Лабораторная диагностика гепарининдуцированной

Российский научный центр хирургии
имени академика Б.В. Петровского РАМН, Москва
ЛАБОРАТОРНАЯ
ДИАГНОСТИКА
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННОЙ
ТРОМБОЦИТОПЕНИИ
МОРОЗОВ Ю.А.
Москва, 27 января 2014
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННАЯ
ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ (ГИТ)
ЛАБОРАТОРНО-КЛИНИЧЕСКИЙ
КОМПЛЕКС
СИМПТОМОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙСЯ В РЕЗКОМ
СНИЖЕНИИ
ЧИСЛА
ТРОМБОЦИТОВ
НА
ВВЕДЕНИЕ ГЕПАРИНА И ВОССТАНОВЛЕНИИ
ИХ КОЛИЧЕСТВА ПОСЛЕ ОТМЕНЫ ГЕПАРИНА.
КЛАССИФИКАЦИЯ
ГИТ I ТИПА
Механизм неимунный
Через 1-2 дня после начала
гепаринотерапии
Снижение тромбоцитов на 1020% от исходных значений
Отмены гепарина не требуется
Встречается до 10% у всех
пациентов,
получающих
гепарин
ГИТ II ТИПА
Механизм иммунный
Через 5-15 дней после начала
гепаринотерапии
Снижение тромбоцитов на
50% и более от исходных
значений
Немедленная
отмена
гепарина,
переход
на
альтернативные средства
3-5% больных, леченных НФГ
Множественные тромбозы:
Эндотелиальная активация при:
ДВС-синдроме, альтернативной
активации тромбоцитов IgG, приеме
лекарств
Тромбозы: 0,2-1%
Внутривенозные катетеры
Обездвиженность
Тромбоцитопения: 1-3%
Доза гепарина
Плотность Fc-рецепторов, генотип
Воспаление
Используемые критерии ГИТ
Образование антител: 3-60%
Тип гепарина, его сульфатирование
Дооперационный уровень ТФ4
Неиммуная активация тромбоцитов
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ГИТ
1
ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ,
ГЕПАРИНОТЕРАПИЯ,
КОТОРОЙ
СО
ПРЕДШЕСТВОВАЛА
СНИЖЕНИЕМ
КОЛИЧЕСТВА
ТРОМБОЦИТОВ НИЖЕ 150×109/л ИЛИ БОЛЕЕ ЧЕМ НА 30%
ОТ ИСХОДНЫХ ЗНАЧЕНИЙ
2
3
ГЕПАРИНОТЕРАПИЯ, ПРОВОДИМАЯ ПО КРАЙНЕЙ МЕРЕ
ЗА 5 ДНЕЙ ДО РАЗВИТИЯ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ
ИСКЛЮЧЕНИЕ ДРУГИХ ПРИЧИН ТРОМБОЦИТОПЕНИЙ
ТЕСТЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГИТ
1. ИММУННЫЕ – определение антител к комплексу гепарину
 иммунотурбидиметрический
 хемилюминисцентный
 ELISA
 полуколичественные тест-полоски
2. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ – гепарин-индуцированная агрегация
тромбоцитов
 тест высвобождения серотонина
 гепарин-индуцированная агрегация тромбоцитов
 тесты высвобождения содержимого тромбоцитарных
гранул
3. ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ – возможность «ответа тромбоцитов» на
последующее введение гепарина
 иммуноглобулиновый коэффициент
ТЕСТ ВЫДЕЛЕНИЯ 14С-СЕРОТОНИНА
Используются донорские FcγRIIa-рецепторы тромбоцитов, меченные
радиоактивным (14С)-серотонином, для выявления активации кровяных
пластинок при инкубации с гепаринизированной сывороткой пациента
Требует не менее 6 часов инкубации и длительного (в течение ночи)
подсчета радиоактивности
Считается «золотым стандартом» в диагностики ГИТ II
СРАВНЕНИЕ ТЕСТА ВЫСВОБОЖДЕНИЯ 14С-СЕРОТОНИНА И
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ДИАГНОСТИКИ ГИТ II
Тест высвобождения
серотонина
ИФА
Интерпретация
++
-++
--
++
--++
ГИТ II определенный
ГИТ II исключен
ГИТ II вероятен
ГИТ II маловероятен
ИФА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОТОНИНА
Тест ИФА-серотонин для количественного определения высвобождения
серотонина из тромбоцитов является эффективным нерадиоактивным
методом для диагностики ГИТ и оценки in vitro перекрестных реакций на
низкомолекулярные гепарины и гепариноиды.
