лектиноферментный анализ как метод оценки гликозилирования иммуноглобулинов

УДК: 577.112.389.4:616-097:577.152.321:616-006.448
лектиноферментный анализ как метод оценки
гликозилирования иммуноглобулинов
А. М. ПЕТРОСЯН, А. В. БРИТАН
Крымский государственный медицинский университет им. С. И. Георгиевского,
Симферополь, Крым, Украина;
e-mail: gtrk@pop.cris.net
Рассмотрены детали взаимодействия лектинов с молекулами IgG в новой, предложенной нами
методике лектиноферментного анализа, позволяющей регистрировать на примере лектина гороха
(Pisum sativum) степень маннозилирования молекул IgG в норме и при патологии. Показано, что для
обнаружения достоверной разницы в степени гликозилирования контрольных IgG и при патологии
оптимальной является исходная концентрация иммуноглобулина 1 мкг/мл. Проведена серия опытов с
внесением a-D-маннозы в иммуноферментный планшет между этапами инкубации иммуноглобулина
и лектина, а также доказан факт ингибирующего влияния a-D-маннозы на активность лектина гороха. Предварительная инкубация лектинов с иммуноглобулинами позволяет лектинам сохранять свою
активность. Показано, что это является следствием неспецифического взаимодействия молекул IgG
c пероксидазой, конъюгированной с лектинами. Лектиноферментный анализ с использованием Fab- и
Fc-фрагментов поликлонального контрольного IgG показал, что лектин гороха обладает большим срод­
ством к антигенсвязывающему фрагменту. Эти результаты и анализ гликозилирования парапротеинов и белков Бенс-Джонса больных множественной миеломой позволяют приблизиться к пониманию
деталей взаимодействия иммуноглобулинов с лектинами.
К л ю ч е в ы е с л о в а: лектин, иммуноглобулин G, гликозилирование, множественная миелома.
М
олекула IgG, как и все иммуноглобулины, является гликопротеином.
Содержание олигосахаридных компонентов в составе иммуноглобулинов колеблется от 3 до 13% в зависимости от их класса
[1]. В Fc-фрагменте IgG CH2-домены тяжелых
цепей ориентированы друг к другу трехцепочечными b-слоями, а между доменами находятся углеводные фрагменты, ковалентно связанные с Asn-297 каждой H-цепи [2] (рис. 1).
Вне зависимости от расположения, все олигосахаридные компоненты иммуноглобулинов
имеют примерно одинаковый набор основных
моносахаридов: галактоза, манноза, N-ацетил­
глюкозамин, N-ацетилгалактозамин, фукоза
и сиаловая кислота. Гликозилирование иммуноглобулинов начинается еще в эндоплазматической сети, где к полипептидной цепи
присоединяются N-ацетилглюкозамин и манноза. Затем в аппарате Гольджи происходит
полное формирование олигосахаридной цепи,
причем последними присоединяются фукоза
и сиаловая кислота [3, 4]. Олигосахаридные
цепи, входящие в состав иммуноглобулинов
здорового человека, имеют высокую микрогетерогенность с преобладанием комплексов
биантеннарного типа, а также сиаловых кислот, за счет чего около 25% иммуноглобулинов
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
сиалированы. По крайней мере 30 различных
олигосахаридов обнаружены в молекуле IgG.
Молярное соотношение каждого олигосахарида и общего пула олигосахаридов – величина
постоянная [5].
По сравнению с гликанами Fc-фрагмента углеводные компоненты, локализованные
в Fab-фрагменте, имеют более однородную
структуру и отличаются повышенным содержанием моно- и дисиалированных окончаний.
У больных ревматоидным артритом тяжелые
цепи Fab-фрагментов сиалированы сильнее,
чем легкие [6]. Классическая биантеннарная
структура может быть заменена триантеннарной с добавлением N-ацетилглюкозамина и галактозы или тетраантеннарной цепью
с добавлением к каждой из ветвей N-ацетил­
глюкозамина и галактозы. Возможен также
вариант олигосахаридной цепи, обогащенный
маннозой. Благодаря (1→6), (1→3) и (1→2)-гликозидным связям образуются разветвленные
олигосахаридные маннозные цепи; из других
углеводов представлены лишь две молекулы
N‑ацетилглюкозамина. Некоторые авторы считают, что вариант гликозилирования иммуно­
глобулинов, обогащенный маннозой, присущ,
в основном, IgM и IgD [7].
