Выпуск 1

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010
Биология
Вып. 1 (1)
Содержание
Зоология
Мандрица С.А. К размерно-возрастной изменчивости головешки-ротана (Perccottus glenii
Dybowski, 1877) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Есюнин С.Л. Дополнение к фауне пауков (Aranei) Краснодарского края . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
12
Микробиология
Каменских Т.Н., Калашникова Е.А., Ившина И.Б. Особенности криоконсервации алканотрофных
актинбактерий рода Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Нестерова Л.Ю., Ткаченко А.Г. Роль факторов общей стрессорной устойчивости в формировании
резистентности Escherichia coli к фторхинолонам . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Елькин А.А., Кылосова Т.И., Гришко В.В., Ившина И.Б. Биотрансформация арилалкильных
сульфидов целыми клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Филатова Л.Б., Лемкина Л.М., Кононова Л.И., Полюдова Т.В., Коробов В.П. Антибактериальное
действие пептида варнерина опосредовано активацией аутолитических систем атакуемых
бактерий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Шумков М.С., Гончаренко А.В., Кылосова А.М., Ткаченко А.Г. Изменение экспрессии ldcC
Escherichia coli как фактор адаптации к антибиотикам . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Кононова Л.И., Коробов В.П. Физиологические особенности устойчивых к ванкомицину штаммов
коагулазонегативных стафилококков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
21
27
32
36
41
Экология
Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А., Будников В.И. Влияние гидрогелей
полиакриламида на микрофлору почвы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Егорова Д.О., Коршунова И.О., Плотникова Е.Г. Новые галотолерантные штаммы-деструкторы
бифенила рода Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Демаков В.А., Кузнецова М.В., Карпунина Т.И., Николаева Н.В. Гидрофобные свойства и
пленкообразующая способность штаммов рода Pseudomonas, изолированных из разных
экологических ниш . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Коробов В.П., Лемкина Л.М., Монахов В.И. Анализ чувствительности процессов формирования
биопленок Staphylococcus epidermidis 33 к некоторым факторам внешней среды . . . . . . . . . . . . . .
45
50
55
59
Биотехнология
Ноговицина Е.М., Тарасова Е.В., Гришко В.В., Ившина И.Б. Получение стигмаст-4-ен-3-она из βситостерола с использованием актинобактерий рода Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Куюкина М.С., Ившина И.Б., Серебренникова М.К. Оптимизация процесса иммобилизации
клеток алканотрофных родококков на хвойных описках в условиях колоночного биореактора . .
64
69
Медико-биологические науки
Гейн С.В., Баева Т.А., Маерова Е.Д., Тендрякова С.П. Участие каппа-опиатных рецепторов в
регуляции пролиферативной и секторной активности мышиных спленоцитов in vivo . . . . . . . . . .
Заморина С.А., Горбунова О.Л., Ширшев С.В. Хорионический гонадотропин как регулятор
фенотипического созревания интактных и интерлейкин-2-активированных NK- и NKT-клеток .
Правила оформления статей в Вестник Пермского университета. Серия Биология . . . . . . . . . . . .
73
77
81
BULLETIN OF PERM UNIVERSITY
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Biology
Number 1 (1)
Contents
Zoology
Mandrytsa S.A. On the size-age variation of the rotan (Perccottus glenii Dybowski, 1877) . . . . . . . . . . . . .
Esyunin S.L. Addition to spiders’ fauna (Aranei) of Krasnodar Krai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
12
Microbiology
Kamenskikh T.N., Kalashnikova E.A., Ivshina I.B. Cryoconservation features of alkanotrophic
actinobacteria of the genus rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nesterova L.Yu., Tkachenko A.G. The role of general stress adaptation factors in the development of
Escherichia coli fluoroquinolone resistance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Elkin A.A., Kylosova T.I., Grishko V.V., Ivshina I.B. Biotransformation of alkyl aryl sulfides by
Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Filatova L.B., Lemkina L.M., Kononova L.I., Poludova T.V., Korobov V.P. Antibacterial effect of peptide
warnerin mediated by activation of autolytic systems in attacked bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Shumkov M.S., Goncharenko A.V., Kylosova A.M., Tkachenko A.G. Alterations of Escherichia coli ldcC
expression as a factor of adaptation to antimicrobials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kononova L.I., Korobov V.P. Physiological peculiarities of vancomycin-resistant strains of coagulasenegative staphylococci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
21
27
32
36
41
Ecology
Maksimova Yu.G., Maksimov A.Yu., Demakov V.A., Budnikov V.I. The influence of polyacrylamide gels
on soil microflora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Egorova D.O., Korshunova I.O., Plotnikova E.G. New halotolerant strains of the genus Rhodococcus –
degraders of biphenyl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Demakov V.A., Kuznetsova M.V., Karpunina T.I., Nikolaeva N.V. Hydrophobic properties and filmforming abilities of Pseudomonas strains isolated from different ecological niches . . . . . . . . . . . . . . . . .
Korobov V.P., Lemkina L.M., Monakhov V.I. Sensitivity assay for the processes of Staphylococcus
epidermidis 33 biofilm formation with respect to several environmental factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
50
55
59
Biotechnology
Nogovitsina Ye.M., Tarasova Ye.V., Grishko V.V., Ivshina I.B. Stigmast-4-ene-3-one formation from βsitosterol using actinobacteria of the genus Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kuyukina М.S., Ivshina I.B., Serebrennikova M.К. Optimization of the immobilization process for
alkanotrophic rhodococci on a sawdust carrier in the column bioreactor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
69
Medical-biological sciences
Gein S.V., Baeva T.A., Maerova Е.D., Tendryakova S.P. The role of kappa-opiate receptors in the in vivo
regulation of proliferative and secretory activities of mouse splenocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zamorina S.A., Gorbunova O.L., Shirshev S.V. Human chorionic gonadotropin as a regulator of
phenotypic maturation of intact and interleukin-2-activated NK-, and NKT-cells . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
73
77
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
ЗООЛОГИЯ
УДК 591.5
К РАЗМЕРНО-ВОЗРАСТНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ
ГОЛОВЕШКИ-РОТАНА
(PERCCOTTUS GLENII DYBOWSKI, 1877)
С. А. Мандрица
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Сравниваются результаты оценки размерно-возрастной изменчивости формы тела головешки-ротана (Perccottus glenii Dybowski, 1877), полученные методами традиционной и геометрической морфометрии. Наиболее значительные преобразования формы тела ротана в онтогенезе связаны с уменьшением относительных размеров глаз, изменением положения парных
и непарных плавников, а также увеличением относительных размеров заглазничной области
головы.
Ключевые слова: ротан; Perccottus glenii; геометрическая морфометрия; размерно-возрастная изменчивость.
К настоящему времени сведения о размерновозрастной изменчивости формы тела головешкиротана (Perccottus glenii Dybowski, 1877) немногочисленны и не однозначны (Никольский, 1956; Глуховцев, Дукравец, 1986; Скрябин, 1997; Бакланов,
2001 и др.). В данном исследовании сделана попытка дополнить этот раздел знаний о ротане, используя методы геометрической морфометрии.
изученных признаков были проанализированы с
использованием программ TpsUtil, TpsDig,
TpsRegr (Rolhf, 2004, 2005а,b) и CoordGen6f, TwogroupGen6h, ТmorphGen6с и CVAGen6о из блока
программ IMP (Sheets, 2003a,b, 2005a,b), а также
программы Statistica 6.0. В качестве алгоритма выравнивания использовалось наложение Прокруста
(Rolhf, 1990, 1996, 1999). Поскольку примерно
треть пластических признаков имели распределение, статистически значимо отличное от нормального, попарное сравнение выборок было проведено с использованием двух критериев: t-критерия
Стьюдента и U–критерия Манна-Уитни (Болл и
др., 2007).
Следует отметить, что используемые в настоящем исследовании названия линейных промеров
не всегда полностью соответствуют общепринятым в ихтиологии (Правдин, 1966). Поэтому для
корректного восприятия материала следует обращать внимание не только на условные названия
признаков, но и на нумерацию меток, между которыми сделаны соответствующие промеры.
Материал и методы
Краткие сведения об изученном материале
приведены в табл. 1. Цифровые фотографии рыб,
фиксированных в 10% формалине, были получены
с помощью фотоаппарата Canon A620. Положение
опорных точек (меток), по которым анализировалось изменение формы тела рыб в двухмерном
пространстве, приведено на рис. 1.
Для более разносторонней оценки результатов
межвыборочные различия анализировались не
только с помощью критериев, используемых в
геометрической морфометрии, но и с помощью
набора традиционных пластических признаков
(рис. 2), включая их индексы (в % SL). Оба набора
Таблица 1
Характеристика изученного материала
Стандартная длина тела (SL), мм
Число
Место и дата лова
экземпляров
min-max
s
X
Озеро в микрорайоне Юбилейный г. Перми
103
56.9
40.9
7.7–194.4
2.07.05 – 8.11.05
SL – стандартная длина тела (до основания средних лучей хвостового плавника), X – среднее арифметическое,
s – стандартное отклонение, min-max – наименьшее и наибольшее значения признака, соответственно.
© С. А. Мандрица, 2010
4
К размерно-возрастной изменчивости головешки-ротана
5
Рис. 1. Схема положения опорных точек (меток) на теле рыб:
1 – на передней точке головы, 2 – на верхней точке глаза, 3 – на основании первого луча первого спинного плавника,
4 – на основании первого луча второго спинного плавника, 5 – на основании последнего луча второго спинного
плавника, 6 и 9 – на передне-верхней и передне-нижней границах хвостового плавника, соответственно, 7 – на дистальном конце средних лучей хвостового плавника, 8 – на основании средних лучей хвостового плавника, 10 – на
основании последнего луча анального плавника, 11 – на основании первого луча анального плавника, 12 – на основании первого луча брюшного плавника, 13 – на заднем крае нижней челюсти, 14 – на заднем крае верхней челюсти,
15 – на нижней точке глаза, 16 – на передней точке глаза, 17 – на задней точке глаза, 18 – на заднем крае головы, 19 –
на основании верхнего луча грудного плавника, 20 – на основании нижнего луча грудного плавника
Рис. 2. Схема промеров пластических признаков ротана
Результаты и обсуждение
Статистически значимыми (рНо ≤ 0.05) оказались
только первые три главных компонента деформации формы тела ротана в онтогенезе (рис. 3), объясняющие 61, 29 и 6.9 % общей дисперсии, соответственно.
Очевидно, что наиболее значительные преобразования формы тела ротана в онтогенезе связаны
с уменьшением относительных размеров глаз, изменением положения парных и непарных плавников, а также увеличением относительных размеров
заглазничной области головы (рис. 3). Более контрастно это показано на рис. 4.
6
С. А. Мандрица
А
Б
С
Рис. 3. Схема основных неизомерических изменений формы тела ротана в онтогенезе: по первому (А),
второму (Б) и третьему (С) главным компонентам деформации формы тела (CVAGen6о)
К размерно-возрастной изменчивости головешки-ротана
7
А
Б
Рис. 4. Схема смещения опорных точек на теле ротана в онтогенезе:
А – от наименьшего (TL = 9.6 мм) к наибольшему экземпляру (TL = 228.9 мм), Б – от трех наименьших (TL = 9.612.4 мм) к трем наибольшим экземплярам (TL = 158.7-228.9 мм) (TpsRegr и TwogroupGen6)
При сравнении характера распределения особей ротана из разноразмерных групп по главным
компонентам формы тела этого вида (рис. 5) установлены неравномерность и разнонаправленность
изменения формы тела ротана в онтогенезе.
Выявленные методами геометрической морфометрии направления и особенности изменения
формы тела ротана в онтогенезе (рис. 3 и 4) нашли
свое отражение и в размерно-возрастной изменчивости пластических признаков (табл. 2 и 3). Поскольку статистически значимые результаты оценки межвыборочных различий по t-критерию
Стьюдента и U–критерию Манна-Уитни полностью совпали, в табл. 3 приведены статистики
только по t-критерию Стьюдента.
Всего выявлено 11 признаков, однонаправлено
изменяющихся с увеличением размеров особей ротана (см. табл. 3): антедорсальное расстояние, ан-
теанальное расстояние, расстояние V–A, заглазничное расстояние, (19–20), постдорсальное расстояние, длина хвостового стебля, горизонтальный
диаметр глаза, вертикальный диаметр глаза, (5–6),
(9–10), – при этом первые 5 признаков увеличиваются, а остальные уменьшаются. Учитывая тот
факт, что с предшествующими работами в этой
области наиболее сопоставимы различия между
нашими группами «2» и «3», необходимо отметить, что в данном размерном диапазоне статистически значимы различия по 25 из 33 признаков,
что значительно больше, чем отмечалось другими
исследователями (Никольский, 1956; Глуховцев,
Дукравец, 1986; Скрябин, 1997; Бакланов, 2001).
Скорее всего, это связано с большей межгрупповой разницей в средних линейных размерах особей
ротана, описанных в настоящей работе.
8
С. А. Мандрица
А
Б
С
Рис. 5. Схема распределения трех размерных групп ротана (1-я группа – кружки, 2-я – крестики, 3-я –
звездочки; особенности групп даны в табл. 2):
по первому–второму (А), первому–третьему (Б) и второму–третьему (С) главным компонентам деформации
формы тела (CVAGen6o)
9
К размерно-возрастной изменчивости головешки-ротана
Таблица 2
Описательная статистика пластических признаков трех групп ротана
из озера в микрорайоне Юбилейный г. Перми
Группы
2
Признаки
(опорные точки, между которыми
проводились промеры)
X
S
X
S
X
S
TL, мм (1–7)
SL, мм (1–8)
Антедорсальное расстояние (1–3)
Антепекторальное расстояние (1–19)
Антевентральное расстояние (1–12)
Антеанальное расстояние (1–11)
Длина основная ID (3–4)
Длина основная IID (4–5)
Постдорсальное расстояние (5–8)
Длина основания А (11–10)
Длина хвостового стебля (10–8)
Длина средних лучей С (8–7)
Расстояние P-V (19–12)
(20–12)
Расстояние V–A (12–11)
Длина головы (1–18)
Длина рыла (1–16)
Горизонтальный диаметр глаза (16–17)
Вертикальный диаметр глаза (2–15)
Заглазничное расстояние (17–18)
Длина верхней челюсти (1–14)
Длина нижней челюсти (1–13)
(1–2)
(2–3)
(5–6)
(6–7)
(7–9)
(9–10)
(3–12)
(5–10)
(6–9)
(4–11)
(3–19)
(19–20)
(13–12)
16.5
13.3
45.2
37.6
37.5
60.3
14.1
17.0
28.7
13.6
27.8
24.5
13.7
6.1
24.0
36.7
6.9
10.7
10.3
19.6
12.4
16.5
13.9
32.3
24.8
27.8
28.9
23.3
27.6
15.5
12.2
23.7
14.2
7.7
21.9
3.30
2.57
1.46
1.33
1.10
1.15
1.29
1.48
1.72
0.97
1.47
2.64
0.96
0.69
0.94
1.15
0.88
0.62
0.80
0.91
0.80
1.02
1.01
1.23
1.57
2.89
3.03
1.39
1.03
0.87
0.48
1.23
0.92
0.70
1.15
54.1
42.9
45.2
36.2
37.5
62.3
15.7
18.9
25.1
13.9
26.6
26.4
14.54
6.3
26.4
36.3
6.9
8.9
8.1
21.1
10.9
15.8
12.5
33.5
21.9
28.9
29.5
23.2
29.9
15.9
12.9
25.9
15.8
8.3
22.0
13.37
11.05
1.22
1.81
0.91
1.61
1.05
1.70
2.36
0.74
1.52
2.56
0.78
0.75
1.38
1.80
1.24
0.73
1.00
1.39
0.87
0.82
0.94
1.07
2.88
2.13
2.40
1.65
1.00
0.72
0.69
1.06
0.82
0.45
1.04
136.2
113.1
46.0
39.1
38.1
63.9
15.6
18.3
24.7
14.1
24.5
20.7
13.8
4.9
26.8
38.4
9.5
5.6
5.1
23.9
12.5
17.4
13.14
33.34
20.94
24.2
25.6
19.4
27.5
15.1
13.9
24.4
13.7
9.1
21.2
26.18
22.68
1.21
1.47
1.28
1.55
0.86
1.15
1.34
0.89
1.41
1.62
1.20
0.91
1.13
1.55
0.89
0.47
0.54
0.82
1.38
1.24
0.77
1.00
1.62
1.67
1.47
1.57
1.52
0.97
0.86
1.67
0.93
0.68
0.95
1
3
Число особей в группах: в 1-й и 3-й – по 25, во 2-й – 22. Обозначения плавников: ID – первый спинной, IID –
второй спинной А – анальный, Р – грудной, V – брюшной, С – хвостовой. TL – длина тела до конца средних лучей С,
SL – длина тела до основания средних лучей С.
X
– среднее арифметическое, S – стандартное отклонение.
10
С. А. Мандрица
Таблица 3
Размерно-возрастная изменчивость индексов (в % SL) пластических признаков ротана
из озера в микрорайоне Юбилейный г. Перми
Пары сравниваемых групп
Признаки
(опорные точки, между которыми проводились промеры)
t
p
t
p
t
p
Антедорсальное расстояние (1–3)
Антепекторальное расстояние (1–19)
Антевентральное расстояние (1–12)
Антеанальное расстояние (1–11)
Длина основная ID (3–4)
Длина основная IID (4–5)
Постдорсальное расстояние (5–8)
Длина основания А (11–10)
Длина хвостового стебля (10–8)
Длина средних лучей С (8–7)
Расстояние P–V (19–12)
(20–12)
Расстояние V–A (12–11)
Длина головы (1–18)
Длина рыла (1–16)
Горизонтальный диаметр глаза (16–17)
Вертикальный диаметр глаза (2–15)
Заглазничное расстояние (17–18)
Длина верхней челюсти (1–14)
Длина нижней челюсти (1–13)
(1–2)
(2–3)
(5–6)
(6–7)
(7–9)
(9–10)
(3–12)
(5–10)
(6–9)
(4–11)
(3–19)
(19–20)
(13–12)
-0.06
2.91
-0.03
-4.89
-4.48
-4.12
6.04
-1.34
2.74
-2.48
-3.44
-1.16
-6.79
0.89
0.15
9.05
8.33
-4.41
6.12
2.64
4.98
-3.72
4.46
-1.63
-0.80
0.38
-7.46
-1.79
-4.22
-6.47
-6.08
-3.56
-0.77
0.956
0.006
0.977
0.000
0.000
0.000
0.000
0.170
0.009
0.017
0.001
0.252
0.000
0.376
0.882
0.000
0.000
0.000
0.000
0.011
0.000
0.001
0.000
0.111
0.428
0.703
0.000
0.079
0.000
0.000
0.000
0.001
0.446
-2.19
-3.89
-1.83
-9.41
-4.81
-3.34
9.37
-1.87
8.11
6.16
-0.63
5.25
-9.50
-4.65
-10.21
32.78
26.98
-17.58
-0.34
-2.77
3.36
-3.27
8.59
5.34
4.88
9.41
0.42
1.85
-8.55
-1.67
1.89
-6.90
1.90
0.033
0.000
0.074
0.000
0.000
0.002
0.000
0.068
0.000
0.000
0.535
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.733
0.008
0.002
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.678
0.070
0.000
0.102
0.064
0.000
0.063
-2.27
-6.02
-1.86
-3.56
0.20
1.57
0.87
-0.57
4.91
9.24
2.30
5.88
-1.31
-4.46
-8.33
18.90
13.08
-8.62
-4.70
-5.17
-2.26
0.74
1.36
8.61
6.86
8.06
6.22
3.49
-4.22
3.55
7.94
-4.26
2.80
0.028
0.000
0.070
0.001
0.844
0.123
0.390
0.569
0.000
0.000
0.026
0.000
0.198
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.029
0.466
0.181
0.000
0.000
0.000
0.000
0.001
0.000
0.001
0.000
0.000
0.007
1–2
1–3
2–3
Номера и состав групп как в табл. 2. t – t-критерий Стьюдента, р – вероятность нулевой гипотезы по t-критерию
Стьюдента. Полужирным шрифтом отмечены статистически значимые (рНо ≤ 0.05) различия. Подчеркнутым курсивом выделены признаки с однонаправленными изменениями в онтогенезе. Остальные обозначения как в табл. 2.
Таким образом, в результате проведенного исследования выявлено значительное аллометрическое изменение формы тела ротана в размерном
диапазоне от 10 до 200 мм общей длины тела. Эти
различия установлены как по традиционным пластическим признакам, так и методами геометрической морфометрии. Однонаправлено изменяются в
онтогенезе примерно треть пластических признаков ротана, что значительно больше, чем отмечалось ранее (Никольский, 1956; Глуховцев, Дукравец, 1986; Скрябин, 1997; Бакланов, 2001). Наиболее значительные преобразования формы тела ро-
тана в онтогенезе связаны с уменьшением относительных размеров глаз, изменением положения
парных и непарных плавников, а также увеличением относительных размеров заглазничной области головы.
Библиографический список
Бакланов, М.А. Головешка-ротан Perccottus glenii
Dyb. в водоемах г. Перми // Вестн. Удмурт. унта. Сер. Биология. 2001. № 5. С. 29–41.
11
К размерно-возрастной изменчивости головешки-ротана
Руководство по биометрии / Р.М. Болл, Д.X. Коннел, Ш. Панканти [и др.]. М.: Техносфера,
2007. 368 с.
Глуховцев, И.В. Морфометрическая характеристика ротана-головешки Perccottus glehni Dybowski (Eleotridae) из оз. Ханка / И.В. Глуховцев,
Г.М. Дукравец // Вопр. ихтиологии. 1986. Т. 26,
вып. 6. С. 1028–1030.
Никольский, Г.В. Рыбы бассейна Амура / Г.В. Никольский. М.: Изд-во АН СССР, 1956. 552 с.
Правдин, И.Ф. Руководство по изучению рыб: 4-е
изд. / И.Ф. Правдин. М.: Пищевая пром-сть,
1966. 376 с.
Скрябин, А.Г. Морфологическая характеристика
ротана Perccottus glenii (Eleotridae) бассейна
озера Байкал // Вопр. ихтиологии. 1997. Т. 37.
№ 3. С. 421–423.
Rohlf, F.J. Rotational fit (Procrustes) methods // Proceedings of the Michigan morphometric workshop
/ Eds Rohlf F.J., Bookstein F.L. Ann Arbor (Michigan): Univ. Michigan Mus. Zool. Spec. Publ.
1990. № 2. P. 227–236.
Rohlf, F.J. Morphometric spaces, shape components
and the effect of linear transformations // Advances in morphometrics / Eds Marcus L., Corti
M., Loy A., Slice D. N.Y.; L.: Plenum Press, 1996.
P. 131–152.
Rohlf, F.J. Shape statistics: Procrustes superimposition and tangent spaces // J. Classification. 1999.
Vol. 16. № 1. P. 197–223.
Rohlf, F.J. TPSDIG, version 1.40. N.Y.: State Univ. at
Stony Brook. 2004. (Geometric morphometric
software for the PC).
Rohlf, F.J. TPSREGR, version 1.34. N.Y.: State Univ.
at Stony Brook. 2005a. (Geometric morphometric
software for the PC).
Rohlf, F.J. TPSUTIL, version 1.31. N.Y.: State Univ.
at Stony Brook. 2005b. (Geometric morphometric
software for the PC).
Sheets, D. CoordGen6f. N.Y.: Canisus College. 2003a
(Geometric morphometric software for the PC).
Sheets, D. TwogroupGen6h. N.Y.: Canisus College.
2003b (Geometric morphometric software for the
PC).
Sheets, D. ТmorphGen6с. N.Y.: Canisus College. 2005a
(Geometric morphometric software for the PC).
Sheets, D. CVAGen6n. N.Y.: Canisus College. 2005b
(Geometric morphometric software for the PC).
Поступила в редакцию 22.03.2010.
On the size-age variation of the rotan (Perccottus glenii Dybowski, 1877)
S.A. Mandrytsa
Estimation results for the size-age variation of the rotan (Perccottus glenii Dybowski, 1877) body shape obtained by traditional and geometric morphometrics are compared. Most significant transformations of the rotan
body shape in ontogeny are associated with a decrease in the relative size of the eye, change in the position of
paired and unpaired fins, as well as the increase in the relative size of the postorbital region of the head.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 581.9
ДОПОЛНЕНИЕ К ФАУНЕ ПАУКОВ (ARANEI)
КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ
С. Л. Есюнин
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Приведены новые данные по фауне пауков Краснодарского края. Девять видов впервые отмечаются в фауне региона.
Ключевые слова: пауки; фауна.
Введение
Аннотированный список видов
Начиная с пионерной работы А.С. Спасского
(1937) информация по фауне пауков Краснодарского
края появлялась с завидной регулярностью. В ряду
публикаций следует особо отметить обзоры, посвященные изучению фауны кавказских пауков (Овчаренко, 1979; Tanasevitch, 1987; Танасевич, 1990; Дунин, 1992). Кроме них, имеется значительное количество работ, посвященных ревизиям различных
таксономических групп (например, Харитонов, 1947;
Logunov, Rakov, 1998; Efimik, 1999; Logunov,
Marusik, 1999; Logunov, Guseinov, 2002; Mikhailov,
2003), в которых упоминаются особи из Краснодарского края.
В последние три года вышел целый ряд работ,
посвященных изучению фауны пауков Краснодарского края (Пономарев, Чумаченко, 2007;
Кобзарь, Пономарев, 2009; Пономарев, 2009;
Пономарев, Ковблюк, 2009; Пономарев, Хачиков,
2009), в том числе обзорного характера
(Пономарев, Михайлов, 2007).
Привести точную оценку разнообразия фауны
пауков Краснодарского края на данный момент затруднительно. По нашим подсчетам с учетом приведенных ниже данных в крае насчитывается более
270 видов.
Материал был собран студентами и аспирантами кафедры зоологии беспозвоночных ПермГУ в
различное время и различных местах Краснодарского края. Определенные экземпляры размещены в
коллекции кафедры зоологии беспозвоночных и
водной экологии Пермского университета. Коллекционные номера приведены в круглых скобках.
В результате обработки материала коллекции
обнаружено 20 видов. Новыми для региона являются 9 видов, помеченные в тексте звездочками. Ниже
приводится аннотированный список видов.
Пользуясь случаем выражаю признательность
всем сборщикам, участвующим в пополнении фондов коллекции пауков ПермГУ.
© С. Л. Есюнин, 2010
12
Agelenidae
Tegenaria agrestis (Walckenaer, 1802) *
Материал: 1 ♂, 10 ♀♀ (PSU-4950), 20 км от
Анапы, с. Варваровка, балка, август 2007, неизвестный сборщик.
Araneidae
Argiope bruennichi (Scopoli, 1772)
Материал: 4 ♀♀ (PSU-4952), 20 км от Анапы, с.
Варваровка, балка, август 2007, неизвестный сборщик; 1 ♀ (PSU-5152), г. Ейск, Ейская коса, с рудеральной растительности, 22-23.08.2008, Фарзалиева
Г.Ш.
Araneus diadematus Clerck, 1758
Материал: 2 ♂♂, 7 ♀♀ (PSU-5149), Ейск город
2, сборы с заборов, домов, плюща, 22-23.08.2008,
Фарзалиева Г.Ш.
Larinioides folium (Schrank, 1803) *
Материал: 4 ♂♂, 1 ♀ (PSU-5153), г. Ейск, Ейская коса, с рудеральной растительности, 2223.08.2008, Фарзалиева Г.Ш.
Larinioides ixobolus (Thorell, 1873) *
Материал: 1 ♀ (PSU-1405), г. Анапа, пос. Веселовка, в беседке, 12.07.2000, Михайлова Е.; 8 ♂♂, 7
♀♀ (PSU-5148), Ейск город, сборы с заборов, домов, плюща, 22-23.08.2008, Фарзалиева Г.Ш.
Larinioides patagiatus (Clerck, 1758) *
Материал: 1 ♂, 1 ♀ (PSU-5150), г. Ейск, сборы с
заборов, домов, плюща, 22-23.08.2008, Фарзалиева
Г.Ш.
Neoscona adianta (Walckenaer, 1802)
Материал: 1 ♀ (PSU-4957), 20 км от Анапы, с.
Варваровка, балка, август 2007, неизвестный сборщик.
Nuctenea umbratica (Clerck, 1758)
Материал: 1 ♂ (PSU-3498), Сочи, Лазаревское,
дом, 29.08.2005, Крашенинников А.Б.
Дополнение к фауне пауков (Aranei) Краснодарского края
Gnaphosidae
Scotophaeus scutulatus (L. Koch, 1866)
Материал: 1 ♂ (PSU-5158), г. Ейск, Ейская коса,
22-23.08.2008, Фарзалиева Г.Ш.
Trachyzelotes lyonneti (Savigny et Audouin, 1826)*
Материал: 1 ♀ (PSU-1419), г. Анапа, пос. Веселовка, на песке, 09.VII.2000, Михайлова Е.
Linyphiidae
Linyphia triangularis (Clerck, 1758)
Материал: 2 ♂♂, 6 ♀♀ (PSU-4953), 20 км от
Анапы, с. Варваровка, балка, август 2007, неизвестный сборщик.
Megalepthyphantes pseudocollinus Saaristo, 1997
Материал: 1 ♂ (PSU-190), Усть-Лабинский район, станция Кирпельская, лесополоса 28.VII.1995,
Жиркова В.
Lycosidae
Geolycosa vultuosa (C.L. Koch, 1838) *
Материал: 1 ♀ (PSU-3481), г. Геленджик,
08.2005, неизвестный сборщик; 1 ♀ (PSU-4951), 20
км от Анапы, с. Варваровка, на горе в норке, август 2007, неизвестный сборщик.
Pardosa ?jergeniensis Ponomarev, 1979 *
Материал: 1 ♀ (PSU-5157), г. Ейск, Ейская коса,
22-23.08.2008, Фарзалиева Г.Ш.
Tetragnatidae
Tetragnatha obtusa C.L. Koch, 1837 *
Материал: 1 ♂, 2 ♀♀ (PSU-5154, 5156), г. Ейск,
Ейская коса, с рудеральной растительности, 2223.08.2008, Фарзалиева Г.Ш.
Theridiidae
Parasteatoda tabulata (Levi, 1980) *
Материал: 1 ♂, 1 ♀ (PSU-5155), г. Ейск, сборы с
заборов, домов, плюща, 22-23.08.2008, Фарзалиева
Г.Ш.
Phylloneta impressa (L. Koch, 1881)
Материал: 1 ♂ (PSU-5151), г. Ейск, Ейская коса,
с рудеральной растительности, 22-23.08.2008, Фарзалиева Г.Ш.
Steatoda triangulosa (Walckenaer, 1802)
Материал: 1 ♂ (PSU-4954), 20 км от Анапы, с.
Варваровка, балка, август 2007, неизвестный сборщик.
Thomisidae
Xysticus gallicus Simon, 1875
Материал: 1 ♀ (PSU-3499), Сочи, Лазаревское,
лес, 26.08.2005, Крашенинников А.Б.
Uloboridae
Hyptiotes paradoxus (C.L. Koch, 1834)
Материал: 1 ♂ (PSU-4955), 20 км от Анапы, с.
Варваровка, балка, август 2007, неизвестный сборщик.
13
Работа выполнена при финансовой поддержке
грантов РФФИ № 09-04-01365 и Президента РФ по
поддержке ведущих научных школ № 5367.2006.4.
Библиографический список
Дунин, П.М. Пауки семейства Dysderidae фауны
Кавказа (Arachnida Aranei Haplogynae) //
Arthropoda Sel. 1992. Vol. 1, № 3. P. 35–76.
Кобзарь, В.Ф. Фаунистические комплексы пауков
(Arachnida, Aranei) в агроценозах озимой пшеницы юга России / В.Ф. Кобзарь, А.В. Пономарев // Агрохимия. 2009. № 7. С. 60–65.
Овчаренко, В.Н. Пауки семейств Gnaphosidae,
Thomisidae, Lycosidae (Aranei) Большого Кавказа // Фауна и экология паукообразных. Л.,
1979. С. 39–53.
Пономарев, А.В. Новые виды и находки пауков
(Aranei) с юга России и из Западного Казахстана // Кавказ. энтомол. бюл. 2009. Т. 5, № 2. С.
143–146.
Пономарев, А.В. Trochosa hirtipes sp. n. Gnaphosa
jucunda Thorell, 1875 (Arachnida: Aranei) с Западного Кавказа / А.В. Пономарев, Н.М. Ковблюк // Кавказ. энтомол. бюл. 2009. Т. 5, № 1. С.
7–12.
Пономарев, А.В. Добавление к фауне пауков
(Aranei) российского Кавказа / А.В. Пономарев,
К.Г. Михайлов // Труды ЮНЦ РАН. 2007. Т. 3.
С. 130–151.
Пономарев, А.В. Предварительные данные о фауне
пауков (Aranei) заказника «Большой Утриш»
(Россия, Краснодарский край) / А.В. Пономарев, Э.А. Хачиков // Животный мир горных
территорий. М.: Т-во научных изданий КМК,
2009. С. 109–113.
Пономарев, А.В. Паукообразные (Arachnida) в надпочвенной мезофауне тисо-самшитовой рощи
Кавказского государственного биосферного заповедника / А.В. Пономарев, Ю.А. Чумаченко
// Труды ЮНЦ РАН. 2007. Т. 3. С. 151–163.
Спасский, А.С. Материалы к фауне пауков Черноморского побережья // Сб. науч.-исслед. работ
Азово-Черномор. с.-х. ин-та. 1937. № 5. С. 131–
138.
Танасевич, А.В. Пауки семейства Linyphiidae фауны Кавказа (Arachnida, Aranei) // Фауна наземных беспозвоночных Кавказа. М.: Наука, 1990.
С. 5–114.
Харитонов, Д.Е. Пауки и сенокосцы из пещер
Черноморского побережья Кавказа // Бюл.
МОИП. Отд. Биологии. 1947. Т. 52, № 2. С. 15–
28.
Efimik, V.E. A review of the spider genus Tibellus
Simon, 1875 of the East Palaearctic (Aranei: Philodromidae) // Arthropoda Selecta. 1999. Vol. 8,
№ 2. P. 103–124.
Logunov, D.V. Faunistic review of the jumping spiders
of Azerbaijan (Aranei: Salticidae), with additional
faunistic records from neighbouring Caucasian
14
С. Л. Есюнин
countries / D.V. Logunov, E.F. Guseinov // Arthropoda Selecta. 2002 (2001 на обложке). Vol. 10,
№ 3. P. 243–260.
Logunov, D.V. Miscellaneous notes on Middle Asian
jumping spiders (Aranei: Salticidae) / D.V. Logunov, S.Yu. Rakov // Arthropoda Selecta. 1998.
Vol. 7, № 2. P. 117–144.
Logunov, D.V. A brief review of the genus Chalcoscirtus Bertkau, 1880 in the faunsa of Central Asia
and the Caucasus (Aranei: Salticidae) / D.V. Lo-
gunov, Yu.M. Marusik // Arthropoda Selecta. 1999
(1998 на обложке). Vol. 7, № 3. P. 205–226.
Mikhailov,, K.G. The spider genus Clubiona Latreille,
1804 (Aranei: Clubionidae) in the fauna of the
former USSR: 2003 update // Arthropoda Selecta.
2003 (2002 на обложке). Vol. 11, № 4. P. 283–
317.