Пациенты с ГИТ II
Чувствительность
Специфичность
Тест высвобождения
14С-серотонина
100,0
ИФА высвобождения
серотонина
100
92,9
97,4
Нормальные значения – 38 нг/мл
Пациенты с ГИТ II
Гепарин 0,1 МЕ/мл – 2548 нг/мл
Гепарин 100 МЕ/мл – 29 нг/мл
Низкомолекулярные гепарины - 2100 нг/мл
Данапароид – 272 нг/мл
ELISA-ТЕСТЫ




ELISA-тест на твердой фазе с анти-ГТФ4-антителами
ELISA-тест с антигенами к ТФ4-полисульфонату
Иммуноферментный тест в жидкой фазе
Тест с использованием частиц геля
Проводят измерение оптической плотности
и значения выше 0,41 рассматриваются
как наличие антител к гепарину и
вероятность развития ГИТ II
Требуют длительного времени до получения результатов
(от 2,5 до 12 часов в зависимости от используемого теста)
HemosIL HIT (PF4-H)
HemosIL HIT-Ab (PF4-H)
 иммунотурбидиметрия
 жидкий, готов к использованию
 результат за минуты
HemosIL AcuStar HITIgG (PF4-H)
HemosIL AcuStar HITAb(PF4-H)
 Хемилюминисценция
 Картриджи
 Дифференциация по изотипам
FcγRIIa-РЕЦЕПТОР
∨
Находится на моноцитах, гранулоцитах,
эозинофилах, макрофагах, В-лимфоцитах
∨
Осуществляет связь с IgG
∨
Описаны подтипы RI (CD64), RII (CD32), RIII (CD16)
∨
RI (CD64) – обладает высоким аффинитетом к IgG,
играет роль в раннем иммунном ответе
RII (CD32) низкая аффинность к IgG,
RIII (CD16) играет роль в позднем иммунном ответе
HemosIL HIT (PF4-H)
Суть
метода
Время
Рабочий
диапазон
Стабильность
0 – 5.7 (16)
2 мес. (28°C)
Все АТ
HIT-Ab(PF4-H)
(IgG,
IgM,
IgA)
AcuStar HITAb(PF4-H)
Все АТ
AcuStar HITIgG(PF4-H)
IgG
13 мин
порог 1 Ед/мл
15 дней
(2ч/день)
0.2 – 128
порог 1 Ед/мл
30 мин
12 нед.
0.13 – 128
порог 1 Ед/мл
1-4
образцов в
неделю
1 образец
каждые 2
недели
HemosIL HIT (PF4-H): СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ
HemosIL HIT (PF4-H): ИНТЕРПРЕТАЦИЯ
РЕЗУЛЬТАТОВ
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИММУННЫХ ТЕСТОВ
ДОЛЖНА СТРОИТЬСЯ ТОЛЬКО СОВМЕСТНО
С ОЦЕНКОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ВЕРОЯТНОСТИ
РАЗВИТИЯ ГИТ (шкала 4Т)
Пороговое значение IgG-антител – 1,0 Е/мл
Менее 1,0 Е/мл
– вероятность ГИТ II низкая, может быть продолжена гепаринотерапия,
– провести функциональные теста для исключения гиперагрегации
тромбоцитов на гепарин
Более 1,0 Е/мл
– вероятность ГИТ II высокая, изменение антикоагулянтной терапии
HemosIL HIT (PF4-H)
ИММУНОТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
 HemosIL HIT-Ab(PF4-H)
 Для большинства лабораторий для исключения
диагноза ГИТ
ХЕМИЛЮМИНИСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
 HemosIL AcuStar панель тестов ГИТ
 Для специализированных центров
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ
Тест
Диагностические
значения
D-димер
500 нг/мл FEU
aCL IgG
20 Е/мл
aCL IgM
20 Е/мл
aB2GPI IgG
20 Е/мл
aB2GPI IgM
20 Е/мл
ГИТ общий
1 Е/мл
ГИТ IgG
1 Е/мл
ТЕСТЫ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
(ELISA)
 Высокая чувствительность, но
низкая
