флюоресценция при разведении образца 1:100 1:1000 отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует слабая отсутствует умеренная отсутствует сильная слабая сильная умеренная 1:10 000 отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует Титр антител 1:10 1:32 1:100 1:320 1:1000 1:3200 ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 5 _________________________________________________________________________________________________ сильная . . . сильная . . . сильная . . . слабая . . . 1:10 000 . . . При постановке диагноза наряду с серологическими результатами следует всегда учитывать и клинические симптомы. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Антиген Для определения аутоантител к двуспиральной (нативной) ДНК (dsDNA, nDNA) с помощью непрямой иммунофлуоресценции сегодня преимущественно используются клетки патогенного для животных простейшего жгутикового микроорганизма Hemoflagellates Crithidia luciliae. У основания жгутика в клетках критидий расположена гигантская митохондрия (кинетопласт), не содержащая никаких ядерных антигенов кроме двуспиральной ДНК. Поэтому антинуклеарные антитела, реагирующие с кинетопластом, направлены только против антигенов двуспиральной ДНК. ИФА набор EUROIMMUN Anti-dsDNA-ELISA более чувствительный, чем непрямая иммунофлуоресценция с использованием клеток Crithidia luciliae, но метод НРИФ более специфичен при таком заболевании как системная красная волчанка и считается подтверждающим при наличии соответствующих клинических симптомов. Стабильность При соблюдении условий хранения стабильность набора гарантируется в течение 18 месяцев со дня изготовления. Диапазон определения Начальным для данной тест-системы является разведение 1:10. Далее образцы можно разводить с шагом 10, так что получается серия разведений 1:100, 1:1000 и т.д. Верхнего предела определения нет. Воспроизводимость в пределах одной постановки Воспроизводимость в пределах одной постановки оценивали по 10 определениям двух охарактеризованных образцов, инкубируемых параллельно. При полуколичественном анализе отклонения интенсивности флюоресценции отсутствовали. Интенсивность специфической флюоресценции в числовом выражении фирмой EUROIMMUN называется уровнем интенсивности флюоресценции. Эта величина может измеряться числами от «0» (отсутствие специфической флюоресценции) до «5» (чрезвычайно высокая степень специфической флюоресценции). Воспроизводимость между постановками Воспроизводимость между постановками оценивали более чем по пяти двойным определениям каждой их двух охарактеризованных образцов, инкубируемых в параллели в два разных дня. При полуколичественном анализе отклонения интенсивности флюоресценции отсутствовали. Воспроизводимость между сериями Воспроизводимость между сериями оценивали более чем по 10 различным сериям с помощью охарактеризованного образца. При полуколичественном анализе отклонения составляли не более + 1 уровня интенсивности флюоресценции. Перекрестные реакции Перекрестные реакции исследовали на двух панелях (n=28 сывороток положительных на антитела к одноцепочечной ДНК и 20 сывороток положительных на IgG антитела к гистонам). На обеих панелях образцов перекрестной реактивности с Crithidia luciliae выявлено не было. Влияние гемоглобина, триглицеридов и билирубина Не отмечено искажения результатов при исследовании данным набором гемолизированных, липемических или желтушных образцов сывороток. Референтный диапазон Титр 1: < 10 Специфичность и чувствительность Специфичность и чувствительность тест системы анализировали в двух независимых исследованиях на панели из 1129 предварительно охарактеризованных образцов пациентов и 200 здоровых доноров крови. Чувствительность тест системы на панели образцов (n=394) с симптоматикой системной красной волчанки (СКВ) составила 37%, специфичность (n=935) – 99%. ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 6 _________________________________________________________________________________________________ Исследование 1: n Crithidia luciliae (anti-dsDNA) IIFT Crithidia luciliae sensitive (anti-dsDNA) IIFT Anti-dsDNANcX-ELISA Anti-dsDNA-RIA СКВ 194 68 (35%) 114 (59%) 94 (48%) 111 (57%) Чувствительность 194 68 (35%) 114 (59%) 94 (48%) 111 (57%) Склеродермия 130 4 (97%) 9 (93%) 6 (95%) 2 (98%) n=129 Дерматомиозит/ полимиозит 178 3 (98%) 11 (94%) 5 (97%) 7 (96%) Ревматоидный артрит 227 4 (98%) 21 (90%) 8 (96%) 4 (94%) n=71 Специфичность 535 11 (98%) 41 (92%) 19 (96%) 13 (97%) n=378 Исследование 2: n Crithidia luciliae (antidsDNA) IIFT Crithidia luciliae sensitive (anti-dsDNA) IIFT Anti-dsDNA-NcX-ELISA СКВ 200 79 (40%) 126 (63%) 126 (63%) Чувствительность 200 79 (40%) 126 (63%) 126 (63%) Ревматоидный артрит 30 0 (100%) 3 (90%) 3 (90%) Синдром Шегрена 60 1 (98%) 9 (85%) 6 (90%) Коллагеноз 40 2 (95%) 4 (90%) 5 (88%) Здоровые доноры крови 70 0 (100%) 0 (100%) 0 (100%) Специфичность 200 3 (99%) 16 (92%) 14 (93%) n Здоровые доноры крови 200 Crithidia luciliae (anti-dsDNA) IIFT 0 (100%) Crithidia luciliae sensitive (anti-dsDNA) IIFT 2 (99%) КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Выявление антител к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) играет важную роль в диагностике системной красной волчанки (СКВ). Антитела к ДНК можно разделить на два типа: антитела к двуспиральной (нативной) ДНК (dsDNA, nDNA) и антитела к односпиральной (денатурированной) ДНК (ssDNA). Антитела к двуспиральной ДНК направлены в основном к внешним эпитопам дезоксирибозофосфатного остова двойной спирали. С другой стороны, антитела к односпиральной ДНК направлены к полимерам пуриновых или пиримидиновых оснований. Однако они могут распознавать также и эпитопы дезоксирибозофосфатного остова. Антитела к двуспиральной ДНК выявляются практически только при системной красной волчанке (СКВ), известной также как диссеминированная красная волчанка. Степень распространенности антител к двуспиральной ДНК составляет от 20 до 90% в зависимости от метода определения и активности заболевания. Следует отметить тот факт, что у 85 % изначально здоровых пациентов, но у которых были обнаружены антитела к dsDNA, в течение первых пяти лет после обследования развилась системная красная волчанка. Однако отрицательный результат при выявлении антител к dsDNA не может полностью гарантировать отсутствие СКВ. Системная красная волчанка – это системное аутоиммунное заболевание, относящееся к группе системных болезней соединительной ткани (коллагенозов). Термин «волчанка» произошел из-за внешнего сходства поражений кожи на лице, вызываемых СКВ, и волчьих укусов. Диагностика СКВ базируется на 11 так называемых критериях АРА (Американская Ревматологическая Ассоциация), которые были переименованы в 1988 году в критерии ACR (ACR = Американский Ревматологический Колледж) и обновлены в 1997 году. Если выявляются 4 признака из 11, то вероятность диагноза системная красная волчанка составляет от 80 до 90%. Критерии СКВ следующие: 1. Эритема в форме бабочки (красные высыпания на лице, распространяющиеся на обе щеки), 2. Дискоидные высыпания (красная, чешуйчатая, приподнятая четко очерченная сыпь на остальных частях тела), 3. Фотосенсибилизация, 4. Изъязвления слизистых оболочек полости рта, 5. Артрит (неэрозивный артрит двух или более периферических суставов с болезненностью, припуханием или выпотом), 6. Серозит (воспаление так называемой серозной ткани, например плевры или перикарда), 7. Почечные нарушения (стойкая протеинурия более 0,5 г/сут или цилиндрурия), ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 7 _________________________________________________________________________________________________ 8. Неврологические нарушения (судороги, припадки, психоз), 9. Гематологические нарушения (гемолитическая анемия с ретикулоцитозом, лейкопения, лимфопения или тромбоцитопения), 10. Иммунологические нарушения (выявление антител к dsDNA, антитела к Sm-антигену (антигену Смита), антитела к кардиолипину), 11. Антинуклеарные антитела в РНИФ. Французский врач П. Л. А. Казенав первым в 1851 году описал данное заболевание. Согласно оценкам, в Германии около 40,000 человек (чаще всего молодые женщин репродуктивного возраста) страдают от СКВ. Распространенность СКВ в Европе составляет 25-27 новых случаев на 