151
методи
Рис. 1. Схема строения олигосахаридной цепи CH2-домена Fc-фрагмента IgG.
Появление бисекторного N-ацетилглюкоз­
амина, соединенного с b-маннозой, считается
одной из особенностей гликозилирования Fabфрагментов IgG [8]. Предполагается, что появление гликанов с таким строением связано с
более высокой активностью гликозилтрансфераз в вариабельных областях IgG, где олигосахаридные цепи обладают большей гибкостью,
чем таковые в Fc-фрагменте [9].
Одним из методов изучения углеводных
компонентов
иммуноглобулинов
является
применение лектинов. Лектины – это белки,
обладающие уникальной способностью к специфичному распознаванию различных моно-,
ди- и олигосахаридов, а также боковых гликозидных остатков гликопротеинов, причем связывание гликанов лектинами происходит без
нарушения их ковалентной структуры.
Очищенные лектины растений служат
удобным инструментом для оценки роли углеводов в структуре гликопротеинов и специфичности взаимодействия углеводов с белками.
Лектиноферментный анализ (ЛФА) как метод
регистрации гликозилирования иммуноглобулинов находит все более широкое применение
[10]. Методом ЛФА показано, что отличие в
строении иммуноглобулинов различных животных выражается также в их гликозилировании [11].
Однако детали связывания IgG с лектинами, в частности вклад неспецифических
контактов и участие антигенсвязывающего
участка IgG, до конца не выяснены. Целью
нашей работы являлось более углубленное
изучение взаимодействия иммуноглобулинов с лектинами во время проведения ЛФА,
а также разработка методики, способной с достаточной уверенностью судить об изменении
гликозилирования молекул IgG при развитии
патологических процессов. Для этой цели был
152
использован лектин гороха (Pisum sativum), обладающий большим сродством к маннозе [12].
Были исследованы парапротеины сыворотки крови больных множественной миеломой (ММ), а также обнаруживаемые в моче
этих пациентов свободные легкие цепи IgG –
белки Бенс-Джонса [13].
Материалы и методы
Глобулиновую фракцию из сыворотки
крови здоровых и больных осаждали 17,5%‑м
(NH4)2SO4. Отделенный центрифугированием (6000 g, 30 мин) осадок растворяли в ЗФР
(0,005 М фосфатном буферном растворе с
0,15 М NaCl, рН 7,4) и диализировали против 0,025 М трис-НCl-буферного раствора
с 0,035 М NaCl, рН 8,8. Пробы IgG получали методом ионообменной хроматографии на
ДЭАЭ-трисакриле М («LKB», Швеция) элюцией тем же трис-НCl-буферным раствором.
Профиль элюции строили по значениям оптической плотности собираемых проб при длине
волны 280 нм, измерение которой проводили
на спектрофотометре СФ-26 (Россия).
Белки Бенс-Джонса из мочи больных ММ
выделяли следующим образом. Белок мочи
осаждался кристаллами (NH4)2SO4 до полного
насыщения. Осадок был отцентрифугирован
(8000 g, 30 мин) и затем растворен в ЗФР. Тип
легких цепей белков Бенс-Джонса определяли методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони [14] с использованием
овечьих поликлональных моноспецифических
антисывороток против l- и k-цепей иммуно­
глобулинов человека (НИИ эпидемиологии и
микробиологии МЗ Российской Федерации,
г. Нижний Новгород).
Контроль чистоты выделенных белков
осуществляли с помощью диск-электрофореза в 7,5%-м полиакриламидном геле (ПААГ),
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
А. М. ПЕТРОСЯН, А. В. БРИТАН
приготовленном на 0,001 М трис-глициновом
буферном растворе, pH 8,3 [15].
В лунки иммуноферментного планшета вносили раствор исследуемого иммуно­
глобулина в концентрации 1 мкг/мл в 0,05 М
Nа‑бикарбонатном буфере, рН 9,2 (по 100 мкл
в лунку). В контрольные лунки вносили по
100 мкл буферного раствора.
Длительность инкубации иммуноглобулинов при +37 °С составляла один час.