специфичность
в
диагностике ГИТ
 Не все антитела играют роль в
развитии
ГИТ
и
активации
тромбоцитов
 Высокая оптическая плотность
более важна в диагнозе, чем
низкая
 Длительность в выполнении
 Широко не распространен
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ
(ГЕПАРИН-ИНДУЦИРОВАННАЯ
АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ)
 Более специфичен, чем ELISA
 Могут выполняться в любой
лаборатории
 Не требуют значительного времени
ТЕСТЫ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
ТЕСТ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ АННЕКСИНА V
Донорские отмытые тромбоциты инкубируют
с сывороткой пациента + 0,2 МЕ/мл гепарина, 45 мин
Центрифугирование
Осадок ресуспендируют в HEPES-буфере, содержащим фикоэритрин-конъюгант антиCD42а-антитела и аннексин-V-флюоресцин-изотиоцианат, инкубация 15 мин
Проточная цитофлоуметрия с определением выделившегося аннексина V
Здоровые доноры – 36,5 флюоресцентной интенсивности (ФИ)
Анти-ТФ4/гепарин-IgM/IgA-индукция – 60,45 ФИ
Анти-ТФ4/гепарин-IgG-индукция – 221,65 ФИ
Тромбоцитопения с отрицательными антителами к гепарину – 35,5 ФИ
Пациенты с тромбозами и отрицательными тестами на ГИТ – 34,55 ФИ
ТЕСТЫ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
ТЕСТ ГЕНЕРАЦИИ МИКРОЧАСТИЦ
Инкубация сыворотки пациента с отмытыми тромбоцитами
и гепарином 0,2 МЕ/мл, 45 мин
Суспензия тромбоцитов + анти-CD42a мышиные моноклональные антитела,
инкубация 30 мин
Центрифугирование
Ресуспендирование, + FITC-конъюгант против мышиных антител, инкубирование
Центрифугирование, отмывка, ресуспендирование
Проточная цитофлоуметрия
Здоровые доноры – 20,8%
Анти-ТФ4/гепарин-IgM/IgA-индукция – 22,0%
Анти-ТФ4/гепарин-IgG-индукция – 68,9%
Тромбоцитопения с отрицательными антителами к гепарину – 17,2%
Пациенты с тромбозами и отрицательными тестами на ГИТ – 22,5%
ТЕСТЫ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
АКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ ПРОТОЧНОЙ ФЛОУМЕТРИИ
Используется специальный прибор – проточный флоуметр
Активация – гепарин 0,3 МЕ/мл и 200 МЕ/мл
Результат
Позитивный
Критерий
 Активация тромбоцитов свыше 11% при низких дозах
гепарина
 Отношение активации тромбоцитов 0,3/200 свыше 1,5
Отрицательный
Активация тромбоцитов менее 11% на высокую и низкую
дозы гепарина
Промежуточный
Несоответствие другим критериям
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННАЯ
ТРОМБОЦИТОВ
АГРЕГАЦИЯ
НФГ имеет два активных
центра:
 для
связывания
с
антитромбином III
 для
связывания
с
тромбоцитами
через
рецептор GPIIa/IIIb
НМГ имеют один активный
центр:
 для связывания только с
антитромбином III
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННАЯ
ТРОМБОЦИТОВ
АГРЕГАЦИЯ
ВЛИЯНИЕ ГЕПАРИНА НА АГРЕГАЦИЮ
ТРОМБОЦИТОВ НЕОДНОЗНАЧНО:
Проагрегантный эффект
проявляется только при введении больших
доз гепарина
усиливается
АДФ,
коллагеном,
адреналином (но не тромбином!)
