Противоопухолевая активность вируса LIVP

Руженкова Ю.С.
Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. Гончарова Е.П.
Лаборатория биохимии нуклеиновых кислот, ИХБФМ СО РАН
Противоопухолевая активность вируса LIVP-GFP на модели лимфосаркомы RLS-40
(солидная форма)
Wennier, Li, McFadden, 2011
2
Преимущества вируса осповакцины
 Реплицируется и лизирует клетки быстрее по сравнению с




другими вирусами
Инфицирует разные типы опухолевых клеток, т.к. не
требует определенных рецепторов на поверхности клетки
Жизненный цикл вируса протекает в цитоплазме, поэтому
не происходит встраивания ДНК в геном хозяина
Образует особую инфекционную форму (EEV), которая
способна эффективно распространяться между клетками
Размер генома позволяет встраивать терапевтические
гены без потери онколитических свойств
3
 Рекомбинантный вирус осповакцины LIVP-GFP
GFP
Ген
тимидинкиназы
Опухолевые модели с фенотипом МЛУ
Поэтапно
повышающиеся
концентрации
ВИНБЛАСТИНА
Устойчива к действию
циклофосфамида
RLS-40 проявляет высокую
устойчивость к действию
циклофосфамида, цисплатина,
рубомицина и винбластина
4
– исследовать факторы, влияющие на
эффективность онколитического действия
рекомбинантного штамма вируса осповакцины LIVP-GFP,
в клетках лимфосаркомы, проявляющей выраженный
фенотип МЛУ
определить
эффективность
онколитического
действия вируса LIVPGFP на опухолевые
клетки с различными
механизмами
формирования МЛУ
оценить
противоопухолевую
активность вируса
LIVP-GFP на модели
лимфосаркомы RLS40 в экспериментах
in vivo
Определить степень
активации вирусом LIVPGFP Т-клеточного звена
иммунного ответа
5
Влияние вируса LIVP-GFP на жизнеспособность клеток
Количество живых клеток, %
120
Мышиная
лимфосаркома
Цервикальная
карцинома человека
Нормальные клетки
100
80
1 сутки
60
2 сутки
3 сутки
40
20
0
RLS
RLS-40
КВ-3-1
КВ-8-5
ФДЧ
Спленоциты
 На все исследуемые линии опухолевых клеток вирус LIVP-GFP оказывает цитопатическое
действие
 Нормальные клетки (спленоциты, фибробласты десны человека – ФДЧ) обладают низкой
чувствительностью к вирусу
6
Развитие вирусной инфекции в культурах клеток
100
90
80
70
60
6ч
50
1 сут
40
2 сут
30
20
10
0
Количество клеток, экспрессирующих GFP,
%
Количество клеток, экспрессирующих GFP,
%
100
90
80
70
60
6ч
50
1 сут
40
2 сут
30
20
10
0
RLS
RLS-40
КВ-3-1
КВ-8-5
 Значительная часть опухолевых клеток различных культур экспрессирует белок
GFP, что свидетельствует о развитии вирусной инфекции
7
Противоопухолевая активность вируса LIVP-GFP на модели
лимфосаркомы RLS-40 (солидная форма)
0 сутки
Самки мышей линии
СВА, ~ 6 нед.
4 сутки
RLS-40 в правую бедренную
мышцу, 105 кл/мышь
Vi в/о
БОЕ/мышь
5*107
1.2
Vi в/о
БОЕ/мышь
5*107
Объем опухоли, см3
1.0
0.8
*
LIVP-GFP в/о 0д 4д
0.6
RLS-40+PBS
0.4
0.2
0.0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Сутки после трансплантации опухоли
* отличия с р<0,05
8
Противоопухолевая активность вируса LIVP-GFP на модели
лимфосаркомы RLS-40 (солидная форма)
Площадь метастазов, %
5.0
4.0
Средняя площадь метастазов (S):
3.0
*
2.0
LIVP-GFP в/о 0д
4д
S метастазов в печени
x 100%
S печени
1.0
* отличия с р<0,05
0.0
Гистологические срезы печени мышей СВА с лимфосаркомой RLS-40
RLS-40+PBS
LIVP-GFP 0д 4д
К-
1 мм
Окрашивание гематоксилин-эозином
9
Противоопухолевая активность вируса LIVP-GFP при
комбинированной терапии
Имплантация RLS-40
в правую бедренную
мышцу, 106 кл/мышь
Vi в/о
Самки мышей линии
СВА, ~ 6 нед.
Vi в/б
5*107
5*107
БОЕ/мышь БОЕ/мышь
ПХТ в/б
ПХТ в/б
PBS в/о
4 сутки роста
опухоли
8 сутки роста
Vi в/о 5*107
Vi в/о 5*107
опухоли
БОЕ/мышь
БОЕ/мышь
9 сутки роста
опухоли
ПХТ в/б
ПХТ в/б
10
Противоопухолевая активность вируса LIVP-GFP при
комбинированной терапии
4
3.5
Объем опухоли, см3
3
LIVP-GFP в/о
2.5
*
2
LIVP-GFP в/б
*
1.5
1
RLS-40+PBS
0.5
0
0
2
4
6
LIVP-GFP в/о или в/б
8
10
12
LIVP-GFP в/о
Влияние вируса
LIVP-GFP на рост
опухоли при
внутрибрюшинном
и двукратном
внутриопухолевом
способе введения.
14
* отличия с р<0,05
Сутки после трансплантации опухоли