После тщательной промывки водой проводили трехразовую (по 10 мин) промывку лунок планшета 200 мкл раствора, содержащего
3,75 мг/мл бычьего сывороточного альбумина
(БСА) («Serva», Германия) в ТЗФР (ЗФР, содержащий 0,025% твин 20 («Serva»)): БСА +
ТЗФР. Таким образом лунки промывали от
несвязавшихся иммуноглобулинов и одновременно проводили блокировку свободных
валентностей планшета. На следующем этапе вносили по 50 мкл раствора лектина гороха, конъюгированного с пероксидазой хрена
(«Лектинотест», Украина) в подобранном рабочем разведении в 0,003 М фосфатном буфере с
0,14 М NaCl и 0,003 М KCl, pH 7,4. Инкубацию
лектина проводили в течение 1 ч при +37 °С.
После стандартной промывки БСА + ТЗФР в
лунки вносили по 100 мкл субстратной смеси:
0,2 мМ АБТС (2, 2′-азино-ди-[3-этил-бензтиазолинсульфонат (6)]) в 0,05 М Na-цитратном
буферном растворе, рН 4,0, содержащем 0,01%
пероксида водорода. Результат учитывали на
спектрофотометре Multiskan («Titertek», Финляндия) при длине волны 405 нм. При этом
рассматривались только данные тех рядов, в
которых контрольные лунки демонстрировали
минимальную оптическую плотность – от 0,03
до 0,085.
В отдельной серии экспериментов между
стадиями внесения иммуноглобулинов и лектинов следовала часовая инкубация в лунках
раствора a-D-маннозы в ЗФР в концентрации
0,5 мг/мл. Промывку планшета до и после внесения маннозы осуществляли смесью БСА +
ТЗФР по вышеуказанной схеме.
Для оценки вклада неспецифического
взаимодействия иммуноглобулина с лектином
и пероксидазой пробы лектинов инкубировали
при +37 °C с растворами IgG (IgG + Л). Их
сравнивали с интактными лектинами (ИЛ),
прошедшими такой же по продолжительности
этап инкубации (1, 2 и 8 часов). Все реагенты
растворялись в 0,003 М фосфатном буферном
растворе с 0,14 М NaCl и 0,003 М KCl, pH 7,4.
Концентрации компонентов IgG + Л подбирались таким образом, чтобы конечное разведеISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
ние лектинов совпадало с концентрацией ИЛ.
Затем в лунках иммуноферментного планшета
проводили реакцию связывания ИЛ и IgG + Л
с субстратом 0,2 мМ АБТС, для чего к 10 мкл
реагентов добавляли 100 мкл субстратной смеси.
С целью выяснения, какой участок молекулы IgG обладает наибольшим сродством к
молекуле лектина, мы изучили взаимодействие
лектина гороха с контрольным поликлональным IgG, выделенным из смеси сывороток
крови пятидесяти здоровых людей, и с Fab- и
Fc-фрагментами этих иммуноглобулинов, полученных методикой папаинового гидролиза
молекулы IgG [16]. Сравнивалась также степень взаимодействия с лектином контрольного
иммуноглобулина G и парапротеинов IgG, а
также белков Бенс-Джонса, выделенных соответственно из сыворотки крови и мочи больных ММ.
Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета программ Microsoft
Excel (Windows XP). Данные представлены в
виде M ± m. Различия оценивались по t-критерию Стьюдента и считались достоверными
при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Важным этапом в проведении ЛФА
является подбор исходной концентрации
иммуно­глобулинов. Правильно подобранное
разведение иммуноглобулинов позволяет регистрировать различную степень сродства
разных проб IgG к лектинам. В наших экспериментах наиболее оптимальной оказалась
концентрация IgG 1 мкг/мл. Ее повышение
приводило к сглаживанию различий во взаимодействии нормальных и патологических иммуноглобулинов с лектинами.
Многие авторы подчеркивают, что взаимодействие лектина с иммуноглобулином не ограничивается специфической связью. Возможно также и неспецифическое взаимодей­ствие
[11], например ингибирующее воздействие иммуноглобулинов G на способность некоторых
лектинов к агглютинации эритроцитов [17].
Учитывая, что в наших экспериментах использовался лектин гороха, конъюгированный с
пероксидазой, нельзя было также исключить
факт неспецифического взаимодействия IgG с
этим ферментом.