Антиагрегантный эффект
за счет инактивации тромбина
спонтанная агрегация, %
СПОНТАННАЯ АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ
В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГЕПАРИН-500 И ГЕПАРИН-5 У
ЛЕЧЕННЫХ И НЕЛЕЧЕННЫХ ГЕПАРИНОМ
10
8
6
4
2
0
Г500>10%; Г5<10%
Г500<10%; Г5>10%
Нелеченные гепарином
Г500>10%; Г5>10%
Г500<10%; Г5<10%
Леченные гепарином
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННАЯ
ТРОМБОЦИТОВ
АГРЕГАЦИЯ
КОРРЕЛЯЦИОННЫЕ ВЗАИМОСВЯЗИ РАЗЛИЧНЫХ
ТИПОВ ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННОЙ АГРЕГАЦИИ
ТРОМБОЦИТОВ
Количество
тромбоцитов
Количество
тромбоцитов
Спонтанная
агрегация
Гепарин
500 МЕ
Гепарин
5 МЕ
Гепарин
5/500 МЕ
-0,64
-0,60
-0,76
-0,74
0,88
0,71
0,35
Спонтанная
агрегация
- 0,64
Гепарин
500 МЕ
-0,60
0,88
Гепарин
5 МЕ
-0,76
0,71
Гепарин
5/500 МЕ
-0,74
0,35
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННАЯ
ТРОМБОЦИТОВ
АГРЕГАЦИЯ
Тип агрегации
Гиперагрегация Нормоагрегация
Спонтанная
37,7
62,3
АДФ-индуцированная
22,0
35,8
Гепарин 500 МЕ
24,6
75,4
Гепарин 5 МЕ
37,0
63,0
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННАЯ АГРЕГАЦИЯ
ТРОМБОЦИТОВ позволяет выявлять гиперагрегационный
тромбоцитарный синдром в ответ на гепаринотерапию, то
есть используется для диагностики ГИТ I типа
Гепарин 500 МЕ > 10%, Гепарин 5 МЕ < 10%
ТРОМБОЦИТАРНЫЕ НАРУШЕНИЯ МОГУТ РАЗВИТЬСЯ ТОЛЬКО НА
ВВЕДЕНИЕ БОЛЬШИХ ДОЗ ГЕПАРИНА.
КЛИНИЧЕСКИЙ ОТВЕТ БУДЕТ ПРОЯВЛЯТЬСЯ В РАННЕМ
ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ В ВИДЕ СНИЖЕНИЯ, НО НЕ
КРИТИЧЕСКОГО,
КОЛИЧЕСТВА
ТРОМБОЦИТОВ
С
ИХ
ГИПЕРАГРЕГАЦИЕЙ И ПОВЫШЕННОЙ КРОВОПОТЕРИ НА 1
СУТКИ.
До операции
Коэффициент Ig
1 сутки после операции
1,8
Кол-во тромбоцитов, тыс/мкл
280,5
138,7
АДФ-агрегация, %
41,3
75,4
Гепарин-200, %
14,8
Гепарин-0,3, %
4,3
На 1 сутки после операции кровопотеря составила 540 мл
(7,2 мл/кг массы тела)
Гепарин 500 МЕ < 10%, Гепарин 5 МЕ> 10%
НАРУШЕНИЯ
ТРОМБОЦИТАРНОГО
ЗВЕНА
МОГУТ
РЕАЛИЗОВЫВАТЬСЯ
ПРИ
ПЕРЕВОДЕ
ПАЦИЕНТА
НА
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ
ИЛИ
ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ
ДОЗЫ
ГЕПАРИНА, ТО ЕСТЬ НА 2-4 ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫЕ СУТКИ.
МОЖЕТ
СОПРОВОЖДАТЬСЯ
РАЗВИТИЕМ
РАССТРОЙСТВ
МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ, ОРГАННОЙ/ПОЛИОРГАННОЙ ДИСФУНКЦИИ
СО ЗНАЧИТЕЛЬНЫМ СНИЖЕНИЕМ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ
ПРИ НОРМАЛЬНОЙ/СНИЖЕННОЙ ИХ ФУНКЦИИ.
До операции
Коэффициент Ig
1 сутки после операции
3,1
Кол-во тромбоцитов, тыс/мкл
301,4
105,6
АДФ-агрегация, %
48,5
35,4
Гепарин-200, %
4,6
Гепарин-0,3, %
13,8
В послеоперационном периоде – нарушение функции почек
(СКФ = 59,1 мл/мин)
Коэффициент IgG/(IgA+IgM)
Дементьева И.И. и соавт. Способ прогнозирования развития
гепарининдуцированной тромбоцитопении у кардиохирургических
больных. Патент РФ №2269781, 2006
3
Коэффициент IgG/(IgA+IgM)
(норма < 3,0)
Дементьева И.И. и соавт. Способ прогнозирования развития
гепарининдуцированной тромбоцитопении у кардиохирургических
больных. Патент РФ №2269781, 2006
100
% больных
80
60
40
20
0
спонтанная
Г500>10%
агрегация >5%
коэффициент<3
Г5>10%
коэффициент>3
Г500>10%,
Г5>10%
Введение гепарина
Развитие тромбоцитопении
Тестирование по школе 4Т
Определение антител
Функциональные тесты
Принятие решения об изменении
терапии
ГЕПАРИНИНДУЦИРОВАННАЯ
ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ
БЛАГОДАРЮ
ЗА ВНИМАНИЕ