100,000 в год, а в США чуть выше. Вероятность того, что пациент проживет более 5 лет после постановки диагноза СКВ, составляет около 95%, более 10 лет – около 85%. Было доказано, что антитела к dsDNA в высокой степени участвуют в патогенезе системной красной волчанки. При данном заболевании иммунные комплексы двуспиральной ДНК и соответствующих аутоантител откладываются в капиллярах подкожной клетчатки, почек и других органов, что ведет к повреждению тканей после активации системы комплемента. Есть вполне обоснованные предположения, что для патогенетически значимых антител первичным целевым антигеном является не «голая» ДНК, а комплекс ДНК с нуклеосомами. Серологические тесты играют важную роль при постановке диагноза СКВ в комплексе с ACR критериями. Из-за высокой специфичности (70-98% в зависимости от метода определения) антитела к двуспиральной ДНК считаются одним из наиболее важных критериев в диагностике СКВ. Так как концентрация антител коррелирует с активностью заболевания, а особенно с активностью волчаночного нефрита, то определение титра антител является удобным средством мониторинга терапии. В настоящее время наиболее распространенных методов для диагностики антител к dsDNA три: иммуноферментный анализ (ИФА – ELISA, мини-блот – EUROASSAY, иммуноблот – EUROLINE), радиоиммунный анализ по методу Фарра (Farr RIA) и иммунофлуоресцентный тест с клетками Crithidia luciliae в качестве субстрата. Так как все эти диагностические методы определяют различные группы антител и сильно отличаются по чувствительности и специфичности, во многих лабораториях для дополнения и подтверждения результатов диагностики СКВ предпочитают комбинацию двух или трех из вышеуказанных методов. В наборе Crithidia luciliae dsDNA IIFT, основанном на методе НРИФ, в качестве субстрата для определения антител к нативной, двуспиральной ДНК (dsDNA, nDNA) используются клетки патогенного для животных простейшего жгутикового одноклеточного микроорганизма Crithidia luciliae. В клетке критидии расположена гигантская митохондрия, содержащая dsDNA (кинетопласт) и не содержащая никаких других ядерных антигенов. Поэтому антинуклеарные антитела, реагирующие с кинетопластом, направлены только против антигенов двуспиральной ДНК. Флуоресцентное свечение всей клетки Crithidia luciliae или только ядра клетки, или только базального тела (основание жгутика) должно расцениваться как отрицательная реакция на антитела к двуспиральной ДНК. Положительной реакцией считается гомогенная флуоресценция кинетопласта или ядра вместе с кинетопластом. Перекрестные реакции других антител с специфической структурой антигена не известны. По причине своей высокой специфичности для диагностики именно СКВ тест, основанный на реакции непрямой имунофлуоресценции с Crithidia luciliae в качестве субстрата, является одним из наиболее достоверных для диагностики пациентов с характерной симптоматикой и подозрением на данное заболевание. Мониторинг активности СКВ рекомендуется проводить с использованием ИФА набора Anti-dsDNA ELISA. Высокие уровни антител к двуспиральной ДНК, определенные с помощью радиоиммунного анализа по методу Фарра (Farr RIA), также считаются достоверным критерием диагностики СКВ. Изменение концентрации антител к dsDNA коррелирует с активностью заболевания, поэтому может считаться хорошим прогностическим критерием. Необходимо также упомянуть об еще одном тесте для серодиагностики СКВ. С использованием метода специальной биохимической подготовки была разработана новая ИФА тест-система для определения антител к dsDNA (Anti-dsDNA-NcX-ELISA), превосходящая по качеству диагностики критерии метода Фарра (аnti-dsDNA RIA). Антиген, иммобилизованный на твердой фазе, состоит из двуспиральной ДНК связанной с нуклеосомами (NcX). Высокая специфичность данного теста достигается использованием очень тонкого слоя высокоочищенной фракции нуклеосом, не содержащей H1, Scl-70 и других негистоновых белков. В отличие от традиционного набора Anti-dsDNA ELISA, в новом наборе нет необходимости использовать связывающие вещества, такие как поли-L-лизин или протаминсульфат, которые представляют собой потенциальные