Наши опыты показали (рис. 2), что повышение активности лектина в присутствии
иммуноглобулина сохраняется с течением времени. Если через час инкубации разница между IgG + Л и ИЛ по степени взаимодействия
с субстратом не наблюдается, то уже через 2
153
методи
часа активность ИЛ оказывается существенно
ниже, чем лектина в составе IgG + Л. Этот
эффект сохраняется даже после восьмичасовой
инкубации. Серия экспериментов с использованием вместо лектинов конъюгата овечьих антител против IgG мыши с пероксидазой хрена
(«Boehringer Mannheim», Германия) в точно­сти
повторяет результаты первой серии опытов:
смесь IgG + указанный конъюгат по сравнению
с субстратной смесью характеризуется бóльшей
оптической плотностью, чем просто конъюгат.
Более того, подобным стабилизирующим эффектом обладает также раствор БСА.
Полученные результаты свидетельствуют,
что факт стабилизирующего воздействия иммуноглобулинов не связан со специфическим
взаимодействием IgG с лектином, а является
результатом других белок-белковых (иммуно­
глобулин-пероксидаза) взаимодействий.
Известно, что специфическое взаимодей­
ствие лектинов с гликозилированными белками нарушается в присутствии свободных
углеводов [4, 8]. С другой стороны, нельзя исключить, что IgG и лектины взаимодействуют
в ЛФА как антитела с антигенами по месту антигенсвязывающего центра IgG [18]. Для выяснения возможного вклада таких взаимодей­
ствий в результаты ЛФА была проведена серия
экспериментов с внесением между стадиями имму­
ноглобулинов и лектинов свободной маннозы.
Как видно на рис. 3, разница в показателях оптической плотности между контрольной группой здоровых людей и больного раком
желудка значительно сглаживается в случае
предварительного внесения маннозы, что свидетельствует об ингибирующем воздействии
свободной маннозы на взаимодействие лектин – иммуноглобулин. Если бы в данном
случае лектин с иммуноглобулином взаимодействовали как антиген с антителом, то вряд
ли вносимый моносахарид влиял на конечный
результат ЛФА.
Следовательно, взаимодействие лектина
гороха с иммуноглобулинами в ЛФА может
быть интерпретировано исключительно как
результат высокоспецифичного связывания
первого с углеводными детерминантами вторых.
Предлагаемая нами методика ЛФА значительно сокращает время эксперимента по сравнению с методами других авторов, которые
отличаются более длительными периодами
инкубации иммуноглобулинов и способами
замещения свободных валентностей планшета
[11, 19, 20].
1,4
E405
1,2
**
*
1
*
А405
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
2
3
4
5
6
ɉɪɨɛɵ IgG
Ɋɢɫ. 2.
Рис. 2. Взаимодействие
с субстратом (АБТС) смеси иммуноглобулин G + лектин (белые столбики) и
интактного лектина (серые столбики). Время инкубации при +37 °C: 1, 2 – 1 ч; 3, 4 – 2 ч; 5, 6 – 8 ч.
А405 – оптическая плотность при длине волны 405 нм. Достоверность отличий в сравнении с контролем: *p < 0,05; ** p > 0,05.
154
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
А. М. ПЕТРОСЯН, А. В. БРИТАН
Ⱥ
1,01
ȿ405
Ȼ
**
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
А405
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
*
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0
Ⱦɨɧ
Ⱦɨɧ
Ȼɢɥ
Ȼɢɥ
ɉɪɨɛɵ IgG
Ɋɢɫ. 3.
Рис. 3. Взаимодействие
лектина гороха с IgG здоровых людей (Дон, белые столбики) и больного раком
желудка (Бил, серые столбики) без промежуточной стадии инкубации с маннозой (А) и с внесением
на втором этапе маннозы (Б). А405 – оптическая плотность при длине волны 405 нм. Достоверность
отличий в сравнении с контролем: * p < 0,05.
Согласно литературным данным, Fab- и
Fc-фрагменты гликозилированы по-разному.
Так, лектин бузины черной (Sambucus nigra)
демонстрирует более эффективное взаимодей­
ствие с Fab-фрагментом IgG, чем с Fc-фрагментом, но денатурированный Fc-фрагмент
обладает большим сродством к лектину, чем
нативный [21]. Факт более эффективной связи
лектинов с Fab-фрагментом IgG по сравнению
с Fc-фрагментом подтверждается также другими авторами [22]. Множество данных касается
гликозилирования миеломных иммуноглобулинов. В частности в одной из работ обнаружено, что Fab-фрагменты парапротеинов класса
G по сравнению с их Fc-фрагментами более
гликозилированы с преобладанием фукозы и
сиаловой кислоты [23].