Tanasevitch, A.V. The linyphiid spiders of the Caucasus, USSR (Arachnida: Araneae: Linyphiidae) //
Senckenberg. Biol. 1987. Bn. 67, № 6/7. S. 297–
383.
Поступила в редакцию 22.03.2010.
Addition to spiders’ fauna (Aranei) of Krasnodar Krai
S.L. Esyunin
New data on spiders’ fauna of Krasnodar Krai are presented. Seventeen species are observed in the fauna of
this region for the first time.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.873.6. + 57.086.13
ОСОБЕННОСТИ КРИОКОНСЕРВАЦИИ
АЛКАНОТРОФНЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ
РОДА RHODOCOCCUS
Т. Н. Каменских a , Е. А. Калашникова b , И. Б. Ившина a , b
a
b
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Исследовано влияние долгосрочного низкотемпературного (-85°С) хранения на жизнеспособность клеток и стабильность основных морфологических и физиолого-биохимических характеристик коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus. Установлен высокий
(70–90%) уровень жизнеспособности родококков с алканотрофным типом метаболизма после
их восстановления из замороженного состояния. В результате сравнительного исследования
криозащитных соединений показано преимущество использования 5% ДМСО для краткосрочного хранения представителей вида R. ruber и 10% глицерина в качестве универсального
протектора, эффективного для длительной низкотемпературной консервации представителей
всех исследованных видов родококков. Оценена пригодность экспрессных методов специфической окраски для оценки уровня жизнеспособности бактерий после криоконсервации.
Ключевые слова: алканотрофные актинобактерии; Rhodococcus; криоконсервация; криопротекторы;
жизнеспособность; респирометрия; специфическое окрашивание клеток.
исследования в отношении актинобактерий рода
Rhodococcus ранее не проводились.
Цель настоящего исследования – оценка эффективности метода криоконсервации алканотрофных
родококков при -85С для длительного хранения
генофонда коллекционных культур.
Введение
Практическое использование микроорганизмов
в различных областях биотехнологии и медицины
напрямую связано с применением эффективных
методов
поддержания
гарантированно
стабильных, жизнеспособных культур. Создание
таких методов, пригодных для продолжительного
хранения микроорганизмов, стало возможным
благодаря расшифровке природы обратимой
остановки
жизнедеятельности
клеток
при
глубоком замораживании и высушивании. Следует
однако отметить, что ни один из существующих
методов длительного поддержания коллекционных
и производственных культур не является
универсальным. Для хранения больших коллекций
микробных
ресурсов
наиболее
оправдано
применение методов глубокого высушивания
(лиофилизации) и криоконсервации (Ившина и др.,
1994; Gherna, 1994; Каменских, 1998; Цуцаева и
др., 2008;). Один из современных способов
криоконсервации
микроорганизмов
–
замораживание и хранение бактериальных культур
в условиях специализированных морозильников
сверхнизких (-85…96С) температур. Литературные сведения об эффективности данного метода
хранения весьма немногочисленны, а подобные
Методы исследования
Объектом исследования служили 15 штаммов
родококков, принадлежащих к видам Rhodococcus
erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber, и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним
ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций
культур #768, www.iegm.ru/iegmcol). Культуры выращивали на мясопептонном агаре (МПА), а также
минеральной среде в пропано-воздушной атмосфере (1:5), либо в присутствии н-гексадекана (1.0 об.
%) (Каталог штаммов..., 1994) в качестве единственного источника углерода. В работе использовали
бактериальные взвеси плотностью 107-108 кл/мл. В
качестве криопротекторов применяли 10% глицерин или 5% диметилсульфоксид (ДМСО). В контрольных опытах клетки родококков суспендировали в дистиллированной воде без добавления криопротектора. Замораживание культур проводили при
-85°С в морозильнике сверхнизких температур
© Т. Н. Каменских, Е. А. Калашникова, И. Б. Ившина, 2010
15
16
Т. Н. Каменских, Е. А. Калашникова, И. Б. Ившина
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что родококки, суспендированные в дистиллированной воде, довольно хорошо переносят
процесс низкотемпературного замораживания с
последующим оттаиванием при комнатной температуре. Так, выживаемость клеток представителей
видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber составляет от 55 до 70% (рис. 1) при средней исходной концентрации 4.3107 кл/мл. Для повышения
устойчивости клеток к воздействию низких температур целесообразно применение защитных веществ – криопротекторов (Пучков, Говорунов,
1983; Kisidayova, 2005). Их действие связывают со
способностью вступать во взаимодействие с гидратной оболочкой биологически активных макромолекул и воздействовать, таким образом, на их
структуру.
R. erythropol is
(5 штаммов)
R.rhodochrous
(2 штамма)
R. ruber
(8 штаммов)
0
20
40
60
80
100
Выж иваемость, % к контролю (до криоконсервации)
Рис. 1. Влияние процесса криоконсервации на
выживаемость коллекционных культур
Rhodococcus spp.
Так механизм защитного действия глицерина,
объясняется его адсорбцией на клеточной мембране
и интерколяцией между молекулами липидов, способствующих лабильности мембран (Dyubko et al.,
2006). При этом криозащитные вещества ослабляют
эффект кристаллизации, изменяя ее характер (Волков, 1994).
По нашим данным, использование ДМСО в качестве криопротектора позволяет повысить показатель
выживаемости
замороженных
клеток
R. erythropolis в среднем до 80%, однако в течение
1-го года хранения численность жизнеспособных
клеток в замороженной суспензии достоверно снижается до 45%. В то же время, при криоконсервации представителей данного вида с использованием
глицерина высокий (80%) уровень выживаемости
сохраняется в течение всего срока хранения (рис. 2).
При этом показатель жизнеспособности отдельных
штаммов R. erythropolis достигает 94%, что соответствует 8.3107 кл/мл (табл. 1).
120
100
Выживаемость, %
MDF-U4086S (Sanyo, Япония) с резервной системой
для поддержания температуры Back-up System
CVK-UB2. Процесс восстановления замороженных
клеток осуществляли путем оттаивания при комнатной температуре.
Число жизнеспособных клеток определяли
микрометодом точечных высевов по колониеобразующей способности (Веслополова, 1995). В сравнительных
экспериментах
жизнеспособность
культур параллельно оценивали путем специфического окрашивания бактерий 0.2% раствором йодонитротетразолия фиолетового (Packard, 1971) и
двухкомпонентным красителем Live/Dead BacLigth Bacterial Viability Kit L1352, в соответствии с
инструкцией производителя (Molecular Probes,
Inc.; www.probes.com). В первом случае на планшетном фотометре ( 492 нм) Multiskan Ascent 354
(Thermo, Китай) регистрировали концентрацию
активно респирирующих клеток по содержанию не
растворимого в воде формазана, образующегося
при восстановлении бесцветной соли тетразолия
(Haines et al., 1995; Uraizee et al., 1998). Во втором
– подсчитывали живые и мертвые клетки с помощью люминесцентного микроскопа (возбуждающий фильтр EX545) MС-400 F (Micros, Австрия).
Цитоморфологические исследования проводили с
помощью светлопольного микроскопа с фазовоконтрастным устройством Axiostar plus (Carl Zeiss,
Германия) с использованием системы визуализации и анализа микроскопического изображения
ВидеоТест-Размер 5.0 (ВидеоТест, Россия), включающей цветную цифровую систему ввода изображения Pixera PRO-150ES (Pixera, США). Эффективность криоконсервации оценивали по показателю выживаемости. Процент жизнеспособных
клеток родококков рассчитывали относительно
числа клеток, определяемого до криоконсервации.
Проверку сохранения физиолого-биохимичских
свойств бактериальных культур осуществляли
путем контрольного определения ключевых признаков (Ившина и др., 1994). Статистическую обработку результатов проводили с использованием
пакета компьютерных программ Microsoft Office
Excel 2003, принимая уровень вероятности 95%.
80
1
2
3
60
40
20
0
1 нед
1 год
Срок хранения
Рис. 2. Динамика жизнеспособности коллекционных культур R. erythropolis при криоконсервации:
1 – контроль (без внесения протектора); 2 – в
качестве протектора использовали глицерин; 3 –
ДМСО
Особенности криоконсервации алканотрофных актинбактерий рода Rhodococcus
17
Изучение выживаемости коллекционных культур R. ruber после криоконсервации показало, что
наибольшая (100%) степень жизнеспособности
замороженных клеток регистрируется с использованием ДМСО сразу после низкотемпературного
воздействия (рис. 3).
Таблица 1
Жизнеспособность коллекционных штаммов R. erythropolis после криоконсервации
в течение 1 года
Штамм
ИЭГМ
Число жизнеспособных клеток/мл
Криопротектор
до криоконсервации
через 1 год
Выживаемость, %
(1.7 ± 0.38) × 107
(1.8 ± 0.38) × 108
(9.6 ± 2.86) × 107
(1.4 ± 0.34) × 108
(1.1 ± 0.28) × 108
(2.4 ± 0.43) × 108
(7.6 ± 2.43) × 107
(9.6 ± 2.88) × 107
(2,0 ± 0.37) × 108
(8,3 ± 0.75) ×107
(6.0 ± 0.59) ×107
(4.5 ± 0.55) × 107
(4.7 ± 0.36) × 107
(2.4 ± 0.35) × 107
(5.6 ± 0.33) × 107
(1.4 ± 0.21) × 107
(4.5 ± 0.30) ×107
(3.0 ± 0.51) × 107
94.32
66.67
93.75
69.12
44.44
46.67
36.84
93.75
30.00
Глицерин
ДМСО
Глицерин
Глицерин
ДМСО
Глицерин
ДМСО
Глицерин
ДМСО
200
267
487
507
684
180
160
Выживаемость, %
140
120
3
2
1
100
80
60
40
20
0
0.4
1
6
12
Срок хранения, мес.
Рис. 3. Динамика жизнеспособности R. ruber
после криоконсервации:
1 – криопротектор ДМСО; 2 – глицерин; 3 – без
внесения протектора
По-видимому, это объясняется биологической
особенностью представителей R. ruber, проявляющейся в начале стационарной фазы роста клеток,
как то, присутствием палочковидных фрагментов,
наряду с доминированием кокковидных форм, и
последующей фрагментацией клеточного мицелия
(Нестеренко и др., 1985). В течение одного года
хранения уровень жизнеспособности R. ruber в этом
варианте опыта достоверно снижается до 40–50%.
Полученные данные свидетельствуют о преимуществе использования протектора ДМСО для краткосрочного (до 6 мес.) хранения родококков вида
R. ruber.
Интересно отметить, что выживаемость представителей R. ruber в вариантах без применения
криопротектора и с использованием 10% глицерина, на протяжении всего срока хранения оставалась
на одном уровне. При этом средний процент выживаемости к концу 1 года хранения составлял 60–
70% от первоначального (рис. 3). Таким образом,
применение ДМСО и глицерина в качестве протек-
торов позволяет повысить степень выживаемости
родококков в процессе низкотемпературного хранения.
Учитывая способность родококков утилизировать широкий спектр углеводородных соединений,
нами проведен сравнительный анализ жизнеспособности культур, предварительно выращенных на
углеводных и углеводородных средах. Установлено, что степень устойчивости к низкотемпературному воздействию культур, использующих пропан
в качестве единственного источника углерода и
энергии на 20% выше по сравнению с клетками
родококков, выращенными на МПА (табл. 2).
Исследование выживаемости замороженных
родококков, предварительно выращенных в присутствии н-гексадекана, показало, что содержание
жизнеспособных клеток в суспензии после 1-го
года криоконсервации снижается до 0.7–47.0%,
составляя в среднем 16.2% (рис. 4). Однако на наш
взгляд, это не связано с гибелью клеток, использующих н-гексадекан, в результате воздействия
низкотемпературного фактора. Так, по данным
микроскопического анализа (рис. 5), клетки родококков, предварительно выращенные на среде в
присутствиии н-гексадекана, собраны в плотные
агрегаты размером от 8 до 12 мкм.
Это приводит к заниженным результатам численности бактериальных клеток в связи с формированием на агаризованной питательной среде
колоний, выросших не из одной клетки, а из агрегатов, образованных множеством жизнеспособных
клеток. Выявленный факт подтверждается результатами дифференцирующего окрашивания живых
и мертвых клеток после криоконсервации с использованием флуоресцентных красителей. Так,
процентное содержание бактерий, окрашенных в
зеленый цвет компонентным красителем «Syto 9»
и регистрируемых как живые, в 3.6 раза превышает таковое, полученное методом высева на агаризованную питательную среду.
18
Т. Н. Каменских, Е. А. Калашникова, И. Б. Ившина
Таблица 2
Жизнеспособность родококков, предварительно выращенных на разных средах,
после 1 года хранения при -85°С
Число жизнеспособных кл/мл
Среда
Штамм
Выживапредварителного
1 год после
R. ruber
емость, %
до криоконсервации
культивирования
криоконсервации
8
МПА
(1.8 ± 0.27) × 10
(9.4 ± 0.52) × 107
52.22
ИЭГМ 71
8
С3*
(1.4 ± 0.56) × 10
(1.4 ± 0.09) × 108
100.00
МПА
(2.0 ± 0.28) × 108
(1.2 ± 0.08) × 108
60.00
ИЭГМ 74
7
С3
(4.4 ± 0.56) × 10
(3.5 ± 0.32) × 107
79.55
МПА
(1.2 ± 0.22) × 108
(8.2 ± 0.57) × 107
68.33
ИЭГМ 83
С3
(3.3 ± 0.31) × 107
(1.9 ± 0.19) × 107
57.58
МПА
(2.4 ± 0.31) × 108
(9.6 ± 0.57) × 107
40.00
ИЭГМ 233
С3
(2.7 ± 0.27) × 108
(1.7 ± 0.20) × 108
62.96
МПА
(2.6 ± 0.32) × 108
(1.3 ± 0.10) × 108
50.00
ИЭГМ 235
С3
(5.9 ± 0.41) × 107
(4.0 ± 0.47) × 107
67.80
МПА
(1.3 ± 0.23) × 108
(7.8 ± 0.58) × 107
60.00
ИЭГМ 381
С3
(5.6 ± 0.50) × 107
(4.0 ± 0.42) × 107
71.43
МПА
(2.0 ±0.28) × 108
(1.3 ± 0.04) × 108
65.00
ИЭГМ 468
С3
(3.1 ± 0.37) × 107
(3.0 ± 0.26) × 107
96.77
* С3 – минеральная среда с пропаном.
ИЭГМ…
ИЭГМ…
Штамм
ИЭГМ…
ИЭГМ…
1
2
ИЭГМ…
ИЭГМ…
ИЭГМ…
0
50
Выживаемость, %
100
Рис. 4. Выживаемость родококков, предварительно выращенных на разных средах, после 1 года криоконсервации:
1 – жидкая минеральная среда с н-гексадеканом; 2 – мясопептонный агар
По нашим данным, эффективным способом
учета жизнеспособности углеводородокисляющих
родококков после криоконсервации является экспрессный спектрофотометрический метод, основанный на окрашивании активно респирирующих
клеток 0.2% раствором йодонитротетразолия фиолетового. Установлена сильная (r>0.71) степень
корреляции между показателем интенсивности
окрашивания тетразолием и числом жизнеспособных клеток родококков, регистрируемых методом
точечных высевов с достоверной вероятностью
95% (рис. 6).
Важным аспектом при оценке эффективности
криоконсервации родококков является проверка
сохранения их основных морфологических и фи-
зиолого-биохимических особенностей. Цитологические исследования с определением размеров
клеток не выявили достоверных различий морфометрических характеристик с исходными показателями после воздействия низкотемпературного
фактора. То же следует отметить и в отношении
основных макроморфологических признаков, в
частности, размеров и формы колоний, их структуры, консистенции, оптических свойств и т.п.
Кроме того, учитывая способность представителей
Rhodococcus spp. к биотрансформации практически всех классов органических соединений, проведены контрольные тесты на способность родококков к окислению ряда природных и антропогенных
углеводородных субстратов. Анализ результатов
Особенности криоконсервации алканотрофных актинбактерий рода Rhodococcus
свидетельствует о сохранении каталитической
активности, присущей интактным клеткам родококков, и после длительного хранения культур в
замороженном состоянии. Так, в частности, пропанокисляющая способность и уровень биотрансформации клетками R. ruber β-ситостерола до
стигмаст-4-ен-3-она, а также выявленная ранее
способность некоторых штаммамов R. rhodochrous
к окислению тиоанизола до фенилметилового
сульфоксида не изменилась и после 2-х лет хранения.
19
ность к смене фаз существования, присутствие
специфических липидных компонентов в составе
клеточной стенки, накопление гранул поли-βоксибутирата, синтез жирных кислот с нечетным
числом углеродных атомов, поверхностно-активных соединений (биосурфактантов) и аминокислот
при росте на углеводородсодержащих средах. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о перспективности метода низкотемпературного хранения практически ценных культур,
поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов
ИЭГМ, гарантирующего сохранение их жизнеспособности и функциональной активности.
Исследование выполнено при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» и
Программы Президиума РАН «Биологическое
разнообразие».
Библиографический список
Рис. 5. Клеточные агрегаты R. ruber ИЭГМ 231
после криоконсервации (фазово-контрастная
микроскопия, увеличение ×1000)
110
100
МОТ, %
90
80
y = 0,4129x + 56,991
R2 = 0,7134
70
60
50
40
50
60
70
80
90
100
110
МТВ, %
Рис. 6. Оценка степени корреляции показателя
жизнеспособности (%) криоконсервированных клеток
родококков, оцениваемых методами точечных высевов
(МТВ) и окраски тетразолием (МОТ)
Таким образом, метод криоконсервации актинобактерий рода Rhodococcus при -85°С, предполагающий использование бактериальных клеток с
предварительно индуцированным алканотрофным
метаболизмом и применение 10% глицерина в качестве криопротектора, обеспечивает высокую
(106–108 клеток/мл) степень выживаемости родококков и способствует сохранению их основных
морфологических и физиолого-биохимических характеристик. По-видимому, устойчивость исследуемых культур к воздействию низкой температуры определяется характерными структурными и
физиологическими особенностями данных актинобактерий (Ившина, 1997), как то: наличие сложного морфогенетического цикла развития, способ-
Веслополова, Е.Ф. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов // Микробиология. 1995. Т. 64, № 2. С.
279–284.
Волков, В.Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию и высушиванию // Микробиология. 1994. Т. 63, вып. 2.
С. 5–16.
Ившина, И.Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие) :
дис. … д-ра биол. наук : 03.00.07 / Ившина
Ирина Борисовна. Пермь, 1997. 98 с.
Ившина, И.Б. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков / И.Б. Ившина, Т.Н. Каменских, М.С. Куюкина [и др.] // Микробиология. 1994. Т. 63, вып. 1. С. 118–127.
Каменских, Т.Н. Консервация и гарантированное
сохранение родококков ex situ : автореф. дис.
… канд. биол. наук : 03.00.07 / Каменских
Татьяна Никодимовна. Пермь, 1998. 20 с.
Каталог штаммов региональной профилированной
коллекции алканотрофных микроорганизмов /
под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994. 163 с.
Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Киев: Наук. думка, 1985.
336 с.
Пучков, Е.О. Проблемы криоконсервации бактериальных культур / Е.О. Пучков, И.Г. Говорунов
// Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1983. 24 с.
Цуцаева, А.А. Опыт долгосрочного хранения промышленных штаммов микроорганизмов / А.А.
Цуцаева, А.Е. Ананьина, Л.М. Балыбердина [и
20
Т. Н. Каменских, Е. А. Калашникова, И. Б. Ившина
др.] // Микробиология. 2008. Т. 77, № 5. С.
696–700.
Dyubko, T. Influence of freezing and low molecular
weight cryoprotectants on microsomal membrane
structure: a study by multiparametric fluorescent
probe / T. Dyubko, E. Onishchenko, V. Pivovarenko // J. Fluoresc. 2006. Vol. 16. Р. 817–823.
Gherna, R. Culture preservation // Methods for general and molecular bacteriology. Washington: American Society for Microbiology, 1994. P. 279–292.
Haines, J.R. Measurement of hydrocarbon degrading
microbial population by a 96-well plate mostprobable-number procedure / J.R. Haines, B.A.
Wrenn, E.L Holder [et al.] // J. Ind. Microbiol.
1995. Vol. 16. P. 36–41.
Kisidayova, S. Regeneration of cryoresistense of in
vitro rumen ciliate cultures / S. Kisidayova, Z. Varadyova, T. Michalowski, C.J. Newbold // Cryobiology. 2005. Vol. 51, iss. 1. P. 76–84.
Packard, T.T. The measurement of respiratory electron-transport activity in marine phytoplankton // J.
Mar. Res. 1971. Vol. 29. P. 235–244.
Uraizee, F.A. A model for diffusion controlled bioavailability of crude oil components / F.A. Uraizee, A.D. Venosa, M.T. Suidan // Biodegradation.
1998. Vol. 8. P. 287–296.
Поступила в редакцию 10.02.2010
Cryoconservation features of alkanotrophic actinobacteria of the genus rhodococcus
T.N. Kamenskikh, E.A. Kalashnikova, I.B. Ivshina
The effect of a long-term low-temperature (-85°С) conservation on the cell viability and stability of major
morphological and physiological-biochemical characteristics of the collection cultures of the genus Rhodococcus
actinobacteria were studied. It was found that rhodococci with an alkanotrophic metabolism maintained a high
survival rate (70-90%) after being recovered from the lyophilized state. The comparative study of cryoprotective
compounds showed the advantageous use of 5% DMSO for a short-term conservation of R. ruber members,
while 10% glycerol proved to be an effective versatile protective agent for a long-term and low-temperature conservation of all Rhodococcus species studied. The rapid methods of specific staining were evaluated with regard
to their usefulness in estimating the survival rate of bacteria after cryoconservation.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.22
РОЛЬ ФАКТОРОВ ОБЩЕЙ СТРЕССОРНОЙ
УСТОЙЧИВОСТИ В ФОРМИРОВАНИИ
РЕЗИСТЕНТНОСТИ ESCHERICHIA COLI
К ФТОРХИНОЛОНАМ
Л. Ю. Нестерова a , А. Г. Ткаченко a , b
a
b
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Селекционированы мутанты Escherichia coli с разной степенью устойчивости к фторхинолону левофлоксацину. Показано, что в ряду поколений мутантов базовый уровень экспрессии
гена rpoS, кодирующего один из основных регуляторов стрессорной устойчивости, возрастает прямо пропорционально степени резистентности. Это сопровождается возрастанием активности LdcC – фермента синтеза кадаверина, повышением способности мутантов к биоплёнкообразованию и снижением бактериального фитнеса. Установлено, что данные признаки являются наследственно закреплёнными и селективно значимыми при отборе антибиотикорезистентных форм.
Ключевые слова: антибиотикорезистентность; Escherichia coli; мутантные штаммы; левофлоксацин;
стрессорная устойчивость; адаптация; экспрессия гена rpoS; лизиндекарбоксилаза LdcC.
Формирование резистентности бактерий к антибиотикам – неизбежное следствие массового
применения антимикробных препаратов. В настоящее время фторхинолоны – одно из наиболее
широко используемых средств в лечении бактериальных инфекций человека и животных. Этим
обусловлено быстрое возрастание резистентности
к данному классу антибиотиков. Наиболее высокий уровень устойчивости к хинолонам возникает
в результате специфических мутаций в генах, кодирующих белки-мишени, ДНК-гиразу и топоизомеразу IV. Помимо этих мутаций обнаружены и
другие, менее специфичные, но также вносящие
существенный вклад в антибиотикорезистентность. Это, как правило, мутации, влияющие на
уровень экспрессии белков общей стрессорной устойчивости. Следствием таких мутаций могут
быть конститутивная сверхэкспрессия гена marA,
ответственного за неспецифический выброс ксенобиотиков из клетки, или soxS, главного регулятора ответа на окислительный стресс (Кern et al.,
2000). В последнее время все большее внимание
привлекают к себе полиамины, низкомолекулярные клеточные катионы, обладающие многообразными антистрессорными функциями (Tkachenko et
al., 2001; Ткаченко и др., 2003, 2004, 2006). Ранее
нами показано, что одним из ответов E. coli на
сублетальное действие фторхинолонов является
возрастание активности ферментов синтеза полиаминов, которое приводит к накоплению этих со-
единений в клетке и играет роль фактора адаптации (Ахова, Ткаченко, 2009). Действие фторхинолонов сопровождалось также характерным для
данного класса антибиотиков возрастанием уровня
экспрессии гена rpoS, продукт которого, как нами
показано, играет существенную положительную
роль в регуляции содержания полиаминов, в частности кадаверина, в клетке. На основании этих исследований было сделано предположение, что
возникновение резистентных к фторхинолонам
штаммов E. coli, может происходить в результате
отбора мутаций, обусловливающих высокий уровень экспрессии генов-регуляторов и/или генов,
кодирующих ферменты синтеза полиаминов. Проверке данного предположения посвящена настоящая работа.
Материалы и методы
Антибиотикочувствительность штаммов оценивали по значению минимальной ингибиторной концентрации (МИК), которую определяли методом
двукратных серийных разведений (Методические
указания…, 2004) с использованием иммунологических планшет.
Для получения мутантов первого поколения
культуру исходного штамма Escherichia coli RO91
выращивали в колбах объемом 250 мл, содержащих
50 мл LB-бульона, в термостатируемом шейкере
(37С, 100 об/мин) до плотности 1.0 (OD600), затем
© Л. Ю. Нестерова, А. Г. Ткаченко, 2010
21
22
осаждали 5 мин при 4500 g, отделяли от супернатанта и ресуспендировали в физиологическом растворе таким образом, чтобы концентрация полученной суспензии составляла 1010 КОЕ/мл. Инокулят в объёме 1 мл вносили в чашки Петри с LBагаром, содержащим левофлоксацин в концентрации, превышающей МИК в 2–16 раз. Чашки инкубировали 48 ч при 37°С. (Kern et al., 2000), после
чего отбирали по 3 колонии с каждой селективной
концентрации антибиотика. Для получения мутантов второго и третьего поколения применяли аналогичный подход, используя в качестве родительского штамма мутанты первого и второго поколения, соответственно.
Уровень экспрессии rpoS определяли путём
измерения β-галактозидазной активности в клетках, несущих репортерное генное слияние
rpoS::lacZ. Активность β-галактозидазы оценивали
методом Миллера (Miller, 1992).
Активность лизиндекарбоксилазы определяли
по количеству образующегося конечного продукта
кадаверина в единицу времени. Для этого бактериальную культуру центрифугировали в течение 6
мин при 3000 g и температуре 0С, дважды отмывали физиологическим раствором. Ресуспендированные клетки разрушали ультразвуком (22 кГц, 10
мА, 3 раза по 10 сек), обломки клеток осаждали
центрифугированием (20 мин, 16000 g). Инкубационная смесь включала 100 мМ цитратнофосфатного буфера (рН 7.5), 0.04 мМ пиридоксальфосфата, 1 мМ дитиотрейтола, 10 мМ L-лизина и
супернатант, содержащий 100 мкг белка, в конечном объеме 0.5 мл. Реакцию запускали добавлением
субстрата, смесь инкубировали в течение 60 мин
при 37С, после чего реакцию останавливали внесением хлорной кислоты до конечной 0.4 молярной
концентрации.
Содержание кадаверина определяли методом
ВЭЖХ его дансилированного производного. Хроматографическая система включала хроматограф
Shimadzu LC-20A (Shimadzu, Япония); колонку
Luna С18(2) размером 250×4.6 мм, 5 мкм (Phenomenex, США), предколонку С18 Securityguard, 4×3
мм, 5 мкм (Phenomenex, США); флуоресцентный
детектор RF-10A XL (Shimadzu, Япония). Длины
волн экстинкции и эмиссии устанавливали на 400
и 516 нм, соответственно. В качестве мобильной
фазы использовали смесь воды и ацетонитрила,
которую подавали на колонку со скоростью 1
мл/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 40 до 100% в течение 10 мин с последующим уравновешиванием в течение 10 мин
40% ацетонитрилом.
Определение количества белка проводили методом Лоури.
Способность к биоплёнкообразованию оценивали с помощью окрашивания биоплёнок генцианвиолетом. Для этого ночные культуры, выращенные в пробирках, содержащих 5 мл LB-бульона и 5
г/л глюкозы при 37С, доводили в физиологиче-
Л. Ю. Нестерова, А. Г. Ткаченко
ском растворе до одинаковой плотности 0.1
(OD625), после чего разводили в 25 раз LBбульоном, содержащим 5 г/л глюкозы. 100 мкл полученного инокулята стерильно вносили в лунки
96-луночного полистиролового иммунологического планшета и культивировали в течение 22 ч при
37С без перемешивания. Оптическую плотность
культур (OD625) измеряли с помощью многофункционального микропланшетного ридера Infinite
M200 (Tecan, Швейцария). Бульон с планктонными клетками удаляли, и лунки дважды отмывали
200 мкл дистиллированной воды. Планшеты подсушивали в течение 20 мин, после чего в каждую
лунку добавляли по 150 мкл 0.1% генцианвиолета
и выдерживали в течение 30 мин при комнатной
температуре. Краситель удаляли, и лунки 5-кратно
промывали (добавление в лунки 200 мкл дистиллированной воды, встряхивание в течение 5 сек). С
целью стандартизации обработки все процедуры
по промыванию планшетов проводили автоматически, в микропланшетном ридере. Планшеты высушивали, краситель экстрагировали абсолютным
этанолом, после чего измеряли оптическую плотность (OD570). Измерения проводили в 16-кратной
повторности. Способность к биоплёнкообразованию подсчитывали с использованием уравнения:
SBF = (A – B) / C, где SBF – удельное биоплёнкообразование (Specific biofilm formation); А – OD570
в опытной лунке; В – OD570 в контрольной лунке;
C – OD625 культуры клеток (Naves et al., 2008).
Для определения бактериального фитнеса ночные культуры всех штаммов, выращенные в пробирках, содержащих 5 мл LB-бульона при 37С,
доводили до одинаковой плотности 0.1 (OD625),
после чего разводили бульоном ещё в 4 раза и переносили в планшет. Планшеты культивировали в
течение 20 ч при 37С в микропланшетном ридере
без перемешивания. Оптическую плотность культур измеряли каждые 30 мин. Перед каждым измерением планшеты встряхивали в течение 5 сек.
Значение фитнеса подсчитывали как отношение
времени, за которое каждый мутантный штамм 50кратно увеличивал начальную плотность (OD600), к
времени контрольного штамма (Petersen еt аl.,
2009).
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета стандартных программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.,
2001). На рисунках приведены данные из серии
однотипных экспериментов (не менее трех), представленные в формате среднее ± среднее квадратичное отклонение. Оценка статистической значимости различий произведена с использованием
критерия Ньюмена-Кейлса. Различия считали значимыми при р0.05.
Результаты
Для отбора резистентных к левофлоксацину
мутантов в качестве родительского штамма ис-
Роль факторов стрессорной устойчивости в формировании резистентности …
пользовали E. coli RO91, несущий репортерное
генное слияние rpoS::lacZ, дающее возможность
оценить уровень генной экспрессии rpoS. В лабораторных условиях селекционированы мутанты
трёх последовательных поколений с разным уровнем устойчивости к левофлоксацину. Для дальнейшего изучения среди них были отобраны мутанты, обладающие β-галактозидазной активностью, которые, таким образом, сохраняли исходную репортерную генетическую конструкцию и
составляли подавляющую часть популяции устойчивых штаммов. Получено 9 линий мутантов, ведущих происхождение от разных клонов одного и
того же родительского штамма.
Минимальные ингибиторные концентрации
для левофлоксацина у этих штаммов возрастали
пропорционально поколению мутантов в диапазоне 6-6000 МИК исходного штамма.
23
В качестве первичного критерия для оценки
селективной значимости продукта гена rpoS, σS
субъединицы РНК полимеразы, был использован
базовый (в отсутствие антибиотика) уровень активности гена rpoS в клетках исходного и мутантных штаммов. Экспрессия rpoантибиотикорезистентных штаммов статистически значимо превышала уровень исходного штамма более чем у 80%
полученных мутантов. За малым исключением
данный показатель возрастал прямо пропорционально уровню устойчивости в ряду поколений
родственных штаммов (рис. 1). У мутантов первого поколения экспрессия rpoS превышала уровень
исходного штамма в среднем в 1.5–2 раза, в то
время как в третьем поколении встречались штаммы, превосходящие исходный в 5 раз.
Экспрессия rpoS, ед. Миллера
1000
800
600
400
200
0
исх. 1п.
2п.
3п.
исх. 1п.
2п.
3п.
исх. 1п.
2п.
3п.
Рис. 1. Базовая экспрессия гена rpoS в клетках исходного и мутантных штаммов.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. – исходный E. coli RO91штамм; 1п. – мутант первого
поколения; 2п. – мутант второго поколения; 3п. – мутант третьего поколения
Ранее нами показано, что физиологическая реакция клеток исходного штамма RO91 на сублетальные воздействия левофлоксацина включала
увеличение уровня экспрессии гена rpoS (Ахова,
Ткаченко, 2009). Ответ культур мутантных штаммов, обладающих высоким базовым уровнем генной экспрессии, на добавку сублетальных для них
концентраций левофлоксацина был сходен с реакцией исходного родительского штамма (рис. 2).
Однако уровень индукции rpoS у мутантов снижался по сравнению с родительским штаммом
пропорционально возрастанию базовой экспрессии
данного гена (в отсутствие антибиотика). У мутантов третьего поколения стимуляция отсутствовала
или была минимальной, тогда как базовый уровень
экспрессии rpoS сохранялся на высоком значении,
характерном для мутантов данного поколения.
140
Уровень индукции %
120
100
80
60
40
20
0
исх. 1п. 2п. 3п.
исх. 1п. 2п. 3п.
исх. 1п. 2п. 3п.
Рис. 2. Влияние сублетальных концентраций левофлоксацина на уровень индукции экспрессии гена rpoS в
клетках исходного и мутантных штаммов в ответ на добавку антибиотика.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. – исходный штамм; 1п. – мутант первого поколения; 2п. –
мутант второго поколения; 3п. – мутант третьего поколения
24
Л. Ю. Нестерова, А. Г. Ткаченко
в клетку поступают фторхинолоны (Ахова, Ткаченко, 2009; Samartzidou et al., 1999). Проведенный
нами анализ левофлоксацинустойчивых мутантов
показал, что, несмотря на отсутствие строгой зависимости от уровня антибиотикоустойчивости,
большая их часть обладала повышенным, по сравнению с исходным штаммом, уровнем активности
фермента LdcC (рис. 3).
24
20
нмоль/мг белка в мин.
Активность лизиндекарбоксилазы LdcC
Известно, что RpoS является регулятором
большого числа генов, которые принимают участие в адаптации к неблагоприятным условиям
среды (Hengge-Aronis, 2002). В их числе особый
интерес с точки зрения антистрессорных функций
полиаминов представляет ldcC, который кодирует
один из ферментов синтеза кадаверина. Кадаверин, как известно, принимает участие в регуляции
проницаемости пориновых каналов, через которые
16
12
8
4
0
исх. 1п.
2п.
3п.
исх. 1п.
2п.
3п.
исх. 1п.
2п.
3п.
Рис. 3. Базовая активность лизиндекарбоксилазы LdcC в клетках исходного и мутантных штаммов.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. – исходный штамм; 1п. – мутант первого поколения; 2п. –
мутант второго поколения; 3п. – мутант третьего поколения
мутантных штаммов к формированию биоплёнок.