источники неспецифических реакций. Набор Anti-dsDNA-NcX-ELISA предназначен для полуколичественного и количественного in vitro определения человеческих антител класса IgG к двуспиральной, геномной ДНК в сыворотке или плазме крови. Этот тест очень полезен не только как прогностический маркер, а также для определения титра антител при мониторинге заболевания. По разнообразию и количеству критериев ACR видно, что коллагенозы, такие как СКВ, могут проявляться самыми разнообразными путями и затрагивать различные органы и системы. Необходимо принимать во внимание, что другие серологически определяемые антитела в дополнение к антителам к dsDNA могут отвечать за индивидуальную картину заболевания. Поэтому иногда необходимо также проводить ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 8 _________________________________________________________________________________________________ исследования на наличие антител к нуклеосомам, Sm, nRNP/Sm (U1-nRNP), SS-A (Ro), SS-B (La), рибосомальные P-протеины и другие антигены клеточного ядра. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке. Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см. внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо руководствуйтесь оригиналом инструкции. Crithidia luciliae (nDNA)_FA1572.doc 9/7/2009 4:50:00 PM Оригинал: FA_1572_A_UK_C06.doc Stand:17.07.2009 13:06 Техника TITERPLANE ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Crithidia luciliae (anti dsDNA) IIFT, EUROIMMUN 9 _________________________________________________________________________________________________ Слайды для непрямой иммунофлуоресценции могут быть изготовлены как с одним субстратом, так и с мозаикой Биочипов (до 45 различных субстратов в соответствии с Вашими требованиями). Щитовидная железа, околощитовидная железа, поджелудочная железа, надпочечная железа, яичник, плацента, яички, сперматозоиды, гипофиз, гипоталамус*, головной мозг, мозжечок, варолиев мост*, черная субстанция*, периферические нервы, спинной мозг, глаз*, гранулоциты (фиксированные этанолом или формальдегидом), лимфоциты*, тромбоциты, почка, легкое*, печень, слизистая рта, тело желудка, полость желудка, тонкая кишка, прямая кишка, пупочный канатик, молочная железа*, слезная железа*, околоушная железа, простата*, семенные пузырьки, скелетная мускулатура, миокард, тимус*, липоциты*, хрящ*, эпидермис, пищевод, язык, губы*, меланоциты*, клетки НЕр-2, клетки НЕр-20-10, почка крысы, почка мыши, желудок крысы, желудок мыши, печень крысы, печень мыши, пищевод крысы, мочевой пузырь крысы, Crithidia luciliae и другие. Аденовирусы, Afipia felis*, Bartonella clarridgeiae, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii, Candida albicans, Candida glabrata*, Candida krusei*, Candida tropicalis*, Candida parapsilosis*, Campylobacter coli*, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psitacci*, ЦМВ, вирусы Коксаки (А7, А9, А16, А24, от В1 до В6), EBV-CA, EBNA, EBV-EA, Echinococcus granulosus, эховирусы, вирус клещевого энцефалита, Haemophilus influenzae*, Helicobacter pylori, ВИЧ-1*, ВИЧ-2*, HHV-6, ВПГ-1, ВПГ-2, HUVEC, вирус гриппа А (штамм Шэнгдонг, Сингапур и Пекин), вирус гриппа В (штамм Панама), Klebsiella pneumoniae*, Legionella bozemanii*, Legionella dumoffii*, Legionella gormanii*, Legionella jordanis*, Legionella longbeachae*, Legionella micdadei*, Legionella pneumophila от 1 до 14, Leishmania donovani, Listeria monocytogenes (1/2a и 4b)*, корь, паротит, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, парагрипп типов 14, вирус краснухи, респираторно-синцитальный вирус, вирус тяжелого острого респираторного синдрома, Saccharomyces cerevisiae, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Treponema phagedaenis*, Ureaplasma urealiticum, вирус опоясывающего герпеса, Yersinia enterocolitica (O:3, О:4, О:6 и О:9)*. EUROPLUS®: почка крысы плюс АМА М2, желудок примата (париетальные клетки) плюс внутренний фактор, кишечный тракт примата (эндомизий) плюс глиадин. * На данный момент не могут быть использованы в Евросоюзе ___________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