В наших экспериментах степень взаимодействия лектина гороха с Fab-фрагментом
контрольного IgG была ниже, чем с цельным
IgG, но выше, чем с Fc-фрагментом (рис. 4),
что согласуется с данными литературы.
В работе представлены результаты ЛФА
шести парапротеинов, выделенных из сыворотки крови больных ММ, три из которых относились к классу IgGk, а три – к IgGl, а также
шести белков Бенс-Джонса, пять из которых
были представлены легкими цепями типа k и
один l. Взаимодействие парапротеина больISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
ных ММ с лектином ниже, чем поликлонального IgG, и находится на уровне контрольных
Fab- и Fc-фрагментов, что свидетельствует о
более низкой степени маннозилирования IgG
больных ММ (рис. 4).
При одновременном проведении ЛФА
парапротеинов, выделенных из сыворотки
крови больных ММ, и белков Бенс-Джонса
тех же пациентов было показано, что легкие
цепи (белки Бенс-Джонса) более слабо взаимодействуют с лектином гороха по сравнению
со “своими” парапротеинами (рис. 5). Полученные низкие значения оптической плотности лектиноферментного анализа совпадают с
имеющимися в литературе данными о дегликолизации этих молекул [24, 25]. Исследуемые
белки существенно отличаются по электрофоретической подвижности (рис. 6). Наименьшей
подвижностью обладают поликлональный IgG
здорового человека, его Fab-фрагмент и парапротеины больных ММ. Электроподвижность же белков Бенс-Джонса (исследованных
больных) существенно выше и совпадает с таковой Fc‑фрагмента контрольного IgG. Таким
образом, из двух белков (Fab- и Fc-фрагменты
поликлонального IgG), имеющих близкий молекулярный вес, большей подвижностью при
диск-электрофорезе в 7,5%-м ПААГ обладает
менее маннозилированный Fc-фрагмент. То
155
методи
ȿ405
0,9
0,8
0,7
0,6
A405
0,5
*
*
0,4
*
0,3
*
0,2
*
**
0,1
0
11
22
44
33
6
55
Пробы IgG
ɉɪɨɛɵ IgG
77
**
**
88
99
Рис. 4. Взаимодействие лектина гороха с контрольным IgG (1), с его Fab- (2) и Fc-фрагментами (3),
IgG больных
Ɋɢɫ. 4. множественной миеломой Дор, Род, Кри (4, 5, 6) и белков Бенс-Джонса Ден, Чер, Ели (7,
8, 9). А405 – оптическая плотность при длине волны 405 нм. Достоверность отличий в сравнении с
контролем: *p < 0,05; ** p < 0,01. Серыми столбиками обозначены цельные молекулы IgG, белыми – их
фрагменты.
1,2
*
ȿ405
1
*
*
А405
0,8
0,6
*
0,4
0,2
0
**
**
3
66 77
44 55
Пробы IgG
ɉɪɨɛɵ IgG
Рис. 5. Взаимодействие лектина гороха с IgG здоровых людей (1), белков Бенс-Джонса и парапротеинов больных Кли (2, 3), Еро (4, 5), Ков (6, 7). А405 – оптическая плотность при длине волны 405 нм.
Достоверность отличий в сравнении с контролем: *p < 0,05; ** p < 0,01. Серыми столбиками обозначены цельные молекулы IgG, белыми – их фрагменты.
156
1
2
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
А. М. ПЕТРОСЯН, А. В. БРИТАН
Рис. 6. Диск-электрофорез в 7,5 %-м полиакриламидном геле проб IgG из сыворотки крови больных
множественной миеломой – Дор (1), Род (2), Кри (3), здоровых людей (5), Fab-(4) и Fс- (10) фрагментов
IgG здоровых людей, а также белков Бенс-Джонса из мочи больных множественной миеломой – Ден
(6), Ива (7), Ели (8) и Чер (9).
есть присоединение углеводных остатков существенно влияет на заряд белковой молекулы.
Многочисленные дискуссии о биологической роли углеводных компонентов для
иммуноглобулинов продолжаются и поныне.
