Получение онкогенных мутантов рецепторных тирозинкиназ

УДК 577.22
1,2
2
2
1,2
2,1
Мишин А.В. , Бочарова О.В. , Бочаров Э.В. , Минеев К.С. , Арсеньев А.С.
1
2
Московский Физико-Технический Институт (Государственный Университет)
Институт Биоорганической Химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова Российской Академии Наук
Получение онкогенных мутантов рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB
ErbB2 (HER-2) входит в состав семейства тирозинкиназных рецепторов ErbB (или подругому семейства EGFR – epidermal growth factor receptor), состоящего из четырех
функционально взаимосвязанных рецепторных молекул, которые играют важную роль в
клеточной
пролиферации,
дифференцировке
и
апоптозе.
Недостаток
экспрессии
рецепторов данного семейства приводит к нейродегенеративным заболеваниям, таким как
множественный склероз и болезнь Альцгеймера. Напротив, аномальная активность
приводит к возникновению злокачественных опухолей разных типов.
Рецепторы ErbB2 являются важными для исследователей, т.к. они играют роль в
патогенезе рака молочной железы и, детально исследовав нарушения в их работе, можно
придумать пути лечения. В норме они участвуют в процессах роста и дифференциации
клеток, при этом не имея своего собственного лиганда. Они образуют гетеродимеры с
другими представителями ErbB. Ген ErbB2 является протоонкогеном, т.е. мутации в нём
вызывают необратимые изменения в функционировании рецептора. Вводя направленные
мутации в этом гене и получая in vitro модифицированные рецепторы, исследователи
могут установить их структуру, изменение функции и понять какие мутации являются
ключевыми в процессе патогенеза [1].
Внеклеточные, трансмембранные и цитоплазматические домены участвуют в
димеризации рецепторов. У крыс имеются рецепторы, гомологичные человеческим ErbB2.
Обнаружили, что у них замена в 664 положении гидрофобной аминокислоты Val на
гидрофильную Glu (V664E) вызывает крысиную глиобластому [1]. Пока такая мутация не
найдена в человеческих рецепторах. Однако сверхэкспрессия ErbB2 приводит к ненужной
активации рецептора и появлению опухолей и в отсутствие лигандов. Предполагается, что
механизм активации и трансформации ErbB2 в человеческих опухолях сходен с
аналогичным механизмом у крыс. Замена V659E в трансмембранном домене ErbB2 (эта
замена функционально соответствует замене V664E в крысином гомологе) приводит к
постоянной тирозинкиназной активности [2].
Проводилось множество исследований роли трансмембранного сегмента в
активации рецептора, которые показали, что димеризация необходима, но недостаточна
для трансформации рецептора. Более того, трансмембранный фрагмент в рецепторном
димере играет ключевую роль в создании правильной ориентации киназных доменов друг
относительно друга, обеспечивая фосфорилирование тирозинов.
То, что регуляция образования димеров и активации рецепторов осуществляется
трансмембранным доменом уже практически не вызывает сомнения, что подтверждается
изменением функциональности рецептора при замене его трансмембранной части[3].
В данной работе описано получение очищенного препарата трансмембранного
фрагмента рецептора ErbB2, содержащего мутацию V659E. Подобраны оптимальные
условия экспрессии гена ErbB2-V659E в клетках E.coli при культивировании клеток на
богатой и минимальной средах. Отработана схема выделения и очистки белка ErbB2V659E, с использованием металл-хелатной хроматографии на полигистидиновом линкере,
ионообменной хроматографии на SP-сефарозе, обращённо-фазовой высокоэффективной
жидкостной хроматографии. Получены белковые образцы без изотопной метки, а также
изотопно-меченые варианты 15N-ErbB2-V659E и 15N/13С-ErbB2-V659E в количествах,
пригодных для структурных исследований методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии.
Все образцы первично охарактеризованы методом ЯМР-спектроскопии.
Литература
1. Holbro, T. and Hynes, N.E. The ErBb family of receptor tyrosine kinases and tumor cell
biology // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol..- 2004. - V. 44. - P.195-217.
2. Norbert Garnier, Serge Crouzy, Monique Genest. Molecular Dynamics Simulations of the
Transmembrane Domain of the Oncogenic ErbB2 Receptor Dimer in a DMPC Bilayer //
Journal of Biomolecular Structure &Dynamics.-2006. - V. 21, N 2. – P. 739-746.
3. C. I. Bargmann, M. C. Hung and R. A. Weinberg. Multiple independent activations of the
ErBb oncogene by a point mutation // Cell - 2003. - V.45 ,N 12. - P. 649-657.