Эксперименты показали, что способность к биоплёнкообразованию более чем у 90% мутантных
штаммов превышала уровень исходного штамма.
Как и базовая активность rpoS, способность к формированию биоплёнок возрастала в ряду поколений
резистентных мутантов (рис. 4).
3,0
2,4
1,8
усл. ед.
Способность к биоплёнкообразованию,
Известно, что в состав rpoS-регулона входит ген
crl, кодирующий основной белковый компонент
комплекса внеклеточного матрикса энтеробактерий,
определяющий адгезивную способность клеток и
способность к образованию биоплёнок (Barnhart,
Chapman, 2006). В связи с этим представляла интерес оценка способности селекционированных нами
1,2
0,6
0,0
исх. п.1 п.2 п.3
исх. п.1 п.2 п.3
исх. п.1 п.2 п.3
Рис. 4. Способность к формированию биоплёнок клетками исходного и мутантных штаммов.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. – исходный штамм; 1п. – мутант первого поколения; 2п. –
мутант второго поколения; 3п. – мутант третьего поколения
Одной из основных функций RpoS является регуляция перехода к стационарной фазе, что способствует активации генов, необходимых клетке в
данной фазе развития культуры, и отрицательно
регулирует экспрессию генов, ответственных за
активный рост. В этой связи представляло интерес
исследование зависимости фитнеса антибиотикорезистентных мутантов от уровня экспрессии rpoS.
Значение бактериального фитнеса, которое отражает репродуктивные способности бактерий, является важным параметром, характеризующим способность антибиотикоустойчивых мутантов выжи-
вать в различных условиях среды, как в присутствии антибиотика, дающего им селективные преимущества, так и в его отсутствие. Результаты
этих исследований свидетельствуют о том, что величина фитнеса обратно пропорциональна уровню
экспрессии rpoS и антибиотикоустойчивости (рис.
5), то есть в отсутствие в среде антибиотика преимущество по данному параметру имеют антибиоткочувствительные штаммы.
Роль факторов стрессорной устойчивости в формировании резистентности …
Обсуждение
Описанная нами прямо пропорциональная зависимость между базовым уровнем экспрессии
rpoS (в отсутствие антибиотика) и величиной левофлоксацинрезистентности мутантов E. coli (см.
рис. 1) свидетельствует о том, что продукт данного
25
гена имеет селективное значение и признак его
высокой продукции закрепляется генетически в
процессе отбора. Эти данные хорошо согласуются
с описанной нами ранее физиологической защитной реакцией на действие сублетальных концен-
Бактериальный фитнес, ед.
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
исх. 1п. 2п. 3п.
исх. 1п. 2п. 3п.
исх. 1п. 2п. 3п.
Рис. 5. Бактериальный фитнес культур исходного и мутантных штаммов.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. – исходный штамм; 1п. – мутант первого поколения; 2п. –
мутант второго поколения; 3п. – мутант третьего поколения
траций антибиотика, которая сопровождалась индукцией rpoS, а также высоким накоплением в
клетках полиаминов, в том числе кадаверина, как
продукта RpoS-зависимой лизиндекарбоксилазы
LdcC (Ахова, Ткаченко, 2009). Возрастание базовой экспрессии rpoS в ряду поколений антибиотикорезистентных мутантов сопровождалось снижением степени ее индуктивности (см. рис. 2), что
свидетельствует о конститутивном закреплении
данного признака и его высокой значимости для
выживания клеток в присутствии антибиотиков.
Высокое содержание σS в клетках мутантных
штаммов, вероятно, является одной из причин повышенной активности RpoS-зависимой изоформы
фермента синтеза кадаверина LdcC (см. рис. 3).
Одной их функций кадаверина в клетках E. coli
является регуляция проницаемости пориновых каналов, локализованных во внешней мембране, через которые осуществляется транспорт относительно низкомолекулярных гидрофильных соединений, к числу которых относится большинство
антибиотиков (Delcour et аl., 2003). Благодаря наличию положительных зарядов, кадаверин может
посредством ионных взаимодействий связываться
с отрицательно заряженными остатками аминокислот внутри поры и таким образом перекрывать
просвет канала (Delcour et аl, 2003; Nikaido, 2003).
Отсутствие строгой зависимости между уровнем
экспрессии rpoS и активностью LdcC у мутантов с
различным уровнем устойчивости, по-видимому,
связано с существованием альтернативных механизмов регуляции активности фермента, действующих параллельно с RpoS. Помимо регуляции
экспрессии гена ldcС, σS субъединица РНК полимеразы может способствовать формированию антибиотикоустойчивости, отрицательно регулируя
экспрессию гена ompF, и, таким образом, ограни-
чивая количество пориновых каналов во внешней
мембране E. coli (Liu, Ferenci, 2001).
Одним из факторов, определяющих способность к формированию биопленок клетками E.
coli, является количество молекул σS субъединицы
РНК полимеразы. Высокое содержание этого белка в клетках является причиной наблюдаемого нами возрастания способности к биоплёнкообразованию у селекционированных левофлоксацинрезистентных мутантов, пропорциональное уровню их
антибиотикоустойчивости (см. рис. 4).
Оценка репродуктивной способности таких мутантов показала, что повышенное содержании
RpoS сопровождается снижением фитнеса (рис. 5),
которое, вероятно, обусловлено энергетическими
затратами связанными с гиперпродукцией факторов, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, в том числе RpoS. В естественных условиях
обитания в отсутствие антибиотиков снижение
фитнеса будет способствовать вытеснению антибиотикорезистентных мутантов из популяции.
Таким образом, возрастание экспрессии гена
rpoS, ранее описанное нами для исходного штамма RO91, как физиологическая реакция на действие сублетальных концентраций левофлоксацина,
при отборе мутантов, устойчивых к различным
концентрациям антибиотика, становится наследственно закрепленным признаком и имеет селективное значение в процессе отбора устойчивых форм.
RpoS воздействует на активность лизиндекарбоксилазы LdcC, продуктом которой является кадаверин. Высокое содержание кадаверина, регулирующего пориновый транспорт, наряду с повышенной способностью к биоплёнкообразованию,
вносит вклад в повышение уровня антибиотикорезистентности мутантов.
26
Л. Ю. Нестерова, А. Г. Ткаченко
Работа выполнена по программе Президиума
РАН «Молекулярная и клеточная биология» (№
0120096390), поддержана грантом Российского
фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки
Пермского края № 09-04-99006-р-офи, а также молодежным научным грантом Уральского отделения РАН.
Библиографический список
Ахова, А.В. Лизиндекарбоксилазная активность как
фактор резистентности Escherichia coli к
фторхинолонам / А.В. Ахова, А.Г. Ткаченко //
Микробиология. 2009. Т. 7, № 5. С. 636–640.
Методические указания МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к
бактериальным препаратам // Клин. микробиол.
антимикроб. химиотер. 2004. Т. 6. С. 306–359.
Ткаченко, А.Г. Полиамины как модуляторы экспрессии генов окислительного стресса у Escherichia coli / А.Г. Ткаченко, Л.Ю. Нестерова //
Биохимия. 2003. Т. 68, вып. 8. С. 1040–1048.
Ткаченко, А.Г. Механизмы защитных функций полиаминов E. coli от токсического эффекта параквата,
индуцирующего
супероксидный
стресс // Биохимия. 2004. № 69. С. 234–242.
Ткаченко, А.Г. Роль полиаминов в формировании
множественной
антибиотикоустойчивости
Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий / А.Г. Ткаченко, О.Н. Пожидаева,
М.С. Шумков // Биохимия. 2006. Т. 71, вып. 9.
С. 1287–1296
Barnhart, M.M. Curly biogenesis and function / M.M.
Barnhart, M.R.Chapman // Annu. Rev. Microbiol.
2006. Vol. 60. P. 137–147
Delcour, A.H. Solute uptake through general porins //
Front. Biosci. 2003. Vol. 8. P. 1055–1071.
Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory
mechanisms involved in control of the σS (RpoS)
subunit of RNA polymerase // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. P. 373–395.
Kern, W.V. Non-target gene mutations in the development of fluoroquinolone resistance in Escherichia coli / W.V. Kern, M. Oethinger, A.S. JellenRitter, S.B. Levy // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. Vol. 44, № 4. P. 814–820.
Liu, X. An analysis of multifactorial influences on the
transcriptional control of ompF and ompC porin
expression under nutrient limitation / X. Liu, T.
Ferenci // Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 2981–
2989.
Naves, P. Correlation between virulence factors and in
vitro biofilm formation by Escherichia coli / P.
Naves, G. del Prado, L. Huelves [et al.] // Microb.
Pathog. 2008. Vol. 45. P. 86–91.
Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 67. P. 593–656.
Miller, J.H. Experiments in molecular genetics / J.H.
Miller // Cold Spring Harbor. New York. 1992.
Petersen, A. The in vitro fitness cost of antimicrobial
resistance in Escherichia coli varies with the
growth conditions / A. Petersen, F.M. Aarestrrup,
J.E. Olsen // FEMS Microbiol. Lett. 2009. P. 1–7.
Samartzidou, H. Excretion of endogenous cadaverina
leads to a decrease in porin-mediated outer membrane permeability / H. Samartzidou, A.H. Delcour
// J. Bacteriol. 1999. Vol. 181, № 3. P. 791–798
Tkachenko, A. The role of the natural polyamine putrescine in defense against oxidative stress in
Escherichia coli / А. Tkachenko, L. Nesterova, M.
Pshenichnov // Arch. Microbiol. 2001. Vol. 176. Р.
155–157.
Поступила в редакцию 29.03.2010
The role of general stress adaptation factors in the development of Escherichia coli fluoroquinolone resistance
L.Yu. Nesterova, A.G. Tkachenko
E. coli mutants with different levels of levofloxacin resistance were selected in this work. Basic rpoS expression increased in direct dependence on their levels of antibiotic resistance. It was also accompanied by the
growth of LdcC activity as well as its product cadaverine, and the ability to biofilm formation, while the bacterial fitness decreased. These features were shown to be inheritable and important for the development of fluoroquinolone resistance.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 544.473+577.15+57.088.6+547.27
БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРИЛАЛКИЛЬНЫХ
СУЛЬФИДОВ ЦЕЛЫМИ КЛЕТКАМИ
Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66
А. А. Елькин a , Т. И. Кылосова b , В. В. Гришко c , И. Б. Ившина a , b
a
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
c
Институт технической химии УрО РАН, 614013, Пермь, ул. Академика Королева, 3, e-mail: cheminst@mpm.ru
b
В модельных экспериментах подобраны условия окислительной биотрансформации прохирального
фенилметилового сульфида (тиоанизола) в соответствующий (S)-сульфоксид (ее 82%) с использованием целых клеток Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66. Установлено, что наиболее высокая окислительная активность характерна для клеток родококков, включенных в матрицу поливинилового
спирта. Благодаря использованию приема иммобилизации оказалось возможным использовать
сульфидные субстраты в концентрациях (1.0–1.5 г/л), токсичных для свободных клеток родококков.
Окислительная активность закрепленных бактериальных клеток проявляется в способности их к
образованию (S)-энантиомерно обогащенных фенилметил-, пара-толилметил-, фенилэтилсульфоксидов и их последующему активному окислению в соответствующие сульфоны.
Ключевые слова: актинобактерии, Rhodococcus rhodochrous, целые клетки, биотрансформация, тиоанизол, сульфоксид, иммобилизация, поливиниловый спирт
Введение
Интерес к оптически активным сульфоксидам
обусловлен высокой реакционной способностью и
возможностью последующего удаления медиаторов,
включающих фрагмент RS→O, в реакциях циклоприсоединения, альдольной конденсации, присоединения по Михаэлю и др. (Альфонсов и др., 1998).
Данный подход позволяет осуществлять на основе
хемо-, регио- и стереоселективных превращений
сульфинильных интермедиатов синтез молекул
практически любого класса органических соединений. Кроме того, некоторые сульфоксиды проявляют
биологическую активность, определяющую полезные свойства таких растений как лук, чеснок, горчица и др. (Fernandez et al, 2003). Среди современных
противоязвенных средств к наиболее эффективным
блокаторам протонной помпы относится (S)сульфоксид омепразола – эзомепразол (Cotton et al,
2000; Andersson et al, 2001).
Наряду с металлокомплексным катализом для
направленного окисления прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды используют метод биокаталитической
трансформации. При этом в качестве катализаторов процесса сульфоксидирования применяются
как индивидуальные ферменты, так и целые микробные клетки. Описаны единичные работы
(Holland et al, 1992; Porto et al, 2002), в которых
для повышения эффективности процесса окисления прохиральных сульфидов применяется широко используемый в биотехнологии прием иммобилизации целых клеток мицелиальных грибов. Основные проблемы, возникающие в процессе разработки таких биокатализаторов – сохранение жизнеспособности и функциональной активности иммобилизованных клеток микроорганизмов. С этой
точки зрения, наиболее эффективным представляется использование криогелей, обеспечивающих
проведение иммобилизации бактериальных клеток
при физиологических значениях pH, температуры
без применения токсичных химических веществ
(Лозинский, 1998).
Многие микроорганизмы в природе склонны к
образованию агрегированных форм в виде хлопьев
и биопленок. Так, среди бактерий выраженной
способностью к кооперации отличаются представители рода Rhodococcus, самоиммобилизация которых в условиях индуцированного алканотрофного типа метаболизма способствует адаптации
микробных клеток к экстремальным условиям
обитания. Подобные адаптивные механизмы позволяют эффективно использовать родококки в
биотехнологических целях, в том числе в процессах биотрансформации органических соединений
(Ившина и др., 2007).
Цель настоящей работы – оценка способности
иммобилизованных клеток родококков к окислительной биоконверсии арилалкилсульфидов.
© А. А. Елькин, Т. И. Кылосова, В. В. Гришко, И. Б. Ившина, 2010
27
28
А. А. Елькин, Т. И. Кылосова, В. В. Гришко, И. Б. Ившина
Материалы и методы
В работе использовали штамм R. rhodochrous
ИЭГМ 66 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ
(акроним коллекции ИЭГМ; Каталог штаммов..,
1994; www.iegm.ru/iegmcol).
Биотрансформацию арилалкилсульфидов (0.5–
1.5 г/л) свободными и иммобилизованными клетками родококков проводили в минеральной среде
следующего состава, г/л: KNO3 – 1.0; K2HPO4 –
1.0; KH2PO4 – 1.0; NaCl – 1.0; MgSO4x7H2O – 0.2;
CaCl2x2H2O – 0.02; FeCl3 – 0.001; дрожжевой экстракт – 0.1%; раствор микроэлементов по Постгейту – 1.0 мл/л; 0.1, 0.5 или 1.0 об.% нгексадекана в качестве источника углерода и энергии. В качестве посевного материала использовали
1
мл
2 сут
биомассы
родококков
(5.0±0.4×106 кл/мл), выращенных на мясопептонном агаре и отобранных в экспоненциальной фазе
роста, или 200 гранул иммобилизованных клеток
(5.0±0.6×106 клеток) на 100 мл среды.
В качестве носителя использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (ПВС). В работе применяли ПВС
марки 40/2 (ГОСТ 10779-78) производства ПО
«Азот» (Невинномысск, Россия). Иммобилизацию
родококков осуществляли путём внесения клеточной суспензии в раствор ПВС согласно методике, описанной в работе (Kuyukina et al, 2006).
Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0.5% р-ре NaCl в течение 24
ч.
Бактериальные клетки выращивали в условиях
периодического культивирования в колбах Эрленмейера с объемом питательной среды 100 мл на
орбитальном шейкере Certomat/S (160 об/мин) при
28°С.
Коммерчески доступные фенилметиловый (Iа),
фенилэтиловый (Iб) и пара-толилметиловый (Iв)
сульфиды в виде раствора в изопропаноле (1:10)
добавляли одновременно или через 2 сут культивирования бактериальных клеток. При этом продолжительность процесса биотрансформации родококками составляла 1–12 сут.
Продукты биотрансформации тиоанизола экстрагировали этилацетатом. Объединенные этилаце-
татные вытяжки сушили над сульфатом натрия.
Растворитель удаляли в вакууме роторного испарителя «Heidolph» (Германия). Качественный состав
продуктов биотрансформации контролировали методом тонкослойной хроматографии на пластинах с
флуоресцентной добавкой фирмы «Sigma-Aldrich»
(США), фиксируя образование продуктов окисления в УФ (254 нм) при сравнении с эталонными
сульфидами и соответствующими сульфоксидами,
полученными методом химического окисления.
Анализ продуктов биотрансформации осуществляли методом хромато-масс-спектрометрии с
помощью газового хроматографа Agilent 6890N с
кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1 и
квадрупольным масс-спектрометром Agilent MSD
5973N в качестве детектора. Оптическое вращение
растворов образцов арилалкилсульфоксидов измеряли на поляриметре фирмы «Perkin-Elmer»
(США) модель 341 при длине волны 589 нм. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле фирмы «Merck» (США) (0.06–0.20 мм), соотношение вещества и сорбента  1 : 12, в качестве
элюента использовали смесь гексана с возрастающим от 5 до 40% содержанием этилацетата.
Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью компьютерных программ Exel 2000 и Statistica (версия
6.0 для Windows).
Результаты и их обсуждение
Прием индукции оксигеназных ферментных
систем родококков углеводородными субстратами
широко используется в процессе биотрансформации органических соединений различных классов,
в том числе органических прохиральных сульфидов (Ohta et al, 1984, 1985; Гришко и др. 2000,
2009). Ранее нами было показано (Гришко и др.,
2004), что в присутствии 1 об.% н-гексадекана
свободные клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 трансформируют фенилметиловый сульфид (Iа) (тиоанизол) в оптически активный (S)-сульфоксид (IIа)
(содержание в сумме продуктов реакции 55%) за 7
сут при условии добавления сульфида через 2-е
сут инкубации родококков (рис. 1, 2).
O
O
S
S
R2
R2
(I)
R2
R1
R1
R1
O
S
(II)
(III)
а R1=H, R2=CH3
б R1=H, R2=C2H5
в R1=R2=CH3
Рис. 1. Биотрансформация арилалкилсульфидов R. rhodochrous ИЭГМ 66
Биотрансформация арилалкильных сульфидов … Rhodococcus rhodochrous
100
%
1
80
2
60
3
40
20
0
1
2
3
4
5
Сут
Рис. 2. Биотрансформация тиоанизола (Ia) (0.5 г/л)
свободными клетками родококков в присутствии нгексадекана в концентрации, об. %:
1 – 0.1; 2 – 0.5; 3 – 1.0
Установлено, что существенное влияние на каталитическую активность оксигеназных ферментов R. rhodochrous ИЭГМ 66 в отношении тиоанизола оказывает концентрация н-гексадекана в ростовой среде. Как видно из рис. 2, снижение содержания н-гексадекана до 0.5 об. % приводит к увеличению сульфидокисляющей активности родококков и, как следствие, повышению содержания
сульфоксида (IIа) до 68% в сумме продуктов биотрансформации. Полная конверсия тиоанизола (Iа)
в соответствующий сульфоксид (IIа) достигается в
29
присутствии 0.1 об. % н-гексадекана, что позволяет сократить продолжительность трансформации
тиоанизола до 6-ти сут при условии добавления
сульфида через 2-е сут инкубации родококков.
В то же время при повышении концентрации
тиоанизола биокаталитическая активность родококков заметно ингибируется. Так, при внесении
1.0 или 1.5 г/л тиоанизола уровень биоконверсии
сульфида (Iа) составляет не более 25%, при увеличении продолжительности инкубации до 12 сут –
не превышает 50%.
Для оптимизации процесса биоконверсии тиоанизола (Iа) использовали прием иммобилизации
клеток родококков в криогель на основе ПВС. По
данным хромато-масс-спектрометрии, полная биоконверсия тиоанизола (0.5 г/л) в целевой сульфоксид достигается при использовании иммобилизованных бактериальных клеток, предварительно
выращенных в присутствии н-гексадекана. Установлено, что при использовании гранул биокатализатора, содержащих 0.1 об.% н-гексадекана, уже
через 1 сут регистрируется образование в среде
целевого сульфоксида (IIа) и сульфона (IIIа) тиоанизола в соотношении 3:1 (табл. 1).
Таблица 1
Биотрансформация тиоанизола (Iа) иммобилизованными клетками родококков
Содержание в сумме продуктов реакции (%)*
Соединение
А
Б
В
1 сут 2 сут 3 сут 1 сут
2 сут 3 сут 1 сут 2 сут 3 сут
Тиоанизол (Ia)
73.6
94.1
18.0
Сульфоксид (IIa)
74.7
34.3
13.3
26.4
55.9
28.3
5.9
78.3
41.2
Сульфон (IIIa)
25.3
65.7
86.7
44.1
71.7
3.7
58.8
* При концентрации тиоанизола (Iа) в среде: А – 0.5, Б – 1.0, В – 1.5 г/л.
Достигнутая благодаря использованию иммобилизованных клеток интенсификация окислительного процесса позволила использовать более
высокие концентрации сульфидного субстрата. По
данным хромато-масс-спектрометрии, иммобилизованные клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 при добавлении тиоанизола (Iа) в концентрации 1.0 и 1.5
г/л катализируют активное окисление образующегося сульфоксида (IIа) в сульфон (IIIа) уже в течение первых суток. Как следствие, на момент
полного исчезновения тиоанизола через 2-3-е сут
концентрация побочного сульфона (IIIа) составляет 44.1 и 58.8 % соответственно (см. табл. 1).
На следующем этапе исследовали ферментативную активность иммобилизованных клеток
R. rhodochrous ИЭГМ 66 в отношении арилалкильных гомологов тиоанизола – фенилэтилового
(Iб) и пара-толилметилового (Iв) сульфидов. Установлено, что родококки при добавлении сульфидов (Iб, Iв) в концентрации 1.5 г/л, как и в модельных экспериментах с тиоанизолом (Iа), катализируют
образование
соответствующих
(S)-
сульфоксидов (IIб, IIв). Однако, показатель оптической чистоты арилалкилсульфоксидов (IIб, IIв)
уступает таковому сульфоксида тиоанизола (IIа).
Энантиомерный избыток (ее) (S)-сульфоксидов
(IIб, IIв) составляет 54.7 и 48.0 %, соответственно.
Как видно из табл. 2, при окислении арилалкилсульфидов (Iа, Iб, Iв) параллельно с процессом
образования сульфоксидов (IIа, IIб, IIв) регистрируется накопление побочных продуктов окисления
– сульфонов (IIIа, IIIб, IIIв), сопровождающееся
снижением эффективности процесса направленного синтеза целевых сульфоксидов (IIа, IIб, IIв),
химический выход которых не превышает 30%. На
наш взгляд, решение проблемы ингибирования
сульфоноокисляющей активности родококков позволит сместить направление процесса окислительной биотрансформации в сторону направленного образования целевого продукта и повышения
его оптической чистоты.
30
А. А. Елькин, Т. И. Кылосова, В. В. Гришко, И. Б. Ившина
Таблица 2
Биотрансформация арилалкилсульфидов (Iа, Iб, Iв) иммобилизованными клетками родококков
Содержание (%) продуктов биоХимический выход (%), ее (%) и
трансформации
Сульфид
[α]D (S)-сульфоксида (II)
(I)
(II)
(III)
Тиоанизол (Iа)
0.0
41.2
58.8
27.5; 82.1; -134 (c 0.4; CHCl3)
Фенилэтилсульфид (Iб)
0.0
43.6
56.4
28.4; 54.7; -116 (c 0.3; EtOH)
пара-Толилметилсульфид (Iв)
9.8
40.3
49.9
29.6; 48.0; -86 (c 0.4; CHCl3)
Заключение
Таким образом, полученные в результате проведенных исследований данные свидетельствуют о
значительном повышении сульфидокислительной
активности целых клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66
при включении их суспензии в ПВС-криогель. Установлено, что использование иммобилизованной
формы биокатализатора позволяет осуществить
конверсию арилалкилсульфидов в концентрациях
(>0.5 г/л), токсичных для свободных клеток родококков, и сократить продолжительность процесса
биотрансформации до 3 сут. О высоком окислительном потенциале родококков свидетельствует
активность полученного биокатализатора в отношении образующихся в процессе биотрансформации арилалкилсульфоксидов, ингибирование процесса окисления которых в соответствующие сульфоны может способствовать повышению продуктивности процесса образования целевых сульфоксидов.
Работа поддержана грантами Президента РФ
«Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4 и
Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие».
Библиографический список
Гришко, В.В. Биотрансформация изопимаровой и
дегидроабиетиновой кислот с использованием
бактерий рода Rhodococcus / В.В. Гришко, А.В.
Воробьев, Э.Н. Шмидт // Химия в инт. устойч.
развития. 2000. № 8. С. 693–698.
Гришко, В.В. Биотрансформация тиоанизола актинобактериями Rhodococcus sensu stricto / В.В.
Гришко, И.Б. Ившина, А.Г. Толстиков // Биотехнология. 2004. № 5. С. 49–56.
Гришко, В.В. Биокаталитическое получение физиологически активных соединений на основе
растительного β-ситостерола / В.В. Гришко,
Е.М. Ноговицина, И.Б. Ившина // Кат. в
промышл. 2009. № 1. С. 67–74.
Ившина, И.Б. Адаптационные механизмы выживания алканотрофных родококков, реализованные в неблагоприятных условиях среды / И.Б.
Ившина, Т.Н. Каменских, Б.А. Анохин // Вестн.
Перм. ун-та. Сер. Биология. 2007. № 5 (10). С.
107–112.
Каталог штаммов Региональной профилированной
коллекции алканотрофных микроорганизмов /
под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994. 163 с.
Лозинский, В.И. Криотропное гелеобразование
растворов поливинилового спирта // Успехи
химии. 1998. Т. 67, № 7. С. 641–652.
Получение и свойства органических соединений
серы / В.А. Альфонсов [и др.]; под ред. Л.И.
Беленького. М.: Химия. 1998. 560 с.
Andersson, T. Pharmacokinetic studies with esomeprazole, the (S)–isomer of omeprazole / T. Andersson, M. Hassan-Alin, G. Hasselgren [et al.] // Clin.
Pharmacokinet. 2001. Vol. 40. № 6. P. 411–426.
Cotton, H. Asymmetric synthesis of esomeprazole / H.
Cotton, T. Elebring, M. Larsson [et al.] // Tetrahedron: Asymmetry. 2000. Vol. 11. № 18. P. 3819–
3825.
Fernandez, I. Recent developments in the synthesis
and utilization of chiral sulfoxides / I. Fernandez,
N. Khiar. // Chem. Rev. 2003. Vol. 103. P. 3651–
3705.
Holland, H.L. Effect of cell immobilization and organic solvents on sulfoxidation and steroid hydroxylation by Mortierella isabellina / H.L. Holland, S.
Poddar, B. Tripet // J. Ind. Microbiol. 1992. Vol.
10. P. 195–197.
Kuyukina, M.S. Immobilization of hydrocarbonoxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels
hydrophobized using a biosurfactant / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, A.Y. Gavrin [et al.] // J. Microbiol. Methods. 2006. Vol. 65. P. 596–603.
Ohta, H. Asymmetric synthesis of chiral sulfoxides
via microbial oxidation of sulfides / H. Ohta, Y.
Okamoto, G. Tsuchihashi // Chem. Lett. 1984. P.
205–208.
Ohta, H. Microbial oxidation of allylic sulfides to the
corresponding optically active sulfoxides / H. Ohta, Y. Okamoto, G. Tsuchihashi // Agric. Biol.
Chem. 1985. Vol. 49, № 3. P. 671–676.
Биотрансформация арилалкильных сульфидов … Rhodococcus rhodochrous
Porto, A.L.M. Aspergillus terreus CCT 3320 immobilized on chrysotile or cellulose/TiO2 for sulfide
oxidation / A.L.M. Porto, F. Cassiola, S.L.P. Dias
31
[et al.] // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2002. Vol.
19–20. P. 327–334.
Поступила в редакцию 15.03.2010
Biotransformation of alkyl aryl sulfides by Rhodococcus rhodochrous IEGM 66
A.A. Elkin, T.I. Kylosova, V.V. Grishko, I.B. Ivshina
Conditions for oxidative biotransformation of methyl phenyl sulfide (thioanisole) to corresponding (S)sulfoxide (82% ee) by whole cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 were determined in the model experiments. Poly(vinyl) alcohol cryogel-immobilized rhodococci showed higher oxidation activities. As a result, the
effective oxidation of thioanisole methyl p-tolyl and ethyl phenyl sulfide (1.5 g/l) into optically active (S)sulfoxides after 3-day incubation was achieved using an immobilized biocatalyst.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.234+579.22
АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ КАТИОННОГО
ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА ОПОСРЕДОВАНО АКТИВАЦИЕЙ
АУТОЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ АТАКУЕМЫХ БАКТЕРИЙ
Л. Б. Филатова, Л. М. Лемкина, Л. И. Кононова, Т. В. Полюдова, В. П. Коробов
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail:
info@iegm.ru
На бактериях Staphylococcus epidermidis 33 изучены бактериолитические эффекты тритона
Х-100, цетавлона и низкомолекулярного амфифильного пептида варнерина. Показано, что наибольшим литическим действием обладают катионный детергент цетавлон и варнерин. Наблюдаемый в присутствии этих соединений бактериолизис обусловлен неспецифической активацией
локализованных в клеточных стенках пептидогликангидролаз.
Ключевые слова: низкомолекулярные катионные пептиды, варнерин, бактериолитическое действие, Staphylococcus epidermidis, пептидогликангидролазы, детергентная активность
Введение
Быстрое формирование резистентности и полирезистентности бактерий к антибиотикам определяет необходимость поиска новых соединений этого
класса не только среди продуктов химического синтеза, но и функционирующих в природе на всех
уровнях организации живых систем. Особое внимание исследователей привлекают убиквитарные низкомолекулярные катионные пептиды (НКП), обеспечивающие эффективную защиту про- и эукариотических организмов от ближайшего бактериального окружения (Кокряков, 1999). Механизмы антибактериального действия НКП во многом определяются высоким положительным зарядом их молекул даже в нейтральных условиях, а также гидрофобными свойствами, благодаря значительному содержанию в них алифатических аминокислот. Выраженная амфифильность способствует проявлению
мембранотропных эффектов НКП, важными следствиями которых являются быстрое падение мембранного потенциала и резкое снижение внутриклеточного уровня АТФ (Garcera et al., 1993). Вместе с тем,
обнаружены и литические эффекты этих антибактериальных соединений, которые могут быть связаны
с активацией ими аутолизинов клеточных стенок
атакуемых бактерий (Bierbaum et al., 1987). К аутолитическим ферментам относятся различные гликан- и пептидгидролазы, связанные с главным компонентом клеточных стенок бактерий пептидогликаном (Shockman et al., 1996; Baba, Schneewind,
1998). Функциональная активность этих ферментов
специфически проявляется лишь на конкретных
стадиях роста и деления бактериальных клеток
(Vollmer et al., 2008; Bourgeois et al., 2009). Показана
и неспецифическая активация аутолизинов внешними факторами, в частности, детергентами, которая
приводит к глубоким нарушениям пептидогликанового слоя клеточных стенок бактерий и их осмотической гибели (Hinks et al., 1978).
Цель настоящей работы – сравнительный анализ
бактериолитических эффектов известных поверхностноактивных соединений тритона Х-100 (октилфеноксиполиэтоксиэтанол) и цетавлона (цетилтриметиламмоний бромид), а также гидрофобного катионного пептида варнерина, выделенного из сред культивирования бактерий Staphylococcus warneri KL-1 (Коробов и др., 2010).
Материалы и методы
Работа проведена на коллекционном штамме Staphylococcus
epidermidis
33,
полученном
в
ГНИИСКМБП им. Тарасевича (Москва). Бактериальную культуру выращивали на среде LB до середины
логарифмической фазы роста. Бактерии осаждали
(10 000 g, 10 мин) на центрифуге 3K30 (Sigma, Германия), дважды отмывали в том же режиме 0.01 М
Tris-HCl буфером (рН 7.2) и ресуспендировали в буфере до оптической плотности (OD600), равной 5.0.
Для активации неспецифических аутолитических
процессов к препаратам бактерий добавляли детергенты тритон Х-100 (конечные концентрации 0.05% и
0.1%), цетавлон (конечные концентрации 0.05% и
0.1%) или низкомолекулярный пептид варнерин (конечная концентрация 8 мг/мл). Инкубацию проб проводили на шейкере Sertomat (Sartorius, Германия) при
150 об/мин и 37°С в течение 4 ч с измерением оптической плотности ежечасно на спектрофотометре PD-
© Л. Б. Филатова, Л. М. Лемкина, Л. И. Кононова, Т. В. Полюдова, В. П. Коробов, 2010
32
33
Антибактериальное действие пептида варнерина …
303 (Apel, Япония) при 600 нм. По завершению инкубации из всех проб готовили мазки для окрашивания
бактерий по методу Грама, используя комплект реагентов “Микро-ГРАМ” и пропись фирмыизготовителя (НИЦФ, С.-Петербург, Россия). Микроскопирование окрашенных препаратов проводили на
микровизоре проходящего света мVizo-103 (ЛОМО,
Россия). Для получения растворимой части бактериальных препаратов аликвоты сред культивирования
центрифугировали, как указано выше. В полученных
супернатантах изучали содержание и спектр аутолитических ферментов, используя ренатурируемый
электрофорез в 9% ПААГе (Mani et al., 1993), содержащем убитые автоклавированием (0.5 ати, 30 мин) и
отмытые дистиллированной водой бактерии S. epidermidis 33 (1.6 мг сухого веса/мл геля). После окончания процедуры разделения гели отмывали дистиллированной водой в течение 30 мин, помещали в ренатурирующий буфер (50 мМ MES-NaOH, pH 6.0;
тритон Х-100 0.1%) и инкубировали в течение 16 ч
при 37°С. После ренатурации гели промывали водой,
окрашивали 0.1% метиленовым синим в 0.01% КОН в
течение 1 ч и отмывали от красителя водой до проявления прозрачных зон лизиса импрегнированных в
гель бактериальных клеток на синем фоне связавших
краситель не лизированных бактерий.
Результаты и обсуждение
Динамика лизиса бактериальных суспензий в
присутствии детергентов и варнерина представлена
на рис. 1. Видно, что наиболее выраженным литическим действием на бактерии S. epidermidis 33 обла-
дает катионный детергент цетавлон – через 1 ч инкубирования в присутствии 0.1% раствора этого детергента около 90% бактериальных клеток лизируется, а через 4 ч в препаратах лизируются практически все клетки. Снижение концентрации этого сурфактанта до 0.05% значительно сдерживает бактериолитический эффект и через 2 ч инкубации лизируется лишь половина имеющихся в пробах бактерий. В значительно меньшей степени выражено бактериолитическое действие нейтрального детергента
тритона Х-100. Расчет использованных в этих экспериментах эмульгирующих концентраций обоих
поверхностноактивных факторов показал, что мощное литическое действие цетавлона (0.1%) проявляется при 3 ККМ (критическая концентрация мицеллообразования), в то время как даже при 6 ККМ эффект тритона Х-100 (0.1%) был, по-существу, не сопоставим с бактериолитической активностью цетавлона. По-видимому, интенсивность бактериолизиса
бактерий определяется не только способностью детергентов снижать поверхностное натяжение на
границе клеточных поверхностей и среды, но и воздействием на более глубокие структуры бактериальных клеток. Катионные свойства цетавлона, вероятно, способствуют быстрому достижению им отрицательно заряженной плазматической мембраны и
ее мицеллизации. Подтверждением этому является
выраженный бактериологический эффект катионного гидрофобного пептида варнерина. Как следует из
представленных данных, пептид, по существу, имитирует действие цетавлона.
120
Степень лизиса,%
100
80
1
2
60
3
40
20
0
0
1
2
3
4
4
5
час
Рис. 1. Динамика лизиса бактерий S. epidermidis 33 под действием низкомолекулярного пептида варнерина и
детергентов (тритон Х-100, цетавлон, додецилсульфат натрия):
1 – тритон Х-100 (0.05%); 2 – тритон Х-100 (0.1%); 3 – цетавлон (0.05%); 4 – варнерин (8 мг/мл); 5 – цетавлон (0.1%)
Различия в проявлении эффектов литических
факторов хорошо выявляются при микроскопическом изучении бактериальных суспензий через 2 ч
инкубации в присутствии детергентов и варнерина
(рис. 2). Видно, что действие цетавлона и варнерина приводит к потере бактериальными клетками
значительных количеств пептидогликана, что выявляется меньшим, нежели в контроле, связыванием красителя. В незначительной степени это характерно и для бактерий, инкубированных с тритоном. Во всех вариантах экспериментов обращает
на себя внимание выраженный диспергирующий
34
Л. Б. Филатова, Л. М. Лемкина, Л. И. Кононова, Т. В. Полюдова, В. П. Коробов
эффект детергентов и варнерина, проявляющийся
относительно равномерным распределением бактерий на поверхности стекла, в отличие от хорошо
прокрашивающихся генцианвиолетом мощных
кластеров бактерий в контрольном препарате.
1
2
3
4
5
6
Рис. 2. Препараты бактерий S. epidermidis 33 (окраска по методу Грама), подвергшихся действию
низкомолекулярного пептида варнерина и различных детергентов в течение 2 ч (ув. 100×2):
1 – контроль; 2 – варнерин (8 мг/мл); 3 – тритон Х-100 (0.05%); 4 – тритон Х-100 (0.1%); 5 – цетавлон (0.05%);
6 – цетавлон (0.1%)
Существенные данные, раскрывающие механизмы действия поверхностноактивных соединений и
пептидного антибиотика варнерина, получены при
электрофоретическом исследовании супернатантов
суспензий бактерий после инкубации с детергентами и пептидом. Как видно из представленной на
рис. 3 энзинограммы, наибольшая активация аутолизинов бактерий наблюдается под влиянием цетавлона и варнерина. При анализе состава обнаруженных в лизатах пептидогликангидролаз, обращает на
себя внимание наличие в их спектрах как одинаковых, так и активируемых в значительной степени
цетавлоном (“низкомолекулярные”) и варнерином
(“высокомолекулярные”) фракций. Эти данные во
многом раскрывают механизмы литических превращений бактерий (см. рис. 1) в присутствии использованных детергентов и варнерина, в основе которых, на наш взгляд, лежит неспецифическая активация локализованных в клеточных стенках бактерий гидролаз за счёт их “освобождения” из анионных сайтов связывания (Zoll et al., 2010).
1
2
3
Рис. 3. Энзимограмма (негативное изображение)
аутолитических ферментов бактерий S. epidermidis 33,
активирующихся при действии низкомолекулярного
пептида варнерина и детергентов:
1 – цетавлон (0.1%); 2 – тритон Х-100 (0.1%); 3 –
варнерин (8 мг/мл)
35
Антибактериальное действие пептида варнерина …
Таким образом, результаты предпринятого анализа бактериолитических эффектов цетавлона и
варнерина позволяют констатировать наличие у
пептида детергентной активности, как важной составляющей арсенала его антибактериального действия.
Работа поддержана грантами Президента РФ
«Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4;
Российского фонда фундаментальных исследований
и Министерства промышленности, инноваций и
науки Пермского края № 10-04-96086-р_урал_а;
Программы Президиума РАН «Молекулярная и
клеточная биология» и Междисциплинарного проекта фундаментальных исследований, выполняемых
в учреждениях УрО РАН.
Библиографический список
Кокряков, В.Н. Биология антибиотиков микробного
происхождения / В.Н. Коряков // СПб.: Наука,
1999. 164 с.
Коробов, В.П. Выделение и характеристика нового
низкомолекулярного антибактериального пептида семейства лантибиотиков / В.П. Коробов,
Л.М. Лемкина, Т.В. Полюдова, В.К. Акименко //
Микробиология. 2010. Т. 79, № 2. С. 228–238.
Baba, T. Targeting of muralytic enzymes to the cell division site of Gram-positive bacteria: repeat domains
direct autolysin to the equatorial surface ring of Staphylococcus aureus / T. Baba, O. Schneewind //
EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 4639–4646.
Bierbaum, G. Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of
N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase / G. Bierbaum, H.G. Sahl // J. Bacteriol. 1987. Vol. 169. P.
5452–5458.
Bourgeois, I. Characterization of AtlL, a bifunctional
autolysin of Staphylococcus lugdunensis with
N-acetylglucosaminidase and N-acetylmuramoyl-Lalanineamidase activities / I. Bourgeois, E. Camiade,
R. Biswas [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. 2009.
Vol. 290. P. 105–113.
Garcerá, M.J. In vitro pore-forming activity of the lantibiotic nisin. Role of protonmotive force and lipid
composition / M.J. Garcerá, M.G. Elferink, A.J.
Driessen, W.N. Konings // Eur. J. Biochem. 1993.
Vol. 12. P. 417–422.
Heilmann, C. Identification and characterization of a
novel autolysin (Aae) with adhesive properties from
Staphylococcus epidermidis / C. Heilmann, G.
Thumm, G.S. Chhatwal [et al.] // Microbiology.
2003. Vol. 149. P. 2769–2778.
Hinks, E.T. Effects of temperature on the autolytic enzyme system of Streptococcus faecalis / E.T. Hinks,
L. Daneo-Moore, S. Braverman // J. Bacteriol. 1978.
Vol. 136. P. 491–496.
Mani, N. Isolation and characterization of autolysisdefective mutants of Staphylococcus ureus created
by Tn917-lacZ mutagenesis / N. Mani, P. Tobin, R.
K. Jayaswal // J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. P. 1493–
1499.
Shockman, G.D. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis / G.D. Shockman, L.
Daneo-Moore, R. Kariyama, O. Massidda // Microb.
Drug. Resist. 1996. Vol. 2. P. 95–98.
Zoll, S. Structural basis of cell wall cleavage by a staphylococcal autolysin / S. Zoll, B. Pätzold, M.
Schlag [et al.] // PLoS Pathog. 2010. Vol. 6:
e1000807.
Vollmer, W. Bacterial peptidoglycan(murein) hydrolases
/ W. Vollmer, B. Joris, P. Charlier, S. Foster //
FEMS Microbiol. Rev. 2008. Vol. 32. P. 259–286.
Поступила в редакцию 30.03.2010
Antibacterial effect of peptide warnerin mediated by activation of autolytic systems
in attacked bacteria
L.B. Filatova, L.M. Lemkina, L.I. Kononova, T.V. Poludova, V.P. Korobov
Bacteriolytic effects of Triton X-100, cetavlon, and low-molecular weight amphiphilic peptide warnerin were
examined using bacteria S. epidermidis 33. It was demonstrated that highest lytic effect possessed cationic detergent cetavlon and warnerin. Bacteriolysis being observed in presence of those compounds was conditioned by
non-specific activation of peptidoglycan hydrolases localized in cell walls.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.22
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ldcC Escherichia coli
КАК ФАКТОР АДАПТАЦИИ К АНТИБИОТИКАМ
М. С. Шумков a , А. В. Гончаренко b , А. М. Кылосова c , А. Г. Ткаченко a , c
a
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, ул. Ленинский проспект, 33, e-mail: inbi@inbi.ras.ru
c
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15: biodin@psu.ru
b
На основе репортерных генных слияний созданы штаммы E. coli, позволяющие изучить экспрессию
гена ldcC на транскрипционном и трансляционном уровнях её регуляции. Показано, что антибиотики фторхинолонового ряда (пефлоксацин) вызывают приблизительно 2-кратное повышение экспрессии, в то время как β-лактамы (цефотаксим) проявляют противоположно направленный эффект,
приводя к 2-кратному снижению уровня экспрессии ldcC. Выраженная функциональная специализация полиаминов в условиях воздействия антибиотиков обусловливает различия их эффектов на
экспрессию ldcC в зависимости от с класса действующего антибиотика (фторхинолоны или βлактамы).
Ключевые слова: антибиотикорезистентность, Escherichia coli, мутантные штаммы, пефлоксацин, цефотаксим,
адаптация, полиамины, экспрессия гена ldcC, лизиндекарбоксилаза LdcC.
Антибиотикотерапия является одним из наиболее
широко используемых способов лечения бактериальных инфекций. Вместе с тем, эффективность
применения антибиотиков в последнее время неуклонно снижается, что связано с широким распространением антибиотикоустойчивых форм бактерий.
Резистентность микроорганизмов к антибиотикам
может формироваться как на основе специфических
(обусловленных изменением структуры мишени,
приобретением специфических ферментов деградации и т.д.) так и неспецифических механизмов, которые, как правило, не обеспечивают высокого
уровня антибиотикорезистентности, но действуют в
отношении широкого спектра антибактериальных
препаратов. В основе таких механизмов лежит активация общего стрессорного ответа бактериальной
клетки, которая может быть обусловлена индукцией
rpoS регулона, то есть группы генов адаптации, которые находятся под контролем глобального транскрипционного регулятора σS (RpoS), и/или естественными защитными свойствами полиаминов – биогенных модуляторов широкого спектра действия.
Ранее нами показано, что сублетальные воздействия представителей наиболее широко используемых классов антибиотиков, фторхинолонов и βлактамов, индуцируют ответ со стороны системы
синтеза полиаминов, что приводит к значительному
их накоплению в клетках E. coli (Ткаченко и др.,
2009). При этом количественное соотношение различных полиаминов было специфичным для разных классов антибиотиков. Показано, что наиболее
характерным признаком ответа на фторхинолоны
является высокое накопление одного из полиаминов, кадаверина, что сопровождалось существенной
индукцией экспрессии rpoS и характеризовалось
сильной корреляцией этих параметров (r=0.90,
p≤0.05).
Известно, что синтез кадаверина в клетках
E. coli осуществляется в процессе реакции, катализируемой двумя изоферментами лизиндекарбоксилазы, CadA и LdcC. При этом синтез LdcC, которая
ранее считалась конститутивным ферментом, находится под контролем RpoS (Lemonier, Lane, 1998;
Ткаченко и др., 2009). Сравнительное изучение активности двух форм лизиндекарбоксилазы в условиях воздействия различных антибиотиков показало изменение их соотношения в зависимости от
класса действующего антибактериального препарата. В частности, рассматриваемая ранее как конститутивная лизиндекарбоксилаза LdcC, демонстрировала существенное возрастание активности в ответ
на фторхинолоны (Ахова, Ткаченко, 2009). Исходя
из этого, сделано предположение о возможности
индуцибельного характера изменения экспрессии
гена ldcC, кодирующего данный фермент, в ответ
на воздействие фторхинолоновых антибиотиков.
Для проверки данного предположения в настоящей
работе сконструированы два типа однокопийных
репортерных генных слияний ldcC::lacZ, транскрипционное и трансляционное, и проведено изучение их экспрессии в ответ на воздействие двух
различных классов антибиотиков, фторхинолонов и
β-лактамов.
© М. С. Шумков, А. В. Гончаренко, А. М. Кылосова, А. Г. Ткаченко, 2010
36
Изменение экспрессии ldcC Escherichia coli как фактор адаптации к антибиотикам
Материалы и методы
Объекты исследования
Использованные в настоящей работе плазмиды
и штаммы E. coli с указанием их генотипических
свойств перечислены в таблице.
Плазмиды pRS551/6 и pRS552/13 были сконструированы путём лигирования промоторной области гена ldcC, амплифицированной с использованием
праймеров
LdcRI
5’CCGGAATTCGCAAAAGTTCTGAAAAAGGGTC-
37
3’
и
LdcBam
5’GGGGATCCCAGATAATCTGAAAGCCTTGCGC3’, в pGEM-T easy (Promega, США) с последующим
переносом EcoRI/BamHI-рестриктов в pRS551 или
pRS552 (Simons et al., 1987), соответственно. Полученные плазмиды трансформировали в клетки E.
coli BMH 71-18 mutS (Promega, США), λRS45 лизаты которых затем использовали для инфекции E.
coli GC4468. Отобранные по результатам KanR моно-лизогены несли транскрипционное (SHT36) или
трансляционное (SHT40) ldcC::lacZ генное слияние.
Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в настоящей работе
Штаммы E. coli
и плазмиды
SHT36
SHT40
BMH 71-18 mutS
pRS551/6
pRS552/13
Источник
получения
Генотип
GC4468 (RS45 ldcC::lacZ)
GC4468 (RS45 ldcC::lacZ [hybr])
thi, supE, Δ(lac-proAB), [mutS::Tn10], [F´, proAB,
laqIqZΔM15]
pRS551 ldcC::lacZ
pRS552 ldcC::lacZ
Культивирование микроорганизмов
Перед экспериментом штаммы E. coli, сохраняемые на скошенном LB-агаре, высевали на пробирку с
5 мл LB-бульона. По истечении 11 ч культивирования в термостате при 37С клетки переносили в колбу со 100 мл LB-бульона и выращивали в течение 13
ч в термостатируемом шейкере (100 об/мин) при той
же температуре. Выросшую культуру использовали в
качестве инокулята для посева в колбы с 50 мл LBбульона. Исследуемые антибиотики, в концентрациях, указанных в подписях к рисункам, вносили при
оптической плотности культуры равной 0.3 (OD600).
Биомассу клеток оценивали по оптической
плотности (OD600) на спектрофотометре PD-303UV
(Apel, Япония).
Активность -галактозидазы измеряли в клетках, предварительно обработанных смесью DS-Na и
хлороформа методом Миллера (Miller, 1992).
Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием пакета стандартных программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., 2001).
На рисунках приведены данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех), представленные
в формате среднее ± среднее квадратичное отклонение. Оценка статистической значимости различий
средних сравниваемых групп для множественных
сравнений произведена с использованием критерия
Ньюмена-Кейлса. Различия считали значимыми при
р0.05.
Результаты
Влияние антибиотиков на экспрессию ldcC
Известно, что эффект антибиотиков на генную
экспрессию может значительно изменяться в зависи-
настоящая работа
настоящая работа
Promega, США
настоящая работа
настоящая работа
мости от величины их воздействующей концентрации (Davies et al., 2006). Исходя из этого, концентрации антибактериальных препаратов, использованные
нами для воспроизведения их сублетального эффекта, подбирались таким образом, чтобы обеспечить
одинаковое, 70%, снижение накопления биомассы к
5 часу действия антибиотика.
Транскрипция ldcC после внесения в среду 0.12
мкг/мл фторхинолона пефлоксацина возрастала в 2.6
раза, тогда как уровень трансляции в этих условиях
увеличивался на 70% (рис. 1).
В отличие от этого внесение 0.4 мкг/мл цефотаксима, относящегося к классу β-лактамов, вызывало
противоположный эффект, приводя к 55% падению
транскрипции ldcC и 40% снижению его трансляции
(рис. 1).
Влияние полиаминов на экспрессию ldcC в
присутствии антибиотиков
Ранее показано, что полиамины могут принимать
участие в широком спектре адаптивных реакций бактериальной клетки (Ткаченко, 2004; Ткаченко и др.,
2006; Rhee et al., 2007), в том числе, в ответе на добавку антибиотиков (Ткаченко и др., 2009), где они
могут играть роль фактора адаптации, способствующего повышению жизнеспособности. Поскольку одним из механизмов участия полиаминов в приспособлении бактерий к неблагоприятным условиям
среды является регуляция экспрессии адаптивных
генов, было сделано предположение о возможности
участия полиаминов, в частности путресцина и спермидина, также и в регуляции экспрессии ldcC.
38
М. С. Шумков, А. В. Гончаренко, А. М. Кылосова, А. Г. Ткаченко
как внесение спермидина вызывало снижение уровня
экспрессии ldcC на обоих уровнях экспрессии до
значений нестрессированной культуры (рис. 2).
В условиях добавки в среду цефотаксима транскрипция ldcC при действии путресцина и спермидина
не изменялась. В то же время, на уровне трансляции
полиамины демонстрировали тенденцию к повышению экспрессии ldcC (примерно на 30% в сравнении
со стрессированной культурой без полиаминов), однако их эффект не был статистически значимым
(рис. 3).
Экспрессия ldcC, ед. Миллера
600
500
400
300
200
100
1
2
1
пефлоксацин
2
цефотаксим
Рис. 1. Влияние антибиотиков на экспрессию гена ldcC E.
coli. на транскрипционном (1) и трансляционном (2)
уровнях спустя 4 ч после внесения антибактериальных
препаратов. Светлые столбцы – контроль (культивирование в отсутствие антибиотиков), заштрихованные –
культивирование в присутствии антибиотика в концентрациях 0.12 мкг/мл пефлоксацина и 0.4 мкг/мл цефотаксима. Различия средних значений экспрессии ldcC в
стрессированных и контрольных культурах статистически
значимы при p≤0.05
Экспрессия ldcC, ед. Миллера
Проведенные нами исследования показали, что в
контрольной культуре, выращенной в отсутствие антибиотиков, полиамины не оказывали существенного
влияния на уровень экспрессии ldcC (рис. 2, 3) и скорость роста бактериальной культуры (рис. 4).
1200
*
*
1000
800
600
400
*
*
200
0
1 2 3
1 2 3
К
ПФЛ
транскрипция
1 2 3
1 2 3
К
ПФЛ
трансляция
Рис. 2. Влияние полиаминов на экспрессию гена ldcC на
уровнях транскрипции (E. coli SHT36) и трансляции (E. coli
SHT40) при действии пефлоксацина:
1 – контрольная культура, без добавки полиаминов; 2 –
внесение 5 мМ путресцина; 3 – внесение 5 мМ спермидина;
К – культуры без антибиотиков; ПФЛ – культуры с
добавкой 0.12 мкг/мл пефлоксацина; * – статистически
значимые отличия от стрессированной культуры без
полиаминов, p≤0.05
Иная картина наблюдалась при добавке полиаминов в бактериальную культуру в условиях воздействия антибиотиков. В присутствии пефлоксацина путресцин вызывал 70% повышение транскрипции и
90% возрастание трансляции ldcC в сравнении со
стрессированной культурой без полиаминов, тогда
Экспрессия ldcC, ед. Миллера
400
0
320
240
160
80
0
1 2 3
1 2 3
К
ЦФТ
транскрипция
1 2 3
1 2 3
К
ЦФТ
трансляция
Рис. 3. Влияние полиаминов на экспрессию гена ldcC на
уровнях транскрипции (E. coli SHT36) и трансляции (E. coli
SHT40) при действии цефотаксима:
1 – контрольная культура, без добавки полиаминов; 2 –
внесение 5 мМ путресцина; 3 – внесение 5 мМ спермиидина; К – культуры без антибиотиков; ЦФТ – культуры с
добавкой 0.4 мкг/мл цефотаксима
На фоне таких изменений экспрессии ldcC привлекают внимание данные, характеризующие рост
соответствующих культур (рис. 4). Путресцин в присутствии пефлоксацина не оказывал какого-либо
влияния на скорость накопления биомассы, тогда как
спермидин вызывал 2-кратное повышение значений
оптической плотности, что указывает на его роль как
фактора, частично снимающего ингибирующий эффект антибиотика. Вместе с тем, в условиях действия
цефотаксима полиамины не оказывали какого-либо
влияния на рост бактериальных культур (данные не
показаны).
Обсуждение
Первое упоминание о существовании второй, наряду с CadA, лизиндекарбоксилазы E. coli LdcC приводится в работе Kikuchi et al. (1997). Приблизительно в то же время появилось сообщение о вероятном
конститутивном характере экспрессии кодирующего
её гена ldcC (Yamamoto et al., 1997). Вместе с тем, в
последующих за этими публикациями работах Lemonnier, Lane (1998) и Kikuchi et al. (1998) показано,
Изменение экспрессии ldcC Escherichia coli как фактор адаптации к антибиотикам
Оптическая плотность, OD 600
2,0
1,6
1,2
*
0,8
0,4
0,0
1
2
3
без антибиотика
1
2
3
пефлоксацин
Рис. 4. Влияние полиаминов на рост культуры E. coli
SHT36 при действии 0.12 мкг/мл пефлоксацина:
1 – контрольная культура, без добавки полиаминов; 2 –
внесение 5 мМ путресцина; 3 – внесение 5 мМ спермиидина; * – статистически значимые отличия от стрессированной культуры без полиаминов, p≤0.05
что экспрессия ldcC зависит от σS-субъединицы РНКполимеразы (RpoS) и поставлен под сомнение конститутивный характер её регуляции. Что касается
возможности участия других факторов в регуляции
экспрессии ldcC, информация по данному вопросу до
сих пор отсутствовала.
В настоящей работе нами впервые продемонстрировано изменение экспрессии ldcC в ответ на добавку антибиотиков двух различных классов – фторхинолонов и β-лактамов (см. рис. 1). Таким образом, с
одной стороны, получено несомненное доказательство индуцибельного характера регуляции данного гена, с другой – описаны условия его индукции, которые указывают на возможную адаптивную роль соответствующего фермента в условиях стресса, обусловленного действием антибиотиков фторхинолонового ряда.
Известно, что экспрессия rpoS в условиях стресса,
вызванного антибиотиками, также существенно изменяется (Ткаченко и др., 2009), однако оставалось
неизвестным, связаны ли наблюдаемые изменения
экспрессии ldcC в ответ на антибиотики только с
влиянием RpoS, или в её регуляции принимают участие другие факторы. Данные об однозначном возрастании экспрессии rpoS в ответ на антибиотики,
независимо от их класса (Ткаченко и др., 2009), в отличие от альтернативного ответа со стороны экспрессии ldcC на различные антибиотики (см. рис. 1,
3), свидетельствуют о том, что, по меньшей мере при
добавке цефотаксима, в регуляции экспрессии ldcC,
помимо RpoS, принимают участие другие генные
модуляторы.
Ранее было установлено, что экспрессия rpoS может возрастать при добавке полиаминов даже в отсутствие стрессорного воздействия (Ткаченко, Шумков, 2004). В настоящей работе показано, что полиамины (путресцин и спермидин) вызывали статистически значимое изменение экспрессии ldcC только в
присутствии фторхинолонового антибиотика пеф-
39
локсацина и совсем не влияли на неё в контрольных
культурах без антибиотиков (см. рис. 2, 3). Исходя из
этого, можно прийти к заключению, что, во-первых,
в качестве транскрипционных модуляторов в отношении ldcC, наряду с RpoS, могут выступать полиамины (путресцин и спермидин), во-вторых, наряду с
полиаминами, в этом процессе должны участвовать
какие-то дополнительные факторы, обусловливающие, в том числе, и противоположный характер эффекта цефотаксима.
Снижение экспрессии ldcC при добавке спермидина в присутствии пефлоксацина в среде культивирования (см. рис. 2), очевидно, не связано с негативным влиянием этого полиамина на транскрипцию
или трансляцию исследуемого гена. Наиболее вероятно, это обусловлено альтернативными антистрессорными функциями спермидина, частично снимающего ингибиторное действие антибиотика, что
вызывает пропорциональное снижение силы адаптивного ответа в виде ослабления экспрессии ldcC.
Об этом свидетельствует 2-кратная стимуляция роста
культуры E. coli, наблюдаемая в ответ на добавку
спермидина в присутствии антибиотика (рис. 4).
В отличие от спермидина, путресцин не оказывал
заметного положительного эффекта на уровень биомассы стрессированной культуры (рис. 4), однако
двукратно повышал экспрессию ldcC в ответ на воздействие пефлоксацина (см. рис. 2). Исходя из этого,
складывается впечатление о преобладании у путресцина свойств положительного модулятора ldcC по
сравнению с его антистрессорными свойствами, подобными спермидину. Спермидин, как известно,
имеет большее, по сравнению с путресцином, сродство к ДНК (Cohen, 1978) и способность улавливать
активные формы кислорода (Ткаченко, Федотова,
2007), продуцируемые при действии антибиотиков
(Kohansky et al., 2007).
Таким образом, экспрессия ldcC в условиях сублетальных воздействий антибиотиков регулируется в
широких пределах. Фторхинолоны (пефлоксацин)
вызывают её 2-кратное повышение, в то время как βлактамы (цефотаксим) оказывают противоположно
направленный эффект, приводя к 2-кратному снижению экспрессии. Такие особенности изменения экспрессии ldcC дают основание считать, что соответствующая лизиндекарбоксилаза играет более существенную роль в защите бактериальной клетки от
фторхинолоновых антибиотиков по сравнению с βлактамами. Полиамины в этих условиях проявляют
выраженную функциональную специализацию с
преобладанием антистрессорных свойств у спермидина и функций положительного модулятора генной
экспрессии у путресцина.
Работа выполнена по программе Президиума
РАН «Молекулярная и клеточная биология» (№
0120096390), поддержана грантом Российского
фонда
фундаментальных
исследований
и
Министерства промышленности, инноваций и науки
Пермского края № 09-04-99006-р-офи, а также
40
М. С. Шумков, А. В. Гончаренко, А. М. Кылосова, А. Г. Ткаченко
молодежным
научным
отделения РАН.
грантом
Уральского
Библиографический список
Ахова, А.В. Лизиндекарбоксилазная активность как
фактор резистентности Escherichia coli к фторхинолонам / А.В. Ахова, А.Г. Ткаченко // Микробиология. 2009. Т. 78, № 5. С. 636–640.
Ткаченко, А.Г. Механизмы защитных функций полиаминов Escherichia coli от токсического эффекта параквата, индуцирующего супероксидный стресс //
Биохимия. 2004. Т. 69. С. 234–242.
Ткаченко, А.Г. Роль путресцина в регуляции уровня σ s -субъединицы. РНК-полимеразы в клетках
Escherichia coli при переходе к стационарной
фазе / А.Г. Ткаченко, М.С. Шумков // Биохимия.
2004. Т. 69. С. 1079–1087.
Ткаченко, А.Г. Роль полиаминов в формировании
множественной
антибиотикоустойчивости
Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий / А.Г. Ткаченко, О.Н. Пожидаева, М.С. Шумков // Биохимия. 2006. Т. 71, № 9. С. 1287–1296.
Ткаченко, А.Г. Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от силы стрессорных
воздействий супероксидных радикалов / А.Г.
Ткаченко, М.В. Федотова // Биохимия. 2007. Т. 72.
С. 109–116.
Ткаченко, А.Г. Адаптивные функции полиаминов при
сублетальных воздействиях антибиотиков / А.Г.
Ткаченко, М.С. Шумков, А.В. Ахова // Микробиология. 2009. Т. 78, № 1. С. 32–41.
Cohen, S.S. What do the polyamines do? // Nature. 1978.
Vol. 274. P. 209–210.
Davies, J. The world of subinhibitory antibiotic concentrations / J. Davies, G.B. Spiegelman, G. Yim // Curr.
Opin. Microbiol. 2006. Vol. 9. P. 445–453.
Kikuchi, Y. Characterization of a Second Lysine Decarboxylase Isolated from Escherichia coli / Y. Kikuchi,
H. Kojima, T. Tanaka [et al.] // J. Bacteriol. 1997.
Vol. 179, № 14. P. 4486–4492.
Kikuchi, Y. RpoS-dependent expression of the second lysine
decarboxylase gene in Escherichia coli / Y. Kikuchi, O.
Kurahashi, T. Nagano [et al.] // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. Vol. 62. P. 1267–1270.
Kohanski, M.A. A Common Mechanism of Cellular
Death Induced by Bactericidal Antibiotics / M.A.
Kohanski, D.J. Dwyer, B. Hayete [et al.] // Cell.
2007. Vol. 130. P. 797–810.
Lemonnier, M. Expression of the second lysine decarboxylase gene of Escherichia coli / M. Lemonnier, D.
Lane // Microbiology. Uk. 1998. Vol. 144. P. 751–
760.
Miller, J.H. Experiments in molecular genetics. / J.H.
Miller. Cold Spring Harbor. New York. 1992.
Rhee, H.J. Physiological polyamines: simple primordial
stress molecules / H.J. Rhee, E.-J. Kim, J.K. Lee // J.
Cell. Mol. Med. 2007. Vol. 11, № 4. P. 685–703.
Simons, R.W. Improved single and multicopy lac-based
cloning vectors for protein and operon fusions / R.W.
Simons, F. Houman, and N. Kleckner// Gene. 1987.
Vol. 53. P. 85–96.
Yamamoto, Y. The Escherichia coli ldcC gene encodes
another lysine decarboxylase, probably a constitutive enzyme / Y. Yamamoto, Y. Miwa, K. Miyoshi
[et al.] // Genes Genet. Syst. 1997. Vol. 72. P. 167–
172.
Поступила в редакцию 29.03.2010
Alterations of Escherichia coli ldcC expression as a factor of adaptation to antimicrobials
M.S. Shumkov, A.V. Goncharenko, A.M. Kylosova, A.G. Tkachenko
E. coli strains with single-copy chromosomal operon and protein ldcC::lacZ reporter gene fusions were constructed. Approximately 2-fold ldcC expression increase following pefloxacin application was demonstrated using these strains. On the contrary, cefotaxime treatment caused a 2-fold decrease in the ldcC expression. Polyamines in the presence of antibiotics demonstrated substantial functional specialization. Their effect strongly depended on the antibiotic applied: either fluoroquinolone or β-lactam.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.22+579.253.2
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
УСТОЙЧИВЫХ К ВАНКОМИЦИНУ ШТАММОВ
КОАГУЛАЗОНЕГАТИВНЫХ СТАФИЛОКОККОВ
Л. И. Кононова, В. П. Коробов
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614990, Пермь, ул. Голева, 13; e-mail: info@iegm.ru
Селекционированные в лаборатории и клинические изоляты коагулазонегативных стафилококков, устойчивые к гликопептидному антибиотику ванкомицину, имеют ряд отличительных физиологических особенностей по сравнению с бактериями чувствительного к ванкомицину коллекционного штамма Staphylococcus epidermidis 33. Все Vanr-штаммы обладают не только высокой степенью устойчивости с ванкомицину, но и характеризуются множественной устойчивостью к другим антибиотикам, а также ослабленной чувствительностью к антибактериальному
пептиду варнерину, снижением уровня гидрофобности поверхности клеточных стенок, замедленным ростом и слабой способностью к накоплению биомассы.
Ключевые слова: коагулазонегативные стафилококки, Staphylococcus epidermidis, антибиотикоустойчивость,
ванкомицин, низкомолекулярные катионные пептиды, варнерин, гидрофобность
Введение
Появление в 80-х гг. прошлого столетия резистентности бактерий родов Enterococcus и Staphylococcus к гликопептидным антибиотикам ванкомицину и тейкопланину быстро нашло биохимическое и
генетическое объяснение благодаря интенсивному
изучению ванкомицин-резистентных штаммов энтерококков (Al-Obeid et al., 1990) и S. aureus (Lyon et
al., 1987). Однако, несмотря на неуклонный рост резистентных штаммов, гликопептидные антибиотики
во всех странах мира в настоящее время остаются
препаратами выбора при инфекциях, обусловленных
метициллин-резистентными штаммами S. aureus
(MRSA) и S. epidermidis (MRSE), а также устойчивыми к ампициллину и аминогликозидам штаммами
энтерококков (Huycke et al., 1998; Зайцев, 2003).
Существенным событием последнего времени
является появление и значительное увеличение гетерорезистентности к гликопептидам среди метициллин-устойчивых коагулазонегативных стафилокков (КНС), механизмы которой до сих пор не
раскрыты (Sieradzki et al., 1999). Это определяет
необходимость дополнительных исследований
природы такой устойчивости КНС и поиска путей
ее преодоления.
Типы устойчивости к гликопептидам, обнаруженные среди различных видов энтерококков, обусловлены генами резистентности, которые расположены на мобильных генетических элементах и
способны к переносу не только в чувствительные
реципиенты этого рода, но и в другие грамположительные бактерии (Arthur et al., 1993). При этом ус-
тановлено, что для штаммов S. aureus со сниженной
чувствительностью или устойчивостью к ванкомицину (Van) характерно существенное утолщение
клеточной стенки и избыточная продукция новых
мишеней действия гликопептидов, локализованных
вдали от истинных мишеней на плазматической
мембране (Hanaki et al., 1998; Cui et al., 2003).
Механизмы устойчивости КНС к гликопептидам
полностью не раскрыты (Biavasco et al., 2000). Показано, что устойчивые к Van КНС отличаются по некоторым свойствам (появлению множественной устойчивости к антибактериальным препаратам, изменению способности поглощать ванкомицин из среды
культивирования) от чувствительных бактерий. Более того, гетерогенная природа устойчивости КНС к
Van является характерной особенностью этой группы микроорганизмов (Biavasco et al., 2000).
Целью работы было изучение физиологических
характеристик устойчивых к ванкомицину штаммов КНС и сравнение их со свойствами чувствительного к Van штамма S. epidermidis 33.
Материалы и методы
В работе исследовали коллекционный штамм S.
epidermidis 33, полученный в ГНИИСКМБП им.
Тарасевича, и его Vanr-производные, селекционированные в лаборатории культивированием на средах с возрастающими концентрациями антибиотика, а также клинические Vanr-штаммы КНС, выявленные посевом на агаризованные среды с градиентом концентрации этого антибиотика (Hanaki et al.,
2001).
Выращивание бактерий проводили в питатель-
© Л. И. Кононова, В. П. Коробов, 2010
41
42
Л. И. Кононова, В. П. Коробов
ной среде LB (Миллер, 1976) на орбитальном
шейкере Certomat (Sartorius, Германия) при 150
об/мин и температуре 37ºC. За динамикой роста
следили по изменению оптической плотности бактериальных культур при 600 нм на спектрофотометре PD-303 (APEL, Япония). МПК ванкомицина
всех изучаемых штаммов определяли методом
двукратных серийных разведений в 96-луночных
иммунологических планшетах. В лунки, содержащие питательную среду LB, вносили бактерии логарифмической фазы роста в конечной концентрации 105 КОЕ/мл.
Определение чувствительности бактерий к
низкомолекулярному пептиду варнерину проводили, как представлено ранее (Korobov et al., 2003).
Чувствительность к антибиотикам выявляли методом диффузии с дисков (Скала и др. 2004). Степень гидрофобности поверхности бактериальных
клеток определяли с помощью BATH-теста в
двухфазной системе с гексадеканом (Rosenberg et
al., 1980). Способность штаммов к образованию
биопленок изучали в плоскодонных полистироловых планшетах при культивировании на среде LB
при 37ºC без перемешивания в течение двух суток.
После окончания культивирования и двухкратного
промывания биопленок физиологическим раствором проводили их окрашивание 0.1% раствором
генцианвиолета. Количество связавшегося красителя определяли после экстракции пленок этанолом и измерения оптической плотности спиртовых
экстрактов на планшетном спектрофотометре
Benchmark Plus (Bio-Rad, США) при 570 нм (Christensen et al., 1985).
Результаты и их обсуждение
Результаты исследований представлены в табл.
1, 2. Обнаружено, что полученные в лаборатории
под прессом возрастающих концентраций антибиотика Vanr-производные штамма S. epidermidis
33 и клинические Vanr-изоляты стафилококков обладали высоким уровнем устойчивости к Van
(МПК от 250 до 1000 мкг/мл). Устойчивость всех
изученных Vanr-штаммов к варнерину была приблизительно одинакова. МПК варнерина для них
составляла ≥125 мкг/мл, что значительно превышало МПК варнерина родительского штамма S.
epidermidis 33, равную 0.25 мкг/мл.
Таблица 1
Характеристика гидрофобности и чувствительности к ванкомицину и варнерину
использованных в работе штаммов
МПК ванкомицина,
МПК варнерина,
Гидрофобность клеточШтаммы
мкг/мл
мкг/мл
ной поверхности, %
S. epidermidis 33
1.1
0.25
34 – 55
S. epidermidis 33 Vanr (16)*
≥ 400.0
≥ 125.0
7 – 14
S. epidermidis 33 Vanr2(12)*
≥ 500.0
≥ 125.0
7 – 26
S. epidermidis 33 Vanr3(12)*
≥ 1000.0
≥ 125.0
22 – 26
КНС клинический 337 Vanr
≥ 250.0
≥ 62.5
5 – 15
r
КНС клинический 713 Van
≥ 250.0
≥ 62.5
4–9
КНС клинический 699 Vanr
≥ 250.0
≥ 62.5
6 – 12
(12)*, (16)*
– число пассажей на средах с возрастающей концентрацией ванкомицина.
Таблица 2
Чувствительность исследованных штаммов стафилококков к антибиотикам
Антибиотики
Штаммы
Бен Ген Цеф Тет Лин Окс
Риф
Эр Фуз Лев Ван Цип
S. epidermidis 33
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
Ч
S. epidermidis 33
У
Ч
Ч
П
У
У
П
Ч
У
Ч
У
Ч
Vanr (16)*
S. epidermidis 33
У
Ч
Ч
П
У
У
П
Ч
У
Ч
У
Ч
Vanr2 (12)*
S. epidermidis 33
У
Ч
Ч
П
У
У
П
Ч
У
Ч
У
Ч
Vanr3(12)*
КНС клинический
У
Ч
Ч
Ч
У
У
Ч
Ч
Ч
Ч
У
Ч
337 Vanr
КНС клинический
У
Ч
Ч
Ч
У
У
Ч
Ч
Ч
Ч
У
Ч
713 Vanr
КНС клинический
У
Ч
Ч
Ч
У
У
Ч
Ч
Ч
Ч
У
Ч
699 Vanr
Степень устойчивости к антибиотикам: У – устойчивый, П – промежуточный, Ч – чувствительный. Антибиотики: Бен – бензилпенициллин, Ген – гентамицин, Цеф – цефалексин, Тет – тетрациклин, Лин – линкомицин, Окс – оксациллин, Риф – рифампицин, Эр – эритромицин, Фуз – фузидин, Лев – левомицетин, Ван – ванкомицин, Цип – ципрофлоксацин.
43
Физиологические особенности устойчивых к ванкомицину штаммов …
Как видно из табл. 1, для всех Vanr-штаммов
было характерно значительное снижение гидрофобности клеточной поверхности. Возможно, это
играет существенную роль в снижении чувствительности Vanr-штаммов к варнерину за счет ослабления гидрофобных взаимодействий молекул пептида с поверхностными структурами бактериальных клеток. Интересно отметить, что рост всех
Vanr-штаммов подавлялся концентрациями NaCl
(10–15%), при которых чувствительный штамм S.
epidermidis 33 обладал способностью к обильному
росту.
Исследования показали, что образование Vanrфенотипа стафилококков сопровождалось приобретением устойчивости и к ряду других антибиотиков (табл. 2). При этом клинические штаммы, по
данным первых экспериментов, обладали одинаковыми плазмидными спектрами.
Сравнительный анализ динамики роста на среде LB стафилококков, различающихся по чувствительности к Van, показал, что характерной особенностью всех клинических и лабораторных
Vanr-штаммов стафилококков является значительное увеличение времени генерации и меньшее накопление биомассы по сравнению с исходными
штаммами (рис. 1, 2). Особенно важно отметить,
что приобретение устойчивости к Van не вызывало
каких-либо значительных изменений в способности штаммов к образованию биопленок. На рис. 3
приведены результаты двух независимых исследований биопленок, образованных на вторые сутки
культивирования штаммов.
OD600
КОЕ
КОЕ (кл/мл)
(кл/мл)
х108
40
30
20
OD570
0,3
0,2
0,1
0
1
КОЕ (кл/мл)
OD600
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5ч
время,
6
7
Рис. 2. Динамика роста культуры S. epidermidis
8
24
33 Vanr(16)
6
7
Таким образом, развитие устойчивости к Van
сопровождается выраженными изменениями некоторых важных физиологических характеристик
коагулазонегативных стафилококков. Обнаруженная взаимосвязь резистентности стафилококков к
ванкомицину с изменением чувствительности к
антибактериальному пептиду варнерину требует
дальнейшего изучения для выяснения механизмов
формирования защиты Van-устойчивых бактерий
от катионных антибактериальных пептидов.
Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований и Министер4 ства промышленности, инноваций и науки Пермского края № 10-04-96086-р_урал_а, Программы
3 Президиума РАН «Молекулярная и клеточная
биология», Междисциплинарного проекта фундаисследований, выполняемых в
2 ментальных
учреждениях УрО РАН.
0
КОЕ (кл/мл)
х108
4
5
1 – S. epidermidis 33, 2 – S. epidermidis 33Vanr (16), 3 –
S. epidermidis 33 Vanr2 (12), 4 – S. epidermidis 33 Vanr3(12),
5 – КНС клинический 337 Vanr, 6 – КНС клинический
713 Vanr, 7 – КНС клинический 699 Vanr
0
Рис. 1. Динамика роста культуры S. epidermidis 33
4
Рис. 3. Способность изученных штаммов стафилококков
к образованию биопленок:
1
9 24
3
штаммы
10
0 0,5 1 1,5 2,5 время,
3,5 4,5ч 5,5 6,5 8
2
Библиографический список
Зайцев, А.А. Стафилококки и ванкомицин: тенденции противостояния / А.А. Зайцев, О.И. Карпов, С.В. Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т. 48, № 6. С. 20–26.
Миллер, Д. Эксперименты в молекулярной генетике / Д. Миллер. М.: Мир, 1976. 394 с.
Скала, Л.З. Практические аспекты современной
клинической микробиологии / Л.З. Скала, С.В.
Сидоренко, А.Г. Нехорошева, И.Н. Лукин, С.А.
Грудинина. М.: ООО Изд-во Триада. 2004. 312 с.
Arthur, M. Genetics and mechanisms of glycopeptide
resistance in enterococci / M. Arthur, P Courvalin
// Antimicrob. Agents Chemother. 1993. Vol. 37,
№ 8. P. 1563–1571.
Biavasco, F. Glycopeptide resistance in coagulasenegative staphylococci / F. Biavasco, C. Vignaroli,
P.E. Varaldo // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.
2000. Vol. 19, № 6. P. 403–417.
44
Л. И. Кононова, В. П. Коробов
Christensen, G.D. Adherence of coagulase-negative
staphylococci to plastic tissue culture plates: a
quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices // G.D. Christensen, W.A.
Simpson, J.J. Younger [et al.] // J. Clin. Microbiol.
1985. Vol. 22, № 6. P. 996–1006.
Cui, L. Cell wall thickening is common feature of
vancomycin resistance in Staphylococcus aureus /
L. Cui, X. Ma, K. Sato [et al.] // J. Clin. Microbiol.
2003. Vol. 41, № 1. P. 5–14.
Hanaki, H. Activated cell-wall synthesis is associated
with vancomycin resistance in methicillin-resistant
Staphylococcus aureus clinical strains Mu3 and
Mu50 / H. Hanaki, K. Kuwahara-Arai, S. BoyleVavra [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. 1998.
Vol. 42, № 2. P. 199–209.
Hanaki, H. Detection methods of glycopeptideresistant Staphylococcus aureus / H. Hanaki, K.
Hiramatsu // Antibiotic resistance. Humana Press,
2001. Vol. 48. P. 85–91.
Huycke, M. M. Multiple-drug resistant Enterococci: The
nature of the problem and an agenda for the future /
M. M. Huycke, D.F. Sahm, M.S. Gilmore // Emerg.
Infect. Dis. 1998. Vol. 4, № 2. P. 239–249.
Korobov, V.P. Production of a wide-spectrum antibacterial factor by Staphylococcus warneri cells / V.P.
Korobov, L.M. Lemkina, T.V. Polyudova // Docl.
Biol. Sci. 2003. Vol. 390, № 5. P. 286–288.
Lyon, B.R. Antimicrobial resistance of Staphylococcus
aureus: genetic basis / B.R. Lyon, R. Skurray //
Microbiol. Rev. 1987. Vol. 51, № 1. P. 88–134.
Al-Obeid, S. Mechanism of Resistance to Vancomycin
in Enterococcus faecium D366 and Enterococcus
faecalis A256 / S. Al-Obeid, E. Collatz, L. Gutmann // Antimicrob. Agents Chemother. 1990.
Vol. 34, № 2. P. 252–256.
Rosenberg, M. Adherence of bacteria to hydrocarbons:
a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity / M. Rosenberg, D. Gutnick, E. Rosenberg // FEMS Microbiol. Lett. 1980. Vol. 9, № 1.
P. 29–33.
Sieradzki, K. Heterogeneously vancomycin-resistant
Staphylococcus epidermidis strain causing recurrent peritonitis in a dialysis patient during vancomycin therapy / K. Sieradzki, R.R. Roberts, D. Serur [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37, №
1. P. 39–44.
Поступила в редакцию 31.03.2010
Physiological peculiarities of vancomycin-resistant strains of coagulase-negative staphylococci
L.I. Kononova, V.P. Korobov
In vitro selected and clinical isolates of coagulase-negative staphylococci being resistant to glycopeptide antibiotic vancomycin were examined. Those were found to possess a number of distinctive physiological properties as compared to the bacterial vancomycin-sensitive collection strain Staphylococcus epidermidis 33. It was
observed that all of the Vanr-strains had not just the high extent of vancomycin resistance, but were also characterized by multiple resistances to other antibiotics, as well as weakened sensitivity to the antibacterial peptide
warnerin, decrease in the level of surface hydrophobicity of cell wall surfaces, delayed growth, and poor ability
of biomass accumulation.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
ЭКОЛОГИЯ
УДК 579.64: 541.64
ВЛИЯНИЕ ГИДРОГЕЛЕЙ ПОЛИАКРИЛАМИДА
НА МИКРОФЛОРУ ПОЧВЫ
Ю. Г. Максимова a , А. Ю. Максимов a , b , В. А. Демаков a , b , В. И. Будников c
a
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
c
Институт технической химии УрО РАН, 614013, Пермь, ул. Академика Королева, 3, e-mail: cheminst@mpm.ru
b
Изучено влияние синтезированных гидрогелей полиакриламида (ПААГ) с различными наполнителями на бактериальную флору почвы и жизнеспособность модельных почвенных средообразующих бактерий. Показано, что ПААГ не оказывают отрицательного воздействия на почвенные бактерии, в то
время как мономеры в высоких концентрациях подавляют их рост. Общее количество гетеротрофных
бактерий в почвах после внесения ПААГ достоверно не изменялось, за исключением ПААГ с древесной мукой, при внесении которого наблюдали небольшое снижение общего количества бактерий.
Ключевые слова: гидрогели полиакриламида, ПААГ, микрофлора почвы, Pseudomonas fluorescens, Bacilus
subtilis, ингибирование роста, акриламид, акрилат аммония
Гидрофильные акриловые полимеры находят
широкое применение в различных областях народного хозяйства как суперабсорбенты. Перспективной сферой их использования является производство влагоудерживающих препаратов для сельского хозяйства, декоративного и приусадебного растениеводства.
Внесение препаратов на основе полиакриламида (ПАА) в почву аридных областей имеет выраженное положительное влияние на рост и выживание растений (Hayat, Ali, 2004; El-Rehim, 2005).
Широкое применение акриловых полимеров ограничивается в основном высокой стоимостью таких
препаратов. Синтез полимеров с органоминеральными наполнителями (древесным опилом и твердыми отходами биотехнологического производства
акриловых мономеров) позволит снизить их себестоимость, а биоразложение этих отходов может
служить дополнительным источником питания
растений. Кроме того, полиакриламидный гель
может рассматриваться как потенциальный носитель для инсектицидов, фунгицидов, гербицидов и
удобрений (Jhurry, 1997).
Гидрофильные полимеры могут изменять свойства почвы благодаря способности адсорбировать
большое количество воды, в 400 и более раз превышающее собственную массу, что в свою очередь
влияет на скорость инфильтрации и испарения,
плотность и структуру почвы (Hayat, Ali, 2004).
Полиакриламид стабилизирует почвенные агрега-
ты, а в дождливых областях и на орошаемых землях уменьшает поверхностное уплотнение и коркообразование, а также эрозию (Green, Stott, 2001).
До сих пор остается не вполне ясным вопрос о
влиянии гидрофильных акриловых полимеров на
микробиоценоз почвы. В лабораторных экспериментах ПААГ в небольшой степени стимулировал
рост бактерий рода Pseudomonas, причем стимуляцию роста авторы связывали с дополнительным
поступлением аммонийного азота в среду при гидролизе амидных групп углеродной цепи ПАА (Grula, Huang, 1981; Grula et al., 1994). Позднее было
продемонстрировано, что почвенные микроорганизмы, обладающие амидазной активностью, могут утилизировать ПАА как единственный источник азота, но не как единственный источник углерода. По мнению авторов, данный факт может
быть связан с тем, что ПАА конвертируется в
длинноцепочечный полиакрилат, который в дальнейшем может деградироваться физическими или
биологическими механизмами или включаться в
органическую материю (Kay-Shoemake et al.,
1998a, 1998b, 2000). Длительное воздействие ПАА
на почвенные микробные сообщества приводит к
появлению и долговременному сохранению ПААспецифической амидазной активности. Тем не менее, общий эффект применения ПАА, повидимому, невелик, особенно когда он рассматривается в ряду химических веществ, вносимых в такие почвы (Kay-Shoemake et al., 1998b).
© Ю. Г. Максимова, А. Ю. Максимов, В. А. Демаков, В. И. Будников, 2010
45
46
Ю. Г. Максимова, А. Ю. Максимов, В. А. Демаков, В. И. Будников
Также было проанализировано влияние обработки ПАА на общее количество бактерий в почвах. Было обнаружено, что количество культивируемых гетеротрофных бактерий значительно увеличивалось в почвах, обработанных ПАА и засеянных картофелем (Solanum tuberosum), тогда как
этот эффект не наблюдался, если обработанные
почвы засевались фасолью (Phaseolus vulgaris).
Эти данные коррелировали с тем, что почвы, обработанные ПАА и засеянные картофелем, содержали значительно более высокие концентрации
NO3– и NH3, чем необработанные почвы, тогда как
в почвах, засеянных фасолью, такой разницы не
было (Kay-Shoemake et al., 1998a). Таким образом,
влияние ПАА на количество бактерий в почве было труднопредсказуемым.
Данная работа посвящена изучению влияния
синтезированных ПААГ различного наполнения,
предназначенных для использования в качестве
влагоудерживающих препаратов в сельском хозяйстве и декоративном растениеводстве, на модельные почвенные средообразующие бактерии и микрофлору почв.
Материалы и методы исследований
В качестве модельных культур использовали
штаммы Pseudomonas fluorescens C2 и Bacilus
subtilis ATCC 6633.
В качестве полимерной основы использовали
смесь акриламида и акрилата аммония при их соотношении 50 : 50 мольн. %, содержание сшивающего агента (метиленбисакриламид) – 0.2
мольн.% от суммы мономеров, в качестве инициирующей системы использовали окислительновосстановительную систему – персульфат аммония
+ сульфит натрия. Получение наполненных композиций осуществляли смешением акриловых мономеров и наполнителей при температуре 18–22С в
течение 8–10 мин, после чего вводили компоненты
инициирующей системы; режим полимеризации –
80С, 6 час. Наполнитель – отработанный биокатализатор биокаталитического производства акриламида добавляли в количестве 30 масс.%. Обозначения образцов ПААГ: 36/0 – ненаполненный
ПААГ, 36/Б – наполненный шламом биокатализатора производства акриловых мономеров, 36/Д –
наполненный измельченной древесиной.
Для выращивания бактерий использовали синтетическую среду N (солевую основу), следующего
состава (г/л): KH2PO4 – 1.0; K2HPO4×3H2O – 1.6;
NaCl – 0.5; MgSO4×7H2O – 0.5; CaCl2 – 0.005;
CoCl2×6H2O – 0.01; FeSO4×7H2O – 0.005; pH 7.2 ±
0.2. Источником углерода служила глюкоза в конечной концентрации 0.2%. В качестве источника
азота использовали NH4Cl в концентрации 10 мМ.
Количество колониеобразующих единиц (КОЕ)
определяли методом серийных разведений с по-
следующим высевом на агаризованную среду Луриа-Бертани и подсчетом колоний на чашках Петри.
Рост бактерий оценивали по изменению оптической плотности культуры, измеренной при длине
волны 540 нм (ОП540) на фотоэлектроколориметре
КФК-3.
Влияние гидрогелей различного состава на модельные культуры бактерий в почвенной и водной
среде оценивали по КОЕ. В водной среде для этого
ПААГ без наполнителя (36/0) и с наполнителями
(древесиной (36/Д); шламом отработанного биокатализатора производства акриламида (36/Б)) добавляли в количестве 500 мг к 20–30 мл ростовой
среды, которую инокулировали штаммами бактерий P. fluorescens C2 и B. subtilis ATCC 6633. Высев культур для оценки жизнеспособности проводили через 4 дня.
Для определения влияния гидрогелей на модельные культуры бактерий в почвенной среде 5 г почвы
стерилизовали автоклавированием при 121°С, увлажняли стерильным 10 мМ калий-фосфатным буфером, вносили 500 мг ПААГ и инокулировали 0.1 мл
суспензии спор B. subtilis АТСС 6633 и 0.5 мл суспензии клеток P. fluorescens С2 (ОП540=0.5). Высев
культур для оценки жизнеспособности проводили через 14 и 70 дней.
Для определения влияния ПААГ на общее количество гетеротрофных бактерий в почве использовали почвогрунт универсальный на основе биогумуса «Terra vita живая земля», производства
ЗАО «МНПП «Фарт», Россия. КОЕ определяли путем высева на среду Луриа-Бертани из почв, в которые добавляли ПААГ различного наполнения
(0.4% от веса почвы), через 21 день выращивания
фасоли (Phaseolus vulgaris L.). Количество бактерий, гидролизующих амид, определяли при высеве
на агаризованную среду N с ацетамидом в качестве единственного источника углерода и азота.
Влияние мономеров ПАА на рост и жизнеспособность модельных почвенных культур B. subtilis
АТСС 6633 и P. fluorescens С2 определяли в водной среде N с глюкозой и аммонием. В среду добавляли растворы акриламида (АА) и акрилата
аммония (ААм) до концентрации 5, 10, 20% и раствор акриловой кислоты (АК) до концентрации
10%. Рост бактерий оценивали по изменению
ОП540 среды культивирования, жизнеспособность –
по КОЕ.
Результаты и обсуждение
Изучено влияние высоких концентраций мономеров ПАА на рост и жизнеспособность почвенных средообразующих бактерий B. subtilis и
P. fluorescens С2. Выявлено, что мономеры ПАА
(5–20% раствор АА, 5–20% раствор ААм и 10%
раствор АК) оказывают выраженное подавляющее
47
Влияние гидрогелей полиакриламида на микрофлору почвы
действие на рост модельных культур, причем единичные жизнеспособные клетки B. subtilis сохранялись только в растворе акриламида – 100–200
КОЕ/мл и акрилата аммония – 60 КОЕ/мл (кон-
троль – 4.4×106 КОЕ/мл). Культура P. fluorescens
после инкубации с мономерами ПААГ не содержала жизнеспособных клеток (табл. 1).
Таблица 1
Влияние мономеров ПАА на жизнеспособность почвенных средообразующих бактерий
Концентрация
мономеров
Контроль
КОЕ/мл
B. subtilis АТСС 6633
4.4×106
Раствор АА
2.4×102
1.0×102
1.2×102
Раствор ААм
0
60
0
Раствор АК
0
5%
10%
20%
5%
10%
20%
10%
P. fluorescens С2
2.9×109
0
0
0
0
0
0
0
Таким образом, мономеры ПАА в высоких
концентрациях токсичны для почвенных бактерий,
причем более устойчивыми являются B. subtilis,
вероятно, за счет спорообразования.
Изучено влияние гидрогелей различного состава на модельные культуры почвенных бактерий в
водной и почвенной среде. Показано незначительное стимулирующее действие гидрогелей на бакте-
рии в водной среде (вне зависимости от наполнителя) по сравнению с контролем (табл. 2).
Влияние ПААГ на модельные микроорганизмы
в почвенной среде, достоверно отличающееся от
контроля, выявлено не было (табл. 3). Исключение
составил ПААГ с наполнителем древесиной: количество бактерий при длительном культивировании
(70 дней) снижалось на порядок.
Таблица 2
Влияние ПААГ различного состава на модельные культуры почвенных бактерий в водной среде
Наполнитель
Контроль
36/0
36/Б
36/Д
КОЕ/мл
B. subtilis АТСС 6633
2.5×106
2.3×107
8.0×106
2.4×107
P. fluorescens С2
6.2×108
2.9×109
5.3×109
1.3×109
Таблица 3
Влияние ПААГ различного состава на модельные культуры бактерий в почвенной среде
КОЕ/мл
Наполнитель
К*
36/0
36/Б
36/Д
B. subtilis АТСС 6633
14 дн.
70 дн.
7
8.6×10
1.6×108
3.6×107
1.7×108
6
6.0×10
1.4×108
7
2.2×10
1.6×107
P. fluorescens С2
14 дн.
70 дн.
9
1.8×10
6.9×108
5.2×106
5.1×108
9
1.4×10
5.4×108
8
2.0×10
3.7×107
* Контрольный опыт без добавок ПААГ.
По-видимому, воздействие ПААГ на изучаемые
бактерии может быть более заметным при внесении его в водную среду со строго определенным
химическим составом, т.к. наличие различных органических и минеральных веществ в естественной
почве не позволяет заметить эффект внесенного
вещества. Тем не менее, было показано, что ПААГ
не оказывает отрицательного воздействия на мо-
дельные почвенные бактерии. В качестве рекомендации может быть замечено, что при производстве
влагоудерживающих препаратов на основе ПААГ
следует сводить к минимуму содержание токсичных мономеров в препарате.
Изучено влияние ПААГ с различными добавками (шлам биокатализатора производства акриловых мономеров – Rhodococcus rhodochrous, Al-
48
Ю. Г. Максимова, А. Ю. Максимов, В. А. Демаков, В. И. Будников
caligenes denitrificans; древесная мука) на содержание в почве гетеротрофных и амидгидролизующих бактерий (рисунок).
Было показано, что внесение в почву ПААГ
различного состава не оказывает на почвенную
бактериальную флору влияния, достоверно отличающегося от контроля. Исключение составил
ПААГ с добавлением древесной муки, при внесении которого наблюдалось небольшое снижение
общего количества гетеротрофных бактерий. Определено, что количество бактерий, использующих
амид в качестве единственного источника углерода
и азота, составило от 6 до 16% от общего количества гетеротрофов. В образце почвы после внесения ПААГ с древесной мукой количество амидгидролизующих бактерий составило половину от
общего числа гетеротрофов. Кроме того, в этой
почве увеличивалась доля грибной микрофлоры.
КОЕ/г 1.00E+10
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
1
/0
36
/Д
36
/Б
*
36
/Б
36
Ко
нт
р
ол
ь
2
Количество гетеротрофных бактерий в почве с
добавлением ПААГ после 21 дня выращивания
фасоли:
36/Б – ПААГ с добавлением шлама биокатализатора R. rhodochrous, 36/Б* – ПААГ с добавлением шлама биокатализатора A. denitrificans,
36/Д – ПААГ с добавлением древесной муки,
36/0 – ПААГ без добавок; 1 – на среде LB, 2 – на
минимальной среде с ацетамидом
Таким образом, ПААГ, являясь нетоксичным и
биодеградабельным соединением, не нарушает
бактериальную флору почвы и может служить дополнительным источником питания для почвенных
бактерий. В качестве наполнителя можно порекомендовать шлам биокатализатора производства
акриловых мономеров, что позволит одновременно
достичь удешевления влагоудерживающего препа-
рата и утилизировать отходы биотехнологического
производства.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований и
Министерства промышленности, инноваций и
науки Пермского края № 09-03-99026 р-офи.
Библиографический список
Abd El-Rehim, H.A. Characterization and possible
agricultural application of polyacrylamide/sodium
alginate crosslinked hydrogels prepared by ionizing radiation // J. Appl. Polymer Sci. 2006. Vol.
101. P. 3572–3580.
Green, V.S. Polyacrylamide: a review of the use, effectiveness, and cost of a soil erosion control
amendment / V.S. Green, D.E. Stott // D.E. Stott,
R.H. Mohtar, G.C. Steinhardt (eds). Sustaining
the Global Farm. 2001. P. 384–389.
Grula, M. Interactions of polyacrilamides with certain
soil pseudomonas / M. Grula, M. Huang // Dev.
Ind. Microbiol. 1981. Vol. 22. P. 451–457.
Grula, M. Interaction of certain polyacrilamides with
soil bacteria / M. Grula, M. Huang, G. Sewell //
Soil Sci. 1994. Vol. 158, № 4. P. 291–300.
Hayat, R. Water absorption by synthetic polymer
(Aquasorb) and its effect on soil properties and
tomato yield / R. Hayat, S. Ali // Int. J. Agri. Biol.
2004. Vol. 6, № 6. P. 998–1002.
Jhurry, D. Agricultural polymers // Conf. Proc.
AMAS. 1997. P. 109–113.
Kay-Shoemake, J.L. Polyacrylamide as an organic nitrogen source for soil microorganisms with potential effects on inorganic soil nitrogen in agricultural soil / J.L. Kay-Shoemake, M.E. Watwood,
R.D. Lentz, R.E. Sojka // Soil Biol. Biochem.
1998a. Vol. 30, № 8/9. P. 1045–1052.
Kay-Shoemake, J.L. Polyacrylamide as a substrate for
microbial amidase in culture and soil / J.L. KayShoemake, M.E. Watwood, R.E. Sojka, R.D.
Lentz // Soil Biol. Biochem. 1998b. Vol. 30, №
13. P. 1647–1654.
Kay-Shoemake, J.L. Soil amidase activity in polyacrilamide-treated soils and potential activity toward
common amide-containing pesticides / J.L. KayShoemake, M.E. Watwood, R.E. Sojka, R.D.
Lentz // Biol. Fertil. Soils. 2000. V. 31. P. 183–
186.
Поступила в редакцию 24.03.2010
The influence of polyacrylamide gels on soil microflora
Yu.G. Maksimova, A.Yu. Maksimov, V.A. Demakov, V.I. Budnikov
The influence of synthesized polyacrylamide gels (PAGs) with various fillings on soil bacterial flora and viability of model soil environment constitutive bacteria was studied. It was shown that PAGs had no negative effect on soil bacteria, at the same time monomers in high concentrations depressed their growth. The overall
Влияние гидрогелей полиакриламида на микрофлору почвы
49
number of soil heterotrophic bacteria was not significantly different excepted when a wood flour filling PAG
was added leading to insignificant decrease in the total bacterial number.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.87: 579.222.2: 579.222.4: 579.25
НОВЫЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ ШТАММЫ–
ДЕСТРУКТОРЫ БИФЕНИЛА РОДА RHODOCOCCUS
Д. О. Егорова a , И. О. Коршунова b , Е. Г. Плотникова a , b
a
b
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
Из образцов техногенно-минеральных образований солеразработок (Березники, Пермский край)
выделено 6 штаммов-деструкторов бифенила. На основании морфо-физиологических свойств и
анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммы идентифицированы как Rhodococcus sp. Установлено, что штаммы используют в качестве единственного источника углерода и
энергии ряд моно- и полиароматических соединений, а также их хлорированные и гидроксилированные производные. Показана способность штаммов использовать бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии в условиях повышенного содержания хлорида натрия в среде.
Ключевые слова: засоленные почвы, почвенные бактерии, анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S
рРНК, Rhodococcus, биодеструкторы, галотолерантность, бифенил
Введение
Активное развитие химической и электротехнической промышленности в XX в. привело к загрязнению обширных территорий особо опасными для животных и человека соединениями ароматического
ряда – полихлорированными бифенилами (ПХБ).
Полихлорированные бифенилы отличаются повышенной устойчивостью к деструктивному действию
физических и химических факторов (высокие и низкие температуры, воздействие кислот и щелочей).
Согласно
Стокгольмской
Конвенции
(http://www.unep.org), полихлорированные бифенилы
должны быть полностью выведены из производства;
обширные территории, загрязненные данными поллютантами подлежат восстановлению, а ПХБ, находящиеся в местах складирования, должны быть утилизированы. Основную роль в разложении ПХБ в естественных условиях играет бактериальная микрофлора почв и донных отложений (Unterman, 1996;
Pieper, 2005; Васильева, Стрижакова, 2007; Seeger,
Pieper, 2010).
В течение последних десятилетий описано значительное количество бактерий, принадлежащих
родам Pseudomonas, Burkholderia, Comamonas,
Sphyngomonas, Rhodococcus, Bacillus, осуществляющих деструкцию ПХБ (Unterman, 1996; Seeger,
Pieper, 2010). Стоит отметить, что известно лишь
несколько штаммов, эффективно разлагающих
широкий спектр полихлорированных бифенилов
(Billingsley et al., 1997; Kim, Picardal, 2001; Pieper,
2005). Активность штаммов по отношению к ПХБ
обусловливается наличием метаболических систем
разложения незамещенного бифенила (Martinkova
et al., 2008; Seeger, Pieper, 2010). В связи с этим
целесообразен поиск новых штаммов-деструкторов ПХБ на основе отбора штаммов, способных
активно утилизировать бифенил.
В реальных условиях загрязнение окружающей
среды носит комбинированный характер. Присутствие в почвах широкого спектра органических
поллютантов, а также таких экстремальных факторов как повышенная минерализация, присутствие
тяжелых металлов, высокий или низкий уровень
рН – обусловливает стресс у бактерий и приводит
к ингибированию процессов деструкции ароматических соединений (Martinkova et al., 2008). В связи с вышесказанным, бактерии, обладающие устойчивостью к стрессовым условиям среды и высокой деструктивной активностью по отношению
к органическим поллютантам, представляют интерес для использования их в экобиотехнологиях.
Цель работы – изучение грамположительных
бактерий-деструкторов бифенила, выделенных из
техногенно-минеральных образований (Березники,
Пермский край).
Материалы и методы
Среды и условия выделения штаммовдеструкторов
В работе использовали минеральную среду
Раймонда (г/л): NH4NO3 – 2.0, MgSO4 × 7H2O – 0.2,
KH2PO4 – 2.0, Na2HPO4 – 3.0, Na2CO3 – 0.1, CaCl2 ×
6H2O – 0.01 (Розанова, Назина, 1982) и ее модификации: а) с добавлением 5 г/л триптона и 2.5 г/л
дрожжевого экстракта – в качестве полноценной
среды; б) с добавлением FeSO4·7H2O – 0.001 г/л,
© Д. О. Егорова, И. О. Коршунова, Е. Г. Плотникова, 2010
50
Новые галотолерантные штаммы-деструкторы бифенила рода Rhodococcus
MnSO4·5H2O – 0.002 г/л – в качестве минеральной
среды при исследовании ростовых характеристик
чистых культур. NaCl вносили в среды до конечной концентрации (%): 3, 5, 6, 9. Для получения
агаризованных сред вносили агар («Sigma») 15 г/л.
Выделение штаммов деструкторов проводили
методом накопительного культивирования. Образцы техногенно-минеральных образований (ТМО)
(10 г/л) были помещены в 250 мл колбы с 100 мл
основной среды Раймонда (3% NaCl) с бифенилом,
в качестве ростового субстрата. Накопительные
культуры инкубировали в течение 1 месяца на
термокачалке (100 об/мин) при температуре 28˚С.
Чистые культуры штаммов-деструкторов выделяли путем высева из накопительных культур на агаризованную среду Раймонда с 3% NaCl с бифенилом, чистоту культур контролировали путем высева на полноценную агаризованную среду Раймонда (3% NaCl).
Определение таксономического положения
изолированных штаммов
Морфологические и физиологические признаки
микроорганизмов изучали по общепринятым методикам (Методы…, 1983; Методы…, 1991). Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров 27F и 1492R
(Tiirola et al., 2002). Секвенирование продуктов амплификации осуществляли с помощью набора реактивов DYEnamic ET Dye Terminator Cycle
sequencing Kit на автоматическом секвенаторе
MegaBASE 1000 (JSC GE Healthcare, США) согласно рекомендациям производителя. Полученные
нуклеотидные последовательности анализировали с
использованием программ CLUSTAL W (Thompson
et al., 1994), TREECON (van de Peer, DeWachter,
1994), BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Поиск
гомологичных последовательностей производили
по
базам
данных
GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
и
EzTaxon
(http://www.eztaxon.org).
Ростовые характеристики штаммов
Ростовые характеристики штаммов изучали в
жидкой минеральной среде Раймонда (3% NaCl) с
бифенилом (1г/л) в качестве источника углерода и
энергии. Штамм выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл в 100 мл минеральной среды при
температуре 28С и аэрации на шейкере со скоростью 120 об/мин. Оптическую плотность культур
измеряли на спектрофотометре BioSpec-mini
(Shimadzu) при длине волны 540 нм. Расчет удельной скорости роста (μ) культуры и время удвоения
(td) производили по стандартным формулам.
51
Устойчивость бактерий к содержанию в среде культивирования NaCl
Устойчивость бактерий к содержанию в среде
культивирования NaCl определяли на агаризованной и в жидкой минеральных средах с бифенилом
(1 г/л) в качестве ростового субстрата. Концентрация хлорида натрия в среде составляла от 0 до 9%.
Рост бактерий учитывали на седьмые сутки.
Субстратная специфичность штаммов
Субстратную специфичность штаммов изучали
при выращивании на минеральной среде Раймонда
с 3% NaCl (Плотникова и др., 2006). В качестве
единственного источника углерода и энергии использовали фенантрен, нафталин, бифенил и ряд
карбоновых кислот: бензойную, гентизиновую,
пара-гидроксибензой-ную (ПГБК), 2- и 4-хлорбензойные (2ХБК, 4ХБК), орто-фталевую.
Статистическая обработка результатов
Все эксперименты проводили в трехкратной
повторности. Полученные данные обрабатывали с
использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Методом накопительного культивирования из
образцов ТМО были выделены шесть штаммов
бактерий. Штаммы ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10, ЕК11 и ЕК-12 при росте на полноценной среде формировали круглые колонии с гладкой, блестящей
поверхностью, непрозрачные, светло-бежевые, с
гладким краем. Изолированные бактерии – аэробы, клетки неподвижные, не образуют спор, характеризуются выраженной каталазной активностью. Для исследуемых бактерий характерен трехстадийный морфогенетический цикл развития
(кокки – палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки – кокки).
У штаммов ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10 и ЕК-11
определены нуклеотидные последовательности
фрагментов гена 16S рРНК длиной 666, 589, 511,
682 и 582 п.н., соответственно, и проведено их
сравнение с гомологичными последовательностями, имеющимися в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ и на сервере EzTaxon. Выявлена филогенетическая близость штаммов ЕК-7 и
ЕК-10 с типовым штаммом Rhodococcus wratislavensis NCIMB 13082Т, штаммов ЕК-9, ЕК-11 – с
Rhodococcus opacus DSM 43205T, штамма ЕК8 – с
Rhodococcus percolatus MBS1T. На данном этапе
исследований изолированные бактерии отнесены к
роду Rhodococcus.
Изучена способность штаммов к росту моно- и
полиароматических углеводородах (табл. 1). Известно, что представители рода Rhodococcus способны разлагать широкий спектр органических
52
Д. О. Егорова, И. О. Коршунова, Е. Г. Плотникова
поллютантов, в том числе, ароматические углеводороды и их хлорированные производные (Seto et
al., 1995; Martinkova et al., 2008). Изолированные
нами штаммы проявляли способность использовать в качестве единственного источника углерода
и энергии моно- (бензойная, гентизиновая, ортофталевая кислоты) и полиароматические (фенантрен, нафталин, бифенил) углеводороды, а так же
их хлор- и гидроксипроизводные (4ХБК, 2ХБК,
ПГБК). Установлено, что штаммы ЕК-7, ЕК-8, ЕК9, ЕК-10 и ЕК-12 способны расти в жидкой минеральной среде Раймонда (3% NaCl) с бифенилом в
качестве единственного источника углерода и
энергии (рисунок). Рост культур характеризовался
непродолжительной подготовительной фазой.
Таблица 1
Рост штаммов рода Rhodococcus на ароматических субстратах
Фенантрен
++
++
++
++
++
++
Штамм
ЕК-7
ЕК-8
ЕК-9
ЕК-10
ЕК-11
ЕК-12
Бифенил
++++
++++
++++
++++
++++
++++
Нафталин
++
++
++++
+++
+++
++
Бензоат
+
+
+++
+
+
+
Гентизат
++
++
++++
++
++
++
офталат
+++
++++
++++
++
++
++
ПГБК
4ХБК
2ХБК
++++
++++
++++
++++
++++
++++
+
+
+++
+
+
+
++
++
++
++
++
++
«++++» – колонии размером более 0.3 см, «+++» – колонии размером 0.2–0.3 см, «++» – колонии размером 0.1–
0.2 см, «+» – колонии размером менее 0.1 см.
Таблица 2
Ростовые характеристики штаммовдеструкторов бифенила
ОП540
2
1
2
3
4
1,6
1,2
Штамм
5
ЕК-7
ЕК-8
ЕК-9
ЕК-10
ЕК-12
0,8
0,4
0
0
50
100
150
200
время, ч
Рост штаммов Rhodococcus sp. на бифениле
(1г/л) в качестве единственного источника
углерода и энергии при 3% NaCl в среде:
1 – ЕК-10; 2 – К-9; 3 – ЕК-12; 4 – ЕК-7; 5 – ЕК-8
Для всех исследуемых штаммов была отмечена
значительная оптическая плотность культуры при
достижении стационарной фазы роста (ОП540 1.0–
1.2 ед.).
В табл. 2 приведены параметры роста родококков в минеральной среде с бифенилом. Высокая
удельная скорость роста штаммов свидетельствует
об эффективном использовании бифенила в качестве ростового субстрата.
Физиологические характеристики роста исследуемых штаммов сопоставимы с таковыми параметрами описанного нами ранее штаммадеструктора ПХБ Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ
896) (Рыбкина, 2003).
Изучено влияние NaCl на способность изолированных штаммов использовать бифенил в качестве источника углерода и энергии (табл. 3).
Удельная скорость
роста, ч-1
Время
удвоения, ч
0.069±0.002
0.053±0.002
0.046±0.004
0.064±0.003
0.069±0.005
10.0±0.1
13.0±0.2
15.0±0.2
10.5±0.1
10.0±0.1
Установлено, что максимальный уровень минерализации, при котором штаммы проявляли
свои деструктивные свойства, при культивировании в жидкой среде составил 5%, а на агаризованной – 6%. В литературе встречаются лишь единичные сведения по бактериальному разложению
бифенила в условиях повышенной минерализации
среды. Так известно, что штамм Dyella ginsengisoli
LA-4 использовал бифенил как ростовой субстрат
при содержании NaCl в среде до 3% и проявлял
деструктивные свойства по отношению к данному
субстрату при минерализации среды до 10% (Li et
al., 2009). Для штаммов рода Rhodococcus способность расти на бифениле в жидкой минеральной
среде, в присутствии высоких концентраций хлорида натрия описана впервые. В тоже время, известны факты разложения родококками бензола и
нафталина в условиях повышенной осмолярности
среды (Luz et al., 1997, Плотникова и др., 2001,
2006).
Следует отметить, что исследуемые штаммы
растут в минеральных средах с бифенилом как в
присутствии хлорида натрия, так и в его отсутствие. Данные результаты позволяют отнести исследуемые штаммы к галотолерантным микроорга-
Новые галотолерантные штаммы-деструкторы бифенила рода Rhodococcus
низмам, по классификации Кашнера (Кашнер,
53
1981).
Таблица 3
Рост штаммов рода Rhodococcus на бифениле при различном содержании NaCl в среде
Содержание NaCl в агаризованной среде, %
Содержание NaCl в жидкой среде, %
Штамм
0
3
6
9
0
3
5
6
ЕК-7
++++*
++++
++
–
++++**
++++
+
–
ЕК-8
++++
++++
++
–
++++
++++
+
–
ЕК-9
++++
++++
++
–
++++
++++
+
–
ЕК-10
++++
++++
++
–
++++
++++
+
–
ЕК-11
++++
++++
++
–
++++
++++
+
–
ЕК-12
++++
++++
++
–
++++
++++
+
–
* «++++» – колонии размером более 0.3 см, «+++» – колонии размером 0.2–0.3 см, «++» – колонии размером 0.1–
0.2 см, «+» – колонии размером менее 0.1 см, «–» – нет роста, ** «++++» – ОП540 > 1.5; «+++» – ОП540 1.0–1.5; «++» –
ОП540 0.5–1.0; «+» – ОП540 < 0.5; «–» – нет роста.
Заключение
На современном этапе развития технологий
восстановления загрязненных территорий становится очевидным тот факт, что эффективная очистка почв возможно только при использовании в
составе биопрепаратов бактериальных штаммов,
проявляющих свои деградативные свойства в отношении поллютантов не только в оптимальных,
но и в экстремальных условиях.
Выделенные галотолерантные штаммы Rhodococcus sp. ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10, ЕК-11 и ЕК-12
обладают широким спектром деградативной активности в отношении ароматических соединений.
Установлено, что исследуемые штаммы используют в качестве ростовых субстратов как моно-,
так и полиароматические углеводороды, а также
их хлор- и гидроксипроизводные. Особый интерес
представляет тот факт, что штаммы утилизируют
бифенил в условиях осмотического стресса, вызванного повышенным содержанием хлорида натрия в среде культивирования.
Полученные результаты свидетельствуют о высоком потенциале описанных штаммов для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды от ароматических соединений. Будут
продолжены исследования по изучению деструктивных свойств изолированных штаммов Rhodococcus spp. в отношении полихлорированных бифенилов.
Работа поддержана грантами ФЦП «Научные и
научно-педагогические кадры инновационной
России» и Программы Президиума РАН
«Молекулярная и клеточная биология».
Библиографический список
Васильева, Г.К. Биоремедиация почв и седиментов,
загрязненных полихлорированными бифенилами / Г.К. Васильева, Е.П. Стрижакова // Микробиология. 2007. Т. 76. №6. С. 725–741.
Кашнер, Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Д. Кашнер. М.: Мир, 1981. 390 с.
Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхардт [и др.]. М.: Мир, 1983. Т. 1–3.
Методы почвенной микробиологии и биохимии:
Учеб. пособие / Под ред. Звягинцева Д. Г. М.:
Изд-во МГУ, 1991. 304 с.
Плотникова, Е.Г. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района
солеразработок / Е.Г. Плотникова, О.В. Алтынцева, И.А. Кошелева [и др.] // Микробиология.
2001. Т. 70. С. 61–70.
Плотникова, Е.Г. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья / Е.Г. Плотникова, Д.О. Рыбкина, Л.Н.
Ананьина, О.В. [и др.] // Экология. 2006. №4. С.
261–268.
Розанова, Е.П. Уголеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах / Е.П.
Розанова, Т.Н. Назина // Микробиология. 1982.
Т. 51. С. 324–348.
Рыбкина, Д.О. Исследование аэробных бактерий,
разлагающих полихлорированные бифенилы и
хлорбензойные кислоты: Дис… канд. биол. наук: 03.00.07 / Рыбкина Дарья Олеговна. Пермь,
2003. 181 с.
Billingsley, K.A. Studies on the transformation of selected polychlorinated biphenyl congeners by
Pseudomonas strain LB400 / K.A. Billingsley,
S.M. Backus, O.P. Ward // Can. J. Microbiol.
1997. Vol. 43. P. 782–788.
Kim, S. Microbial growth on dichlorobiphenyls chlorinated on both rings as a sole carbon and energy
sourсe / S. Kim, F.W. Picardal // Appl. Environ.
Microbiol. 2001. Vol. 64. P. 1953–1955.
Li, A. Characterization of a newly isolated biphenyldegrading bacterium, Dyella ginsengisoli LA-4 /
A. Li, Y. Qu, J. Zhou, F. Ma // Appl. Biochem.
Biotechnol. 2009. Vol. 159. P. 687–695.
Luz, M. A Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene / M. Luz, F.
Paje, A. Brett [et al.] // Microbiology. 1997. Vol.
143. P. 2975–2981.
Martinkova, L. Biodegradation potential of the genus
Rhodococcus / L. Martinkova, B. Uhnakova, M.
54
Д. О. Егорова, И. О. Коршунова, Е. Г. Плотникова
Patek [et al.] // Environ. Int. 2009. Vol. 35. P. 162–
177.
Pieper, D.H. Aerobic degradation of polychlorinated
biphenyls // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005.
Vol. 67. P. 170–191.
Seeger, M. Genetics of biphenyl biodegradation and
co-metabolism of PCBs / M. Seeger, D.H. Pieper //
Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Springer-Vergal, Berlin, Heidelberg, 2010.
4699 p.
Seto, M. A novel transformation of polychlorinated
biphenyls by Rhodococcus sp. strain RHA1 / M.
Seto, K. Kimbara, M. Shimura // Appl. Environ.
Microbiol. 1995. Vol. 61. P. 3353–3358.
Thompson, J.D. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment
through sequence weighting, position-specific gap
penalties and weight matrix choice / D.G. Higgins,
T.J. Gibson // Nucl. Acids Res. 1994. Vol. 22. P.
4673–4680.
Tiirola, M.A. Isolation and characterization of Novosphingobium sp. Strain MT1, a dominant polychlorophenol-degrading strain in a groundwater bioremediation system / M.A. Tiirola, M.K. Mannisto,
J.A. Puhakka, M.S. Kulomaa // Appl. Environ.
Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 173–180.
Unterman, R. A history of PCB biodegradation // Bioremediation. Principles and Applications / Eds.
R.L. Crawford, D.L. Crawford. Cambridge University Press, New York, 1996. P. 209–253.
Van de Peer, Y. TREECON for Windows: a software
package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. van de Peer, R. De Wachter // Comput.
Appl. Biosci. 1994. Vol. 10. P. 569–570.
Поступила в редакцию 23.03.2010
New halotolerant strains of the genus Rhodococcus – degraders of biphenyl
D.O. Egorova, I.O. Korshunova, E.G. Plotnikova
Using a method of enrichment culture, six biphenyl-degrading bacterial strains have been isolated. The analysis of their morphology, physiology and 16S rDNA sequences indicated that these isolates belonged to the genus Rhodococcus. The strains were able to use mono- and polyaromatic hydrocarbons and its chloro- and hydroxyl-derivatives as a sole carbon and energy source. The strains were able to use biphenyl as a sole carbon and
energy source in the presence of elevated levels of NaCl in the culture medium.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.841.11: 575.21
ГИДРОФОБНЫЕ СВОЙСТВА И ПЛЕНКООБРАЗУЮЩАЯ
СПОСОБНОСТЬ ШТАММОВ РОДА PSEUDOMONAS,
ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ РАЗНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ НИШ
В. А. Демаков a , b , М. В. Кузнецова b , с , Т. И. Карпунина с , Н. В. Николаева с
a
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13,
e-mail: info@iegm.ru
с
Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера, 614000, Пермь,
ул. Петропавловская, 26, e-mail: rector@psma.ru
b
Обнаружено, что большинство почвенных и клинических культур были пленкообразующими. Как
гидрофильные по BATH-тесту штаммы (из водной фазы в фазу гексадекана экстрагировалось не
более 5–8% клеток), так и более гидрофобные псевдомонады (экстрагировалось до 24,2%) проявляли высокую пленкообразующую способность, т.е. не было обнаружено четкого взаимного соответствия между гидрофильно-гидрофобными свойствами клеточной стенки бактерий и степенью пленкообразования. У клинических штаммов гетерогенность популяции по обоим признакам более выражена.
Ключевые слова: Pseudomonas, почвенные бактерии, клинические штаммы, гидрофобность, специфическая и неспецифическая адгезия, пленкообразующая способность
В природных экотопах основная часть микроорганизмов существует в виде ассоциаций, определяемых общим термином «биопленки»: пространственно и метаболически структурированных сообществ,
расположенных на границе раздела фаз и заключенных во внеклеточный полимерный матрикс (Николаев, Плакунов, 2007). Развитие прикрепленных сообществ – одна из основных стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в организмах инфицируемых хозяев (Ильина и др., 2006).
Установлено, что многие хронические инфекции вызываются бактериями, растущими в виде биопленок
(Радионович и др., 2006; Costerton et al., 1999).
Формирование микробных сообществ проходит
несколько стадий развития. На первом этапе перехода от планктонной формы к прикрепленному состоянию происходит сначала обратимая, а затем необратимая адгезия к поверхности (Сидоренко,
2004). На этапе обратимого прикрепления действуют неспецифические физико-химические силы
взаимодействия между молекулами и структурами
на поверхностях микроорганизма и твердого субстрата (Николаев, Плакунов, 2009). Показатель гидрофобности является одной из ключевых характеристик клеточной поверхности, определяющий адсорбционную иммобилизацию микроорганизмов.
Вместе с тем, диссоциативные варианты бактерий,
отражающие различия/изменения в клеточной оболочке, могут значительно отличаться по гидрофобности и адгезивным свойствам (Милько, Егоров,
1996). Ответить на вопрос, является ли гидрофобность свойством, определяющим исход неспецифического взаимодействия, представляется возможным по конечному результату – эффективности
формирования биопленок разными штаммами.
Цель данной работы – изучение гидрофобности
и пленкообразующей способности различных
представителей рода Pseudomonas.
Материалы и методы исследования
В работе использовали 16 штаммов почвенных
бактерий рода Pseudomonas (I группа) и 11 изолятов Pseudomonas aeruginosa (II группа), выделенных из различного клинического материала.
Гидрофобность клеток оценивали по относительному распределению между водной фазой и
фазой органического растворителя гексадекана
(Коваленко и др., 1998; Rosenberg et al., 1980). Для
этого к суспензии клеток (3 мл), термостатированной в течение 15 мин при 35°С, добавляли гексадекан (0.2 мл, 0.5 мл), интенсивно встряхивали в
течение 1 мин, затем снова термостатировали в
аналогичном режиме и регистрировали изменение
оптической плотности в водной фазе при λ = 590
нм. Среднее значение относительного изменения
(в %) оптической плотности клеточной суспензии
в водной фазе по сравнению с ее первоначальной
величиной служило мерой гидрофобности бактериальных клеток. Расчет осуществляли по форму-
© В. А. Демаков, М. В. Кузнецова, Т. И. Карпунина, Н. В. Николаева, 2010
55
56
В. А. Демаков, М. В. Кузнецова, Т. И. Карпунина, Н. В. Николаева
ле: % гидрофобности = (Ас – Aг) / Ас х 100, где Ас
– ОП590 суспензии до обработки гексадеканом, Aг
– ОП590 суспензии после обработки гексадеканом.
Образование биопленок изучали на поверхности 96-луночной полистироловой планшеты согласно И.А. Шагиняну (Шагинян и др., 2007). Суточные бульонные культуры в разведении 1/100
инокулировали в лунки по 150 мкл в 4-х повторах.
После 24-часовой инкубации при 37°C содержимое лунок (планктонную культуру) аккуратно удаляли, пленки окрашивали 0.1% раствором генцианвиолета (170 мкл в лунку) в течение 45 мин. Затем после 3-кратного промывания в лунки для экстрагирования краски добавляли по 200 мкл 96%
этанола. Уровень экстракции (абсорбции) генцианвиолета этанолом измеряли на спектрофотометре Ultrоspec 3300 при длине волны 580 нм в единицах оптической плотности (Ед, ОП580). Степень
пленкообразования соответствовала интенсивности окрашивания содержимого лунок красителем.
Пленкообразующими считали культуры, если значение ОП превышало контроль в 3 и более раз
(ОП580≥1.0), склонными к адгезии – в 2–3 раза
(0.6≥ОП580<1.0), остальные оценивали как непленкообразующие. Контролем служили лунки с LBбульоном (Луриа-Бертани) (ОП580≤0.3).
Результаты и их обсуждение
Показатель гидрофобности клеточной поверхности псевдомонад из различных экологических
ниш не превышал 25%, M±σ составила 5.9±3.2% –
для «почвенной» группы и 9.5±7.2% – для «клинической». Этот показатель варьировал у разных
штаммов в обеих группах, причем более значительно во II группе.
При сравнении показателя пленкообразования
в обеих группах выявлено следующее. Высокую
пленкообразующую способность чаще проявляли
клинические изоляты (81.8%). Основную часть
почвенных бактерий составили штаммы, «склонные к адгезии» (таблица).
Биопленка, образованная штаммом
P. aeruginosa 3–4 (в инвертированном варианте,
увеличение 1×1500)
Отмечено, что как гидрофильные по BATHтесту штаммы P. aeruginosa (в фазу гексадекана из
водной фазы экстрагировалось не более 5–8% клеток), так и более гидрофобные псевдомонады (экстрагировалось до 24.2%) проявляли высокую
пленкообразующую способность, т.е. не было обнаружено четкого взаимного соответствия между
гидрофильно-гидрофобными свойствами клеточной стенки бактерий и степенью пленкообразования. Учитывая, что псевдомонады разных видов
подвергаются расщеплению на диссоцианты R-,
S- и M-типов (Милько, Мартынкина, 1996), изучаемые штаммы были разделены по доминирующиму морфотипу колоний при росте на LB-агаре.
Различные представители рода Pseudomonas формировали колонии преимущественно S-типа. Среди почвенных штаммов выявлены все три варианта, в то время как R-штаммы в группе клинических
изолятов отсутствовали.
Прослежена взаимосвязь анализируемых показателей среди штаммов с разными морфотипами
колоний. Оказалось, что гидрофобность клеток Sштаммов варьировала в широких пределах: выявлены как максимальные для данной выборки, так и
нулевые показатели коэффициента гидрофобности. Клетки М-вариантов практически не переходили из суспензии в гексадекан (M±σ – 3.6±2.5%).
Бактерии R-типа, изолированные из почвы, устойчиво проявляли гидрофобные свойства с минимальным разбросом показателей коэффициента
гидрофобности. Важно подчеркнуть, что только
для R-штаммов отмечена прямая зависимость между показателем гидрофобности и пленкообразованием. В то же время, клинические штаммы с Мморфотипом колоний и низким коэффициентом
гидрофобности все были отнесены к пленкообразующим. Как почвенные, так и клинические Sизоляты были вариабельны по обоим признакам.
Заключение
Псевдомонады относятся к убиквитарным микроорганизмам, которые отличает популяционная
гетерогенность, обусловливающая возможность
вида выжить практически в любых местах обитания. Такая вариабельность выявлена и по гидрофобности клеточной поверхности, и по пленкообразующей способности в обеих изученных группах, хотя у почвенных изолятов средние отклонения этих показателей были минимальными. Повидимому, это связано с относительно более постоянными условиями обитания бактерий в природных экосистемах, где отсутствуют агрессивные
факторы, имеющие место в условиях ЛПУ (антибиотики, дезинфектанты, смена хозяина и др.).
Как показали наши исследования, закрепление
этих микроорганизмов на поверхности и ее дальнейшая колонизация далеко не всегда детерминируется гидрофобностью клеток. Очевидно, что относительно низкую гидрофобность клеточной по-
Гидрофобные свойства и пленкообразующая способность штаммов Pseudomonas
верхности у псевдомонад могут компенсировать
другие факторы адгезии, в том числе пили, жгутики, альгинат, гемагглютинин, экзоэнзим S – для
57
P. aeruginosa и т.п. Это объясняет высокую пленкообразующую способность М- и S-вариантов.
Гидрофобные свойства и пленкообразующая способность штаммов рода Pseudomonas
Показатель гидПленкообразующая
ГрупМорфотип
Штамм
рофобности, %
способность, ОП580
Место и год выделения
па
колонии
М±m
М±m
Солонец, Троицк,
А51
S
9.2±1.2
0.728 ± 0.116
Челябинская обл., 2009
А59
S
10.5 ± 0.5
0.593 ± 0.096
Там же
А60
R
10.3 ± 1.1
1.120 ± 0.088
Там же
А61
S
4.5 ± 0.8
1.401 ± 0.303
Там же
А66
M
5.7 ± 0.6
0.898 ± 0.061
Там же
Каштановая почва,
H7
R
13.7 ± 1.5
1.031 ± 0.075
Саратовская обл.
H8
S
2.7 ± 1.1
0.974 ± 0.078
Там же
I
H12
M
2.9 ± 0.6
0.473 ± 0.078
Там же
H13
M
2.0 ± 0.5
0.532 ± 0.069
Там же
H15
S
6.0 ± 0.9
0.464 ± 0.069
Там же
H16
S
4.4 ± 0.4
0.654 ± 0.080
Там же
Н17
R
10.0 ± 1.2
1.004 ± 0.098
Там же
Н18
S
4.1 ± 0.4
0.700 ± 0.046
Там же
Н19
S
0.0 ± 0
0.691 ± 0.084
Там же
Н20
М
6.6 ± 0.7
1.056 ± 0.126
Там же
Н31
М
1.2 ± 0.3
1.037 ± 0.275
Там же
3-4
M
0.0 ± 0
2.269 ± 0.106
ГКБ, Пермь, 2009
3-19
M
0.6 ± 0.3
1.916 ± 0.087
Там же
3-24
S
0.0 ± 0
0.642 ± 0.059
Там же
8-4
M
5.3 ± 0.5
1.199 ± 0.044
Там же
2пл
S
5.7 ± 0.8
0.992 ± 0.129
ЦРБ, п. Лобаново, 2010
II
31пл
S
7.5 ± 0.8
0.381 ± 0.015
Там же
60пл
S
14.8 ± 1.6
1.739 ± 0.089
Там же
9
S
21.2 ± 1.9
1.113 ± 0.087
ГКБ, Чайковский, 2010
17
M
8.2 ± 0.7
0.904 ± 0.093
Там же
18
S
17.3 ± 2.7
1.108 ± 0.074
Там же
К-7
S
24.2 ± 1.8
1.171 ± 0.104
ККБ, Пермь, 2009
Штаммоспецифичность показателя гидрофобности и независимо от этого высокая пленкообразующая способность клинических штаммов (особенно М-типа) еще раз указывает на высочайшую
пластичность P. aeruginosae, способных устойчиво
сохранять наиболее выгодный в конкретной экологической нише признак. Вместе с тем, можно
полагать, что у природных штаммов доминируют
механизмы неспецифической адгезии, а у клинических – фактором, определяющим колонизацию и
пленкообразование в биотопах макроорганизма,
служит специфическая адгезия. Сочетание этих
двух механизмов обеспечивает выживание псевдомонад в нозокомиальных условиях.
Библиографический список
Бухарин, О.В., Механизмы выживания бактерий /
О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова
[и др.]. М.: Медицина, 2005. 367 с.
Ильина, Т.С. Системы коммуникаций у бактерий и
их роль в патогенности / Т.С. Ильина, Ю.М.
Романова, А.Л Гинцбург // Микробиология.
2006. № 3. С. 22–29.
Коваленко, Г.А. Углеродминеральные носители
для адсорбционной иммобилизации нерастущих бактериальных клеток / Г.А. Коваленко
Е.В. Кузнецова, В.М Ленская // Биотехнология.
1998. № 1. С. 47–56.
Милько, Е.С. Гидрофильно-гидрофобные и адгезивные свойства диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus / Е.С. Милько, Н.С. Егоров //
Микробиология. 1994. Т. 64, Вып. 2. С. 382–
284.
Милько, Е.С. Морфологические и физиологобиохимические особенности диссоциантов
Pseudomonas aeruginosae / Е.С. Милько, Л.П.
Мартынкина // Микробиология. 1996. Т. 65,
№ 3. С. 352–356.
58
В. А. Демаков, М. В. Кузнецова, Т. И. Карпунина, Н. В. Николаева
Николаев, Ю.А. Биопленка – «город микробов»
или аналог многоклеточного организма? / Ю.А.
Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология.
2007. Т. 76, № 2. С. 149–163.
Радионович, А.М. Биофильм и его потенциальная
роль в патогенезе хронического бронхолегочного процесса у больных муковисцедозом, инфицированных Pseudomonas aeruginosae /
А.М. Радионович , Н.Ю. Каширская , Н.И. Капранов // Пульмонология. Прил. по муковисцидозу. 2006. С. 106–112.
Сидоренко, С.В. Роль бактериальных биопленок в
патологии человека // Инф. хир. 2004. Т. 2, № 3.
С. 16–20.
Шагинян, И.А., Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса
Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик /
И.А. Шагинян, Г.А. Данилина, М.Ю. Чернуха
[и др.] // Журн. микробиол. 2007. № 1. С. 3–9.
Costerton, J.W. Bacterial biofilms: a common cause of
persistent infections / J.W. Costerton, P.S. Stewart,
E.P. Greenberg // Science. 1999. Vol. 284. P.
1318–1322.
Rosenberg, M. Adherence of bacteria to hydrocarbons:
A simple method for measuring cell surface hydrophobicity / M. Rosenberg, D. Gutnik, E.
Rosenberg // FEMS Microbiol. Lett. 1980. Vol. 9.
P. 29–33.
Поступила в редакцию 23.03.2010
Hydrophobic properties and film-forming abilities of Pseudomonas strains isolated
from different ecological niches
V.A. Demakov, M.V. Kuznetsova, T.I. Karpunina, N.V. Nikolaeva
It was found that most soil and hospital cultures were found to be film-forming. The BATH-tested hydrophilic strains (up to 5-8% of cells were extracted from an aqueous phase to a hexadecane phase) and more hydrophobic pseudomonades (up to 24.2% were extracted) both demonstrated film-forming abilities, i.e. there was no
clear consistency between the hydrophilic-hydrophobic properties of bacterial cell walls and the extent of a film
formation. The hospital strains exhibited more expressed population heterogeneity by both characteristics.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.262: 579.22
АНАЛИЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРОЦЕССОВ
ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНОК STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS 33 К НЕКОТОРЫМ ФАКТОРАМ
ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
В. П. Коробов a , b , Л. М. Лемкина a , В. И. Монахов b
a
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
b
Изучены процессы формирования биопленок бактериями Staphylococcus epidermidis 33 на поверхностях стекла, медицинских катеров и микробиологических планшетов. Показано, что динамика накопления биомассы пленок на богатой среде LB во многом отражает кинетику роста
планктонных бактериальных культур. Наиболее выраженное образование биопленок происходит
на поверхностях катетеров и планшетов, обладающих гидрофобными свойствами. Максимальный уровень биомассы пленок обнаруживается при культивировании в нейтральной зоне рН.
Вместе с тем интенсивное развитие биопленок происходит и при повышенной кислотности (рН
4.0), а также в слабощелочной зоне (pH 8.0). Введение в среду культивирования глюкозы (1.0%),
галактозы (0.1–1.0%) и маннозы (0.5–1.0%), а также ионов Mg2+, Ca2+, или Mn2+ в концентрациях
0.05–12.5 mM приводит к значительному ингибированию образования биопленок. Результаты
исследований свидетельствуют о значительных изменениях метаболизма бактерий S. epidermidis
33 и его регуляции, по-видимому, способствующих образованию этими бактериями биопленок
при заселении и колонизации различных поверхностей.
Ключевые слова: биопленки, Staphylococcus epidermidis, колонизация поверхности, условия культивирования, гидрофобность
Введение
Бактериальные биопленки – это организованные
сообщества бактерий одного или нескольких видов,
состоящие из активно функционирующих клеток и
их покоящихся форм, включенных в покрывающий
различные доступные поверхности внеклеточный
матрикс (Davey, O'Toole, 2000). Несмотря на то, что
биопленки бактерий (маты) были открыты сравнительно давно (McCoy et al., 1981), исследование этих
микробиологических объектов приобрело систематический характер лишь в последнее десятилетие.
Вероятно, это связано с тем, что функционирование
этих особых бактериальных агломераций в ряде случаев значительно осложняет практическую деятельность человека. Так, установлено, что многие хронические инфекции животных и человека обусловлены
способностью бактерий расти в виде биопленок на
поверхностях их кожных покровов, слизистых и ран.
При этом критическое значение имеет изменение
биологических свойств бактерий в биопленках, которое приводит к возрастанию их патогенного потенциала за счет недоступности в этом состоянии для
специфических и неспецифических защитных им-
мунных систем колонизированного макроорганизма,
устойчивости к действию антибиотиков и других неблагоприятных факторов (Романова и др., 2006; Watnick, Kolter, 2000). Следует также отметить, что бурное развитие высокотехнологичных направлений
медицины значительно расширило лечебное применение различных долгосрочных инвазивных устройств – от сосудистых катетеров до сердечных клапанов, кардиостимуляторов, глазных протезов и даже информационно-коммуникационных микрочипов
(Habash, Reid, 1999). К сожалению, функционирование этих лечебных устройств часто сопровождается
заселением их поверхностей оппортунистической
микрофлорой, главным образом, коагулазонегативными стафилококками, с развитием т.н. катетерассоциированных инфекций (Donlan, Costerton,
2002).
Представленное определяет необходимость детального изучения механизмов формирования биопленок инфицирующих бактерий, которое, помимо
фундаментального интереса, необходимо для разработки эффективных способов предупреждения
образования и подавления функционирования этих
высокоорганизованных бактериальных структур.
© В. П. Коробов, Л. М. Лемкина, В. И. Монахов, 2010
59
60
В. П. Коробов, Л. М. Лемкина, В. И. Монахов
Цель настоящей работы – изучение влияния
условий культивирования на формирование биопленок коагулазонегативных стафилококков.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовали
штамм бактерий Staphylococcus epidermidis 33, полученный из ГНИИСКМБП им. Тарасевича. Формирование биопленок проводили на различающихся по физико-химическим свойствам поверхностях: стекла (предметные стекла “Huida”, Китай), венозных катетеров (поливинилхлорид, “Teramo”, Италия) и иммунологических микропланшетов (полистирол, “Медполимер”, Россия).
На логарифмической фазе роста культуры
S. epidermidis 33 на среде Luria-Bertani (LB) отбирали аликвоты, бактериальные клетки осаждали
при 3000 g в течение 10 мин, дважды промывали в
физиологическом растворе и после суспендирования в среде LB до OD600=0.015 пипетировали в
объемах 100 мкл в иммунологические микропланшеты. Хорошо обезжиренные автоклавированные
предметные стекла и фрагменты катетеров (длина
5 мм, диаметр 1.5 мм) помещали во флаконы с
аналогичной бактериальной взвесью. Биопленки
выращивали в термостате при 37ºС в статических
условиях без дополнительной аэрации. После
окончания культивирования планктонные бактерии осторожно удаляли отсасыванием. При необходимости дальнейшего культивирования после
удаления планктонной части в лунки планшетов
вносили первоначальный объем свежей среды LB.
По завершению культивирования поверхности
биопленок промывали 0,01 М фосфатным буфером
(рН=7.2) и окрашивали 0.1% генциан-виолетом в
течение 10 мин. Учет биомассы пленок осуществляли измерением количества связавшегося с ними
красителя, который после однократного промывания пленок физраствором и высушивания при
комнатной температуре экстрагировали этанолом.
Измерение оптической плотности этанольных экстрактов проводили на спектрофотометре PD-303,
при длине волны 570 нм в кювете с длинной оптического пути 1 см. Для сравнения интенсивности
образования биопленок на разных поверхностях
рассчитывали количество связанного биопленками
красителя на единицу площади, равную 1 мм2.
Изучение развития биопленок при дополнительном внесении в среду роста различных углеводов, хлоридов магния, кальция и марганца, также при изменении ее исходной кислотности (внесением 0.1М HCI или 0.1M NaOH) проводили на
полистироловых микропланшетах после культивирования в течение 24 час.
Для статистической обработки экспериментальных данных использовали компьютерные программы Microsoft Excel 2000, Statistica (версия 5.0
for Windows), рассчитывая среднее арифметическое значение, доверительные интервалы и стандартное отклонение. Статистическую значимость
результатов определяли при помощи t-критерия
Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Изучение формирования биопленок S. epidermidis 33 проводили при культивировании в течение 7 сут, с ежедневной детекцией динамики их
биомассы.
Как видно из данных, представленных на рис. 1,
образование биопленок наблюдалось на всех использованных поверхностях. Интересно отметить,
что динамика роста биопленок во всех случаях в
значительной степени напоминала таковую планктонных культур с хорошо выраженными физиологическими фазами – логарифмической, торможения роста и стационара. На венозных катетерах и в
планшетах рост биопленок наблю дался вплоть до
6 сут культивирования, а затем в обоих вариантах
Рис. 1. Накопление биомассы пленок S. epidermidis 33 на поверхностях:
I – поливинилхлорида (катетеры), II – полистирола (планшеты) и III – стекла
61
Анализ чувствительности процессов формирования биопленок …
Известно, что внеклеточный матрикс биопленок стафилококков включает все основные полимеры бактериальных клеток – высокомолекулярные полисахариды, нуклеиновые кислоты и белки
(Gotz, 2002). В связи с этим особый интерес представляло изучение возможных зависимостей накопления биомассы пленок от содержания в среде
роста различных моносахаридов как источников
энергии, так и пластического материала.
Внесение в среду глюкозы, галактозы или манозы, непосредственных предшественников синтеза полиуглеводных компонентов матрикса биопленок стафилококков, привело к неожиданным
результатам (рис. 3). Так, введение в богатую среду LB глюкозы в небольших концентрациях (0.1%
и 0.5%) при культивировании в течение 24 часов,
практически, не сказывалось на биомассе бактериальных пленок, а увеличение концентрации этого
углевода в среде до 1% сопровождалось значительным, более чем на 40%, снижением этого показателя. Значительное ингибирование образования биопленок S. epidermidis 33 вызывало также
внесение в среду роста галактозы и манозы.
1,8
1,6
1,4
OD(570нм)
следовало резкое снижение их биомассы. Наибольшее накопление биомассы пленок к этому
сроку происходило на венозных катетерах, превосходя, практически, в 2 раза содержание биопленок в микропланшетах. Образование пленок на
стекле на несколько порядков уступало рассмотренным выше поверхностям, однако, необходимо
отметить, что в течение всего срока эксперимента
и в этом случае наблюдался перманентный рост
биомассы клеток (рис. 1, вставка). Важно отметить, что при изучении формирования пленок на
стеклянной поверхности нам не удалось зафиксировать снижения их биомассы при использованных сроках культивирования. Возможно, формирование биопленок на стекле происходит в течение более длительного времени. Высокие гидрофильные свойства поверхности стекла, в отличие
от выраженных гидрофобных свойств полимерных
поверхностей катетеров и планшетов, повидимому, значительно затрудняют первоначальные события при формировании бактериальных
пленок в этих условиях – адсорбцию – «приклеивание» бактерий к стеклу и, как следствие, тормозят включение сигнальной системы “quorumsensing” (Dickschat, 2010), замедляя колонизацию
этой поверхности.
Исследования показали, что рост биопленок S.
epidermidis 33 во многом определяется уровнем
кислотности среды. Картина накопления биомассы
бактериальных пленок при различных исходных
значениях рН среды культивирования представлена на рис. 2.
1,2
1
1
2
0,8
3
0,6
4
0,4
0,2
0
1,6
I
II
III
1,4
Рис. 3. Влияние внесения в среду культивирования
углеводов на рост биомассы пленок S. epidermidis 33:
OD (570нм)
1,2
1
0,8
I – глюкоза; II – галактоза; III – манноза;
концентрации углеводов: 1 – 1%; 2 – 0.5%; 3 – 0.1%;
4 – контроль (исходная среда)
0,6
0,4
0,2
0
4
5
6
7
8
рН
Рис. 2. Формирование биопленок S. epidermidis 33
при культивировании в микропланшетах на среде LB
(24 ч) с различным исходным значением pH
Наибольшая биомасса пленок была зафиксирована в нейтральной зоне рН, которая является оптимальной для роста планктонной культуры S. epidermidis 33 (Полюдова, 2004) и близка к значению
рН среды естественных мест обитания этих бактерий. Вместе с тем, обращает на себя внимание хорошо выраженное образование биопленок как при
кислой, так и слабощелочной реакции среды. Это
может рассматриваться в качестве важной физиологической особенности метаболизма стафилококков, способствующей образованию этими бактериями биопленок при экстремальных значениях
кислотности среды.
Результаты этих экспериментов, по-видимому,
свидетельствуют о том, что питательные компоненты среды LB полностью обеспечивают потребности систем биосинтеза углеводных компонентов
биопленок S. epidermidis 33. Полученные данные
могут быть объяснены функционированием в биопленках стафилококков механизмов близких к катаболитной репрессии образования пленок, обнаруженных у бактерий некоторых видов семейства
Enterobacteriaceae (Jackson et al., 2002). Учитывая
данные о наличии в пленках стафилококков белковых компонентов (Gotz, 2002), было проведено
изучение влияния на рост биомассы пленок ионов
биологически активных металлов, так как известно, что активность внеклеточных протеаз и пептидаз во многом определяется концентрацией некоторых двухвалентных катионов (Alekseev et al.,
1985; Ye et al., 2004; Mikhailova et al., 2005). Результаты экспериментов показали, что возрастание
концентрации ионов Са2+, Mg2+ и Mn2+ в среде
62
В. П. Коробов, Л. М. Лемкина, В. И. Монахов
Рис. 4. Влияние двувалентных катионов на формирование биопленки S. epidermidis 33 (24 ч):
1 – Ca2+; 2 – Mg2+; 3 – Mn2+, 4 – контроль
культивирования ведет к снижению образования
биопленок.
Как видно из данных, представленных на рис. 4,
образование биопленок стафилококков на полистироловом субстрате в значительной мере подавляется всеми использованными в работе катионами. Возрастание в среде ионов Mn2+ до 12,5 мМ
снижает способность бактерий образовывать биопленки примерно 5 раз. Наличие в среде культивирования катионов Са2+ и Mg2+ снижает интенсивность формирования пленок в 2 и 3 раза, соответственно.
Выраженное ингибирование образования биопленок S. epidermidis 33 при введении в среду роста ионов Са2+, Mg2+ и Mn2+ может рассматриваться
как следствие активации внеклеточных протеолитических ферментов (Gossas, Danielson, 2006),
приводящей к дефициту полноценных белковых
компонентов, необходимых для построения матрикса формирующихся биопленок коагулазонегативных стафилококков.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что динамика формирования
биопленок бактериями S. epidermidis 33, повидимому, во многом определяется физикохимическими свойствами оккупируемой поверхности, направленными изменениями метаболизма
бактериальных клеток и уровнем активности внеклеточных гидролитических систем.
Работа выполнена при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований и
Министерства промышленности, инноваций и
науки Пермского края № 07-04-96070-р_урал_а, №
10-04-96086-р_урал_а, Программы Президиума
РАН «Молекулярная и клеточная биология» и
Программы междисциплинарных фундаментальных исследований Президиума Уральского отделения РАН.
Библиографический список
Полюдова, Т.В. Изучение феномена продукции
низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus
warneri IEGM KL-1: автореф. дис. … канд.
биол. наук: 03.00.07 / Полюдова Татьяна Вячеславовна. Пермь, 2004. 26 с.
Романова, Ю.М. Образование биопленок – пример
«социального» поведения бактерий / Ю.М.
Романова, Т.А. Смирнова, Л.А. Андреев [и
др.] // Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. С.
556–561.
Alekseev, A.N. Amino acid and mineral element content and the activity of various enzymes in germinating spores of Bacillus thuringiensis / A.N.
Alekseev, L.N. Karabanova, O.A. Krainova [et
al.] // Mikrobiologiia. 1985. Vol. 2. P. 181–185.
Davey, M.E. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics / M.E. Davey, G.A. O'Toole //
Microbiol. Mol. Biol. 2000. Vol. 64. P. 847–867.
Dickschat, J.S. Quorum sensing and bacterial biofilms
// Nat. Product Reports. 2010. Vol. 27. P. 343–
369.
Donlan, R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms / R.M. Donlan,
J.W. Costerton // Clin. Microbiol. Rev. 2002. Vol.
15. Р. 167–193.
Gossas, T. Characterization of Ca2+ interaction with matrix metallopeptidase-12: implications for matrix
metallopeptidase regulation / T. Gossas, U.H. Danielson // Biochem. J. 2006. Vol. 3. P. 393–398.
Götz, F. Staphylococcus and biofilms // Mol. Microbiol. 2002. Vol. 43. P. 1367–1378.
Habash, M. Microbial Biofilms: their development
and significance for medical device–related infections / M. Habash, G. Reid // J. Clin. Pharmacol.
1999. Vol. 39. P. 887–898.
Анализ чувствительности процессов формирования биопленок …
Jackson, D. W. Catabolite repression of Escherichia
coli biofilm formation / D.W. Jackson, J.W. Simecka, T. Romeo // J. Bacteriol. 2002. Vol. 12. P.
3406–3410.
McCoy, W.F. Observations of fouling biofilm formation / W.F. McCoy, J.D. Bryers, J. Robbins, J.W.
Costerton // Can. J. Microbiol. 1981. Vol. 27. P.
910–917.
Mikhailova, A.G. Effect of calcium ions on enteropeptidase catalysis / A.G. Mikhailova, V.V. Likhare-
63
va, I.A. Prudchenko, L.D. Rumsh // Biochemistry
(Mosc). 2005. Vol. 10. P. 1129–1135.
Watnick, P. Biofilm, city of microbes / P. Watnick, R.
Kolter // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 2675–
2679.
Ye, Q. Z. Metalloform-selective inhibitors of Esherichia coli methionine aminopeptidase and X-ray
structure of a Mn(II)-form enzyme complexed
with an inhibitor / Q.Z. Ye, S.X. Xie, M. Huang [et
al.] // J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 43. P. 13940–
13941.
Поступила в редакцию 15.03.2010
Sensitivity assay for the processes of Staphylococcus epidermidis 33 biofilm formation
with respect to several environmental factors
V.P. Korobov, L.M. Lemkina, V.I. Monakhov
The processes of biofilm formation by bacteria Staphylococcus epidermidis 33 on the surfaces of glass, medical catheters, and microbiological plates were examined. It is shown that the dynamics of film biomass accumulation on LB enriched medium reflects in many respects the kinetics of planktonic bacterial culture growth. Most
pronounced biofilm formation occurs on the surfaces of catheters and plates with hydrophobic properties. Maximum level of film biomass could be detected under the cultivation in neutral pH zone. However, the intensive
growth of biofilms is also observed under the elevated acidity (pH 4.0), as well as in weak alkaline zone (pH
8.0). The introduction of glucose (1.0%), galactose (0.1–1.0%), and mannose (0.5–1.0%) and the ions of Mg2+,
Ca2+, or Mn2+ in concentrations of 0.05–12.5 mM into the culture medium resulted in significant inhibition of
biofilm formation. Results evidence for marked alteration in bacterial metabolism of S. epidermidis, as well as
for its regulation; these apparently contribute to biofilm formation by these bacteria upon their colonization of
different surfaces.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 57.088.6+577.175.62
ПОЛУЧЕНИЕ СТИГМАСТ-4-ЕН-3-ОНА
ИЗ Β-СИТОСТЕРОЛА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS
Е. М. Ноговицина a , Е. В. Тарасова b , В. В. Гришко c , И. Б. Ившина a , b
a
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
b
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
c
Институт технической химии УрО РАН, 614013, Пермь, ул. Академика Королева, 3, e-mail: cheminst@mpm.ru
Подобраны оптимальные условия биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он в присутствии повышенных концентраций исходного субстрата. Установлено, что максимальная
(49.5 %) степень образования целевого продукта достигается в процессе биотрансформации 2
г/л β-ситостерола представителями Rhodococcus erythropolis при использовании Твина-80 в
качестве эмульгатора стерола. При этом эффективными индукторами холестеролоксидазной
активности родококков являются пальмитиновая кислота и н-гексадекан.
Ключевые слова: актинобактерии, Rhodococcus, селективная биотрансформация, β-ситостерол,
стигмаст-4-ен-3-он, индукция, холестеролоксидаза
Окислительная биодеградация стеролов животного и растительного происхождения в природе
осуществляется преимущественно бактериями,
принадлежащими к родам Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia,
Streptomyces, Rhodococcus (Doukyu, 2009; Kreit,
Sampson, 2009; Pollegioni et al., 2009). Бактериальные культуры, обладающие стеролтрансформирующей способностью, используются в разработке
эффективных методов получения физиологически
активных производных на основе наиболее доступных стеролов – холестерола и фитостеролов
(β-ситостерола, кампестерола, стигмастерола). Как
правило, на первом этапе окислительной биотрансформации стеролов (рис. 1) образуются 4-ен3-оновые соединения, получение которых катализируется бифункциональным ферментом холестеролоксидазой (Doukyu, 2009; Kreit, Sampson,
2009). На основе использования холестеролоксидазы, катализирующей реакции окисления не
только стеролов, но и стероидов андростанового и
прегнанового ряда, а также соединений нестероидной структуры (аллиловых, моно- и полициклических спиртов), разрабатываются эффективные
методы получения биологически активных соединений и их оптически активных интермедиатов
(Pollegioni et al., 2009). Например, трансформация
растительного стерола β-ситостерола под действием холестеролоксидазы приводит к образованию
стигмаст-4-ен-3-она, перспективного в качестве
лекарственного средства при лечении анрогензависимых заболеваний (Streber, 1993).
Ранее нами (Гришко и др., 2009; Ноговицина и
др., 2009) было показано, что направленная биоконверсия β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он достигается при использовании н-гексадекана в качестве ростового субстрата и представителей R. ruber, катализирующих в данных условиях образование до 98% целевого продукта. Необходимо отметить, что эффективное получение 4-ен-3онового продукта при использовании штаммов
R. ruber возможно только в условиях добавления
β-ситостерола в концентрации 0.5 г/л через 2 сут
роста бактериальных клеток. Применение пальмитиновой кислоты в качестве индуктора холестеролоксидазной активности родококков позволяет сократить продолжительность процесса биотрансформации стерола в стигмаст-4-ен-3-он с 7 до 5
сут, при этом максимальная (56.3%) степень образования целевого продукта достигается при использовании
родококков
другого
вида
(R. erythropolis)
в
условиях
добавления
β-ситостерола одновременно с инокулятом.
Цель настоящей работы – поиск условий селективной биотрансформации β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он при использовании повышенных
концентраций исходного стерола.
© Е. М. Ноговицина, Е. В. Тарасова, В. В. Гришко, И. Б. Ившина, 2010
64
65
Получение стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола …
Материалы и методы
В работе использовали культуры родококков
(табл. 1) из Региональной профилированной кол-
лекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ
(акроним ИЭГМ, Каталог штаммов…, 1994;
http://www.iegm.ru/iegmcol/), принадлежащих к видам R. erythropolis (6) и R. ruber (6).
R
HO
R
O2
Холестерол (R = H)
Кампестерол (R = CH3)
-Ситостерол (R = C2H5)
H2O2
O
Холест-5-ен-3-он (R = H)
Кампест-5-ен-3-он (R = CH3)
Стигмаст-5-ен-3-он (R = C2H5)
R
O
Холест-4-ен-3-он (R = H)
Кампест-4-ен-3-он (R = CH3)
Стигмаст-4-ен-3-он (R = C2H5)
Рис. 1. Первый этап бактериальной трансформации природных стеролов
Таблица 1
Коллекционные штаммы Rhodococcus spp., используемые в работе
Количество
Вид
Номер штамма в коллекции ИЭГМ
штаммов
ИЭГМ 10, ИЭГМ 179, ИЭГМ 183, ИЭГМ 267, ИЭГМ
R. erythropolis
6
487, ИЭГМ 766
ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 94, ИЭГМ 172, ИЭГМ 232,
R. ruber
6
ИЭГМ 233
Родококки выращивали в условиях периодического культивирования на орбитальном шейкере
(150 об/мин) при температуре 28°С. Базовый состав минеральной среды включал следующие компоненты (г/л): KNO3 – 1.0; KH2PO4 – 1.0; K2HPO4 –
1.0; NaCl – 1.0; MgSO4 – 0.2; СaCl2 – 0.02. В среду
добавляли 1.0 г/л дрожжевого экстракта и 0.1 об.%
микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974). В качестве посевного материала использовали родококки (5.0×105 кл/мл), выращенные на скошенном мясопептонном агаре и отобранные в экспоненциальной фазе роста. Эксперименты по биотрансформации β-ситостерола в
соокислительных условиях проводили в присутствии 0.1 об.% н-гексадекана или 1.0% глюкозы. В
ростовую среду дополнительно вносили 0.2 г/л
пальмитиновой кислоты.
Эксперименты по исследованию влияния концентрации индукторов холестеролоксидазной активности родококков на уровень конверсии
β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он проводили в
присутствии пальмитиновой кислоты (0.05-0.5 г/л)
или н-гексадекана (0.5-20.0 г/л). β-Cитостерол (0.5;
1.0; 2.0 г/л) добавляли в среду культивирования
родококков в виде раствора в изопропаноле одновременно с инокулятом. В отдельных эксперимен-
тах в качестве эмульгатора β-cитостерола использовали синтетический сурфактант Твин-80.
Продукты бактериального окисления β-ситостерола экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Объединенные этилацетатные вытяжки промывали насыщенным водным раствором
NaCl и сушили с помощью обезвоженного Na2SO4.
Растворитель удаляли в вакууме роторного испарителя. Образование стигмаст-4-ен-3-она контролировали методом тонкослойной хроматографии
на силикагеле сравнением с эталонным соединением, при этом использовали пластины с флуоресцентной добавкой (Merck, Германия) и УФ облучатель LG/58 (Россия). Экспрессное определение
содержания β-ситостерола в культуральной жидкости проводили ферментативным методом
C.C. Allain (Allain et al., 1974) с детекцией при 500
нм на спектрофотометре Lambda EZ201 (PerkinElmer, США) с помощью коммерческой тестсистемы контроля уровня холестерола (ООО
«Ольвекс Диагностикум», Санкт-Петербург). Количественный анализ продуктов биотрансформации β-ситостерола осуществляли методом УФ
спектроскопии (Гришко и др., 2009). Соотношение
продуктов реакции подтверждали данными хромато-масс-спектрометрии с использованием системы
Agilent 6890/ 5973N (кварцевая колонка HP-5MS
66
Е. М. Ноговицина, Е. В. Тарасова, В. В. Гришко, И. Б. Ившина
SN US 15189741-1) (Agilent technology, США).
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерной программы Excel 2003, рассчитывая среднее
арифметическое и стандартную ошибку. Эксперименты проводили в 3-4-х кратной повторности.
ный эффект пальмитиновой кислоты на стеролтрансформирующую активность R. erythropolis
проявляется только при росте бактериальных клеток в присутствии н-гексадекана, при этом уровень
конверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он в
1.5 раза выше, чем при использовании глюкозы в
качестве дополнительного ростового субстрата
(рис. 2).
Результаты и их обсуждение
По нашим данным, максимальный индуктив-
Стигмаст-4-ен-3-он, г/л
0.25
0,20
0.2
2
0,13
0.15
1
0,16
3
0.1
4
0.05
5
0
0
1
2
3
4
5
Время, сут
Рис. 2. Биотрансформация β-ситостерола с использованием клеток R. erythropolis ИЭГМ 487:
1 – в присутствии пальмитиновой кислоты и н-гексадекана; 2 – без добавления косубстратов в присутствии
пальмитиновой кислоты; 3 – в присутствии пальмитиновой кислоты и глюкозы; 4 – в присутствии нгексадекана без добавления пальмитиновой кислоты; 5 – в присутствии глюкозы без добавления пальмитиновой кислоты
20
0,5
Концентрация пальмитиновой кислоты, г/л
Концентрация н -гексадекана, г/л
17,5
15
12,5
7,5
5
2,5
0,7
0,5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Стигмаст-4-ен-3-он,%
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
Стигмаст-4-ен-3-он, %
Рис. 3. Влияние концентраций н-гексадекана и пальмитиновой кислоты на процесс биоконверсии
β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он с использованием клеток R. erythropolis ИЭГМ 487
Установлено, что эффективность процесса
биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он
зависит от концентрации индукторов холестеролоксидазы в ростовой среде. При этом максимальная (до 80.6%) степень образования целевого про-
дукта достигается в условиях добавления 0.5 г/л
β-ситостерола в присутствии 0.15 г/л пальмитиновой кислоты и 2.5 г/л н-гексадекана (рис. 3).
По нашим данным, использование более высоких концентраций β-ситостерола приводит к
67
Получение стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола …
зна3цуйчительному снижению стеролтрансформирующей активности родококков. Так, при добавлении 1.0 или 2.0 г/л β-ситостерола в виде раствора в изопропаноле содержание стигмаст-4-ен-3-она
в сумме продуктов реакции составляет лишь 26.4 и
39.2% соответственно. Установлено, что добавление синтетического детергента Твина-80 при 2-х
или 4-х кратном повышении исходной концентрации β-ситостерола способствует более эффективному образованию стигмаст-4-ен-3-она по сравнению с результатами, полученными в условиях введения стерола в виде раствора в изопропаноле
(табл. 2).
Таблица 2
Влияние синтетического сурфактанта Твина-80 на уровень биоконверсии β-ситостерола
в стигмаст-4-ен-3-он
Растворитель
Содержание в сумме продуктов реакции, %
Концентрация
Сумма продукββ-ситостерола
тов реакции, %
β-Ситостерола
Стигмаст-4-ен-3-она
ситостерола
Изопропанол
0.53 ± 0.034
0.38 ± 0.004
0.14 ± 0.059 (26.4)
1.0
Твин-80
0.85 ± 0.151
0.51 ± 0.055
0.32 ± 0.108 (37.6)
Изопропанол
1.94 ± 0.543
1.16 ± 0.325
0.76 ± 0.044 (39.2)
2.0
Твин-80
1.85 ± 0.458
0.96 ± 0.122
0.87 ± 0.168 (47.0)
В скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-3-она в сумме продуктов реакции.
R . e r y th r o p o l is И Э Г М 1 0
R . er yth r op o lis И Э Г М 1 7 9
R . er yth r op o lis И Э Г М 1 8 3
R . er yth r op o lis И Э Г М 2 6 7
R . er yth r op o lis И Э Г М 4 8 7
R . er yth r op o lis И Э Г М 7 6 6
R . r u b er
И Э ГМ 72
R . r u b er
И Э ГМ 85
R . r u b er
И Э ГМ 94
R . ru b e r
И Э Г М 1 72
R . ru b e r
И Э Г М 2 32
R . ru b e r
И Э Г М 2 33
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
С ти гм а с т -4 -е н -3 -о н , %
Рис. 4. Стеролтрансформирующая активность исследуемых штаммов родококков в присутствии Твина-80
В результате скрининга стерол-трансформирующей активности коллекционных культур родококков в условиях добавления β-ситостерола в
концентрации 2 г/л в присутствии Твина-80, нгексадекана и пальмитиновой кислоты установлено, что более эффективными биокатализаторами
процесса биотрансформации β-ситостерола являются представители вида R. erythropolis, катализирующие образование до 49.5% целевого продукта
(рис. 4). В то время как степень образования стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола штаммами R. ruber в данных условиях не превышает 25%.
Таким образом, в результате проведенных исследований подобраны условия направленной
биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он
актинобактериями рода Rhodococcus в условиях
добавления повышенных (до 2 г/л) концентраций
исходного субстрата.
Работа поддержана грантами Президента РФ
«Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4;
Российского фонда фундаментальных исследова-
ний и Министерства промышленности, инноваций
и науки Пермского края № 10-04-96032-р-урал и
грантом междисциплинарного проекта фундаментальных исследований, выполняемых в учреждениях УрО РАН.
Библиографический список
Гришко, В.В. Биокаталитическое получение физиологически активных соединений на основе
растительного β-ситостерола / В.В. Гришко,
Е.М. Ноговицина, И.Б. Ившина // Катализ в
промышленности. 2009. № 1. С. 67–74.
Каталог штаммов Региональной профилированной
коллекции
алканотрофных
микроорганизмов / под ред. И.Б. Ившиной М.: Наука, 1994. 163
с.
Ноговицина, Е.М. Влияние индукторов холестеролоксидазной активности клеток родококков на
процесс биоконверсии β-ситостерола / Е.М. Ноговицина, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Вестн.
68
Е. М. Ноговицина, Е. В. Тарасова, В. В. Гришко, И. Б. Ившина
Перм. ун-та. Сер. Биология. 2009. Вып. 10. С.
119–123.
Романенко, В.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов / В.И. Романенко, С.И. Кузнецов;
отв. ред. С.В. Обручев. Л.: Наука, 1974. 194 с.
Allain, C. Enzymatic determination of total serum
cholesterol / C. Allain, L.S. Poon, C.S.G. Chan, [et
al.] // Clin. Chem. 1974. Vol. 20. P. 470–475.
Doukyu, N. Characteristics and biotechnological applications of microbial cholesterol oxidases //
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. Vol. 83. P.
825–837.
Kreit, J. Cholesterol oxidase: physiological functions /
J. Kreit, N.S. Sampson // FEBS J. 2009. Vol. 276,
№ 23. P. 6844–6856.
Patent 5264428 USA. Use stigmasta-4-en-3-on in the
treatment of androgen dependent disease / S. Streber, 23.11.1993.
Pollegioni, L. Cholesterol oxidase: biotechnological
applications / L. Pollegioni, L. Piubelli, G. Mollas
// FEBS J. 2009. Vol. 276. P. 6857–6870.
Поступила в редакцию 15.03.2010
Stigmast-4-ene-3-one formation from β-sitosterol using actinobacteria
of the genus Rhodococcus
Ye.M. Nogovitsina, Ye.V. Tarasova, V.V. Grishko, I.B. Ivshina
Optimal β-sitosterol bioconversion occurred in the presence of increased substrate concentrations. It was
shown that maximal (49.5%) levels of stigmast-4-ene-3-one formation were achieved during transformation of
2 g/L sitosterol by Rhodococcus erythropolis using a sterol emulsifier Tween-80. Thus, effective inductors of
cholesterol oxidase activity in rhodococci appear to be palmitic acid and n-hexadecane.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 579.22+579.695
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ
КЛЕТОК АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ
НА ХВОЙНЫХ ОПИЛКАХ В УСЛОВИЯХ
КОЛОНОЧНОГО БИОРЕАКТОРА
М. С. Куюкина a , b , И. Б. Ившина a , b , М. К. Серебренникова a
а
Пермский государственный университет, 614090, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
b
Подобран оптимальный режим проведения иммобилизации клеток родококков на гидрофобизованных хвойных опилках в условиях лабораторного колоночного биореактора. Показано, что в иммобилизованном состоянии клетки родококоов сохраняют высокую дыхательную
активность в присутствии модельной нефти.
Ключевые слова: алканотрофные родококки, иммобилизованные клетки, колоночный биореактор, респирометрия, модельная нефть
Метод адсорбционной иммобилизации клеток
микроорганизмов широко используется в различных
отраслях биотехнологии, в том числе процессах биокатализа, а также при решении экологических проблем (Козляк и др., 1991). Иммобилизованные микроорганизмы характеризуются повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды и высокой каталитической активностью, которая во многих случаях
возрастает в несколько раз по сравнению со свободными клетками (Синицин и др., 1994). Кроме того,
иммобилизация позволяет концентрировать большие
количества биомассы и избегать ее значительных потерь, что важно в условиях биореактора, а также при
внесении бактериальных клеток в окружающую среду (Podorozhko et al., 2008).
В настоящее время метод адсорбции используется преимущественно для иммобилизации микроорганизмов, участвующих в очистке загрязненного
воздуха или сточных вод (Пирог и др., 2005). Наиболее эффективно применение адсорбированных
микроорганизмов в системах биофильтров и мембранных биореакторов, предназначенных для обработки жидких и летучих промышленных отходов (Prieto et al., 2002).
Актинобактерии рода Rhodococcus широко используются в биотехнологических процессах. Родококки способны синтезировать поверхностноактивные трегалозолипиды (биосурфактанты), витамины, ферменты, усваивать многие труднодоступные и токсичные для других микроорганизмов
органические субстраты, расти в экстремальных условиях среды (Ившина, 1997). Представители от-
дельных видов (R. erythropolis, R. ruber и R. opacus)
родококков являются активными биодеструкторами
нефтяных углеводородов и других ксенобиотиков
(Ившина и др., 2006). Закрепление клеток родококков на поверхности носителя позволит более эффективно очищать загрязненную воду от нефти и
нефтепродуктов. При этом необходимым условием
результативности процесса биодеструкции является
достижение высокой численности иммобилизованных клеток и их прочное закрепление на поверхности носителя. В этой связи цель настоящей работы –
подбор оптимального режима адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков на
органическом носителе в условиях лабораторного
колоночного биореактора для последующего использования их в биотехнологии очистки нефтезагрязненной воды.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы R. ruber ИЭГМ
615 и R. opacus ИЭГМ 249 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/ iegmcol).
Клетки родококков выращивали в 250-мл колбах
Эрленмейера, содержащих 100 мл мясопептонного
бульона (Oxoid Ltd, Англия) на орбитальном шейкере (160 об/мин) при 28°С в течение 24 ч. Непосредственно перед иммобилизацией бактериальные
клетки отмывали от питательной среды натрийфосфатным буфером следующего состава, г/л:
Na2HPO4 – 3.53; KH2PO4 – 3.39.
© М. С. Куюкина, И. Б. Ившина, М. К. Серебренникова, 2010
69
70
М. С. Куюкина, И. Б. Ившина, М. К. Серебренникова
В качестве адсорбента клеток родококков использовали твердый органический носитель –
хвойные опилки с размером частиц d = 1–3 мм.
С целью повышения сродства органического материала к клеткам алканотрофных родококков и углеводородному субстрату носитель предварительно обрабатывали смесью олифы и Rhodococcusбиосурфактанта в соотношении 1:1 (Патент РФ
2298033). Непосредственно перед использованием
носитель отмывали дистиллированной водой и
стерилизовали автоклавированием (121оС, 15 мин).
Процесс иммобилизации клеток родококков
проводили в лабораторном колоночном биореакторе (рис. 1), представляющем собой стеклянную
колонку (12.0×1.4 см), заполненную гидрофобизованными опилками (2 г). Колонка соединялась при
помощи силиконовых трубок с колбой, содержащей суспензию (2.0×107 кл/мл; 200 мл) клеток R.
ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249, отобранных в равном соотношении. Клеточная суспензия
подавалась в колонку с помощью перистальтического насоса через нижнее входное отверстие со
скоростью 0.6; 1.2; 2.0 и 2.8 мл/мин, орошала носитель в направлении снизу-вверх, вытекала из колонки через верхнее выходное отверстие и возвращалась в колбу. Таким образом, биореактор являлся замкнутой циркуляционной системой с переменной скоростью потока. Процесс иммобилизации осуществляли при комнатной температуре и
контролировали путем измерения оптической
плотности (ОП 600 нм) клеточной суспензии с помощью спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin
Elmer, США) в течение 7 сут. Все эксперименты
проводили в трехкратной повторности.
Определение каталитической активности иммобилизованных клеток родококков проводили с
использованием
6-канального
респирометра
Micro-Oxymax® (Columbus, США). Оценивали
скорость дыхания (в мкл мин-1), а также количество потребленного кислорода и углекислого газа (в
мкл) иммобилизованными клетками родококков в
А
присутствии модельной нефти. В качестве модельной нефти использовали 2% водную эмульсию смеси
углеводородов (н-декан, н-ундекан, н-додекан, нтетрадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-нонадекан
– по 12%, пристан – 6%, нафталин, аценафтен, фенантрен, антрацен – по 2%), стабилизированную
0.1% раствором твина 60. Углеводородную эмульсию подвергали УЗ-обработке (Soniprep 150,
SANYO, Япония) в течение 2 мин и вносили в колонки с иммобилизованными клетками родококков и неинокулированным носителем, используемым в качестве контроля. Заполненные колонки
помещали в измерительные камеры респирометра.
Измерения респираторной активности проводили
при 22±2оС, интервал между измерениями составлял 0.42 ч.
Результаты и их обсуждение
Анализ динамики иммобилизационного процесса в условиях колоночного биореактора (рис. 2)
свидетельствует о том, что закрепление клеток родококков на органическом носителе происходит
наиболее интенсивно в течение первых суток эксперимента, в результате чего иммобилизуется от
18 до 36% бактериальных клеток. В дальнейшем
наблюдается постепенное замедление процесса
клеточной адсорбции и последующая стабилизация показателя оптической плотности суспензии
на постоянном уровне, что свидетельствует о достижении уровня адсорбционного насыщения носителя. Следует отметить довольно большие величины доверительных интервалов средних значений
показателя оптической плотности суспензии родококков в аналогичных колонках, которые, вероятно, обусловлены неравномерностью распределения адсорбированных бактериальных клеток на
поверхности носителя вследствие клеточной коагрегации и мозаичности распределения гидрофобных участков материала носителя (Podorozhko
et al., 2008). При этом обнаруживаются существен-
Б
7
6
5
Рис. 1. Колоночный биореактор (А) и экспериментальная установка (Б) по изучению процесса иммобилизации
клеток родококков:
1 – подача жидкости в колонку; 2 – стеклянный фильтр; 3 – гидрофобизованные опилки с иммобилизованными
клетками родококков; 4 – выход жидкости из колонки; 5 – суспензия клеток родококков; 6 – перистальтический насос; 7 – колонка
71
Показатель оптической плотности
(ОП600нм) клеточной суспензии
Оптимизация процесса иммобилизации клеток алканотрофных родококков …
1
0,9
0,8
А
0,7
0,6
Б
0,5
В
0,4
Г
0,3
0
1
2
3
4
5
6
7
Продолжительность иммобилизации, сут
Рис. 2. Динамика процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе.
Скорость подачи клеточной суспензии в биореактор, мл/мин: А – 2.8; Б – 1.2; В – 0.6; Г – 2.0
Количество (мкл) потребленного О2
и выделенного СО2
30000
1
20000
Динамика потребления О2
10000
2
0
-10000
3
-20000
Динамика выделения СО2
-30000
4
-40000
-50000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Время, ч
Рис. 3. Динамика респираторной активности
иммобилизованных клеток родококков в условиях
колоночного биореактора.
Варианты опыта: 1, 4 – адсорбированные клетки;
2, 3 – неинокулированный ноститель (контроль)
1
Скорость дыхания (мкл/мин)
ные различия в степени иммобилизации родококков в зависимости от скорости подачи клеточной
суспензии в биореактор. Так, наиболее высокая
(57%) степень клеточной адсорбции регистрируется при скорости подачи суспензии, равной 2.0
мл/мин, в то время как соответствующие показатели при низкоскоростных (0.6 и 1.2 мл/мин) режимах работы биореактора составляют 46 и 41%, соответственно. Установлено, что дальнейшее увеличение (до 2.8 мл/мин) скорости подачи клеточной суспензии в биореактор не приводит к повышению эффективности иммобилизационного процесса. В частности, показатель оптической плотности суспензии родококков возрастает незначительно к концу наблюдения (рис. 2), что может
быть обусловлено физико-химическим процессом
вымывания материала носителя и биологическим
процессом фрагментации клеточного мицелия при
высокоскоростном режиме работы биореактора
(Куюкина и др., 2007).
В результате респирометрических исследований установлено, что родококки в иммобилизованном состоянии характеризуются высокой каталитической активностью в отношении модельной
нефти. Так, динамика дыхательной активности адсорбированных клеток родококков (рис. 3) характеризуется равномерным увеличением количества
потребленного кислорода и выделенного углекислого газа, суммарные величины которых к концу
эксперимента превышают контрольные показатели
в 5 и 20 раз, соответственно. Кроме того, в условиях колоночного биореактора удельная скорость
потребления О2 иммобилизованными родококками
достигает 0.6, а выделения СО2 – 1.6 мкл/мин·мг
сухих клеток (рис. 4). Такая высокая скорость клеточного дыхания в присутствии нефтяных углеводородов поддерживается в течение 460 ч инкубирования, что свидетельствуют о функциональной
стабильности иммобилизованных клеток родококков и перспективности их использования для очистки нефтезагрязненной воды.
0,5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
-0,5
-1
-1,5
-2
■ Скорость потребления О2
▲ Скорость выделения СО2
Время, ч
Рис. 4. Скорость дыхания иммобилизованных клеток
родококков в присутствии модельной нефти
Заключение
Определены оптимальные условия проведения
иммобилизации клеток алканотрофных родококков на гидрофобизованных древесных опилках в
72
М. С. Куюкина, И. Б. Ившина, М. К. Серебренникова
условиях лабораторного колоночного биореактора.
Установлено, что данный процесс при заданном
режиме (2.0 мл/мин) подачи клеточной суспензии
в биореактор и концентрации клеток (2.0×107
кл/мл) завершается на 5-е сутки и характеризуется
высокой (57%) степенью иммобилизации родококков на органическом носителе. Посредством респирометрии показано, что родококки в иммобилизованном состоянии проявляют стабильно высокую каталитическую активность в отношении
нефтяных углеводородов, поддерживаемую в течение трех недель. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования иммобилизованных клеток родококков в
биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды и перспективности осуществления
данного процесса в колоночном биореакторе.
Исследование выполнено при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. и
программы Президиума РАН «Молекулярная и
клеточная биология».