Известно, что белки, не прошедшие этап гликозилирования или прошедшие его частично,
проявляют особенно высокую чувствительность к протеолизу, в то время как иммуно­
глобулины, обладающие всеми компонентами
олигосахаридной цепи, относительно резистентны к протеолитическим ферментам [26].
Отсутствие углеводов в Fc-фрагменте ведет к
снижению скорости активации С1-компонента и последующему нарушению всей системы
комплемента [27].
Результаты наших экспериментов показывают, что процессы гликозилирования иммуноглобулинов при патологических процессах,
в частности при ММ, нарушены, что приводит к дефициту углеводов в полисахаридных
детерминантах легких цепей.
Согласно литературным данным, гликозилирование легких цепей IgG может влиять
на связывание антигена [28]. Признание этого факта, в свою очередь, позволяет предположить, что при патологических процессах
нарушение секреции иммуноглобулинов соISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
провождается не просто аномальным гликозилированием, но и существенно сказывается
на антигенсвязывающей способности антител.
Модель взаимодействия лектинов с иммуно­
глобулинами в ЛФА позволяет более детально
представить механизмы взаимодействия иммуноглобулинов с эндогенными лектинами [29],
в частности с маннозосвязывающим белком
(MBP), играющим, как известно, ключевую
роль в лектинопосредованном механизме активации системы комплемента [30].
лектиноферментний аналіз як
метод оцінки глікозилювання
імуноглобулінів
А. М. Петросян, А. В. Британ
Кримський державний медичний університет
ім. С. І. Георгієвського, Сімферополь, Україна;
е-mail: gtrk@pop.cris.net
Розглянуто механізм взаємодії лектинів з
молекулами IgG, визначеного методом лектиноферментного аналізу, який дозволяє реєструвати на прикладі лектину гороху (Pisum sativum)
залишки маннози в молекулах IgG за норми
та при патології. Для виявлення достовірної
різниці у ступені глікозилювання контроль157
методи
них та патологічних IgG найбільш оптимальною є вихідна концентрація імуноглобуліну
1 мкг/мл. Виявлено, що внесення в iмуноферментний планшет a-D-маннози між етапами
інкубації імуноглобуліну та лектину інгібує
взаємодію молекул IgG з лектинами. Попередня інкубація лектинів з імуноглобулінами стабілізує активність пероксидази, кон’югованої з
лектинами. Лектиноферментний аналіз з використанням Fab- и Fc-фрагментів IgG показав, що лектин гороху більш споріднений до
антигензв’язувального фрагмента. Ці результати та аналіз глікозилювання парапротеїнів та
білків Бенс-Джонса хворих на множинну мієлому дозволяють визначити механізм взаємодії
лектинів з імуноглобулінами.
К л ю ч о в і с л о в а: лектин, імуноглобулін G, глікозилювання, множинна мієлома.
lectin-enzyme assay
as a method of estimation
of immunoglobulins’
glycosylation
A. M. Petrosyan, A. V. Britan
Crimean State Medical University,
Simferopol, Ukraine;
е-mail: gtrk@pop.cris.net
Summary
The mechanism of interaction of lectins with
IgG molecules by the method of the lectin-enzyme
assay has been described that allows to register a
degree of human serum IgG molecules’ glycosylation (mannosylation in case of lectin of Pisum
sativum) in norm and at pathology. To detect an
authentic difference in a glycosylation degree between control and pathological IgG, the wells of
an ELISA plate were coated with an antibody in
concentration of 1 mg/ml. Introducing a-D-mannose between the stages of incubation of immunoglobulin and lectin showed, that a-D-mannose
inhibits the affinity of lectins for IgG. The preliminary incubation of lectin with IgG molecules
stabilizes the activity of horseradish peroxidase,
which labeled the lectins. Lectin-enzyme assay, in
which Fab and Fc fragments of IgG were used,
showed that lectin of Pisum sativum possesses a
higher affinity for Fab regions. These findings
and the glycosylation analysis of paraproteins and
Bence-Jones proteins of multiple myeloma patients
help to understand the details of interaction of
immunoglobulins and lectins.
K e y w o r d s: lectin, immunoglobulin G,
glycosylation, multiple myeloma.
158
1. Delves P., Roitt I. // N. Engl. J. Med. – 2000. –
343, N 6. – P. 37–49.
2. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б.,
Гаврилова Е. М. Теория и практика
иммуноферментного анализа. – М.: Высшая
школа, 1991. – 288 с.
3. Фаллер Д., Шилдс Д. Молекулярная био­
логия клетки. – М.: Бином, 2003. – 268 с.
4. Хьюз Р. Гликопротеины. – М.: Мир, 1985. –
144 с.
5. Kobata A. // Glycobiology. – 1990. – 1, N 1. –
P. 5–8.
6. Youings A., Chang S., Dwek R., Scragg I. //
Biochem. J. – 1996. – 314. – P. 621–630.
7. Endo T., Wright A., Morrison S., Kobata A.
// Molec. Immunol. – 1995. – 32, N 13. –
P. 931–940.
8. Сыкулев Ю. К., Еронина Т. В. // Успехи
соврем. биол. – 1990. – 110, № 2(5). –
С. 204–218.
9. Dwek R., Lellouch A., Wormald M. // J. Anat. –
1995. – 187. – P. 279–292.
10. Das H., Atsumi T., Fukushima Y. et al. // Clin.
Rheumatol. – 2004. – 23(3). – P. 218–222.
11. Калинин Н. Л., Кулякина М. Н. // Прикладная
биохимия и микробиология. – 1998. –
№ 1. – С. 66–69.
12. Лобсанов Ю. Д., Плетнев В. З., Мокульс­
кий М. А. // Биоорганическая химия. –
1990. – № 12. – С. 1599–1606.
13. Андреева Н. Е., Чернохвостова Е. В. Иммуно­
глобулинопатии. – М.: Медицина, 1985. –
240 с.
14. Иммунологические методы / Под ред.
Г. Фримеля. – М.: Медицина, 1987. – 472 с.
15. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электро­
форез
в
разделении
биологических
макромолекул. – М.: Мир, 1982. – 448 с.
16. Ширяев Н. В., Ширяев В. В., Ефименко А. М.,
Лузин А. В. / Матерiали першої міжнародної
науково-практичної конференції «Науковий
потенціал світу 2004». – Дніпропетровськ,
листопад 2004 р. – Дніпропетровськ: Наука
і освіта, 2004. – 2. – С. 50–51.
17. Кульберг А. Я., Беркун Ю. В. // Молекулярная
иммунология и иммуногенетика. – 1998. –
№ 1. – С. 7–10.
18. Агафонова Н. В., Любимова Н. В., Щер­
бухин В. Д. // Прикладная биохимия и
микро­биология. – 1994. – 30, № 3. –
С. 471–476.
19. Kanan R., Cook D., Dattaa H. // Clin. Chem. –
2000. – N 46. – P. 412–414.
20. Pan T., Li R., Wong B. et al. // J. Clin.
Microbiol. – 2005. – 43, N 3. – P. 1118–
1126.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
А. М. ПЕТРОСЯН, А. В. БРИТАН
21. Dalziel M., McFarlane I., Axford J. // Glycoconj.
J. – 1999. – 16, N 12. – P. 801–807.
22. Zhu D., McCarthy H., Ottensmeier C. et al. //
Blood. – 2002. – 99, N 7. – P. 2562–2568.
23. Kinoshita N., Ohno M., Nishiura T. et al. //
Cancer Res. – 1991. – N 51. – P. 5888–5892.
24. Sox H., Hood L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
– 1970. – 66, N 3. – P. 975–982.
25. Spiegelberg H., Abel C., Fishkin B., Grey H. //
Biochemistry. – 1970. – 9, N 2. – P. 4217–4233.
26. Jefferies R., Lund J., Mizutani H. et al. //
Biochem. J. – 1990. – 268, N 3. – P. 529–537.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 4
27. Koide N., Muramatsu T., Nose M. // Biochem.
Biophys. Res. Communs. – 1977. – 75. –
P. 838–844.
28. Tachibana H., Kido I., Murakami H. // J. Biol.
Chem. – 1994. – 269, N 46. – P. 29061–
29066.
29. Arnold J., Radcliffe C., Wormald M. et al. // J.
Immunol. – 2004. – N 173. – P. 6831–6840.
30. Rother K., Till G., Hänsh G. The Complement
System. Springer, Heidelberg, Germany. –
1998. – P. 564.
Получено 20.03.2006
159