Торможение роста опухоли при введении вируса наблюдается уже на 8 сутки после имплантации
клеток
Замедление роста опухоли наблюдается в течение всего эксперимента и не зависит от способа
введения вируса
11
Противоопухолевая активность вируса LIVP-GFP при
комбинированной терапии
4
3.5
Объем опухоли, см3
3
ПХТ 2 курса
2.5
2
ПХТ 2 курса+LIVPGFP в/о
*
1.5
1
RLS-40+PBS
0.5
0
0
2
4
6
8
10
12
Влияние ПХТ на
рост опухоли
отдельно и в
сочетании с
внутриопухолевым
способом введения
вируса.
14
* отличия с р<0,05
ПХТ
LIVP-GFP в/о ПХТ
Сутки после трансплантации опухоли


При проведении монотерапии с помощью цитостатиков наблюдается стабилизация и
замедление роста опухоли по сравнению с контрольной группой
Замедление роста опухоли наблюдается в течение всего эксперимента
12
Оценка активации Т-клеточного звена иммунной системы
Имплантация RLS-40
в правую бедренную
мышцу, 105 кл/мышь
Самки мышей линии
СВА, ~ 6 нед.
7 сутки роста
опухоли
Vi в/о
5*107
БОЕ/мышь
ПХТ в/б,
Vi в/о
PBS в/о
5*107
БОЕ/мышь
Интактная
мышь К-
Забор
селезенки
15 сутки роста
опухоли (8 сутки
после проведения
терапии)
13
Оценка активации Т-клеточного звена иммунной системы методом ELISpot
250
Число спотов
200
150
контроль
100
Vi
Контроль- (среда)
50
Vi
7*103 БОЕ/лунку
Контроль+
(конканавалин А)
0
Vi в/о
Vi в/о+ПХТ
RLS-40+PBS
K-
350 тыс. клеток/лунку
 Вирус осповакцины увеличивает количество вирус-специфических ИНФ-γ-секретирующих
клеток и, таким образом, стимулирует развитие Т-клеточного иммунного ответа
14
Выводы
 Показано, что в опухолевых клетках с различными механизмами
формирования МЛУ наблюдается прогрессирующее цитопатическое
действие вируса LIVP-GFP.
 Нормальные клетки обладают низкой чувствительностью к
инфицированию вирусом LIVP-GFP.
 При проведении виротерапии на ранних этапах опухолевого роста
наблюдается значительное ингибирование развития метастатического
процесса
 Противоопухолевая активность вируса LIVP-GFP не зависит от способа
введения вируса при проведении терапии мышам с солидной формой
лимфосаркомы RLS-40.
 Исследованная схема проведения комбинированной виротерапии с
включением в схему терапии препаратов, используемых в настоящее
время для лечения онкологических больных, не привела к усилению
торможения роста опухоли.
 При монотерапии, а также при проведении комбинированной
виротерапии вирус осповакцины активирует Т-клеточный иммунный ответ.
Данная работа была поддержана проектом партнерских исследований СО РАН №55
15
Ген-специфический продукт/b актин
Механизмы формирования МЛУ
2
mdr1a
mdr1b
bcl-2
p53
3
1,6
1,2
2
0,8
1
0,4
0
LS RLS RLS40
LS RLS RLS40
LS RLS RLS40
0
LS RLS RLS40
Сравнение профиля экспрессии генов mdr1a, mdr1b, p53 и bcl-2 в
клетках линий LS, RLS и RLS-40 методом ОТ-ПЦР (Шкляева, 2009)
16