Библиографический список
Ившина, И.Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие) :
дис. …докт. биол. наук. / Ившина Ирина Борисовна. Пермь, 1997. 197 с.
Ившина, И.Б. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции непригодных к использованию лекарственных средств /
И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, Е.В. Вихарева [и
др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2006. № 4. С.
443–447.
Козляк, Е.И. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции (Обзор) / Е.И.
Козляк, М.М. Якимов, И.Б. Уткин [и др.] //
Прикл. биохим. микробиол. 1991. Т. 27, вып. 6.
С. 788–801.
Куюкина, М.С. Кинетическая модель процесса иммобилизации на твердом носителе / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.А. Осипенко [и др.] //
Рос. журн. биомеханики. 2007. Т. 11, № 2. С.
79–87.
Пирог, Т.П. Использование иммобилизованных на
керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Т.П. Пирог, Т.А. Шевчук, И.Н. Волошина, Н.Н. Грегирчак // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т.
41, № 1. С. 58–63.
Пат. 2298033 Российская Федерация. Композиция
для получения носителя иммобилизованных микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, и
способ получения носителя / Подорожко Е.А.,
Куюкина М.С., Ившина И.Б., Филп Д.К., Лозинский В.И. Приоритет изобретения 19.04.2005. Зарег. в Госреестре изобр. 27.04.2007.
Синицын, А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И.
Лозинский, С.Д. Спасов. М.: Изд-во МГУ,
1994. 288 с.
Podorozhko, E.A. Hydrophobised sawdust as a carrier
for immobilisation of the hydrocarbon-oxidizing
bacterium Rhodococcus ruber / E.A. Podorozhko,
V.I. Lozinsky, I.B. Ivshina [et al.] // Biores. Technol. 2008. Vol. 99. P. 2001–2008.
Prieto, M.B. Biodegradation of phenol in synthetic
and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier / M.B. Prieto, A. Hidalgo, C.
Rodríguez-Fernández [et al.] // Appl. Microbiol.
Biotechnol. 2002. V. 58. P. 853–859.
Поступила в редакцию 29.03.2010
Optimization of the immobilization process for alkanotrophic rhodococci
on a sawdust carrier in the column bioreactor
М.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.К. Serebrennikova
An optimal regime of the immobilization process for Rhodococcus cells on a hydrophobized pine sawdust
was developed in laboratory column bioreactor conditions. Immobilized rhodococcal cells were shown to maintain high respiration rates during three weeks in the presence of model oil hydrocarbons.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 612-017.1.018
УЧАСТИЕ КАППА-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ И СЕКРЕТОРНОЙ
АКТИВНОСТИ МЫШИНЫХ СПЛЕНОЦИТОВ IN VIVO
С. В. Гейн a , b , Т. А. Баева b , Е. Д. Маерова a , С. П. Тендрякова a , b
а
Пермский государственный университет, 614090, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
b
Динорфин А оказывал модулирующее влияние in vivo на антителогенез в селезенке мышей,
пролиферативную активность спленоцитов и секрецию ими IL-2 и IL-4. Направленность и
выраженность обнаруженных эффектов зависела от вводимой дозы -агониста, степени активации иммунокомпетентных клеток, а также характера действия активационного стимула.
Ключевые слова: каппа-опиатные рецепторы, динорфин А, иммуногенез, спленоциты, пролиферативная
активность, цитокины IL-2 и IL-4
Введение
Стресс как типовой комплекс неспецифических
защитно-приспособительных и патологических реакций организма на агенты, угрожающие жизни и
благополучию организма, реализуется у высших
животных и человека при обязательном участии
нейроэндокринной системы, необходимым звеном
которой являются эндогенные опиоидные пептиды.
Актуальная проблема современной нейроиммунологии – регуляция опиоидными пептидами иммунологических реакций на уровне целостного организма и их роль в регуляции иммуногенеза при
стрессе. В настоящее время выделяют три типа
опиатных рецепторов, экспрессирующихся на клетках нервной и иммунной систем (δ-, μ-, -), к каждому из которых в организме имеются свои высокоафинные лиганды. Наиболее полно охарактеризованы эффекты и механизм действия эндорфинов
и энкефалинов, обладающих высоким сродством к
δ- и μ-опиатным рецепторам, экспрессирующимся с
высокой плотностью на зрелых, активированных
клетках иммунной системы. Основной задачей рецепторов, по-видимому, является регуляция
функциональной активности незрелых Т-клеток,
так как максимальная их плотность зарегистрирована на мембранах тимоцитов, а в процессе созревания клеток уровень экспрессии -рецепторов на
поверхности Т-лимфоцитов значительно снижается
(Ignatowski, Bidlack, 1999). В этой связи значительный интерес представляет анализ иммунорегуля-
торной активности сигналов, поступающих с опиатных рецепторов, экспрессированных на зрелых клетках иммунной системы. В современной литературе имеются немногочисленные данные об
участии эндогенных (динорфины А и В) и экзогенных (U50,488H и U69,593) -агонистов в модуляции
пролиферации, продукции антител, поглотительной
и секреторной активности клеток естественного и
адаптивного иммунитета (Bidlack, 2000). Однако
совершенно не освещены вопросы регуляции динорфинами продукции цитокинов, ответственных
за процессы переключения доминирующего типа
иммунного ответа с клеточно-опосредованного на
гуморальный (IL-4) и наоборот (IFN-γ, IL-2). Цель
работы – изучение эффектов эндогенного высокоафинного -агониста динорфина А (1–17) в системе
in vivo на пролиферативную активность спленоцитов мыши и секрецию ими цитокинов IL-2 и IL-4,
играющих важную роль в регуляции развития иммунного ответа по гуморальному или клеточноопосредованному типу.
Материалы и методы
Эксперимент выполнен на беспородных мышах-самцах массой 17–22 г. Динорфин А (1–17)
(Sigma, США) вводили внутрибрюшинно в разовой дозе 100, 1, 0.01, 0.0001 мкг/кг массы тела;
контрольным животным вводилось эквиобъемное
количество 0.9% NaCl. В дальнейшем экспериментальные животные были поделены на две группы.
Первую группу мышей через 1 ч после введения
© С. В. Гейн, Т. А. Баева, Е. Д. Маерова, С. П. Тендрякова, 2010
73
74
С. В. Гейн, Т. А. Баева, Е. Д. Маерова, С. П. Тендрякова
пептида иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана (ЭБ) в разовой дозе 108 кл/0.2 мл
0.9% NaCl. На 5-е сут животных декапитировали
под эфирным наркозом, определяли титр антиэритроцитарных антител в плазме периферической
крови методом прямой гемагглютинации и количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы. Вторую группу экспериментальных животных
через 1 ч после введения пептида выводили из
эксперимента, выделяли спленоциты и культивировали их в пластиковых круглодонных 96луночных планшетах ("Медполимер", СанктПетербург) в течение 72 ч. Каждая культура содержала 5·105 кл/0.2 мл полной культуральной
среды, которую готовили ex tempore на основе
среды RPMI 1640 («Биолот», Санкт-Петербург) с
добавлением 10 mM HEPES (Sigma), 2 mM Lглутамина (Sigma), 100 мкг/мл пенициллина, 100
мкг/мл стрептомицина и 10% ЭТС («Биолот»,
Санкт-Петербург). В качестве митогенов использовали липополисахарид (ЛПС из E. coli B55:О5,
Sigma; 10 мкг/мл) и конконовалин А (КонА,
Sigma; 20 мкг/мл). За 18 ч до окончания культивирования в лунки вносили по 2 мкКи 3Hметилтимидина в объеме 10 мкл. Радиоактивность
проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Guardian" (Wallac, Финляндия).
Для оценки секреторной активности спленоцитов супернатанты 24-часовых (IL-2) и 48-часовых
(IL-4) культур собирали в пробирки Эппендорфа,
замораживали и хранили при -20оС. Количественное определение цитокинов проводили методом
твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов Bender Medsystems (Австрия) по
методике, предложенной производителем.
Статистический анализ проводили с использованием непарного двухфакторного дисперсионного
анализа и LSD-критерия Фишера (post-hoc). Все
данные на рисунках представлены в виде средней
величины и её стандартной ошибки (Mm).
Результаты и их обсуждение
Установлено (рис. 1А), что динорфин А (1–17)
оказывает статистически значимый стимулирующий эффект на количество АОК в селезенке экспериментальных животных только при введении
самой низкой (0.0001 мкг/кг) исследуемой дозы.
При этом анализ титра антиэритроцитарных антител в плазме крови не выявил значимых количественных изменений в опытных группах по сравнению с контрольными животными (рис. 1Б). При
анализе пролиферативной активности спленоцитов
под воздействием динорфина зарегистрирован угнетающий эффект пептида, используемого в дозах
1, 0.01 и 0.0001 мкг/кг, на пролиферацию спленоцитов, индуцированную ЛПС (рис. 2А), который
является активатором В-лимфоцитарного звена
иммунитета. Стимуляция клеток КонА – поликлональным активатором Т-лимфоцитов, а также
оценка влияния динорфина на спонтанный пролиферативный ответ спленоцитов не выявили статистически значимых эффектов пептида (рис. 2А).
Неоднозначные результаты получены в отношении продукции IL-2 – цитокина, необходимого, с
одной стороны, для поддержания пролиферативных процессов, а с другой стороны – для развития
Th1-хелперов,
протектирующих
клеточноопосредованный тип иммунного ответа. Так, в
группе животных, которым вводился динорфин в
дозе 1 мкг/мл, продукция IL-2 спленоцитами снижалась в присутствии КонА, но стимулировалась в
спонтанных и ЛПС-индуцированных культурах
(рис. 2Б). Кроме того, у мышей, предобработанных
динорфином А в дозе 0.01 мкг/кг, в условиях дополнительной стимуляции клеток ЛПС, статистически значимо усиливалась продукция IL-4, ответственного за пролиферацию и дифференцировку
В-клеток – одного из ключевых звеньев гуморального иммунного ответа (рис. 2В).
Таким образом, динорфин А в системе in vivo
оказывал модулирующее влияние на антителогенез в селезенке, пролиферативную активность
спленоцитов и секрецию ими IL-2 и IL-4. Направленность и выраженность наблюдаемых эффектов
(Б)
10,8
(А)
5
log2 титра антител
log10 АОК/орган
10,4
*
4,8
4,6
4,4
4,2
10
9,6
9,2
8,8
8,4
4
8
К
0,0001
0,01
мкг/кг
1
100
К
0,0001
0,01
1
100
мкг/кг
Рис. 1. Влияние динорфина А на количество АОК в селезенке (А; n=12) и титр антител к ЭБ (Б; n=12)
в плазме крови мышей. Здесь и далее: р0.05 по непарному LSD-критерию Фишера
75
Участие каппа-опиатных рецепторов в регуляции активности …
(А)
Без митогена
Лпс 10 мкг/мл
Кон А 20 мкг/мл
имп/мин
20000
15000
*
10000
*
*
5000
0
01 0,01
00
0,
к
1
01 ,01
00 0
0,
0
10
1
К
01 ,01
00 0
0,
к
0
10
1
0
10
мкг/кг
(Б)
Лпс 10 мкг/мл
500
*
*
15
пг/мл
Кон А 20 мкг/мл
*
400
300
10
200
5
пг/мл
Без митогена
20
100
0
0
01 0,01
00
0,
к
1
0
10
01 0,01
00
0,
к
1
0
10
01 0,01
00
0,
К
1
0
10
мкг/кг
(В)
Без митогена
Лпс 10 мкг/мл
Кон А 20 мкг/мл
12
60
*
50
8
40
6
30
4
20
2
10
0
пг/мл
пг/мл
10
0
01 0,01
00
0,
к
1
0
10
01 0,01
00
0,
к
1
0
10
01 0,01
00
0,
к
1
0
10
мкг/кг
Рис. 2. Влияние динорфина А на пролиферативную активность спленоцитов мыши (А; n=12),
продукцию ими IL-2 (Б; n=6) и IL-4 (B; n=6)
зависела от вводимой дозы -агониста, степени
активации иммунокомпетентных клеток, а также
характера действия активационного стимула.
В современной литературе представлены весьма ограниченные сведения, иллюстрирующие эффекты динорфинов, а также других лигандов опиатных рецепторов природного или синтетического происхождения на функциональную активность В-лимфоцитов в системах in vitro и in vivo. В
то же время, имеющиеся данные однозначно указывают на тоническое угнетение процессов антителообразования при эндогенной и экзогенной активации -опиатных рецепторов. Так, показано
(Vassou et al., 2008), что экзогенный лиганд опиатных рецепторов αs1-казоморфин в высокой
(10-6М) концентрации снижал секрецию Ig M, G, A
в культурах СD 19+ B-лимфоцитов. Эксперименты, выполненные на мышах, нокаутированных по
гену -опиатного рецептора, показали, что после
иммунизации животных гемоцианином улитки
продукция антиген-специфичных иммуноглобулинов значительно повышалась, в то время как мыши, у которых отсутствовал ген μ- или δ-опиатных
рецепторов, демонстрировали нормальные уровни
продукции антител (Gavériaux-Ruff et al., 2003).
Несоответствие литературных данных и выявленных нами эффектов динорфина А на антителогенез
связано, главным образом с выбором экспериментальной модели. В частности, использование чистой популяции СD 19+ лимфоцитов необходимо
для изучения прямых эффектов -агонистов на
функции B-клеток, но не отображает истиной картины, развертывающейся в организме, так как огромную роль при формировании конечных интегральных эффектов играют процессы межклеточной кооперации и нейроэндокринной регуляции. В
организме генетически-модифицированных животных большое значение приобретает развитие
компенсаторных механизмов на месте выключен-
76
С. В. Гейн, Т. А. Баева, Е. Д. Маерова, С. П. Тендрякова
ного звена, поэтому не совсем корректно предполагать, что в нормальном здоровом организме физиологические процессы будут протекать аналогичным образом.
В научных базах практически отсутствуют данные о роли -опиатных рецепторов и их лигандов в
регуляции in vivo пролиферативной активности
лимфоцитов и продукции Th1/Th2-поляризующих
цитокинов. В то же время, аналогичные эффекты агонистов в системах in vitro в присутствии динорфинов, согласно литературным данным, могут
сильно варьировать в зависимости от видовой принадлежности, состава выбранного объекта исследования, временного фактора. Ранее нами было выявлено разнонаправленное влияние динорфина А (113) на пролиферацию лимфоцитов в очищенной
лимфоцитарной фракции и смешанной лейкоцитарной взвеси (Гейн и др., 2009). Показано (Ni et al.,
1999) стимулирующее влияние динорфина А на
пролиферативный ответ спленоцитов мыши и продукцию ими IL-2 и IL-1. В работе Barreca et al.
(1987) установлено, что стимулирующий эффект
динорфина А на пролиферацию мононуклеаров зависит от срока внесения пептида в культуру. С другой стороны, имеются данные (Gorodinsky et al.,
1994) об угнетающем эффекте динорфина В на пролиферацию клеток головного мозга эмбрионов
крыс; данный эффект блокировался nor-BNI. Таким
образом, наличие большого количества факторов,
определяющих конечный эффект динорфинов, требует более масштабных и детальных исследований
в системах in vivo.
Работа поддержана грантами Президента РФ
«Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4 и
программы Президиума РАН «Молекулярная и
клеточная биология».
Библиографический список
Гейн, С.В. Эффект динорфина А (1-13) на пролиферативный ответ лимфоцитов и изменение
Тh1/Тh2 цитокинового профиля / С.В. Гейн,
А.А. Сятчихин, С.П. Тендрякова // Докл. Академии наук. 2009. Т. 424, № 4. С. 563–566.
Barreca, T. Effects of dynorphin on the pha-induced
lymphocyte proliferation in vitro / T. Barreca, G.
Di Benedetto, G. Corsini [et al.] // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1987. Vol. 9. P. 467–475.
Bidlack, J.M. Detection and function of opioid receptors on cells from the immune system // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. Vol. 7. P. 719–723.
Gavériaux-Ruff,, C. Enhanced humoral response in
kappa-opioid receptor knockout mice / C.
Gavériaux-Ruff,, F. Simonin, D. Filliol, B.L. Kieffer // J. Neuroimmunol. 2003. Vol.134. P. 72–81.
Gorodinsky, A. Dynorphin B inhibits thymidine incorporation into DNA in fetal rat and guinea pig brain
cell aggregates / A. Gorodinsky, J. Barg, M.M.
Belcheva [et al.] // Reg. Peptides. 1994. Vol. 54. P.
109–110.
Ignatowski, T.A. Differential κ-opioid receptor
expression on mouse lymphocytes at varying
stages of maturation and on mouse macrophages
after selective elicitation / T.A. Ignatowski, J.M.
Bidlack // J. Pharmacol. Exp. Therapy. 1999. Vol.
290. P. 863–870.
Ni, X. Dynorphin A enhances mitogen-induced proliferative response and interleukin 2 production of rat
splenocytes / X. Ni, B.C. Lin, C.Y. Song, C.H. Wang
// Neuropeptides. 1999. Vol. 33. P. 137–143.
Vassou, D. Opioids modulate constitutive B-lymphocyte secretion / D. Vassou, E. Bakogeorgou, M.
Kampa [et al.] // Int. Immunopharmacol. 2008.
Vol. 8. P. 634–644.
Поступила в редакцию 25.03.2010
The
.
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2010
Биология
Вып. 1 (1)
УДК 612.018:612.017.1:611.018.53
ХОРИОНИЧЕСКИЙ ГОНАДОТРОПИН
КАК РЕГУЛЯТОР ФЕНОТИПИЧЕСКОГО
СОЗРЕВАНИЯ ИНТАКТНЫХ И ИНТЕРЛЕЙКИН2-АКТИВИРОВАННЫХ NK- И NKT-КЛЕТОК
С. А. Заморина a , О. Л. Горбунова a , С. В. Ширшев a , b
a
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: info@iegm.ru
b
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: biodin@psu.ru
Изучены эффекты хорионического гонадотропина (ХГ) на фенотипическое созревание натуральных киллеров (NK-клетки) и Т-клеток с функциями натуральных киллеров (NKT-клетки) в системе in vitro. Показано, что ХГ в дозах, характерных для беременности, выступает индуктором
фенотипического созревания интактных CD3-CD16+56+NK- и CD3+CD16+CD56+NKT-клеток.
Присутствие интерлейкина-2 (ИЛ-2) не изменяет направленность стимулирующего эффекта ХГ в
отношении NKT-клеток, а в случае низкой дозы ХГ усиливает его эффект. В то же время, ХГ в
высокой дозе отменяет NK-активирующее действие ИЛ-2.
Ключевые слова: репродуктивная иммунология, регуляция иммунитета, хорионический гонадотропин, NK- и
NKT- клетки, фенотипическое созревание, цитотоксичность, цитокины
Объяснение причин толерантности иммунной
системы матери к генетически чужеродному плоду
является актуальной проблемой репродуктивной
иммунологии, в рамках которой важнейшим направлением является анализ роли гормонов в регуляции
иммунитета. Хорионический гонадотропин (ХГ) является ключевым гормоном с позиций сохранения и
нормального развития беременности, одновременно
обладая выраженным иммуномодулирующим действием (Ширшев, 2002).
В последнее время большое внимание уделяется исследованию функций клеток врожденного
иммунитета, среди которых важную роль играют
NK- и NKT- клетки.
NK-клетки – это клетки врожденной защиты,
которые без предварительной иммунизации или
активации могут распознавать и убивать абберантные клетки-мишени и быстро продуцировать
хемокины и цитокины, оказывающие защитные
эффекты. Все NK-клетки крови делятся на две
субпопуляции по уровням экспрессии молекул
CD56 и CD16. Приблизительно 90% NK-клеток
периферической крови экспрессируют низкие
уровни CD56 (dim) и одновременно являются позитивными для CD16 (CD56dimCD16+). CD16, в
свою очередь, представляет собой низкоаффинный
рецептор для Fc-фрагмента IgG1 и IgG3 (Fc RIII)
и участвует в обеспечении реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности. Оставшиеся
10% NK-клеток экспрессируют высокие уровни
CD56 (bright) и не экспрессируют СD16
(CD56brigthCD16-) (Trundley, Moffet, 2004). Эти субпопуляции различаются функционально: так,
CD56dim NK-клетки обладают выраженной цитотоксичностью и имеют много цитолитических
гранул, а CD56brigth-клетки представляют собой
раннюю стадию дифференцировки CD56dim и являются основными цитокинпродуцирующими
NK-клетками (Cooper et al., 2001). Кроме того,
именно NK-клетки принимают активное участие в
деструкции неоплазм и аллотрансплантантов. Во
время беременности и сразу после родов активность NK-клеток периферической крови существенно снижена (Baley, Schacter, 1985).
Натуральные киллерные Т-клетки (NKT) являются отдельной субпопуляцией Т-лимофцитов.
Реализуя функции, свойственные NK-клеткам, они
одновременно являются мощными продуцентами
цитокинов (Collucci et al., 2003). При распознавании антигена молекулами TCR NKT-клетки продуцируют большое количество цитокинов, особенно интерлейкин-4 (ИЛ-4) и гамма-интерферон
(IFN-). Благодаря этим свойствам NKT-клетки
принимают участие в отторжении опухоли, предупреждении аутоиммунных реакций, защите от паразитарных или бактериальных инфекций, а также
в изменении профилей цитокинов Т-клеток в ответ
на растворимые белковые антигены (Ширшев,
2009). NKT клетки способны распознавать антигены в комплексе с CD1d или молекулой главного
© С. А. Заморина, О. Л. Горбунова, С. В. Ширшев, 2010
77
78
С. А. Заморина, О. Л. Горбунова, С. В. Ширшев
комплекса гистосовместимости класса G (HLA-G),
представленными на клетках плаценты, что может
привести к аборту, а при повышении процента
CD3+CD16+ клеток в I триместре беременности
увеличивается риск развития гестоза (Борзова и
др., 2005). Очевидно поэтому во время физиологически протекающей беременности функции
NK/NKT клеток периферического пула супрессированы (Mahmoud et al., 2004; Clark et al., 2008).
В то же время, интерлейкин-2 (ИЛ-2) относится
к ключевым цитокинам, инициирующим развитие
специфического иммунного ответа. Хорошо известно, что ИЛ-2 усиливает цитотоксичность Т- и
NK-клеток в отношении NK-чувствительных и
NK-резистентных линий клеток-мишеней, и также
опухолей и инфицированных вирусом клеток
(Ширшев, 2009). Стимулированные ИЛ-2 NKклетки трансформируются в лимфокинактивированные клетки (ЛАК-клетки), цитотоксические в
отношении трофобластов (King, Loke, 1990). Известно, что в период беременности синцитиотрофобласт, экспрессирующий ген ИЛ-2, секретирует
данный цитокин в маточно-плацентарный компартмент (Boehm et al., 1989). Таким образом, в гемохориальной области клетки одновременно контактируют с ХГ и ИЛ-2, направленность эффектов которых может быть прямо противоположна.
Учитывая важную роль NK- и NKТ-клеток при
беременности как эффекторов неспецифической
резистентности организма, целью работы являлась
оценка фенотипического созревания этих клеток
под воздействием ХГ, а также в условиях стимуляции клеток ИЛ-2.
Материалы и методы
В работе использовали суспензию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых небеременных женщин в фолликулярной фазе
менструального цикла. Мононуклеарные клетки
получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3) (Petrof et
al., 1980). Полученную суспензию (1х106 мл) после
двойной отмывки раствором Хэнкса инкубировали
в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 mM HEPES; 2 mM L-глутамина; 100
мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС) с гормоном в течение суток при 370С в условиях 5% СО2.
ХГ в культуры вносили в дозах, соответствующим I и III триместру беременности (100 МЕ/мл и
10 МЕ/мл, соответственно). Рекомбинантный ИЛ-2
(“Sigma”, США) использовали в физиологической
дозе 100 МЕ/мл, соответствующей его уровню при
формировании иммунного ответа (Kurosaka et al.,
2003).
После инкубации с гормоном супернатанты собирали, а клетки отмывали фосфатно-солевым буфером (0.01 М фосфат натрия, 0.145 М хлорид натрия, рН 7.2) и оценивали фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии. Жизнеспособность
клеток после суточной инкубации с гормоном, определяемая в тесте с эозином, составляла 95–98%.
Клетки окрашивали моноклональными антителами к соответствующим поверхностным антигенам согласно методике производителя (Beckman,
Coulter, США). Оценивали экспрессию пар мембранных молекул с использованием двухпараметрических реагентов, меченных контрастными по
цвету флуорохромами: флюоресцеинизотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (PE). Результаты
учитывались на проточном цитофлюориметре
EPICS XL (Beckman Coulter, США). Лимфоцитарное окно (гейт) выставляли на основе комбинации
прямого и бокового светорассеивания и размера
клеток. При учете результатов подсчитывали не
менее 10000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по
флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.
Определяли содержание NK-клеток с фенотипом CD3-CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE) и
NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3FITC/CD16,56-PE), согласно стандартным процедурам окрашивания поверхностных маркеров.
Статистическая обработка данных проводилась с
помощью парного t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Установлено, что ХГ в дозах, соответствующих
I и III триместру беременности, повышает количество CD3-CD16+56+NK-клеток (табл. 1). Как было
сказано выше, субпопуляция NK-клеток периферической крови представлена CD16+CD56+
(CD16+CD56dim) и CD16-CD56+ (CD16-CD56bright)
NK-клетками, причем NK-клетки с фенотипом
CD16+56+ обладают наибольшей цитолитической
активностью (Mittag et al., 2005). Таким образом,
эффекты гормона направлены на изменение экспрессии молекулы CD16 на CD56+ NK-клетках,
что ассоциировано с регуляцией их цитотоксического потенциала.
Установлено, что ИЛ-2 оказывал достоверный
стимулирующий эффект на количество NK-клеток,
более чем в два раза повышая их количество. Известно, что стимулированные ИЛ-2 NK-клетки
трансформируются в ЛАК-клетки, цитотоксические в отношении трофобластов (King, Loke,
1990). Гормон при совместном внесении с ИЛ-2
сохранял свое стимулирующее действие в отношении NK-клеток. Однако, стимулирующий эффект высокой дозы ХГ совместно с ИЛ-2 был ниже, чем самостоятельный эффект ИЛ-2 (табл. 1).
Таким образом, ХГ оказывает стимулирующий
эффект на фенотипическое созревание NK-клеток,
но в высокой дозе отменяет ЛАК-трансформирующее действие ИЛ-2. Важно отметить, что снижение
уровня ЛАК-клеток способствует успешному развитию беременности и, по-видимому, является еще
одним механизмом, при помощи которого ХГ реа-
Хорионический гонадотропин как регулятор фенотипического созревания … клеток 79
лизует свои множественные регуляторные и фетопротекторные эффекты. В то же время, повышение
содержания NK-клеток под действием ХГ, вероятно, связано как с необходимостью увеличения пула
CD16+CD56+ NK-клеток периферической крови в
связи с последующей их миграцией в децидуальную оболочку, так и направлено на защиту матери и
эмбриона от микробной атаки и малигнизации клеток трофобласта.
Таблица 1
Влияние ХГ и ХГ совместно с ИЛ-2 на уровень
NK-клеток CD3-CD16+CD56+
Исследуемый
NK-клетки
n
показатель
CD3-CD16+CD56+
Контроль
5
7.86 ± 1.04
13.24 ± 1.29
ХГ (10 МЕ/мл)
5
p=0.0005*
13.11 ± 1.26
ХГ (100 МЕ/мл)
5
p=0.0055*
18.30 ± 2.91
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)
5
p=0.005*
ХГ (10 МЕ/мл) +
16.45 ± 1.57
5
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)
p=0.0006*
11.85 ± 1.69
ХГ (100 МЕ/мл) +
5
p=0.01*
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)
p=0.012^
Здесь и в табл. 2 *достоверные (p<0,05) отличия по tкритерию Стьюдента с контролем; ^в сравнение с ИЛ-2;
#в сравнении с ХГ.
Показано, что ХГ независимо от дозы увеличивает процент CD16+CD56+NKT-клеток. ИЛ-2 не
оказывал самостоятельного эффекта в отношении
этих клеток. Гормон при совместном внесении с
ИЛ-2 сохранял свое стимулирующее действие в
отношении NKT-клеток (табл. 2).
Таблица 1
Влияние ХГ и ХГ совместно с ИЛ-2 на уровень
NKT-клеток CD3+CD16+CD56+
Исследуемый
NKТ-клетки
n
показатель
CD3+CD16+CD56+
Контроль
5
1.38 ± 0.27
3.33 ± 0.786
ХГ (10 МЕ/мл)
5
p=0.003*
4.18 ± 0.73
ХГ (100 МЕ/мл)
5
p=0.007*
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)
5
1.73 ± 0.27
5.59 ± 0.616
ХГ (10 МЕ/мл) +
p=0.001*
5
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)
p=0.0005^
p=0.005#
5.61 ± 1.52
ХГ (100 МЕ/мл) +
5
p=0.002*
ИЛ-2 (100 МЕ/мл)
p=0.009^
Важно отметить, что в случае совместного стимулирующего эффекта низкой дозы ХГ (10 МЕ/мл)
и ИЛ-2, эти агенты выступают как костимуляторы.
Таким образом, присутствие ИЛ-2 не изменяет на-
правленность стимулирующего эффекта ХГ, а в
случае низкой дозы ХГ усиливает его эффект.
Известно,
что
формирование
фенотипа
CD16+CD56+NKT-клеток является терминальной
стадией активации NKT-клеток и связано с максимальной цитотоксической активностью (Ou et al.,
2002). Таким образом, гормон выступает индуктором фенотипического созревания NKT-клеток.
Кроме того, NKT-клетки составляют субпопуляцию регуляторных Т-лимфоцитов, которые наряду
с дендритными клетками играют ведущую роль в
Тh1/Th2 девиации и формировании периферической толерантности (Boyson et al., 2002). Известно,
что NKT-клетки периферической крови имеют
большое значение в период имплантации, индуцируя цитокиновое окружение Th2-типа (Boyson et
al., 2002). Таким образом, выявленные эффекты
ХГ в отношении CD16+CD56+ NKT-клеток являются одним из возможных механизмов участия
гормона в поддержании баланса цитокинов и периферической толерантности при беременности.
В целом, полученные данные свидетельствуют
о том, что ХГ способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с
усилением их цитотоксической активности. В условиях активации NKT-клеток ИЛ-2 стимулирующий эффект ХГ сохранялся. В то же время, ХГ,
оказывая стимулирующий эффект на фенотипическое созревание NK-клеток, в высокой дозе отменяет NK-активирующее действие ИЛ-2.
Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и молодежным
научным грантом Уральского отделения РАН.
Библиографический список
Пат. 2265221 Российская Федерация. Способ прогнозирования гестоза легкой степени тяжести с
ранних сроков беременности / Борзова Н.Ю.,
Панова И.А., Скрипкина И.Ю., Сотникова
Н.Ю., Кудряшова А.В. Приоритет изобретения
05.01.2004. Зарег. в Госреестре изобр.
10.06.2005.
Ширшев, С.В. Механизмы иммуноэндокринного
контроля процессов репродукции / С.В. Ширшев. Екатеринбург: УрО РАН, 2002. Т. 2. 557 с
Ширшев, С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий / С.В. Ширшев. Екатеринбург: УрО РАН, 2009. 582 с.
Baley, J.E. Mechanisms of diminished natyral killer
cell activity in pregnant women and neonates / J.E.
Baley, B.Z. Schacter // J. Immunol. 1985. Vol.
134. P. 3042–3048.
Boehm, K.D. The interleukin 2 gene is expressed in
the syncytiotrophoblast of the human placenta /
K.D. Boehm, M.F. Kelley, J. Ilan // Proc. Natl.
Acad. Sci USA. 1989. Vol. 86, № 2. P. 656–660.
80
С. А. Заморина, О. Л. Горбунова, С. В. Ширшев
Boyson, J.E. CD1d and invariant NKT cells at the
human maternal-fetal interface / J.E. Boyson, B.
Rybalov, L.A. Koopman [et al.] // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 13741–13746.
Clark, D.A. CD200-dependent and nonCD200dependant pathways of NK cell suppression by
human IVIG / D.A. Clark, K. Wong, D. Banwatt
[et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. 2008. Vol. 25.
P. 67–72.
Collucci, F. What does it take to make a natural killer?
/ F. Collucci, M.A. Caligiuri, J.P. Di Santo // Nature Rev. Immunol. 2003. Vol. 3. P. 413–425.
Cooper, M.A. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56brigth
subset / M.A. Cooper, T.A. Fehinger, S.C. Turner
[et al.] // Blood. 2001. Vol. 97. P. 46–51.
King, A. Human trophoblast and JEG choriocarcinoma
cells are sensitive to lysis by IL-2 stimulated decidual NK-cells / A. King, Y.W. Loke // Cell. Imminol. 1990. Vol. 129. P. 435–448.
Kurosaka, K. Silent cleanup of very early apoptotic
cells by macrophages / K. Kurosaka, M. Takahashi, N. Watanabe, Y. Kobayashi // J. Immunol.
2003. Vol. 171. P. 4672–4679.
Mahmoud, F. Effect of IgG therapy on lymphocyte
subpopulations in the peripheral blood of Kuwaiti
women experiencing recurrent pregnancy loss / F.
Mahmoud, M. Diejomaoh, A. Omu [et al.] //
Gynecol. Obstet. Invest. 2004. Vol. 58, № 2. P.
77–83.
Mittag, A. Polychromatic (eight-color) slide-based cytometry for the phenotyping of leukocyte, NK, and
NKT subsets / A. Mittag, D. Lenz, A.O. Gerstner
[et al.] // Cytometry. 2005. Vol. 65. P. 103–115.
Ou, D. Beta-cell antigen-specific CD56(+) NKT cells
from type 1 diabetic patients: autoaggressive effector T cells damage human CD56(+) beta cells by
HLA-restricted and non-HLA-restricted pathways
/ D. Ou, D.L. Metzger, X. Wang [et al.] // Hum.
Immunol. 2002. Vol. 63. P. 256–270.
Pertof, H. Separation of human monocytes on density
gradients of Percoll / H. Pertof, A. Johnsson, B.
Warmegard, R. Seljelid // J. Imminol. Methods.
1980. Vol. 33. P.221–229.
Trundley, A. Human uterine leukocytes and pregnancy
/ A. Trundley, A. Moffet // Tissue antigens. 2004.
Vol.63. P.1–12.
Wide, L. An immunological method for the assay of
human chorionic gonadotrophin / L. Wide // Acta
Endocrinol. (Kbh). 1962. Vol. 41, Suppl. 70. P. 1–
100.
Поступила в редакцию 28.03.2010
Human chorionic gonadotropin as a regulator of phenotypic maturation of intact
and interleukin-2-activated NK-, and NKT-cells
S.A. Zamorina, O.L. Gorbunova, S.V. Shirshev
Effects of human chorionic gonadotropin (hCG) on phenotypic maturation of natural killers (NK-cells) and
T-cells with the functions of natural killers (NKT-cells) were studied in vitro. It was shown that hCG in doses
typical of those in pregnancy acted as the inducer of maturation of intact CD3-CD16+56+NK-, and
CD3+CD16+CD56+NKT-cells. Under cell activation by interleukin-2 (IL-2) the hormone effects were reproduced at the NKT-cell level. However, hCG in high dose was found to abolish NK-promoting effect of IL-2.