Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Филатова Людмила К.б.н Менеджер по продукции Генетические технологии – не роскошь, а средство ( Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Основные направления развития диагностических технологий, использующих ПЦР ♦Мультиплексный анализ ♦Миниатюризация ♦Автоматизация Повышение пропускной способности Снижение стоимости определения одного параметра/аналита Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Процедура анализа в молекулярной диагностике ♦Пробоподготовка (выделение ДНК/РНК) ♦Амплификация ♦Детекция ♦Интерпретация результатов Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Пробоподготовка Автоматические станции пробоподготовки: ♦Минимизация ручного труда/ошибок оператора ♦Снижение риска перекрёстной и внешней контаминации ♦В зависимости от исходного материала и используемой технологии выделения возможно существенное сокращение времени работы (20-30 мин) ♦Доступны системы различной производительности для адаптации к нуждам лаборатории ♦Простая интеграция с ЛИС Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Пробоподготовка Автоматические станции пробоподготовки: iPrep Bullet Arrow Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Система MutaCHIP - мультиплексный анализ на макрочипах 1. ПЦР (~1.5 часа) 2. Гибридизация (2 часа) 3-4. Автоматические детекция и интерпретация результатов (1 мин) Биотинилированные ампликоны Конъюгат ПХ-СА ТМБ Гибридизация Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Система MutaCHIP - мультиплексный анализ на макрочипах 1. Дигидропиримидин дегидрогеназа (DPYD) дезактивирует 5-FU, препарат, применяемый при онкологических заболеваниях. 2. Некоторые мутации приводят к снижению активности фермента и увеличивают риск токсических побочных эффектов. Применение стандартных доз 5-FU к пациентам, гомозиготным по полиморфизму *2А, может привести к летальному исходу. 3. FDA не рекомендует прописывать 5-FU пациентам с дефицитом активности DPYD. Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Перечень наборов MutaCHIP ♦ MutaCHIP TAMOX (полиморфизм CYP2D6, подбор дозы тамоксифена) ♦ MutaCHIP 5-FU (полиморфизм DPYD, подбор дозы 5-FU) ♦ MutaCHIP CYTO (полиморфизм генов лекарственного метаболизма: CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5, CYP2D6, DPYD) ♦ MutaCHIP CF (диагностика муковисцидоза, 47 мутаций) ♦ MutaCHIP FOOD (диагностика предрасположенности к пищевой непереносимости – гиполактазия, целиакия и т.п.) ♦ MutaCHIP CARDIO (мутации АПФ, полиморфизмы ApoE, FV/II, МТГФР, CETP ♦MutaCHIP OSTEO (мутации в генах COL1A1, рецепторов эстрогена, кальцитонина, витамина D3) Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Автоматический ПЦР-анализатор Наночип 400 1. ПЦР (~1.5 часа) 2-4. Полностью автоматизированные процедуры гибридизации, детекции и интерпретации результатов (64 образца/6 часов, до 192 ) ♦ Чип = микрореактор, через который можно последовательно прокачивать различные растворы ♦ В одном чипе можно анализировать образцы от разных пациентов по нескольким (до нескольких десятков) параметров ♦ Чип многоразового использования (до 10 загрузок в течение 2 мес. после первого использования) Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Кол-во образцов Чипы высокой плотности Real-time PCR Кол-во маркеров Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Перечень наборов Наночип 400 ♦ CF 14 (диагностика муковисцидоза, 14 мутаций); готовится к выпуску CF 20 ♦AJP 11 (диагностика дефицита альфа1-антитрипсина, синдрома Блума, апластической анемии Фанкони, семейной дизавтономии, болезни Гоше, муколипидоза IV и т.д., 18 мутаций) ♦ CYP (полиморфизмы генов цитохрома P450: CYP2C9/VKORC1 (14 полиморфизмов), CYP2D6 (18 полиморфизмов), CYP2C19 (7 полиморфизмов) ♦Инфекционные панели (HPV, респираторная, трансплантационная, гастро- панели, MTB, сепсис, возбудители передающиеся половым путем) Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Основные направления развития диагностических технологий, использующих ПЦР ♦Мультиплексный анализ ♦Миниатюризация ♦Автоматизация Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Метод MLPA (мультиплексная амплификация лигазно-связанных проб) Необходимое оборудование ♦ Амплификатор и секвенатор. ♦ Получение результата в течение 24 часов. ♦ До 96 образцов исследуются в одном эксперименте. + Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Метод MLPA (мультиплексная амплификация лигазносвязанных проб) Последовательность, комплементарная ПЦР-праймеру X 1. Денатурация и гибридизация Комплементарная последовательность Последовательность, комплементарная ПЦРпраймеру Y ДНК А 2. Лигирование Вставка ДНК Б 3. ПЦР Лигаза ДНК А Лигаза Каждый ампликон имеет уникальную длину 130-480 по ДНК Б 4. Разделение ампликонов капиллярным электрофорезом Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Как работает MLPA ♦ Один зонд для MLPA состоит из двух олигонуклеотидов. ♦ Если последовательность, комплементарная зонду, присутствует в образце, то оба олигонуклеотида гибридизуются друг за другом. ♦ Гибридизованные олигонуклеотиды сшивает лигаза. ♦ Лигированные олигонуклеотиды становятся единым зондом и амплифицируются в ПЦР. Происходит амплификация не нуклеиновых кислот образца, а зонда. ♦ ПЦР характеризуется высокой воспроизводимостью, поскольку в реакции принимает участие только одна пара праймеров для амплификации всех зондов. ♦ Каждый зонд образует продукт амплификации уникальной длины. ♦ Продукты амплификации (размеры от 130 до 480 нуклеотидов) анализируют методом капиллярного электрофореза. ♦ Различия в относительных количествах последовательностей ДНК отражаются на высоте соответствующих пиков в референсном и исследуемом образцах. Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Перечень наборов MLPA для ♦ Пренатальной и постнатальной диагностики ♦ Диагностики нейрогенетических заболеваний и врождённого слабоумия ♦ Диагностики наследственных видов рака ♦ Характеристики опухолей ♦ Фармакогенетики ♦ Наборы для определения статуса метилирования (эпигенетические заболевания, онкодиагностика) Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Преимущества MLPA ♦ Можно единовременно анализировать до 50 последовательностей, полученных из одного образца ДНК. ♦ Для анализа достаточно 20 нг ДНК (3000 клеток/0,5 мл амниотической жидкости), возможно использование частично деградировавших образцов. ♦ Различает последовательности, отличающиеся всего одним нуклеотидом. ♦ Идентичный протокол для различных приложений увеличивает воспроизводимость и упрощает работу. ♦ Высокая производительность: результаты для 96 образцов (по макс. 50 параметрам каждый) доступны через 24 часа. ♦ Программное обеспечение секвенатора подразумевает точную, объективную и воспроизводимую идентификацию продуктов и автоматическое архивирование данных. Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний Спасибо за внимание! Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний