Фенотипические особенности лейкоцитарных клеток больных
реклама
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Решетников Игорь Владимирович ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор В.Э. Цейликман Челябинск – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................ 4 ГЛАВА 1. Взаимодействие ВИЧ с иммунной системой человека (обзор литературы) ................................................................................................................ 12 1.1. Характеристика ВИЧ ................................................................................. 12 1.2. Патогенез ВИЧ-инфекции ......................................................................... 14 1.3. Взаимодействие ВИЧ с клетками иммунной системой........................... 19 1.4. Высокоактивная антиретровирусная терапия .......................................... 32 1.5. Российская классификация ВИЧ-инфекции ............................................ 35 1.6. Проточная цитометрия при исследовании иммунного статуса ВИЧинфицированных лиц ................................................................................................. 37 1.7. Использование системы CytoDiff в оценке иммунного статуса ВИЧинфицированных лиц ................................................................................................. 40 1.8. Определение вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ................................. 42 ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .............................................. 47 2.1. Иммунологические методы .................................................................. 47 2.2. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ............ 51 2.3. Статистические методы анализа ............................................................... 53 ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение .............................................................. 54 3.1. Сравнительный анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров ................ 54 3 3.2. Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧинфицированных лиц с учетом стадии заболевания ................................................ 63 3.3. Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧинфицированных лиц с учетом уровня вирусной нагрузки .................................... 67 3.4. Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧинфицированных лиц с учетом уровня Т-хелперов ................................................. 76 3.5. Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧинфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом проводимой ВААРТ 87 3.6. Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧинфицированных лиц с учетом сопутствующих патологий в виде хронического вирусного гепатита с и внутривенного употребления опиоидных наркотиков ..... 94 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................. 101 ВЫВОДЫ ....................................................................................................... 107 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ......................................................... 108 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ПРИНЯТЫХ В ДИССЕРТАЦИИ ................... 109 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 111 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы ВИЧ-инфекция - это медленно прогрессирующее инфекционное заболевание, последняя стадия которого известна как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Первые случаи СПИДа были зарегистрированы в 1981 году в США, а в настоящее время число ВИЧ-инфицированных превышает 35 миллионов человек по всему миру [8]. Пандемия ВИЧ-инфекции далеко вышла за рамки проблемы одной страны, одной специальности, одной медицины. Ежедневно в России диагностируется около 200 новых случаев заражения ВИЧ. За первые 10 месяцев 2012 г. было зарегистрировано более 62 тысяч новых случаев ВИЧ у российских граждан (на 12,5% больше показателей 2010 г.). По данным Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИДом, на 15 сентября 2012 г. число граждан Российской Федерации, инфицированных ВИЧ, составило 682726 человек. Пораженность ВИЧ-инфекцией населения Российской Федерации (число людей с ВИЧ на 100 тысяч населения) составляет 476,1. Ведущим путем передачи ВИЧ-инфекции продолжает оставаться парентеральное употребление наркотиков (в среднем 56,2% по Российской Федерации). Половой гетеросексуальный путь передачи составляет 41,4%. В то же время женщинам ВИЧ передается половым путем намного чаще (в 61% случаев) чем мужчинам [95]. Среди ВИЧ-инфицированных граждан Российской Федерации по-прежнему преобладают мужчины (64%). Эпидемия ВИЧ-инфекции продолжает распространяться на фоне эпидемии наркомании и развития индустрии сексуальных услуг [15]. Растет число пациентов, находящихся на поздних стадиях ВИЧ-инфекции и нуждающихся в антиретровирусной терапии. С введением в схемы антиретровирусной терапии в 1995 г. ингибиторов протеазы и ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы началась эпоха высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ). Терапия позволила улучшить качество и продолжительность жизни 5 ВИЧ-инфицированных людей, снизить смертность и число осложнений, включая оппортунистические инфекции и злокачественные новообразования. К сожалению, несмотря на все успехи антиретровирусной терапии, полная элиминация вируса у ВИЧ-инфицированных по-прежнему остается невозможной [149]. В связи с внедрением ВААРТ появились новые проблемы — ранняя и отдаленная токсичность препаратов и устойчивостью вируса как у отдельных больных, так и в целом [40, 61, 90]. Дальнейшее распространение ВИЧ-инфекции во многом зависит от того, появится ли в ближайшем будущем эффективная вакцина для профилактики этой инфекции. Главное условие, без которого невозможно ни упрочить завоеванных позиций в лечении и профилактике ВИЧ-инфекции, ни достичь новых — будь то иммунотерапия или разработка вакцин, — это понимание иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции. Не вызывает сомнений, что течение ВИЧ-инфекции зависит от свойств как возбудителя, так и макроорганизма. Течение ВИЧ-инфекции отличается крайним непостоянством — у одних людей инфекция прогрессирует быстро, у других медленно [112]. У примерно 5% ВИЧ-инфицированных людей число Т-хелперов не снижается и СПИД не развивается в течение 7 и более лет — в таких случаях говорят о длительном непрогрессирующем течении инфекции. Иногда это связано с дефектными вирусами с ослабленной способностью к репликации [102]. Однако у большинства ВИЧ-инфицированных вирус активно реплицируется, а различия в скорости прогрессирования иммунодефицита объясняются особенностями макроорганизма. На скорость развития иммунодефицита могут влиять различные факторы: исходное количество Т-хелперов, уровень вирусной нагрузки, получение ВААРТ, сопутствующие патологии. Научные данные по этим факторам немногочисленны и порой противоречивы. Необходимы дальнейшие исследования в этой области. Хорошо известно, что основная мишень вируса иммунодефицита человека – лимфоциты CD4+. Однако нельзя забывать, что в патогенез ВИЧ-инфекции вовлечены не только Т-хелперы, но и другие клетки иммунной системы. При 6 ВИЧ-инфекции качественным и количественным изменениям подвергаются практически все популяции лейкоцитов. Исследования по данной теме проводятся довольно редко. Динамика изменения всего субпопуляционного состава лейкоцитов (как зрелых клеток, так и предшественников) представляет собой значительную ценность для построения целостной картины иммунопатогенеза ВИЧ. Цель и задачи исследования Целью настоящего исследования явилось изучение влияния тяжести ВИЧинфекции, антиретровирусной субпопопуляционный состав терапии и лейкоцитов сопутствующих патологий периферической крови на ВИЧ- инфицированных лиц. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи: 1. Выполнить сравнительный анализ показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров. 2. Выявить особенности иммунного статуса ВИЧ-инфицированных лиц с учетом стадии заболевания согласно классификации Покровского. 3. Оценить зависимость между увеличением вирусной нагрузки и изменением субпопуляционного состава лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц. 4. Выявить субпопуляции лейкоцитов, концентрации которых меняются на фоне проведения высокоактивной антиретровирусной терапии. 5. Оценить влияние сопутствующих патологий в виде хронического вирусного гепатита C и внутривенного употребления опиоидных наркотиков на иммунный статус ВИЧ-инфицированных лиц. Методология и методы исследования В настоящей работе проводилось количественное определение различных субпопуляций лейкоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных лиц. 7 Пациенты с ВИЧ-инфекцией были разделены на группы в зависимости от стадии и тяжести заболевания, получаемой ВААРТ и сопутствующих патологий. В состав контрольной группы вошли условно здоровые лица. Определение относительных и абсолютных количеств лейкоцитов осуществлялось методом проточной цитометрии. Также проводилось измерение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови ВИЧ-инфицированных пациентов методом полимеразной цепной реакции. Степень достоверности, апробация результатов, личный вклад автора В первичной документации представлены выписки из историй болезни, протоколы лабораторных исследований, журналы регистрации результатов лабораторных исследований, результаты статистической обработки. Оценка достоверности результатов исследования выявила, что результаты получены на сертифицированном оборудовании, включающем проточный цитометр «Cytomics FC 500» компании Beckman Coulter и автоматизированную систему для анализа нуклеиновых кислот «m2000rt» компании Abbott Laboratories. Полученные результаты не противоречат данным, представленным в независимых источниках по данной тематике. В работе использованы современные методики сбора и обработки исходной информации с использованием пакета прикладных компьютерных программ «Statistica for Windows 6.0». Результаты работы доложены и обсуждены на IV Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 7-9 декабря 2011 г.). Личный вклад автора заключается в непосредственном участии во всех этапах научной работы. Автор принимал непосредственное участие в анализе медицинских карт ВИЧ-инфицированных пациентов (200 историй болезни), в пробоподготовке и проведении исследований (включающих микроскопию препаратов крови, работу на гематологическом анализаторе и проточном цитометре), в создании компьютерной базы данных, статистической обработке 8 материала с использованием прикладных программ «Еxcel 2000» компании Microsoft и пакета программ «Statistica for Windows 6.0» компании StatSoft. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, диссертационного определение исследования методологии проводились и общей совместно концепции с научным руководителем Цейликманом В.Э., заведующим кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России», доктором биологических наук, профессором. Получение и интерпретация клинико-анамнестических данных осуществлялись при участии врачей-инфекционистов Миркиной Т. В. и Смирновой Н.В. (инфекционное отделение для лечения больных ВИЧ/СПИДом Клиники ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России»). Лабораторные исследования в области проточной цитометрии проводились при участии заведующей иммунологической лабораторией Клиники ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России» Квятковской С.В. Лабораторные исследования по определению вирусной нагрузки проводились при участии заведующей клиникодиагностической лабораторией ГУЗ «Челябинский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и другими инфекционными заболеваниями» Долговой Н.В. Доля участия автора в накоплении, обобщении и анализе материала составляет более 90%. Положения, выносимые на защиту 1. У ВИЧ-инфицированных лиц с ростом вирусной нагрузки и падением уровня Т-хелперов ассоциируется повышение числа моноцитов CD16+, а также снижение количества зрелых В-лимфоцитов и повышение концентрации незрелых В-клеток в периферической крови. 2. На фоне получения высокоактивной антиретровирусной терапии у ВИЧ-инфицированных лиц наблюдается снижение количества моноцитов CD16+ 9 и незрелых гранулоцитов, а также увеличение числа зрелых В-лимфоцитов с одновременным снижением уровня незрелых В-клеток. 3. Сопутствующие патологии в виде хронического вирусного гепатита С и внутривенного употребления опиоидных наркотиков ассоциированы с более выраженным дефицитом Т-хелперов у ВИЧ-инфицированных лиц. Научная новизна Впервые исследован расширенный субпопуляционный состав лейкоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных лиц с учетом как зрелых, так и незрелых клеток. Впервые было показано повышение количества незрелых Bклеток крови ВИЧ-инфицированных лиц относительно здоровых лиц. По мере прогрессирования заболевания число незрелых В-лимфоцитов растет при одновременном снижении концентрации зрелых клеток. Выявлены корреляционные связи между концентрацией вируса в крови и числом зрелых и незрелых В-лимфоцитов, «воспалительных» моноцитов CD16+. По мере роста вирусной нагрузки падает число зрелых В-клеток, количество ранних В-клеток и «воспалительных» моноцитов повышается. Доказаны дополнительные – помимо снижения вирусной нагрузки и увеличения количества Т-хелперов – позитивные эффекты ВААРТ. Это – повышение концентрации зрелых В-лимфоцитов, снижение количества незрелых гранулоцитов, «воспалительных» моноцитов CD16+ и незрелых В-клеток в крови. Выявлено негативное влияние хронического вирусного гепатита С и внутривенного употребления опиоидных наркотиков и на уровень Т-хелперов у ВИЧ-инфицированных лиц. Литературные данные по этим вопросам немногочисленны и противоречивы. Теоретическая и практическая значимость Результаты исследования содержат данные о влиянии комплекса факторов на субпопуляционный состав лейкоцитов периферической крови ВИЧ- 10 инфицированных лиц. Получены данные в малоизученных отраслях, касающихся иммунопатогенеза ВИЧ. В частности, изменение концентрации ранних и зрелых В-лимфоцитов, «воспалительных» моноцитов CD16+ при ВИЧ-инфекции. Изучено влияние антиретровирусной терапии на различные популяции лейкоцитов ВИЧ-инфицированных лиц. Выявлены популяции клеток, которые могут служить критериями иммунологической эффективности ВААРТ. Полученные данные могут быть использованы в практике инфекционных отделений по лечению больных ВИЧ/СПИДом. Применение системы CytoDiff в дополнение к стандартным методикам определения числа Т-хелперов и уровня вирусной нагрузки позволяет оценить иммунный статус ВИЧ-инфицированных лиц, а также эффективность антиретровирусной терапии. Данная диссертационная работа может послужить основой для дальнейших научных исследований. Крайне интересной представляется работа по изучению механизма влияния вирусной репликации на число моноцитов CD16+ и ранних В-клеток. Перспективным представляется исследование по выявлению самых ранних маркеров иммунологической эффективности ВААРТ, среди которых могут оказаться «воспалительные» моноциты CD16+. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в практику инфекционного отделения для лечения больных ВИЧ/СПИДом Клиники ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России» с 5 сентября 2012 г. Протокол CytoDiff позволяет врачу-клиницисту оценить степень иммунологических нарушений у ВИЧ-инфицированных пациентов. Уровень моноцитов CD16+ в дополнении к стандартным показателям (число лимфоцитов CD4+) используется в качестве критерия иммунологической эффективности антиретровирусной терапии. Результаты диссертационной работы внедрены в педагогическую практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической 11 лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России» с «11» сентября 2014 г. (Протокол № 3 от 11.09.2014 г.). Конкурсная поддержка исследования Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках базовой части государственного задания (код проекта -1696). Публикации По теме диссертации опубликовано 9 научных работ общим объемом 1,02 печатных листа, в том числе 4 статьи в изданиях, включенных в перечень российских рецензируемых научных журналов, рекомендованных Высшей Аттестационной Комиссией для публикаций основных научных результатов диссертаций, а также 2 работы в зарубежных научных изданиях. 3 работы опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов; имеется 4 публикации в электронных научных изданиях. 6 публикаций размещены в научных изданиях, представленных в базе данных «Российского индекса научного цитирования», 1 статья опубликована в журнале, представленном в базе данных «Scopus». 12 ГЛАВА 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИЧ С ИММУННОЙ СИСТЕМОЙ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Характеристика ВИЧ Возбудители ВИЧ-инфекции – лентивирусы ВИЧ-1 и ВИЧ-2 относятся к подсемейству Lentivirinae большого семейства ретровирусов. Для человека патогенны еще два ретровируса, Т-лимфотропные вирусы человека типов 1 и 2, но они обладают трансформирующим действием на клетки, а не цитопатическим, как лентивирусы. Другие лентивирусы патогенны для многих видов животных, в том числе овец, лошадей, коз, коров, коек, обезьян. Представители подсемейства Lentivirinae вызывают хронические инфекции с длинным латентным периодом, персистирующей репродукцией вируса и поражением ЦНС. ВИЧ-1 и ВИЧ-2 имеют сходную структуру. В то же время у них есть и отличия — по некоторым дополнительным генам и молекулярной массе белков. Репликация как ВИЧ-1 и 2 происходит в лимфоцитах CD4+. Оба вируса вызывают СПИД, хотя у инфицированных ВИЧ-2 он обычно протекает легче. Во всем мире ВИЧ-инфекцию чаще вызывает ВИЧ-1. Диаметр ВИЧ-1 составляет 100 нм. Снаружи вирус окружен липидной мембраной, в которую встроены 72 гликопротеидных комплекса. Каждый из этих комплексов образован тремя молекулами поверхностного гликопротеида (gp120) и тремя трансмембранного (gp41). Связь между gp120 и gp41 довольно слабая, и поверхностный гликопротеид может спонтанно отсоединяться от вируса. Поэтому gp120 обнаруживается в сыворотке, а также лимфоидной ткани инфицированных [124, 140]. При выходе ВИЧ из клетки ее мембранные белки, в том числе HLA классов I и II, и молекулы адгезии, встраиваются в двойной липидный слой внешней оболочки вируса. Эти белки облегчают адгезию вируса к клеткам-мишеням. Внутри к липопротеидной оболочке прилежит матриксный белок p17. Сердцевину вируса (капсид) составляет капсидный белок p24, который окружает белково- 13 нуклеиновый комплекс: две молекулы вирусной РНК, связанные с протеидом p7 и обратной транскриптазой p66. Вирус содержит все необходимые ферменты для репликации: обратную транскриптазу, интегразу и протеазу. Подобно другим ретровирусам ВИЧ-1 имеет гены структурных белков gag (кодирует капсидные белки, включая p24), pol (кодирует обратную транскриптазу, протеазу и интегразу) и env (кодирует белки внешней оболочки вируса). В то же время геном ВИЧ сложнее, чем геномы остальных ретровирусов (особенно тех, которые патогенны для животных, не относящихся к приматам). Геном ВИЧ-1 в составе своих 9000 пар нуклеотидов содержит еще шесть генов - tat, rev, nef, vif, vpr и vpu, участвующие в регуляции экспрессии других вирусных генов. Установлено, что продукты генов nef, tat и rev синтезируются в ранней фазе репликации ВИЧ. Регуляторные белки Tat и Rev накапливаются в ядре и связываются с определенными участками вирусной РНК. Белки Tat и Rev стимулируют транскрипцию провирусной ДНК в РНК, элонгацию РНК и транспорт РНК из ядра в цитоплазму, а также необходимы для трансляции. Белок Rev обеспечивает также транспорт компонентов вируса из ядра и переключение синтеза регуляторных белков на синтез структурных. Белок Nef выполняет несколько функций. Он снижает экспрессию молекул CD4 и HLA классов I и II на мембране инфицированных клеток, тем самым позволяя вирусу ускользать от атаки цитотоксических T-лимфоцитов CD8 и от распознавания лимфоцитами CD4+ [32, 59]. Белок Nef может также угнетать активацию T-лимфоцитов, связываясь с различными белками - компонентами систем внутриклеточной передачи сигнала [65, 131]. Согласно последним данным, белок Nef индуцирует апоптоз преимущественно неинфицированной популяции Т-хелперов, одновременно поддерживая жизнеспособность продуктивно инфицированных клеток [11, 125]. У небольшого числа взрослых и детей ВИЧ-инфекция не прогрессирует в течение 10 и более лет; уровень вирусной нагрузки в крови таких больных, как правило, низкий. Такое течение ВИЧ-инфекции называют замедленным прогрессированием. Оно обусловлено особенностями как вируса, 14 так и больного. У некоторых из этих больных обнаружен вариант ВИЧ с делецией в гене nef, которая, вероятно, приводит к снижению патогенности вируса [43]. Белок Vpr необходим для репликации вируса в непролиферирующих клетках, в том числе макрофагах. Недавно выяснено, что белок Vpr играет важную роль в переносе провируса в ядро и вызывает задержку пролиферации клетки [120]. Белок Vpu важен для выхода вируса из клетки: мутации гена vpu приводят к накоплению вирусных частиц у внутренней поверхности клеточной мембраны. Этот белок участвует также в разрушении комплексов CD4-gp160 в эндоплазматическом ретикулуме, позволяя тем самым gp160 включаться в формирование новых вирионов [45]. Согласно последним публикациям белок Vif играет важную роль в поддержке репликации вируса [114]. Штаммы, лишенные этого белка, не реплицируются в лимфоцитах CD4+, некоторых линиях Tлимфоцитов («недоступных клетках») и макрофагах. Эти штаммы способны проникать в клетки-мишени и начинать обратную транскрипцию, однако синтез провирусной ДНК остается незавершенным. Основное отличие генома ВИЧ-1 от генома ВИЧ-2 заключается в том, что последний вместо гена vpu несет ген vpx. 1.2. Патогенез ВИЧ-инфекции Главной мишенью вируса иммунодефицита человека является CD4рецептор лимфоцитов. CD4 - это мономерный гликопротеид массой 55 кДа, который выявляется на поверхности примерно 60% T-лимфоцитов, предшественников T-лимфоцитов в костном мозге и тимусе, а также моноцитов, макрофагов, эозинофилов, дендритных клеток и клеток микроглии ЦНС. Внеклеточный участок CD4 на Т-лимфоцитах содержит четыре иммуноглобулиноподобных домена D1-D4 и область V2, играющую важную роль в присоединении gp120 к CD4. Эта область перекрывается с участком связывания молекул HLA класса II, которые являются естественными лигандами CD4. Молекулы CD4 связываются с антигенраспознающими рецепторами T- 15 лимфоцитов и молекулами HLA класса II на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Связывание gp120 с CD4 не только служит ключевым моментом в проникновении вируса в клетку, но и нарушает внутриклеточную передачу сигнала и вызывает апопотоз лимфоцитов CD4+ [39]. В настоящее время известно, что одних только молекул CD4 на поверхности клеток для проникновения ВИЧ недостаточно. Был сделан вывод о существовании дополнительных рецепторов – корецепторов [51]. Также были обнаружены некоторые штаммы ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которые могут проникать в клетки, лишенные молекул CD4. Интересно отметить, что моноклональные антитела к CD4 индуцируют связывание конформационных эпитопов (CD4I) с gp120 этих CD4-независимых штаммов. Это позволило предположить, что CD4независимые штаммы уже несут области, необходимые для распознавания корецепторов, поэтому связывание с CD4 не обязательно для проникновения этих штаммов в клетку. CD4-независимые штаммы легко нейтрализуются сывороткой ВИЧ-инфицированных, следовательно, они являются мишенью иммунного ответ [63]. В 1995 г. были обнаружены факторы лимфоцитов CD8, способные in vitro подавлять репродукцию ВИЧ в аутологичных и аллогенных лимфоцитах CD4+, причем этот эффект не связан с цитотоксичностью [58, 109]. В супернатанатах лимфоцитов CD8, взятых у ВИЧ-инфицированных, были найдены хемокины MIP1α, MIP-1β и RANTES. Хемокины и их рецепторы изначально были описаны как факторы, усиливающие миграцию лейкоцитов и их провоспалительную активность. Естественный лиганд рецептора хемокинов CXCR4 - фактор SDF-1 (от англ. «stromal cell-derived factor» - выделенный из стромальных клеток). Этот фактор предотвращает заражение активированных лимфоцитов CD4+ Tтропными штаммами ВИЧ. Хемокины RANTES (от англ. Regulation-uponActivation, Normal T Expressed and Secreted - молекулы «регуляции при активации», экспрессируемые и секретируемые нормальными T-лимфоцитами) и макрофагальные воспалительные белки MIP-1 и MIP-1 (от англ. macrophage 16 inhibitory protein) являются естественными лигандами рецептора CCR5 и способны предотвращать инфицирование T-лимфоцитов M-тропными штаммами ВИЧ. T-тропные штаммы ВИЧ заражают преимущественно активированные лимфоциты CD4+, используя для входа в клетку рецепторы CXCR4 и CD4. Mтропные штаммы способны заражать лимфоциты CD4+, моноциты и макрофаги, используя для входа в клетку рецепторы CCR5 и CD4 [57]. Сегодня взаимодействие gp120 и клеточных рецепторов стали более понятны. Гликопротеид gp120 сначала связывается с определенными эпитопами CD4. После этого обеспечивают gp120 более претерпевает эффективное конформационные взаимодействие изменения, его петли которые V3 с соответствующим корецептором. Трансмембранный гликопротеид gp41 играет ключевую роль в слиянии внешней оболочки вируса и клеточной мембраны. После связывания gp120 с рецептором CD4, в gp41 происходят конформационные изменения, в результате которых гидрофобный N-концевой фрагмент gp41 внедряется в мембрану клетки-мишени. Были открыты и другие рецепторы хемокинов, которые наряду с CCR5 и CXCR4 служат корецепторами для некоторых штаммов ВИЧ - CCR3, CCR2, CCR8, CCR9, STRL33, Gpr 15, Gpr 1, APJ и ChemR23 [67, 110]. Вероятно, в большей части случаев ВИЧ использует в качестве корецептора CCR5 и CXCR4. Рецептор CXCR4 экспрессируется, главным образом, на девственных T-лимфоцитах, а рецептор CCR5 - на активированных T-лимфоцитах, клетках памяти и эффекторных лимфоцитах. На ранней стадии ВИЧ-инфекции обнаруживаются преимущественно M-тропные штаммы ВИЧ. Интересно отметить, что M-тропные штаммы ВИЧ передаются чаще вне зависимости от того, какие штаммы - T-тропные или нет - преобладают у источника инфекции. Вероятные причины данного феномена: благоприятное влияние местной хемокиновой и цитокиновой среды на репродукцию M-тропных вирусов или избирательный транспорт M-тропных штаммов дендритными клетками подслизистого слоя. Предполагается, что M-тропным штаммам легче 17 ускользнуть от иммунной системы благодаря репродукции в макрофагах, что и дает им преимущество в выживании [53]. После слияния вируса с клеточной мембраной вирусное ядро высвобождается в цитоплазму. ВИЧ проникает как в активированные Tлимфоциты, так и в покоящиеся, однако, в покоящихся клетках синтез вирусной ДНК не завершается [73, 147]. Далее в цитоплазме клетки происходит синтез провирусной ДНК на матрице вирусной РНК с участием вирусного фермента обратной транскриптазы. В результате обратной транскрипции образуется двойная цепь ДНК ВИЧ (провирус). Затем провирусная ДНК проникает в ядро клетки и с помощью вирусного фермента интегразы случайным образом встраивается в геном клетки-хозяина. Провирус может находиться в составе генома клетки-хозяина в латентной или активной форме, в последнем случае происходят транскрипция вирусных генов и репликация вирусов. Центральную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции играет клеточная активация, поскольку с ней тесно связан жизненный цикл ВИЧ [88]. В покоящихся Tлимфоцитах образованная в результате обратной транскрипции провирусная ДНК не встраивается в геном клетки хозяина. Для того, чтобы она встроилась в ДНК клетки, необходима активация клетки и перемещение вирусного преинтеграционного комплекса из цитоплазмы в ядро [56]. Активация иммунной системы происходит после контакта с антигеном, вакцинации или на фоне оппортунистической инфекции. Кроме того, имеются сведения о том, что вирусный гликопротеид gp120 сам способен активировать зараженные клетки, способствуя тем самым встраиванию вирусной ДНК в клеточный геном. Помимо моноцитов, макрофагов и клеток микроглии невстроенная в клеточный геном провирусная ДНК ВИЧ содержится в покоящихся Т-хелперах - долгоживущих клетках, которые являются резервуаром ВИЧ и латентной инфекции [49, 55]. Так как естественное течение ВИЧ инфекции характеризуется постоянной репликацией вируса в активированных Т-хелперах, пребывание вируса в латентном состоянии в покоящихся лимфоцитах CD4+ вероятно является 18 случайным феноменом и не имеет большого значения в патогенезе этой инфекции. Однако этот небольшой резервуар латентного провируса приобретает особое значение с началом ВААРТ: антивирусные препараты не действуют на нереплицирующиеся провирусы, поэтому ВИЧ продолжает персистировать в этих клетках и способен к репродукции и новому циклу инфекции при отмене препаратов. Таким образом, существование этого резервуара латентного вируса не позволяет добиться искоренения вируса у ВИЧ-инфицированных с помощью ВААРТ. Причиной плохой репликации ВИЧ в покоящихся лимфоцитах CD4+ является клеточный белок Murr-1, участвующий в метаболизме меди, способный подавлять репликацию ВИЧ-1 в нестимулированных лимфоцитах CD4+. Ингибирование Murr-1 приводит к репликации ВИЧ в покоящихся лимфоцитах CD4+ [83]. Персистирование ВИЧ в покоящихся лимфоцитах CD4+ и других клетках-резервуарах считается основной причиной, по которой не удается добиться полной элиминации вируса из организма человека. Репликация ВИЧ подвержена ошибкам и характеризуется высокой частотой спонтанных мутаций. При обратной транскрипции происходит в среднем от 1 до 10 ошибок на один цикл репликации. Мутации могут приводить к утрате вирусом способности к репликации или снижению патогенности. С другой стороны, могут накапливаться мутации, благодаря которым вирус приобретает устойчивость к антивирусным препаратам [104]. Под давлением противовирусных средств и при неполном подавлении репликации вируса устойчивые вирусы начинают преобладать. Кроме того, жизненный цикл ВИЧ характеризуется высокой скоростью репликации и, соответственно, огромным оборотом вирусных частиц: в среднем за сутки образуется и разрушается 1 миллиард вирионов. Из-за высокой скорости репликации вируса и большой частоты мутаций у одного и того же больного накапливается множество близких вариантов вируса, называемых квазивидами. В результате естественного отбора преимущество получают те квазивиды, которые в результате мутаций приобрели устойчивость к 19 антиретровирусным препаратам и факторам иммунной защиты, таким, как нейтрализующие антитела и цитотоксические T-лимфоциты CD8. 1.3. Взаимодействие ВИЧ с клетками иммунной системой 1.3.1. Участие антигенпрезентирующих клеток в патогенезе ВИЧ-инфекции В патогенезе ВИЧ-инфекции значительную роль играют антигенпрезентирующие клетки [4, 130]. Макрофаги и дендритные клетки - это основные антигенпрезентирующие клетки иммунной системы. Дендритные клетки служат наиболее важными индукторами специфического иммунного ответа и являются необходимым звеном для запуска первичных антигенспецифических иммунных реакций. Предшественники дендритных клеток мигрируют из костного мозга в периферические лимфоидные органы и подслизистый слой кишечника, мочеполовой и дыхательной систем. Они способны захватывать и процессировать растворимые антигены и мигрировать во вторичные органы иммунной системы, где активируют антиген-специфические Tклетки. Дендритные клетки - это гетерогенная популяция клеток с различными функциональными возможностями и фенотипическими маркерами в зависимости от микроокружения и степени зрелости [119]. Незрелые дендритные клетки могут захватывать и процессировать антигены, но их способность активировать Tлимфоциты довольно слаба. Зрелые дендритные клетки, напротив, обладают в основном иммуностимулирующей активностью. Тканевые дендритные клетки и специализированные клетки кожи и слизистых имеют незрелый фенотип и могут захватывать антиген. После этого они мигрируют в лимфоидную ткань, где приобретают зрелый фенотип [22, 28]. Для стимуляции лимфоцитов CD8 и образования антиген-специфических цитотоксических T-лимфоцитов необходима презентация пептидного антигена в комплексе с HLA класса I. Дендритные клетки могут заражаться вирусами [146]. При этом в цитоплазме клетки синтезируются вирусные белки, которые расщепляются на пептиды и переносятся в цитозоль эндоплазматического ретикулума, где связываются с HLA класса I. 20 Образовавшийся комплекс перемещается на поверхность дендритной клетки. Число комплексов специфический пептидный антиген—HLA класса I обычно ограничено, и поэтому антиген распознается лишь одним клоном T-лимфоцитов из 100 000 и более. Антигенраспознающие рецепторы T-лимфоцитов (TсR) обладают низкой аффинностью к антигену [16]. Высокая плотность дополнительных стимулирующих молекул на поверхности дендритных клеток позволяет усилить взаимодействие антигенраспознающих рецепторов с комплексом пептидный антиген-HLA и тем самым запустить пролиферацию (клональную экспансию) T-лимфоцитов. активировать T-лимфоциты зависит Способность дендритных клеток также от секреции стимулирующих цитокинов, в том числе ИЛ-12 - ключевого цитокина в образовании и активации T-хелперов 1 типа и NK-лимфоцитов. Для стимуляции выраженного антигенспецифического T-клеточного ответа достаточно небольшого числа дендритных клеток и антигена, что говорит о высокой иммуностимулирующей способности дендритных клеток. Экспрессия молекул адгезии и лектинов (в частности DCSIGN) способствует агрегации дендритных клеток и T-лимфоцитов и усиливает взаимодействие с антиген-связывающими рецепторами T-лимфоцитов. Зараженные дендритные клетки мигрируют в лимфоидную ткань, где ВИЧ передается лимфоцитам CD4+ [52, 142]. Численность дендритных клеток периферической крови во время ВИЧинфекции несколько снижается. Последние исследования показывают, что помимо уменьшения количества дендритных клеток падает и их функциональная активность, причем функциональные нарушения сохраняются даже на фоне эффективной антиретровирусной терапии. Изучение того, как ВИЧ-инфекция влияет на созревание дендритных клеток, затруднено их малочисленностью (менее 1% от всех мононуклеаров). Плазмацитоидные дендритные клетки — основные поставщики α-интерферона, и, как следует из отдельных работ, их сохранность при развернутом оппортунистических инфекций [69]. СПИДе уменьшает частоту тяжелых 21 Фолликулярные дендритные клетки, найденные в лимфоидных фолликулах, также захватывают и представляют антигены на своей поверхности. У нелеченных больных эти клетки часто несут на себе отдельные антигены ВИЧ, а также целые вирусные частицы. Функция фолликулярных дендритных клеток состоит в стимуляции B-лимфоцитов. 1.3.2. Взаимодействие ВИЧ с макрофагами и моноцитами Число моноцитов в крови при ВИЧ-инфекции обычно нормальное. Однако, как уже говорилось, моноциты несут корецепторы CD4 и хемокиновые рецепторы и поэтому служат мишенями вируса. Будучи инфицированы вирусом, эти клетки погибают не так быстро, как лимфоциты CD4+. Это объясняется малым количеством корецепторов CD4 на их мембране, что значительно снижает вероятность их инфицирования, и большей продолжительностью жизни этих клеток по сравнению с лимфоцитами [24, 84]. Хотя ВИЧ не оказывает цитолитического действия на моноциты и макрофаги, при заражении этих клеток в них идет активная репликация вируса. Таким образом, зараженные моноциты и макрофаги могут служить резервуаром ВИЧ и способствовать распространению вируса по [116,126]. Выявить зараженные моноциты в крови ВИЧ-инфицированных довольно сложно, однако при аутопсии зараженные макрофаги обнаруживаются в ЦНС (клетки микроглии) и легких (альвеолярные макрофаги). Как уже говорилось, ВИЧ способен заражать костномозговые клетки — предшественники моноцитов. Возможно, заражение этих клеток служит одной из причин гематологических нарушений, наблюдаемых при ВИЧ-инфекции. ВИЧ-инфекция сопровождается нарушением таких функций моноцитов и макрофагов, как хемотаксис, продукция ИЛ-1 и свободных радикалов, представление антигенов и активация T-лимфоцитов, цитотоксичность, связывание иммунных комплексов рецепторами C3 и Fc-фрагментов [37, 82]. Что приводит к этим нарушениям, пока неизвестно, однако вряд ли они непосредственно обусловлены заражением моноцитов и макрофагов ВИЧ. Возможно, что эти нарушения частично 22 обусловлены избыточной активацией моноцитов и макрофагов в результате действия цитокинов или связывания этих клеток с вирусным гликопротеидом gp120 [76, 93]. 1.3.3. «Воспалительные» моноциты при ВИЧ-инфекции В настоящее время хорошо известно о существовании различных популяций моноцитов в крови человека. По экспрессии рецепторов CD14+ и CD16+ выделяют 2 субпопуляции: «классические» моноциты с фенотипом CD14++CD16- и «не классические» («воспалительные») моноциты с фенотипом CD14+CD16++. Некоторые ученые выделяют также «промежуточные» моноциты CD14++CD16+. «Воспалительные» моноциты отличаются большей экспрессией молекул зрелостью. числа МНС II, от супрессорной «классических» активностью и Существует ряд сообщений об увеличении или уменьшении CD14+CD16+ моноцитов при различных заболеваниях. Значительное увеличение циркулирующих моноцитов CD16+ наблюдается при воспалительных патологиях, таких как сепсис, ВИЧ-инфекция, туберкулез и астма [38]. По сравнению с «классическими» моноцитами CD16-, CD16+ моноциты демонстрируют морфологию, более характерную макрофагам, производят более высокие уровни TNF и IL-1, имеют более высокий потенциал презентирования антигена и дифференцируются в дендритные клетки после трансэндотелиальной миграции in vitro [150]. Моноциты CD16+ экспрессируют CX3CR1 и мигрируют в ответ на CX3CL1 (фракталкин), мембраносвязанный хемокин, экспрессирующийся на воспаленных эндотелиальных клетках, в то время как моноциты CD16- экспрессируют CD62L и CCR2 и мигрируют в ответ на CCL2, который опосредует миграцию моноцитов из костного мозга и рекрутирование их в очаг воспаления. Моноциты CD16+ продуцируют IL-6, CCL2 и матриксную металлопротеиназу-9 после взаимодействия с CX3CL1-экспрессирующими эндотелиальными клетками и активируют покоящиеся T-клетки в течение ВИЧинфекции, продуцируя хемокины для CCR3 и CCR4. Эти результаты позволяют предположить, что моноциты CD16+ и CD16- рекрутируются в отличные 23 анатомические участки в норме или при воспалении и играют различные функциональные роли в иммунитете и патогенезе заболевания [34]. Предполагается, что моноциты CD16+ и CD16- происходят от общего миелоидного предшественника, и моноциты CD16+ имеют программу транскрипции, более похожую на таковую у макрофагов и дендритных клеток, что предполагает более позднюю стадию дифференцировки. Отдельные транскрипционные программы, рекрутирование в ткани посредством различных механизмов также дают право предположить, что моноциты CD16+ и CD16- дают начало функционально различным дендритным клеткам и макрофагам in vivo. Научная группа W.K. Kim изучала различные подтипы моноцитов при инфицировании макак вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО – аналог ВИЧ у обезьян). Полученные данные показывают, что острая инфекция сопровождается увеличением «воспалительных» и снижением «классических» моноцитов спустя 2 недели после инфицирования. Подобное увеличение CD16+ моноцитов наблюдалось у животных с хронической инфекцией и виремией. Поскольку животные с хронической инфекцией без виремии имели практически нормальные значения данного подтипа моноцитов, вероятно, что репликация вируса и, как следствие, возрастание вирусной нагрузки - движущие силы для экспансии CD16+ моноцитов [101]. W.K. Kim проанализировал подтипы моноцитов для доказательства ВИОинфекции (уровни ДНК) и вирусной репликации (уровни РНК) у животных с острой инфекцией. Kim с коллегами сообщает, что «промежуточные» моноциты CD14++ CD16+ содержат наивысшие уровни РНК ВИО, и они открыли, что уровни ДНК ВИО были эквивалентны во всех подтипах моноцитов. Это противоречит группе P.J. Ellery, которая открыла, что моноциты CD16+ (не разделенные на «не классические» и «промежуточные») имели значительно более высокие уровни ДНК ВИЧ по сравнению с «классическими» моноцитами CD14++ CD16– [72]. 24 В качестве объяснений более высокой экспрессии ВИО в «промежуточных» моноцитах авторы предполагают, что cерпин B2 (также известный как ингибитор активатора плазминогена-2), который, по их данным, специфично и на высоком уровне экспрессируется в моноцитах CD14++CD16+, может быть вовлечен в поддержание репликации ВИЧ. Другой возможной молекулой, которая могла бы объяснить отличительную экспрессию ВИО в «промежуточных» моноцитах, является APOBEC3G. Человеческие моноциты CD16+ (не разделенные на «неклассические» и «промежуточные» моноциты) содержат две формы APOBEC3B, одну с низкой молекулярной массой, которая ограничивает репликацию ВИЧ, и несколько форм с более высокой молекулярной массой, подобной Т-клеточным линиям, которые являются доступными для репликации ВИЧ. Найдены ли формы с более высокой молекулярной массой исключительно в популяциях CD14++CD16+, что таким образом делает эти клетки более доступными для репликации ВИО и ВИЧ, неизвестно. Имеются данные об инфицировании «промежуточных» моноцитов CD14++CD16+ (и «неклассических» CD14+CD16++) вирусом гепатита С. Это показывает, что «промежуточные» моноциты также могут быть важными при этом вирусном заболевании. J. Rappaport считает, что моноциты CD16+ - первый биомаркер, который коррелирует с вирусной нагрузкой и количеством клеток CD4+, что может сделать этот подтип моноцитов ключевым типом клетки в патогенезе СПИДа[78]. В целом, результаты работ Kim и других ученых демонстрируют, что экспансия моноцитов CD16+ связана с репликацией вируса. Выявлено, что в «промежуточных» моноцитах CD14++CD16+ крови обезьян наблюдается наивысший уровень репликации ВИО. Подобные исследования необходимы среди людей, для подтверждения и расширения этих интереснейших открытий, которые позволяют предположить уникальную моноцитов при лентивирусной инфекции. роль «воспалительных» 25 1.3.4. Взаимодействие ВИЧ с цитотоксическими Т-лимфоцитами Цитотоксические лимфоциты способны подавлять репликацию ВИЧ на ранних стадиях инфекции. Цитотоксические T-лимфоциты (лимфоциты CD8) способны распознавать и элиминировать инфицированные вирусом клетки [117]. Ряд исследований четко показывает, что цитотоксические T-лимфоциты играют ключевую роль в подавлении репликации ВИЧ и существенно влияют на прогрессирование болезни [54, 111]. По сравнению с ВИЧ-инфицированными с быстрым падением непрогрессирующим числа лимфоцитов течением CD4+ болезни в у больных изобилии с длительно обнаруживаются предшественники цитотоксических T-лимфоцитов, специфичные ко многим белкам ВИЧ. Связь более быстрого или медленного прогрессирования инфекции с различными аллелями HLA может объясняться различной способностью этих аллелей к представлению вирусных антигенов, от которой зависит сила иммунного ответа. Появление цитотоксических T-лимфоцитов совпадает не только со спадом виремии в начальной стадии ВИЧ-инфекции, но и с перерывами в антиретровирусной терапии. Однако, до сих пор неясно, почему сильный Tклеточный цитотоксический ответ в большинстве случаев со временем ослабевает. Возможно, дело объясняется появлением «ускользающих» квазивидов: распознанные ранее эпитопы перестают быть иммунодоминантными. Белок Nef может подавлять экспрессию антигенов HLA класса I и тем самым препятствовать распознаванию инфицированных клеток цитотоксическими Tлимфоцитами. На поздних стадиях болезни лимфоциты CD8 не только малочисленны, но еще и хуже функционируют, теряя способность справляться с оппортунистическими возбудителями, в частности с цитомегаловирусом. Но и в начале болезни, пока лимфоцитов CD8 еще достаточно, не вполне понятно, насколько они полноценны, поскольку их фенотип, свидетельствующий о цитолитической активности, часто нарушается. Считать ли это причиной или 26 следствием (а может, и тем, и другим) частых оппортунистических инфекций у больных с развернутым иммунодефицитом, судить трудно [148]. Лимфоциты CD8 также могут заражаться ВИЧ, хотя среди специфичных к ВИЧ T-лимфоцитов CD8 зараженных обнаружено не было [137]. 1.3.5. Взаимодействие ВИЧ с Т-хелперами Главная мишень вируса иммунодефицита человека – Т-хелперы (лимфоциты CD4+). ВИЧ поражает в первую очередь активированные лимфоциты CD4+, а поскольку специфичные к ВИЧ лимфоциты входят в число первых клеток, активируемых в ходе ВИЧ-инфекции, они страдают одними из первых [66]. Поэтому пока не ясно, является потеря ВИЧ-специфичных цитотоксических лимфоцитов следствием их внутреннего дефекта или же вторичным результатом потери специфичных T-хелперов [91]. В зависимости от секретируемых цитокинов лимфоциты CD4+ делят на Tхелперы 1 и 2 типа. T-хелперы 1 типа вырабатывают в основном интерлейкин-2 (ИЛ-2) и интерферон. Эти цитокины поддерживают эффекторные функции иммунной системы (цитотоксических T-лимфоцитов, NK-лимфоцитов, макрофагов). T-хелперы 2 типа вырабатывают преимущественно ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-5 и ИЛ-6. Эти цитокины активируют гуморальный иммунный ответ. Tхелперы 1 типа играют важную роль в образовании цитотоксических Tлимфоцитов, поэтому появление специфичных к ВИЧ T-хелперов 1 типа рассматривают как протективную иммунную реакцию [135]. Прямое цитопатогенное действие ВИЧ на CD4+ лимфоциты проявляется в снижении противоинфекционного иммунитета, уменьшении количества циркулирующих в крови CD4+ клеток, нарушении соотношения CD4+/CD8+ лимфоцитов. Непрямое цитопатогенное действие ВИЧ приводит к угнетению пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов, снижению эндогенной продукции ИЛ-2 и других цитокинов, снижению экспрессии рецептора к ИЛ-2 [25, 48]. Существует целый комплекс дополняющих друг друга иммунопатологических механизмов взаимодействия ВИЧ с клетками CD4+. 27 Последние влияют на функцию СD8+ лимфоцитов и макрофагов, индуцируют продукцию антител В-лимфоцитами. 1-й механизм. При состоявшейся репродукции и массированном выходе (несколько тысяч вирионов в генерации одной клетки) из лимфоцитов ВИЧ интенсивно лизирует CD4+ лимфоциты. Но даже если вирусы спонтанно отпочковываются от CD4+ лимфоцита (без его лизиса), клетка не успевает восстанавливать целостность мембран, молекулы цитоплазмы свободно элиминируют из клетки и CD4+ лимфоцит гибнет. Поскольку CD4+ лимфоциты составляют порядка 60% циркулирующих Т-клеток, быстрая их гибель приводит к глубоким нарушениям иммунной системы инфицированного человека. ВИЧинфекция развивается на фоне острой недостаточности CD4+ лимфоцитов [2]. 2-й механизм. На фоне общей стимуляции метаболизма лимфоцитов после их инфицирования вирусом, приводящей их к «гибели от истощения», происходит интеграция геномов вируса и клетки. Диссеминация инфекции захватывает значительное число CD4+ лимфоцитов, при этом хронические инфекции и ряд других воздействий ведут к дополнительной стимуляции CD4+ популяции. Усиленная пролиферация Т-клеток ведет к активации супрессорных механизмов, увеличению количества CD8+ лимфоцитов и резкой активации их функции. 3-й механизм. Частицы ВИЧ изменяют реактогенные зоны поверхности CD4+ лимфоцитов, что приводит к образованию нежизнеспособных синцитиев. Компоненты вирусной оболочки, синтезируемые в процессе репродукции вируса, резко нарушают цитоплазматическую мембрану клетки-хозяина. В результате элиминации протоплазмы клетки сливаются, образуются нежизнеспособные многоядерные структуры. Исследования подтвердили, что вирус резко изменяет мембраны Т-лимфоцитов и приводит к их слиянию в нежизнеспособные многоядерные клетки. гемагглютинирующего Образование эффекта, синцитиев когда возможно здоровые по типу лимфоциты при соприкосновении с инфицированными в свою оболочку включают поверхностные 28 белки вируса и взаимодействие рецепторных зон приводит к образованию крупных нежизнеспособных конгломератов. 4-й механизм. ВИЧ не разрушает CD4+ лимфоциты, а изменяет и значительно замедляет их пролиферацию, тогда как другие виды Т-клеток продолжают размножаться нормально. Отмечено, что скорость гибели зараженных клеток пропорциональна количеству CD4 корецепторов на их поверхности. Со временем число CD4+ лимфоцитов становиться меньше, хотя некоторая их часть выживает и сохраняет вирус в латентном состоянии в виде провируса. 5-й механизм. ВИЧ маскирует CD4 корецептор. Было показано, что в выживших CD4+ лимфоцитах вирус может маскировать CD4 корецептор на поверхности клеток или предотвращать его появление там. В результате получается, что число потенциально активных CD4+ лимфоцитов еще меньше, чем на самом деле. С исчезновением CD4+ лимфоцитов падает уровень ИЛ-2 и в результате замедляется рост клонов зрелых Т-клеток, индуцируемых этим лимфокином. Из-за ослабления синтеза ИЛ-2 и ИФН падает активность NКклеток и макрофагов, которые в норме стимулируются этими цитокинами. На поверхности инфицированных ВИЧ клеток происходит снижение количества молекул MHC I класса. А поскольку цитотоксические CD8+ лимфоциты могут связывать антиген только в кооперации с молекулами MHC I класса, то этот эффект препятствует узнаванию и разрушению инфицированных вирусом клеток. Таким путем ВИЧ избегает любых воздействий со стороны иммунной системы, то есть создается ситуация «иммунного паралича». ВИЧ превращает CD4+ лимфоциты в главного виновника иммуносупрессии. R.C. Gallo отметил, что ВИЧ вызывает не только уменьшение числа CD4+ клеток и выделение растворимого фактора супрессии оставшимися лимфоцитами, но и делает эти уцелевшие клетки не способными осуществлять первую решающую стадию иммунного ответа узнавание антигена [80]. Это можно объяснить тем, что вирус вызывает повреждение корецепторов CD4 на поверхности CD4+ лимфоцитов. Этот 29 корецептор подобен замку: для того, чтобы начался Т-клеточный ответ в него должен быть вставлен «ключ», которым служит сочетание антигена и белка главного комплекса гистосовместимости. Возможно, также, что вирус кодирует белок, попадающий на поверхность инфицированной клетки и препятствующий нормальной рецепции. 6-й механизм. В инфицированных CD4+ лимфоцитах ВИЧ вызывает секрецию растворимого фактора супрессии. Этот медиатор блокирует иммунные реакции, зависящие от Т-клеток как in vitro, так и in vivo. При этом угнетается образование специфических антител и пролиферация Т-клеток. Предполагают, что геном вируса не кодирует последовательность растворимого фактора супрессии, а только лишь индуцирует в CD4+ лимфоците его синтез. Такой же механизм, возможно, лежит в основе иммуносупрессии при других вирусных инфекциях. 7-й механизм. ВИЧ вызывает такие изменения мембранных рецепторов CD4+ лимфоцитов, что ЦТЛ распознают и уничтожают их как чужеродные клетки. В результате идет непрерывное снижение количества CD4+ лимфоцитов в крови, лимфоузлах, селезенке и других тканях. В то же время количество супрессорных CD8+ лимфоцитов не уменьшается и даже несколько возрастает, что приводит к значительному снижению показателя соотношения CD4+/CD8+ лимфоцитов. 8-й механизм. Проникший в лимфоциты ВИЧ изменяет геном CD4+ лимфоцитов, из-за этого они лишаются способности к трансформации и нормальному ответу на ИЛ-2. Несмотря на то, что выявлено несколько причин уменьшения числа лимфоцитов CD4+ при ВИЧ-инфекции, в настоящее время ведущим фактором, обуславливающим снижение абсолютного числа Т-хелперов, считается их гибель по механизму апоптоза [36, 86]. Многочисленные факторы, вносящие свой вклад в ВИЧ-ассоциированный иммунологическую апоптоз активацию; лимфоцитов, gp включают 120/160-связывание хроническую CD4-рецептора; 30 усиленную продукцию моноцитами, макрофагами, В-клетками и CD8+T-клетками ВИЧ-инфицированных пациентов цитотоксических лигандов, уничтожающих неинфицированные CD4+ T-клетки. Прямое инфицирование вирусом клетокмишеней, приводящее к апоптозу, остается дискуссионным на сегодняшний день. Механизмы апоптоза инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных лимфоцитов CD4+ также остаются до настоящего времени дискуссионными. С одной стороны, логичными выглядят результаты исследований, иллюстрирующих ослабление программы апоптоза в инфицированных ВИЧ-1 CD4+ лимфоцитах и клеточных линиях, что в свою очередь, является необходимым фактором, обеспечивающим создание резервуаров для репликации ВИЧ-1 и предпосылок для усиления репликации вируса [35, 132]. С другой стороны, имеются также многочисленные данные об усилении гибели лимфоцитов CD4, а также различных клеточных линий, инфицированных ВИЧ-1 [81, 96, 123]. Данное противоречие может быть лишь отчасти объяснено различиями в используемых для инфицирования лабораторных штаммах ВИЧ-1 [132]. В то же время, анализ активности различных структурных, регуляторных и вспомогательных белков ВИЧ-1 доказывает правомочность существования двух, противоположных друг другу, точек зрения. Лишь в одном авторы всех проведенных исследований единодушны: подавляющее число клеток, погибающих по механизму апоптоза, составляют ВИЧ-1-неинфицированные клетки. 1.3.6. Взаимодействие ВИЧ с NK-клетками NK-лимфоциты, или естественные киллеры — крупные гранулярные лимфоциты, способные убивать клетки-мишени, которыми, в основном, выступают опухолевые и зараженные вирусами клетки со сниженной экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA) класса I. Поскольку HLA класса I представляют клеточные белки T-лимфоцитам, NK-лимфоциты уничтожают те клетки, которые могли бы обмануть клеточный иммунитет, не вырабатывая эти молекулы. Кроме того, благодаря рецепторам к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, NK-лимфоциты убивают клетки, к чьей поверхности 31 прикрепились антитела. Таким образом, NK-лимфоциты задействованы как в специфическом, так и в неспецифическом звеньях иммунитета. Еще в 80-х годах у ВИЧ-инфицированных обнаружили функциональную недостаточность лимфоцитов NK-лимфоцитов, убивать что клетки-мишени связали после с неспособностью прикрепления к этих ним. У изолированных NK-лимфоцитов эту недостаточность иногда удавалось устранить, оставляя их на ночь в сосуде с питательной средой или добавляя хелперные цитокины: ИЛ-2 и гамма-интерферон [108]. Таким образом, в основе функциональной неполноценности NK-лимфоцитов может лежать недостаточная стимуляция со стороны лимфоцитов CD4. 1.3.7. Взаимодействие ВИЧ с В-лимфоцитами Кроме повреждения Т-клеток при ВИЧ-инфекции, нарушается иммунорегуляторная роль и других субпопуляций лимфоцитов. Так, в патогенез ВИЧ-инфекции вовлечено и B-клеточное звено иммунитета. Покоящиеся B-лимфоциты не восприимчивы к заражению ВИЧ. Однако в исследованиях in vitro показано, что ВИЧ способен заражать активированные Bлимфоциты. При ВИЧ-инфекции B-лимфоциты активируются, связываясь с ВИЧ или его антигенами (так, вирусный гликопротеид gp41 вызывает поликлональную активацию B-лимфоцитов). Наконец, мембранные иммуноглобулины, вариабельные участки которых кодируются генным сегментом VH3, могут служить рецепторами ВИЧ на B-лимфоцитах. Активация B-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции приводит к гипергаммаглобулинемии, появлению в сыворотке иммунных комплексов и аутоантител [115]. У больных ВИЧ повышен уровень IgA и IgG. Уровень IgM не изменен, в то же время повышен уровень острофазных белков, например, С-реактивного белка. Постоянная активация B-лимфоцитов также может приводить к гибели данных клеток путем хронической активации лимфоцитов может являться иммунодефицита, так и сопутствующие возбудители. апоптоза. Фактором как сам вирус 32 Нарушения гуморального иммунитета при ВИЧ-инфекции проявляются также угнетением пролиферативного ответа B-лимфоцитов на митогены и антигены in vitro и снижением эффективности вакцинации и ревакцинации белковыми и полисахаридными антигенами. Снижена реакция на Т-зависимые антигены, а также на Т-зависимые и независимые поликлональные активаторы. У ВИЧ-инфицированных взрослых недостаточность гуморального иммунитета служит одной из важнейших причин снижения устойчивости к возбудителям бактериальных оппортунистических инфекций, особенно на стадии СПИДа. У ВИЧ-инфицированных детей она приводит к развитию тяжелых, часто заканчивающихся смертью бактериальных инфекций, вызванных широким спектром возбудителей. Несмотря на нарушение гуморального иммунитета, число B-лимфоцитов в крови ВИЧ-инфицированных обычно нормальное и снижается у некоторых больных лишь на стадии СПИДа. Иногда в острой лихорадочной фазе наблюдается преходящее снижение числа B-лимфоцитов в крови, что, повидимому, обусловлено миграцией этих клеток в лимфоидные органы и ткани [75]. 1.4. Высокоактивная антиретровирусная терапия Развитие антиретровирусной терапии — одна из самых ярких и захватывающих глав в истории медицины. В очень немногих областях медицины наблюдались подобные головокружительные успехи наряду с множеством многообещающих направлений исследований, которые не оправдали возлагавшихся на них надежд. На пути к последним крупным достижениям было много взлетов и падений. В настоящее время основным компонентом лечения больных ВИЧинфекцией является высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) одновременное использование трех или более препаратов, направленных на подавление репликации ВИЧ [133, 138]. С помощью ВААРТ можно добиться контролируемого течения заболевания: остановить прогрессирование 33 заболевания, предотвратить развития вторичных заболеваний или добиться их регресса, предотвратить потерю трудоспособности или восстановить ее, увеличить продолжительность жизни пациента [1]. Основной целью АРВТ является увеличение продолжительности и сохранение качества жизни пациентов. Дополнительными целями являются: - снижение контагиозности пациента и предотвращение распространения им ВИЧ-инфекции; - уменьшение финансовых затрат, связанных с госпитализацией, лечением вторичных заболеваний, нетрудоспособностью пациента; - снижение демографических потерь, связанных со снижением репродуктивных способностей и смертности молодого населения. АРВТ направлена на максимальное подавление размножения ВИЧ, что выражается в снижении вирусной нагрузки до неопределяемого уровня [121]. Подавление репликации ВИЧ останавливает гибель лимфоцитов CD4+, что приводит к восстановлению их популяции (прирост в среднем на 100 клеток/мкл в год) и функциональной активности. Восстановление иммунитета ведет к предотвращению развития вторичных заболеваний, а если они уже развились – к их исчезновению. Низкое содержание вируса в крови, сперме, влагалищных выделениях снижает контагиозность пациентов. Кроме того, эффективное подавление размножения ВИЧ снижает вероятность развития мутаций, приводящих к возникновению резистентных штаммов вируса. Антиретровирусные препараты направлены на уязвимые этапы жизненного цикла ВИЧ и тем самым препятствуют его размножению. В настоящее время достаточно много таких препаратов создано и внедрено в клиническую практику. Разрабатываются и испытываются новые препараты. Однако все они лишь подавляют размножение ВИЧ и не способны уничтожить генетический материал вируса, интегрированный в ДНК клетки хозяина. Они не способны привести к 34 элиминации вируса из организма, то есть к полному излечению от ВИЧинфекции. В мировой клинической практике применяют следующие группы противовирусных препаратов (перечислены в порядке внедрения в клиническую практику): 1. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ (НИОТ). Блокируют процесс обратной транскрипции. Представляют собой измененные молекулы нуклеозидов или нуклеотидов, которые встраиваются в синтезируемую цепочку ДНК и прекращают ее дальнейшую сборку. 2. Ингибиторы протеазы (ИП) ВИЧ – препараты, блокирующие процесс формирования полноценных белков ВИЧ и, в конечном итоге, сборку новых вирусов. 3. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ). Блокируют обратную транскриптазу, взаимодействуя непосредственно с этим ферментом. 4. Препараты, воздействующие на рецепторы, используемые вирусом для проникновения в клетку (например, хемокиновый рецептор CCR5). 5. Ингибиторы интегразы (ИИ) - препараты, блокирующие процесс встраивания провирусной ДНК в ДНК человека с помощью фермента ВИЧ интегразы [18, 21]. В настоящее время при помощи антиретровирусной терапии появилась возможность увеличить ожидаемую продолжительность жизни ВИЧ- инфицированных до нормальных величин. Однако необходимость пожизненного приема препаратов представляет огромную проблему для пациентов, врачей, фармацевтической промышленности и тех, кто оплачивает это лечение [71, 79, 85]. Потребность в новых антиретровирусных препаратах все также остра, поскольку неясно, какие из имеющихся на сегодняшний день препаратов пройдут проверку временем и сохранятся в арсенале врачей через несколько десятилетий [41]. Влияние АРВТ на сердце, почки, кости и другие органы и ткани у 35 стареющей ВИЧ-инфицированной популяции предсказать трудно. Если средство, позволяющее полностью излечивать ВИЧ-инфекцию, не будет найдено, то через несколько десятилетий миру потребуется больше антиретровирусных препаратов разных фармакологических групп [62]. Сейчас совсем непросто зарегистрировать новый препарат, как показал опыт работы с викривироком. Как доказать, что новый препарат обладает преимуществами по сравнению с другими эффективными антиретровирусными препаратами? Получать разрешение на применение новых препаратов становится все сложнее, к тому же рынок препаратов переполнен. Нужны новые стратегии. В то же самое время на простой вопрос «когда начинать АРТ?» ответа до сих пор нет. Вместо распространенной в 90-х гг. рекомендации Дэвида Хо «бить [вирус] рано и сильно» сейчас преобладает позиция «бить ВИЧ как можно сильнее, но только при необходимости» [92]. Это звучит разумно, однако непонятно, когда же конкретно возникает такая необходимость. При количестве лимфоцитов CD4+, равном или меньше 350 клеток /мкл? Какую роль играют вирусная нагрузка, динамика абсолютного количества и процентной доли лимфоцитов CD4+, возраст, пол, особенности организма и тропизм вируса? А как поступать с пациентами с острой ВИЧ-инфекцией? Ответы на некоторые из этих стратегически важных вопросов, возможно, будут найдены при помощи проводящихся в настоящее время крупных исследований. До получения определенных результатов исследований этот вопрос следует решать индивидуально с каждым пациентом. 1.5. Российская классификация ВИЧ-инфекции В России используется классификация ВИЧ-инфекции академика В.И. Покровского от 1989 года, переработанная в 2001 году. Особенностью Российской классификации является выделение стадий заболеваний на основе клинических критериев без учета количества CD3+4+ лимфоцитов и уровня РНК ВИЧ в крови. Согласно данной классификации выделяется 5 стадий ВИЧ: I. Стaдия инкубации. 36 II. Стадия первичных проявлений. А. Бессимптомная фаза. Б. Острая ВИЧ-инфекция без вторичных заболеваний В. Острая инфекция со вторичными заболеваниями III. Субклиническая стадия IV. Стадия вторичных заболеваний IVА. Потеря бактериальные или массы тела вирусные менее 10%, поражения поверхностные кожи и грибковые, слизистых оболочек, опоясывающий лишай, повторные фарингиты, синуситы. Фазы: Прогрессирование (на фоне отсутствия ВААРТ; на фоне ВААРТ) Ремиссия (спонтанная; после ранее проводимой ВААРТ; на фоне ВААРТ) IVБ. Прогрессирующая потеря массы тела более 10%, необъяснимая диарея или лихорадка более одного месяца, «волосистая» лейкоплакия языка, туберкулез легких, повторные или стойкие бактериальные, грибковые, вирусные и протозойные поражения кожи и слизистых оболочек, повторный или диссеминированный опоясывающий лишай, локализованная форма саркомы Капоши. Фазы: Прогрессирование (на фоне отсутствия ВААРТ; на фоне ВААРТ) Ремиссия (спонтанная; после ранее проводимой ВААРТ; на фоне ВААРТ) IVВ. Кахексия, генерализованные бактериальные, вирусные, грибковые, протозойные, паразитарные заболевания, пневмоцистная пневмония, кандидоз пищевода, атипичный микобактериоз, внелегочный туберкулез, диссеминированная саркома Капоши, поражения центральной нервной системы различной этиологии. Фазы: Прогрессирование (на фоне отсутствия ВААРТ; на фоне ВААРТ) Ремиссия (спонтанная; после ранее проводимой ВААРТ; на фоне ВААРТ) 37 V. Терминальная Введение в классификационную систему стадии инкубации, включающей в себя период от момента заражения до ответа организма на него в виде появления клинических проявлений и/или выработки антител, обусловлено существующей в России практикой наблюдения за лицами, имевшими эпидемиологически значимый контакт с больными ВИЧ-инфекцией. При использовании методик, позволяющих выявлять в организме зараженного вирус или его фрагменты, имеется возможность диагностировать заболевание и на этой стадии [12]. Стадия первичных проявлений включает в себя состояния, обусловленные непосредственно взаимодействием макроорганизма с ВИЧ. Присоединение на фоне стойкого иммунодефицита вторичных возбудителей и появление опухолей свидетельствует о переходе болезни в стадию вторичных заболеваний [13]. Терминальная стадия может развиться не только в результате прогрессирования состояний, характерных для стадии IVВ, но и вследствие поражения ЦНС, неопосредованного другими, помимо ВИЧ, возбудителями. Таким образом, в данную классификацию могут вмещаться все проявления болезни от момента заражения до гибели больного, включая и те, которые, возможно, ещё и не известны. 1.6. Проточная цитометрия при исследовании иммунного статуса ВИЧинфицированных лиц Проточная цитометрия как современная технология быстрого измерения характеристик клеток появилась традиционных гистохимических в и результате естественного цитохимических методов развития анализа, направленных в сторону их автоматизации. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностики, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д. [9, 10, 19]. 38 Проточная цитометрия базируется на арсенале цитохимических флуоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток, их антигенов и внутриклеточных процессов. От классической цитохимии проточную цитометрию отличает высокая производительность. Исследуются выборки от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую достоверность результатов. В свою очередь от классической биохимии и молекулярной биологии современную цитометрию отличает возможность анализировать не усредненные молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные параметры для каждой клетки [136]. Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики: – этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу, а при использовании ДНК-цитометрии и генотипу входящих в них клеток [30]. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитометрии связано в первую очередь именно с анализами такого рода [14]. – способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10-5 - 10-7, что возможно благодаря его огромной производительности [68, 113]. Так, современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 10000 клеток в секунду [139]. Основной принцип проточной цитометрии: через проточную ячейку движется постоянный ток изотонического раствора под определенным давлением, который называется «обжимающим». Внутри проточной ячейки находится зонд, с которого подается образец, содержащий клетки. Условия подобраны таким образом, что за счет разницы давления в зонде и «обжимающей» жидкости происходит гидродинамическое фокусирование струи в струе, и клетки за счет 39 этого выстраиваются друг за другом. В определенном месте клетки пересекают луч света, и здесь происходит считывание информации [139]. С помощью проточной цитометрии можно измерять следующие параметры: во-первых, это рассеяние света под малыми углами (1-10 °). Этот параметр используется при измерении размеров клеток. Во-вторых, измерение рассеяния света под углом 90°. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднородности или гранулярности цитоплазмы. И, наконец, третий параметр - это измерение интенсивности флюоресценции изучаемого объекта. Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволяет судить о морфологических характеристиках клеток, что приводит к возможности типирования клеток без применения флюоресцентных красителей, что особенно ценно при работе с периферической кровью. В диагностике и прогнозировании заболеваний, обусловленных иммунодефицитом, в частности при ВИЧ-инфекции, чрезвычайно важное значение имеет определение точных относительных и абсолютных концентраций Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD3+CD4+) и цитотоксических Т- лимфоцитов (CD3+CD8+) для уточнения стадии заболевания и принятия решения о назначении пациенту терапии. Это исследование проводится с помощью проточной цитометрии одноплатформенным методом, при котором подсчет абсолютных значений осуществляется непосредственно на цитометре [10]. Данный подход устраняет необходимость гематологического анализатора для подсчета абсолютного количества клеток и позволяет увеличить сроки хранения образцов до 72 ч, значительно уменьшает внутрилабораторную и межлабораторную вариабельность абсолютных показателей СD3+, СD3+CD4+ и СD3+CD8+ Т-клеток. В настоящее время 3-хцветный анализ с гейтированием по CD45+ (моноклональные антитела к панлейкоцитарному маркеру) и одноплатформенным методом является стандартной методикой для исследования иммунного статуса у ВИЧ-инфицированных больных. В клеточную суспензию, 40 подготовленную к анализу, добавляется суспензия специальных частиц Flow Count, которые по показателям флуоресценции сильно отличаются от клеток. Концентрация этих частиц заранее известна. Проводится счет клеток и частиц Flow Count в полученной суспензии. Этот счет завершается, когда через проточную кювету прошел определенный объем жидкости и в этом объеме насчитано определенное количество частиц. Исходя из известного количества клеток интересующей нас субпопуляции в том же объеме, подсчитывается концентрация клеток этой субпопуляции [29]. 1.7. Использование системы CytoDiff в оценке иммунного статуса ВИЧинфицированных лиц Реагенты CytoDiff представляют собой пятицветную комбинацию из 6 моноклональных антител, которая позволяет с помощью проточной цитометрии определить 9 гематологических параметров в образце цельной крови. Комбинация антител CD36-FITC/CD2-PE/CD294(CRTH2)-PE/CD19-ECD/CD16-PC5/CD45-PC7. Реагент предназначен для использования в рутинной практике клинической лаборатории для in vitro диагностики. При использовании значения общего количества лейкоцитов (WBC), полученного с помощью автоматического гематологического анализатора, анализ образца, окрашенного реагентом CytoDiff, позволяет получить как значения относительного содержания тех или иных популяций клеток, так и абсолютные значения. Реагенты CytoDiff следует использовать на проточных цитофлуориметрах производства Beckman Coulter. Данный тест основан на способности специфических моноклональных антител связываться с антигенными детерминантами, которые экспрессируются лейкоцитами. В таблице 1 приведены популяции лейкоцитов, доступные для определения с помощью системы CytoDiff. 41 Таблица 1 – Популяции лейкоцитов и соответствующие им фенотипы, доступные для определения с помощью системы CytoDiff Популяция клеток В-лимфоциты Т- и NK-клетки CD16- Т- и NK-клетки CD16+ Условное обозначение (фенотип) Ly B (SSClow, CD45high, CD16-, CD2 и CRTH2-, CD19+) T- (SSClow, CD45high, CD16-, CD2+ или CRTH2+) T+ (SSClow, CD45high, CD16+, CD2+ или CRTH2+) Т- и NK-клетки Lymph T&NK Общее количество лимфоцитов Lymph Total Моноциты CD16- Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты Эозинофилы M- (SSCint, CD16-, CD2- и CRTH2-, CD19-, CD36+) M+ (SSCint, CD16+, CD2- и CRTH2-, CD19-, CD36+) Mono Тotal Imm Gr (SSChigh, CD45int, CD16-, CD2- и CRTH2-) Eo Total (SSChigh, CD45high, CD16-, CD2+ или CRTH2+) Зрелые нейтрофилы Neutro Mature (SSChigh, CD45high, CD16+) Общее количество нейтрофилов Neutro Total Незрелые В-лимфоциты Незрелые Т-лимфоциты Базофилы Xb (SSClow, CD45low, CD16-, CD2 и CRTH2-, CD19+) Xt (SSClow, CD45low, CD16-, CD2+ или CRTH2+) Baso Total (SSCint, CD45int, CD16-, CD2+ или CRTH2+) 42 Используемая стратегия гейтирования позволяет обнаружить циркулирующие лейкоциты, среди которых в дальнейшем определяют 9 гематологических параметров. Результат представляется в виде процентного содержания положительно-окрашенных клеток [74]. При инкубации образца с реагентами CytoDiff происходит специфическое окрашивание лейкоцитов. Затем выполняется лизис эритроцитов. Интактные лейкоциты анализируются на проточном цитофлуориметре. Проточный цитофлуориметр измеряет светорассеивание и флуоресценцию клеток. Он позволяет выделить (гейтировать) интересующую популяцию на диаграмме, отображающей светорассеивание в боковом направлении (Side Scatter или SS) и светорассеивание в прямом направлении под малыми углами (Forward Scatter или FS). Система CytoDiff позволяет выявлять 9 гематологических параметров: В-лимфоциты, общее количество T-лимфоцитов, общее количество лимфоцитов, общее количество моноцитов, зрелые нейтрофилы, зозинофилы, базофилы, незрелые гранулоциты, общее количество бластов. Все эти показатели могут иметь ценность и в изучении патогенеза ВИЧ-инфекции. Известно, что при ВИЧинфекции страдают не только CD4+ клетки, но и многие другие популяции (хоть и не так выражено). Среди них В-клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и др. Данные, полученные с использованием панели CytoDiff, могут способствовать более глубокому пониманию иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции. 1.8. Определение вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, 43 инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ. Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧинфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ. С другой стороны, известно, что практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты [12]. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧинфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким 44 наблюдением. Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ- инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧинфекции могут быть решены с помощью ПЦР [118]. Разработанный недавно метод ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR) позволил значительно расширить возможности молекулярной диагностики [94, 97]. Суть метода заключается в том, что в процессе накопления продуктов амплификации происходит увеличение флюоресцентного сигнала, который регистрируется с помощью специального прибора, позволяющего осуществлять детекцию продуктов ПЦР в режиме реального времени [42]. Так как кинетика накопления продуктов амплификации зависит от исходного количества матрицы, то возможно оценить количество исходного продукта. Отсутствие отдельной стадии детекции позволяет уменьшить риск контаминации продуктами ПЦР и, таким образом, упростить требования, предъявляемые к организации ПЦРлаборатории. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов амплификации. Отличительными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале. Количественный метод определения РНК ВИЧ (показатель вирусной нагрузки) используется для диагностики острой ВИЧ-инфекции, прогноза вероятности передачи вируса, выявления показаний к началу антиретровирусной терапии, а также для наблюдения за эффективностью [60, 98]. В настоящее время концентрация PHК ВИЧ в плазме крови (или вирусная нагрузка) является одним из важнейших 45 показателей как на этапе назначения терапии, так и в процессе терапии. Изучая изменение концентрации PHК ВИЧ в процессе лечения, можно судить об эффективности терапии уже через 2-4 недели от ее начала. В основе количественных тестов лежит принцип одновременного тестирования образца плазмы крови с внутренним контрольным образцом. Внутренний контрольный образец (ВКО) с известной концентрацией PHК добавляется в каждую пробу на этапе выделения PHК и в результате проходит через все этапы анализа одновременно с изучаемым образцом крови. Концентрация PHК ВКО подобрана таким образом, чтобы конкуренция на этапе ПЦР между анализируемой матрицей и ВКО была минимальна в заданном диапазоне измерения. При тестировании любого количества образцов крови необходимо параллельно тестировать 2 положительных контрольных образца с высокой и низкой концентрацией PHК ВИЧ и отрицательного контрольного образца [141, 143]. Преимуществами метода ПЦР являются: 1. Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека. 2. Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя. Для повышения специфичности возможно определять несколько разных генов одного микроба. 3. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования. 4. Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно при возникновении сложностей взятия клинического материала на преаналитическом этапе исследования. 46 5. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Недостатки метода ПЦР: 1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. 2. Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно - патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR). 3. Различия при использовании разных тест-систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест-систем разных производителей. 47 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В данной работе нами представлены основные лабораторные методы исследования для оценки иммунного статуса у 166 ВИЧ-инфицированных лиц, средний возраст которых составил 33,3±7,6 лет. Среди обследованных нами пациентов 82 человека (49 %) были в стадии III ВИЧ-инфекции (согласно Российской классификации ВИЧ-инфекции), 84 человека (51 %) – в стадии IVА. 76 ВИЧ-позитивных пациентов (46 %) получали высокоактивную антиретровирусную терапию, 90 пациентов (54 %) – не получали. Диагноз ВИЧинфекция был поставлен врачом-инфекционистом после проведенного лабораторного обследования (выявление антител к ВИЧ в сыворотке крови методами ИФА и иммунного блоттинга) в инфекционном отделении для лечения больных ВИЧ/СПИДом Клиники ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России», где впоследствии все пациенты и находились на диспансерном учете. Исходную контрольную группу составили 32 условно здоровых донора. Средний возраст – 27,9±7,9 лет. Исследования проводились в иммунологической лаборатории Клиники ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России», клинико-диагностической лаборатории ГУЗ «Челябинский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и другими инфекционными заболеваниями». 2.1. Иммунологические методы Так как задачами нашего исследования было выявление иммунологических нарушений, сопровождающих прогрессирование ВИЧ-инфекции, мы сделали акцент на изучении субпопуляционного состава лейкоцитов у ВИЧ- инфицированных лиц в зависимости от стадии заболевания по классификации Покровского, уровня вирусной нагрузки, проводимой ВААРТ и сопутствующих патологий. Для оценки субпопуляционного состава лейкоцитов методом 48 проточной цитометрии материалом для исследования была выбрана цельная периферическая кровь. 2.1.1. Получение исследуемого материала и выделение клеток из крови Для определения общего количества лейкоцитов, подсчета абсолютного и относительного соотношения лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, а также популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов методом проточной цитометрии кровь брали из локтевой вены в вакуумную пробирку, содержащую антикоагулянт K3EDTA (1,50,15 мг на 1 мл крови). Тщательное перемешивание осуществляли путем 8-кратного осторожного переворачивания пробирки. 2.1.2. Подсчет абсолютного и относительного числа различных субпопуляций лейкоцитов методом проточной цитометрии и системы CytoDiff В данном исследовании использовались следующие антитела производства компании Beckman Coulter (США): моноклональные антитела (МА) к CD36, конъюгированные с флуоресцеин -изотиоцианатом (CD36-FITC), МА к CD2, конъюгированные с фикоэритрином (CD2-PE), МА к CRTH2, конъюгированные с фикоэритрином (CRTH2-PE), МА к CD19, конъюгированные с фикоэритриномтехасским красным (ECD) (CD19-ECD), МА к CD16, конъюгированные с фикоэритрином-цианином 5 (CD16-Cy5) и МА к CD45, конъюгированные с фикоэритрином-цианином дифференциального 7 подсчета (CD45-Cy7). лейкоцитов Для выполнения методом ПЦ расширенного использовалась следующая комбинация 6 маркеров-5 красителей: CD36-FITC/CD2-PE/CRTH2PE/CD19-ECD/CD16-Cy5/CD45-Cy7. В каждую пробирку для анализа образцов вносили по 10 мкл реагента CytoDiff. Далее в каждую пробирку добавляли по 100 мкл цельной периферической крови. После 15-минутной инкубации в темноте при комнатной температуре в каждую пробирку вносили по 1 мл смеси для «лизирования с одновременной фиксацией» (1 мл лизирующего раствора VersaLyse с 25 мкл концентрированного 10Х фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution, Beckman Coulter, Виллепинт, Франция). Немедленно перемешивали на вортексе в 49 течение 1 секунды. Инкубировали пробирки 10 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. До проведения анализа на проточном цитометре готовые пробы хранились в холодильнике не более 6 часов. Для анализа использовался проточный цитофлуориметр «Cytomics FC 500» производства компании Beckman Coulter, позволяющий проводить исследование по пяти цветам. Компенсация флуоресценции выполнялась автоматическим методом (Advanced Digital Compensation компании Beckman Coulter) в соответствии с протоколом поставщика. Анализ и подсчет абсолютного количества клеток проводились после регистрации 20 000 событий. Перед каждой серией измерений настройки фотоумножителей проверялись с помощью флуоресцирующих калибровочных частиц (флуоросфер Flow-Set; Beckman Coulter). Коррекция вариации мощности лазеров проводилась согласно рекомендациям изготовителя. Процентное содержание всех популяций лейкоцитов (в том числе, T- и Bлимфоцитов) рассчитывается относительно общего числа лейкоцитов. Для определения абсолютного количества всех типов клеток использовалось общее число лейкоцитов (WBC), полученное с помощью автоматического гематологического анализатора Beckman Coulter Act Diff. 2.1.3. Подсчет абсолютного и относительного числа Т-лимфоцитов и Тхелперов методом проточной цитометрии Определение популяционного состава лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии. моноклональных антител Тест основан на связываться с способности дискретными специфических антигенными детерминантами, экспрессированными на поверхности лейкоцитов. В процессе инкубации образца с реагентом происходит специфическое окрашивание. После этого эритроциты удаляются путем лизирования, а клетки белой крови анализируются на проточном цитометре с использованием лимфоцитарных гейтов. 50 Непосредственно для окрашивания были использованы трехпараметрические реагенты линии IQTest: CD45-FITC/CD4-RD1/CD3-PC5 производства фирмы Beckman Coulter, США. Наличие пан-Т-лимфоцитарного маркера CD3+ характерно для Т-лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD4+ - для Тхелперов. Окрашивание моноклональными антителами проводили в цельной крови. С этой целью, после осторожного 8-кратного переворачивания вакуумной пробирки, по 100 мкл крови помещали в 2 пробирки размером 12 х 75 мм. Добавляли в них по 10 мкл антител: CD45-FITC/CD4-RD1/CD3-PC5. Пробирки инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 25 минут. По окончании инкубации проводили лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов с использованием лизирующего комплекта реагентов Immuno-Prep™ (в состав комплекта входит реагент А – лизирующий эритроциты, реагент В – стабилизирующий и реагент С – фиксирующий реагент) на автоматической станции пробоподготовки Q-Prep™. Непосредственно перед анализом на проточном цитометре добавляли в пробирки по 100 мкл частиц Flow-Count, которые по показателям флуоресценции сильно отличаются от клеток. Концентрация этих частиц заранее известна. Проводили счет клеток и частиц Flow-Count в полученной суспензии. Этот счет завершался, когда через проточную кювету прошел определенный объем жидкости и в этом объеме насчитано определенное количество частиц. Исходя из известного количества клеток интересующей нас субпопуляции в том же объеме, подсчитывается концентрация клеток этой субпопуляции. Готовый образец анализировали на лазерном проточном цитометре «Cytomics FC500» фирмы Beckman Coulter с использованием гетерогенного гейтирования и проведением аналитического контроля качества. 51 2.1.4. Проведение внутрилабораторного контроля качества при определении уровня субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии Приказами Минздрава РФ от 26.05.2003. №220 «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов» и от 02.02.2000 №45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных Федерации» исследований отмечается в учреждениях важная роль здравоохранения контроля Российской качества проводимых исследований. В связи с этим, одним из основных условий корректной оценки иммунного статуса пациентов является постоянное проведение внутрилабораторного контроля качества. Для этих целей необходимо посредством аттестованных контрольных контролировать состояния материалов проточного с известными цитометра и значениями, оценивать качество проведения пре- и аналитического этапов исследования (пробоподготовка, реакционная способность антител и т.д.). Оценку качества работы цитометра проводили ежедневно, включая проверку сигналов светорассеяния и флуоресценции с использованием калибровочных частиц Flow Check Fluorespheres (Beckman Coulter, США) и стандартных настроечных протоколов. Качество аналитического этапа оценивали путем окрашивания контрольного материала Immuno-Trol Cells (Beckman Coulter, США) с заведомо известным диапазоном допустимых значений относительного и абсолютного количества для 19-ти основных популяций лейкоцитов. 2.2. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени Определение вирусной нагрузки проводилось методом полимеразной цепной реакции на автоматизированной системе для анализа нуклеиновых кислот «m2000rt» компании Abbott Laboratories., позволяющей осуществлять флуоресцентную детекцию результатов в реальном времени, имеющим 5 каналов 52 детекции, автоматическую обработку данных и многоуровневый контроль качества результатов. 2.2.1. Получение исследуемого материала Для проведения исследования по определению вирусной нагрузки ВИЧ была использована плазма крови. Цельная кровь в количестве не менее 5 мл собиралась в одноразовую пробирку с K3EDTA (1,50,15 мг на 1 мл крови). После взятия пробирка с кровью перемешивалась переворачиванием 3-4 раза и хранилась при температуре +2-8° C не более 6 часов. Плазма крови была отобрана не позднее 6 часов после взятия крови. Для этого пробирка с цельной кровью центрифугировалась при 800-1600g в течение 20 минут. 2.2.2. Количественное определение уровня РНК ВИЧ в исследуемом материале Пробоподготовка осуществлялась с использованием системы ABBOTT Tm TM Sample Preparation и включала несколько этапов. 1. Лизис - вносили в каждую пробирку с исследуемым материалом по 100 мкл реагента mMicroparticles, 2,4 мл буфера mLysis, перемешивали и помещали в термостат на 20 минут при температуре 50°С. Далее удаляли лизат. 2. Промывка – в каждую пробирку добавляли 700 мкл буфера mWash1 и ресуспендировали. Помещали пробирки в магнитный штатив на 1 минуту. Удаляли из пробирок жидкость. Повторяли процедуру отмывки 3 раза. 3. Элюция – в каждую пробирку добавляли 25 мкл буфера mElutoin и ресуспендировали. Помещали пробирки в термостат на 20 минут при температуре 75°С. Добавляли в каждую пробирку 63 мкл буфера mWash2, ресуспендировали и помещали в магнитный штатив на 1 минуту. Собирали элюат и помещали в чистую пробирку. Интерпретация результатов. Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне 53 пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов. В процессе Real-Time PCR необходима постановка ДНК-калибраторов ВИЧ и ВКО для построения калибровочной кривой, с помощью которой осуществляется расчет концентрации ДНК ВИЧ и ВКО в исследуемых образцах. Построение калибровочной кривой и расчеты концентрации ДНК осуществлялись с использованием программного обеспечения используемого прибора. 2.3. Статистические методы анализа Результаты исследований обрабатывались на ПК под управлением операционной системы Windows XP с применением пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0» [3]. Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами, с определением средней арифметической вариационного ряда (М) и ошибки средней арифметической (m). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде M±m, где М - средняя арифметическая, m - стандартная ошибка средней. Объем выборок параметрических был недостаточен способов анализа, для применения поэтому мы любого из воспользовались непараметрическим аналогом. Согласно литературным данным, при применении непараметрических чувствительность критериев составляет при примерно нормальном 95% от распределении их чувствительности их параметрических аналогов, и непараметрические критерии дают больше шансов выявить реально существующие различия [7]. Достоверность отличия оценивалась по U - критерию Mann-Whitney, статистически значимыми считались изменения при p < 0,05. Представленные цифровые данные были округлены до второго десятичного знака. 54 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ У ВИЧИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ И УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ На первом этапе работы мы изучали особенности субпопуляционного состава лейкоцитов периферической крови больных ВИЧ-инфекцией относительно ВИЧ-негативных людей. Для этого мы провели сравнительный анализ иммунофенотипирования лейкоцитов ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров. В группу 1 вошли 32 условно здоровых донора. Средний возраст – 27,9±7,9 лет. В группу 2 вошли 90 ВИЧ-инфицированных лиц, средний возраст которых был 31,2±6,7 лет. Среди них 68 человек (76 %) были в стадии III ВИЧ-инфекции по Покровскому, 22 человека (24 %) – в стадии IVА. Для того чтобы выявить особенности естественного течения ВИЧ-инфекции, в исследование были включены пациенты, не получающие ВААРТ. Диагноз ВИЧ-инфекция был поставлен врачом-инфекционистом после проведенного лабораторного обследования (выявление антител к ВИЧ в сыворотке крови методами ИФА и иммунного блоттинга) в инфекционном отделении для лечения больных ВИЧ/СПИДом Клиники ГБОУ ВПО «ЮУГМУ Минздрава России». Данные представлены в таблицах 3.1.1-3.1.2. Результаты С помощью панели моноклональных антител CD45-FITC/CD4-RD1/CD3PC5 установлено, что по сравнению с контрольной группой в исследованной когорте пациентов снижено относительное и абсолютное содержание Т-хелперов. Снижение уровня Т-хелперов у ВИЧ-инфицированных лиц объясняется тем, что 55 клетки CD3+CD4+ - основные мишени вируса. Механизмы его патогенного воздействия на Т-хелперы хорошо изучены. Согласно последним представлениям, основной причиной снижения количества Т-хелперов при ВИЧ-инфекции является гибель по механизму апоптоза, причем большая часть погибших клеток не инфицирована вирусом. С помощью системы CytoDiff установлено, что для больных ВИЧинфекцией характерно снижение относительного и абсолютного содержания Влимфоцитов при одновременном повышении относительного количества незрелых В-клеток в крови. Таким образом, мы видим, что в патогенез ВИЧинфекции вовлечено и B-клеточное звено иммунитета. Изменение числа Bлимфоцитов при ВИЧ-инфекции – вопрос малоизученный и спорный. Некоторые ученые полагают, что нарушена лишь функция B-лимфоцитов, без снижения их концентрации в крови [128]. Ряд авторов сообщает, что количество B-клеток у ВИЧ-инфицированных обычно нормальное и снижается лишь у некоторых больных на стадии СПИДа [76]. В нашей работе зафиксировано достоверное снижение числа В-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных людей относительно здоровых лиц. Увеличение числа незрелых форм В-лимфоцитов может являться компенсаторной реакцией на гибель зрелых В-клеток либо отражать нарушение гемопоэза вследствие поражения костного мозга и дисбаланса цитокинов. Согласно данным литературы [115], гибель В-клеток может быть обусловлена сопряжено с активационно-индуцированным усилением иммунопоэза апоптоза, этого звена что может быть лимфоидных клеток. Предположительно, апоптоз B-клеток при ВИЧ-инфекции происходит вследствие хронической антигенной стимуляции, как со стороны самого ВИЧ, так и сопутствующих возбудителей. Многочисленные данные, в том числе полученные при гистологическом исследовании лимфоидных органов, свидетельствуют, что при ВИЧ-инфекции апоптозу подвергаются не только лимфоциты CD4, но и лимфоциты CD8 и B-лимфоциты. Возможно, апоптоз играет роль 56 Таблица 3.1.1 – Сравнительный анализ относительного содержания популяций лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров, (M±m) Группа 1 (условно здоровые доноры) Группа 2 (ВИЧ-инфицированные лица) n=32 n=90 В-лимфоциты 4,86±0,32 2,98±0,20* Т- и NK-клетки CD16- 28,40±0,99 28,32±1,21 Т- и NK-клетки CD16+ 5,11±0,34 3,67±0,22* Т-лимфоциты 26,94±0,95 30,52±1,27 Т-хелперы 15,44±0,65 8,80±0,53* Т- и NK-клетки 33,52±1,14 31,99±1,24 Общее количество лимфоцитов 38,38±1,35 34,98±1,30 Моноциты CD16- 8,55±0,32 8,19±0,25 Моноциты CD16+ 0,73±0,08 1,10±0,08* Общее количество моноцитов 9,28±0,38 9,29±0,31 Незрелые гранулоциты 0,20±0,04 0,61±0,11* Эозинофилы 3,98±0,59 3,31±0,41 Зрелые нейтрофилы 47,34±1,54 51,00±1,36 Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа 47,54±1,55 51,61±1,37 0,07±0,01 0,13±0,02* 0,09±0,02 0,07±0,01 0,01±0,00 0,01±0,00 0,11±0,03 0,14±0,02 Базофилы 0,53±0,07 0,46±0,04 Показатели, % Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 57 неспецифического компенсаторного механизма, направленного на уничтожение избытка активированных лимфоцитов. Однако при этом он является одной из причин иммунологических нарушений, характерных для ВИЧ-инфекции [77]. Нарушение гемопоэза и дифференцировки B-лимфоцитов (как и других иммунокомпетентных клеток) при ВИЧ-инфекции является на данный момент недостаточно изученной проблемой. Крайне интересными представляются дальнейшие исследования в этой области. В группе ВИЧ-инфицированных пациентов также наблюдалось увеличение содержания «воспалительных» моноцитов CD16+ и незрелых гранулоцитов. Также было выявлено снижение абсолютного количества эозинофилов. Повышение уровня моноцитов CD16+ согласуется с литературными данными. Известно, что при некоторых системных заболеваниях (гемолитическом уремическом синдроме, бактериальном сепсисе, ВИЧ), число клеток с фенотипом CD14+CD16+ увеличивается. Данные клетки называют воспалительными, так как они являются мощным продуцентами провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ1 и ИЛ-6 и не продуцируют или продуцируют незначительные количества противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Роль «воспалительных» моноцитов в патогенезе ВИЧ-инфекции в настоящее время активно изучается. Предполагается их участие в распространении вируса по тканям (в том числе, мозга) и поддержании вирусной персистенции [72, 145]. Некоторые ученые полагают, что моноциты CD16+ являются более доступными для репликации ВИЧ, и их экспансия Аналогично поддерживается этому, белок неизвестными вируса Nef пока факторами блокирует вируса программу [101]. апоптоза инфицированных Т-клеток, ослабляя при этом антиапоптозные механизмы окружающих неинфицированных клеток [11]. Вероятные причины высокой репликации ВИЧ в «воспалительных» моноцитах: повышенная относительно «классических» моноцитов экспрессия CCR5 – корецептора для проникновения ВИЧ в клетку; одна из форм внутриклеточного фермента APOBEC3G, характерная для моноцитов CD16+ и менее эффективная в супрессии вируса. 58 Таблица 3.1.2 – Сравнительный анализ абсолютного содержания популяций лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров, (M±m) Показатели, клеток/мкл Группа 1 (условно здоровые доноры) Группа 2 (ВИЧ-инфицированные лица) n=32 n=90 Общее количество лейкоцитов 6017,07±333,03 5523,96±232,33 В-лимфоциты 293,64±27,15 154,35±10,37* Т- и NK-клетки CD16- 1688,32±94,67 1548,90±96,64* Т- и NK-клетки CD16+ 305,29±23,48 197,98±13,55* Т-лимфоциты 1594,66±87,88 1639,96±90,41 Т-хелперы 917,03±57,74 473,81±31,37* Т- и NK-клетки 1993,60±111,26 1746,88±101,62* Общее количество лимфоцитов 2287,24±133,25 1901,23±106,18* Моноциты CD16- 521,42±44,54 441,30±20,19 Моноциты CD16+ 45,71±6,80 56,84±4,01* Общее количество моноцитов 567,13±50,29 498,15±23,05 Незрелые гранулоциты 12,05±2,57 33,10±5,23* Эозинофилы 241,92±41,77 168,21±16,78* Зрелые нейтрофилы 2860,23±197,38 2880,32±175,96 Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов 2872,28±198,44 2913,44±177,55 4,20±0,67 5,92±0,88 5,38±1,29 4,24±0,75 Предшественники моноцитов 0,76±0,13 0,72±0,12 Предшественники неустановленного типа 6,78±1,64 7,42±1,15 Базофилы 31,39±4,68 24,62±2,54 Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 59 Снижение количества эозинофилов также объяснимо. Известно, что взаимодействие ВИЧ с эозинофилами осуществляется путем связывания gp120 с CD4 рецептором, который представлен на плазматической мембране эозинофила и имеет такую же структуру, как и у Т-хелперов. Предшественники эозинофилов, а также зрелые клетки экспрессируют гликопротеин CD4, который изначально был обнаружен на Т-хелперах и на клетках моноцитарно-макрофагальной линии. В ряде исследований было показано, что HIV-1 in vitro может инфицировать клетки - предшественники эозинофилов. Эти данные подтверждают, что в условиях in vivo эозинофилы могут служить резервуаром для вирусов. Повышение уровня незрелых гранулоцитов может быть связано с различными грибковыми и бактериальными заболеваниями, которые встречаются в группе ВИЧ-инфицированных лиц (кандидоз, туберкулез, бактериальный эндокардит и др.). Снижение абсолютного числа Т-хелперов, Т- и NK-клеток CD16+ и Влимфоцитов приводит к снижению общего числа лимфоцитов в группе ВИЧинфицированных лиц. Гистограммы, характеризующие наиболее яркие различия в популяциях лейкоцитов, представлены на рисунках 3.1.1.-3.1.4. Таким образом, показано, что при ВИЧ-инфекции количественным изменениям подвержены практически все популяции и субпопуляции лейкоцитов периферической крови. Наиболее существенные изменения касаются концентрация лимфоцитов CD4+. Однако, помимо этого выявлено достоверное увеличение числа моноцитов CD16+ и незрелых гранулоцитов, а также снижение количества зрелых В-лимфоцитов при повышенном уровне незрелых В-клеток в группе ВИЧ-инфицированных лиц. 60 а б Рисунок 3.1.1 – «Воспалительные» моноциты CD16+ (М+) крови условно здорового донора (а) и ВИЧ-инфицированного лица (б) а б Рисунок 3.1.2 – В-лимфоциты (LY.B) крови условно здорового донора (а) и ВИЧ-инфицированного лица (б) 61 а б Рисунок 3.1.3 – Незрелые В-клетки (Xb) крови условно здорового донора (а) и ВИЧ-инфицированного лица в стадии IVА (б) а б Рисунок 3.1.4 – Незрелые гранулоциты (IG) крови условно здорового донора (а) и ВИЧ-инфицированного лица (б) 62 В исследованной группе ВИЧ-инфицированных лиц были пациенты с III и IVА стадией заболевания согласно классификации Покровского. В следующем разделе будет рассмотрено изменения субпопуляционного состава лейкоцитов, связанные с переходом ВИЧ-инфекции из стадии III в стадию IVА. Результаты раздела «Сравнительный анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров» представлены в публикациях: 1. Решетников, И.В. Определение посредством проточной цитометрии и системы CytoDiff уровней субпопуляций лейкоцитов у больных ВИЧ-инфекцией с III стадией заболевания / И.В. Решетников // Сборник IV Международного молодежного медицинского конгресса. – СПб., 2011. – С. 117. 2. Bouvier, G. Evaluation of CytoDiff extended white blood cells differential on HIV patients / G. Bouvier, I. Reshetnikov, S. Kvyatkovskaya, D. Faye, T. Mirkina, V. Tseilikman, E. Sukhacheva // International Journal of Laboratory Hematology. – 2012. – Vol. 34. – P. 44-45. 63 3.2. АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ С УЧЕТОМ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ В Российской Федерации используется классификация стадий ВИЧинфекции академика В.И. Покровского. Ее особенностью является выделение стадий заболевания на основе только клинических критериев, без учета лабораторных показателей. Для изучения связи нарушений иммунной системы ВИЧ-инфицированных лиц и прогрессирования ВИЧ-инфекции нами был проведен сравнительный анализ показателей иммунитета у больных с различными стадиями ВИЧ-инфекции. Среди ВИЧ-инфицированных лиц 68 человек были в стадии III ВИЧинфекции (группа 1), 22 – в стадии IVА (группа 2). Никто из них не получал ВААРТ. Средний возраст пациентов в группе 1 составил 30,9±7,2 лет, в группе 2 32,0±5,0 лет. Данные представлены в таблицах 3.2.1-3.2.2. Результаты Зафиксировано увеличение количества копий РНК вируса (445060 копий/мл в стадии IVА против 132333 копий/мл в стадии III). Таким образом, пациенты с IVА стадией ВИЧ-инфекции характеризуются большей концентрацией вируса в периферической крови. Рост вирусной нагрузки у пациентов с IVА стадией может объясняться увеличением репликации вируса в крови на фоне снижения иммунного контроля. Однако, возможны и другие причины. Ряд авторов отмечает серьезные нарушение структуры лимфатических узлов на поздних стадиях заболевания. Это приводит к снижению барьерной функции лимфоузлов и массивному высвобождению вирусных частиц в кровоток [76]. У пациентов с IVА стадией заболевания выявлено снижение относительного и абсолютного содержания Т-хелперов. Это, в свою очередь, 64 Таблица 3.2.1 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с учетом стадии заболевания, (M±m) Показатели, % Группа 1 (стадия III) Группа 2 (стадия IVА) В-лимфоциты n=68 2,98±0,23 n=22 3,00±0,39 Т- и NK-клетки CD16- 28,82±1,33 26,78±2,80 Т- и NK-клетки CD16+ 3,90±0,27 2,94±0,33 Т-лимфоциты 31,31±1,42 28,06±2,81 Т-хелперы 9,80±0,59 5,71±0,89* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 32,72±1,36 29,73±2,87 35,70±1,43 32,73±2,97 8,19±0,27 8,19±0,56 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 0,99±0,07 1,44±0,26 9,17±0,32 9,63±0,78 0,51±0,07 0,92±0,37 Эозинофилы 2,97±0,27 4,36±1,45 50,83±1,49 51,53±3,19 Зрелые нейтрофилы Общее количество 51,34±1,50 52,46±3,26 нейтрофилов Предшественники В0,10±0,01 0,21±0,08 лимфоцитов Предшественники Т0,07±0,01 0,09±0,04 лимфоцитов Предшественники 0,01±0,00 0,02±0,00 моноцитов Предшественники 0,15±0,02 0,11±0,05* неустановленного типа 0,49±0,05 0,39±0,08 Базофилы Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 65 Таблица 3.2.2 – Сравнительный анализ абсолютных показателей иммунной системы и вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц с учетом стадии заболевания, (M±m) Показатели, клеток/мкл Группа 1 (стадия III) Группа 2 (стадия IVА) Общее количество лейкоцитов n=68 5570,15±228,69 n=22 5380,26±651,86 В-лимфоциты 156,28±11,15 148,33±25,34 Т- и NK-клетки CD16- 1595,90±106,09 1402,68±223,45 Т- и NK-клетки CD16+ 213,48±16,25 149,76±20,04 Т-лимфоциты 1700,75±96,34 1450,83±219,31 Т-хелперы 527,88±34,83 305,61±54,48* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 1809,38±110,67 1552,44±236,82 1965,66±113,02 1700,77±259,49 444,23±19,65 432,20±57,46 Моноциты CD16+ 53,84±4,20 66,16±9,98 Общее количество моноцитов 498,09±22,81 498,36±64,38 Незрелые гранулоциты 29,15±4,66 45,38±15,86 Эозинофилы 170,12±19,54 162,28±33,59 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 2861,51±162,10 2938,85±530,85 2890,69±163,60 2984,23±535,47 5,43±0,99 7,42±1,91 4,13±0,82 4,56±1,79 0,72±0,14 0,71±0,19 8,17±1,38 5,08±1,91* 27,12±3,20 16,84±2,48 Вирусная нагрузка, копий/мл 132333,30±30640,86 445060,94±248870,14* Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 66 связано с увеличением вирусной нагрузки при переходе заболевания из стадии III в стадию IVА. Можно сказать, что появление вторичных заболеваний, характерных для стадии IVА, ассоциировано с угнетением иммунитета ВИЧинфицированных лиц, в частности, с дефицитом лимфоцитов CD4. Уровень клеток CD4, в свою очередь, имеет обратную корреляцию с вирусной нагрузкой. Об этом говорят иностранные ученые, аналогичный вывод был получен в следующем этапе данной работы [2]. Классификация стадий ВИЧ-инфекции по Покровскому основывается лишь на клинических критериях. Очевидно, однако, что клинические проявления связаны с состоянием иммунной системы (в частности, уровнем Т-хелперов), которое в свою очередь зависит от уровня вирусной репликации. В данном разделе научной работы был проведен количественный анализ расширенного субпопуляционного состава лейкоцитов крови ВИЧ-инфицированных лиц с учетом стадии заболевания. Установлено, что переход ВИЧ-инфекции из субклинической стадии III в стадию вторичных заболеваний IVА сопряжен с усилением виремии и снижением числа клеток CD4+. В то же время, достоверных количественных изменений со стороны В-клеток, NK-клеток, моноцитов и гранулоцитов не зафиксировано. Следующие разделы научной работы посвящены изучению особенностей иммунного статуса ВИЧ-инфицированных лиц с учетом вирусной нагрузки и числа клеток CD4+. Результаты раздела «Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с учетом стадии заболевания» представлены в публикации: Решетников, И.В. Сравнительный анализ гематологических показателей ВИЧ-инфицированных лиц с III и IV стадией заболевания / И.В. Решетников, В.Э. Цейликман // Известия высших учебных заведений. Уральский регион. – 2012. – № 4. – С. 170-174. 67 3.3. АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ С УЧЕТОМ УРОВНЯ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ Прогрессирование ВИЧ-инфекции сопровождается постоянной репликацией вируса и нарастанием вирусной нагрузки в крови. Это, в свою очередь, приводит к снижению количества лимфоцитов CD4+ в периферической крови. Поэтому определение вирусной нагрузки является важным звеном в мониторинге ВИЧ-инфекции. В данном разделе научной работы мы изучали связь субпопуляционного состава лейкоцитов с уровнем вирусной нагрузки. Для исключения влияния стадии заболевания на результаты сравнения был проведен анализ отдельно для пациентов с III и отдельно для пациентов с IVА стадией заболевания. Для исключения влияния ВААРТ в исследование были включены пациенты, не получавшие терапию. Пациенты были поделены на 3 группы – с вирусной нагрузкой менее 500 копий/мл (группа 1), 500-100000 копий/мл (группа 2) и более 100000 копий/мл (группа 3). Концентрации РНК ВИЧ 500 копий/мл - нижний предел детекции на используемом в нашей работе оборудовании. Таким образом, пациенты в группе 1 характеризуются минимальной концентрацией вируса в крови; данная группа выступает в качестве контрольной. Концентрация вируса более 100000 копий/мл считается условно высокой, так как пациенты с таким уровнем вирусной нагрузки характеризуются высокой скоростью падения числа Т-хелперов, а значит, большой вероятностью развития вторичных заболеваний, а также высоким риском передачи вируса половым и вертикальным путем. Кроме того, уровень вирусной нагрузки более 100000 копий/мл считается показанием для назначения ВААРТ. Среди пациентов с III стадией заболевания в группу 1 вошло 5 человек, в группу 2 - 44 человека, в группу 3 - 19 человек. Среди пациентов с IVА стадией в группы 1, 2 и 3 вошло 2, 11 и 9 человек соответственно. 68 Среди ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией средний возраст в группе 1 составил 31,2±5,5 лет, в группе 2 - 30,2±7,6 лет, в группе 3 - 32,9±6,0 лет. Среди ВИЧ-положительных лиц с IVА стадией в группе 1 средний возраст составил 29,4±3,5 лет, в группе 2 - 30,4±3,7 лет, в группе 3 - 34,6±5,9 лет. Данные представлены в таблицах 3.3.1-3.3.5. Результаты Среди пациентов с III стадией заболевания в группе 2 (ВН 500-100000 копий/мл) относительно контрольной зафиксировано снижение абсолютного количества лимфоцитов CD4+. Т-хелперы – основная мишень вируса, и увеличение концентрации ВИЧ в крови ведет к массированной гибели лимфоцитов CD4+. Сохранение общего количества Т-клеток на фоне гибели Тхелперов можно объяснить компенсаторным увеличением числа лимфоцитов CD8+, которое часто наблюдается при ВИЧ-инфекции. В группе 2 также выявлено увеличение относительного и абсолютного числа моноцитов CD16+. Это наблюдение соответствует данным литературы. На основе своих опытов с обезьянами, W.K. Kim с коллегами делает выводы, что репликация вируса и, как следствие, возрастание вирусной нагрузки - движущие силы для экспансии CD16+ моноцитов [101]. Роль моноцитов CD16+ в патогенезе ВИЧ-инфекции окончательно не выяснена, но активно изучается. Имеются данные об участии данной субпопуляции моноцитов в распространении инфекции по организму и поддержании вирусной персистенции [72, 145]. Предполагается, что данный подтип моноцитов более доступен для репликации вируса вследствие особенностей экспрессии хемокиновых рецепторов и внутриклеточных ферментов. При этом «воспалительные» моноциты CD16+ способны придавать покоящимся Т-клеткам восприимчивость к инфекции за счет продукции ряда хемокинов. Учитывая перечисленные данные, моноциты CD16+ представляются вспомогательным звеном в развитии ВИЧ-инфекции. Увеличение их количества, вероятно, отражает не эффективную реакцию иммунной системы на внедрение вируса, а часть стратегии вируса по распространению по организму и 69 Таблица 3.3.1 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией заболевания с учетом вирусной нагрузки, (M±m) Группа 1 (ВН < 500 копий/мл) Группа 2 (ВН 500-100000 копий/мл) Группа 3 (ВН > 100000 копий/мл) n=5 n=44 n=19 В-лимфоциты 4,09±1,66 3,24±0,26 2,10±0,29** Т- и NK-клетки CD16- 21,18±4,76 28,69±1,59 31,02±2,66 Т- и NK-клетки CD16+ 3,30±1,27 4,23±0,31 3,32±0,56 Т-лимфоциты 25,18±7,09 31,17±1,58 33,18±3,05 Т-хелперы 13,52±4,69 10,18±0,57 8,02±1,09** Т- и NK-клетки 24,48±6,02 32,92±1,58 34,33±2,77 Общее количество лимфоцитов 28,56±7,56 36,16±1,69 36,43±2,73 Моноциты CD16- 6,57±0,48 8,31±0,32* 8,32±0,60 Моноциты CD16+ 0,45±0,09 1,01±0,08* 1,08±0,15* Общее количество моноцитов 7,02±0,57 9,31±0,37* 9,40±0,70 Незрелые гранулоциты 0,98±0,26 0,46±0,09* 0,52±0,13 Эозинофилы 1,55±0,63 2,21±0,18 5,03±0,60* ** Зрелые нейтрофилы 61,27±8,24 51,08±1,73 47,66±2,62 Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов 62,25±8,42 51,54±1,75 48,18±2,60 0,10±0,05 0,09±0,01 0,12±0,04 0,08±0,03 0,07±0,01 0,08±0,03 Предшественники моноцитов 0,01±0,01 0,01±0,00 0,01±0,00 Предшественники неустановленного типа 0,14±0,02 0,16±0,03 0,12±0,03 Базофилы 0,30±0,06 0,44±0,06 0,63±0,12 Показатели, % Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 70 Таблица 3.3.2 – Сравнительный анализ абсолютных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией заболевания с учетом вирусной нагрузки, (M±m) Показатели, клеток/мкл Группа 1 (ВН < 500 копий/мл) n=5 Группа 2 (ВН 500-100000 копий/мл) n=44 Группа 3 (ВН > 100000 копий/мл) n=19 Общее количество лейкоцитов 6971,01±1025,30 5215,35±250,71 6018,23±472,90 В-лимфоциты 246,57±61,84 163,52±13,12 117,41±16,03* Т- и NK-клетки CD16- 1341,93±108,89 1488,17±112,90 1901,78±260,55 Т- и NK-клетки CD16+ 192,35±47,62 223,78±18,79 195,59±37,12 Т-лимфоциты 1562,75±199,00 1589,89±98,93 1984,69±241,26 Т-хелперы 822,25±149,46 526,83±39,61* 456,63±66,57* Т- и NK-клетки 1534,28±148,84 1711,95±119,08 2097,37±270,94 Общее количество лимфоцитов 1780,84±198,91 1875,47±125,57 2214,78±270,64 Моноциты CD16- 450,79±54,36 420,77±20,23 495,39±49,00 Моноциты CD16+ 28,73±4,26 51,50±4,49* 65,37±9,96 Общее количество моноцитов 479,51±55,28 472,30±23,78 560,76±56,45 Незрелые гранулоциты 71,53±20,11 23,65±5,04* 30,95±9,54 Эозинофилы 89,12±24,83 117,35±12,31 309,11±47,49* ** Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов 4510,00±1132,95 2685,95±169,11 2844,41±270,12 4581,53±1148,09 2709,63±170,16 2875,36±270,17 5,35±1,98 4,55±0,59 7,44±3,19 5,11±1,84 3,62±0,88 5,04±2,04 Предшественники моноцитов 0,79±0,42 0,73±0,20 0,68±0,21 Предшественники неустановленного типа 8,87±0,44 8,43±1,96* 7,41±2,04 Базофилы 19,90±2,24 23,24±3,26 37,65±8,07 410792,25±68603,53* ** Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 Вирусная нагрузка, копий/мл 229,00±90,69 23252,03±4305,60* 71 установлению персистенции. Механизмы, посредством которых вирус поддерживает экспансию моноцитов CD16+ пока не известны, и дальнейшие исследования в этой области представляют значительный интерес. В группе с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл) относительно контрольной зафиксировано снижение абсолютного количества Тхелперов и зрелых В-клеток. Известно, что постоянная активация B-лимфоцитов (в частности, антигенами ВИЧ) может приводить к гибели данных клеток путем апоптоза. При увеличении количества вируса в организме происходит усиление антигенной нагрузки на В-лимфоциты, что приводит к активационно- индуцированному апоптозу. В группе 3 также зафиксировано увеличение относительного числа моноцитов CD16+ по сравнению с контрольной группой (ВН < 500 копий/мл). В группе с высокой ВН относительно группы с умеренной ВН наблюдается снижение относительного числа Т-хелперов и зрелых В-клеток. Для того, чтобы избежать использования условных низких и высоких уровней вирусной нагрузки, дополнительно был проведен анализ корреляционных связей вирусной нагрузки и субпопуляционным составом лейкоцитов в группе ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией, не получающих ВААРТ (таблица 3.3.3). В результате выявлены отрицательные связи уровня вирусной нагрузки с относительным и абсолютным количеством Т-хелперов и B-лимфоцитов. Выявлены положительные связи с относительным и абсолютным количеством незрелых B-клеток и моноцитов CD16+. Корреляционная связь ВН с незрелыми В-клетками слабая; с лимфоцитами CD4+, моноцитами CD16+ и зрелыми Влимфоцитами – умеренная. В целом, результаты корреляционного анализа подтверждают закономерности соотношения вирусной нагрузки и состава лейкоцитов, которые были получены мною в ходе проведения сравнительного анализа групп пациентов, разделенным по уровню вирусной нагрузки. 72 Таблица 3.3.3 – Корреляционные связи между уровнем вирусной нагрузки и субпопуляционным составом лейкоцитов у пациентов с III стадией ВИЧ-инфекции Сравниваемые показатели Вирусная нагрузка (копий/мл) Коэффициент корреляции, r Т-хелперы (%) -0,30 Т-хелперы (абс) -0,36 В-лимфоциты (%) -0,36 В-лимфоциты (абс) -0,45 Предшественники B-лимфоцитов (%) 0,21 Предшественники B-лимфоцитов (абс) 0,23 Моноциты CD16+ (%) 0,30 Моноциты CD16+ (абс) 0,28 Примечание: указаны только статистически значимые показатели, p<0,05 Среди пациентов с IVА стадией заболевания группы 2 и 3 характеризуются увеличением относительного и абсолютного числа незрелых В-лимфоцитов относительно группы 1. Повышение количества незрелых В-клеток может являться компенсаторной реакцией организма в ответ на гибель зрелых Влимфоцитов либо отображать нарушение гемопоэза, связанного с поражением костного мозга и дисбалансом цитоконов. Группа с высокой вирусной нагрузкой по сравнению с контрольной характеризуется снижением относительного и абсолютного числа Т-хелперов и Влимфоцитов, а также снижением абсолютного количества Т-лимфоцитов и лимфоцитов. Вероятно, на поздних стадиях ВИЧ-инфекции, характеризующимися высоким уровнем ВН, общее число Т-клеток не поддерживается компенсаторным увеличением абсолютного числа лимфоцитов CD8+, что свидетельствует об истощении иммунологической реактивности организма антигенной нагрузке. при значительной 73 Таблица 3.3.4 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом вирусной нагрузки, (M±m) n=2 Группа 2 (ВН 500-100000 копий/мл) n=11 Группа 3 (ВН > 100000 копий/мл) n=9 В-лимфоциты 4,14±1,66 3,24±0,66 2,49±0,32* Т- и NK-клетки CD16- 35,68±4,76 26,68±4,14 25,65±4,27 Т- и NK-клетки CD16+ 4,54±1,27 3,00±0,42 2,63±0,57 Т-лимфоциты 40,21±7,09 27,44±4,11 27,23±4,20 Т-хелперы 12,68±4,69 5,63±1,33 4,82±0,86* Т- и NK-клетки 40,22±6,02 29,69±4,23 28,29±4,31 Общее количество лимфоцитов 44,36±7,56 32,93±4,37 30,78±4,41 Моноциты CD16- 6,41±0,48 8,92±0,83 7,42±0,72 Моноциты CD16+ 1,31±0,09 1,63±0,40 1,19±0,36 Общее количество моноцитов 7,73±0,57 10,54±1,17 8,61±1,03 Незрелые гранулоциты 0,42±0,26 0,65±0,18 1,38±0,93 Эозинофилы 0,99±0,63 5,90±2,44 2,65±1,15 Зрелые нейтрофилы 45,95±8,24 49,08±4,15 55,84±5,67 Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа 46,37±8,42 49,73±4,25 57,22±5,67 0,03±0,01 0,21±0,13* 0,23±0,11* 0,06±0,03 0,10±0,06 0,06±0,03 0,01±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,05±0,02 0,15±0,09 0,07±0,02 Базофилы 0,40±0,06 0,42±0,12 0,36±0,11 Показатели, % Группа 1 (ВН < 500 копий/мл) Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 74 Таблица 3.3.5 – Сравнительный анализ абсолютных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом вирусной нагрузки, (M±m) Показатели, клеток/мкл Группа 1 (ВН < 500 копий/мл) n=2 Группа 2 (ВН 500-100000 копий/мл) n=11 Группа 3 (ВН > 100000 копий/мл) n=9 Общее количество лейкоцитов 4162,97±1025,30 5462,28±1069,13 5436,99±780,43 В-лимфоциты 172,37±61,84 159,43±44,82 129,04±16,43 Т- и NK-клетки CD16- 1485,38±108,89 1521,93±401,68 1220,50±94,71 Т- и NK-клетки CD16+ 188,82±47,62 154,68±30,48 137,15±29,41 Т-лимфоциты 1674,00±199,00 1541,10±396,74 1290,00±75,43* Т-хелперы 528,00±149,46 334,50±93,57 232,57±24,40* Т- и NK-клетки 1674,20±148,84 1676,62±426,96 1357,65±87,28 Общее количество лимфоцитов 1846,58±198,91 1836,04±468,56 1486,70±87,29* Моноциты CD16- 266,99±54,36 479,49±96,37 388,24±51,49 Моноциты CD16+ 54,62±4,26 72,84±14,53 58,27±15,75 Общее количество моноцитов 321,60±55,28 552,33±107,23 446,51±60,57 Незрелые гранулоциты 17,66±20,11 34,85±12,10 64,39±37,61 Эозинофилы 41,22±24,83 201,98±44,71 122,86±54,32 Зрелые нейтрофилы 1912,77±1132,95 2801,52±791,96 3281,62±812,40 1930,43±1148,09 2836,37±799,60 3346,00±815,78 1,22±0,55 6,06±1,83* 10,26±4,09* 2,44±1,84 5,71±3,10 3,23±1,43 0,41±0,42 0,66±0,15 0,83±0,46 2,23±0,44 5,89±3,32 4,33±1,61 16,85±2,24 17,24±2,93 16,27±5,12 Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 20444,30±3939,94 1115182,29±573355,85 * * ** Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по Uкритерию Манна-Уитни: р<0,05 Вирусная нагрузка, копий/мл 378,00±90,69 75 Среди пациентов с IVА стадией ВИЧ-инфекции не было найдено статистически достоверных корреляционных связей между вирусной нагрузкой и субпопуляционным составом лейкоцитов. Вероятно, это связано с малым объемом выборки. Таким образом, показано, что иммунологические нарушения, которые характерны для ВИЧ-инфицированных лиц в сравнении со здоровыми людьми, усугубляются по мере роста вирусной нагрузки. Это проявляется в снижении относительного и абсолютного числа лимфоцитов CD4+ и B-клеток, общего числа Т-клеток и лимфоцитов. При этом повышается количество моноцитов CD16+ и незрелых В-клеток. Интересно отметить, что среди пациентов с III стадией ВИЧинфекции абсолютное число Т-лимфоцитов достоверно не уменьшается на фоне роста ВН и падения числа Т-хелперов. Вероятно, это происходит за счет компенсаторного увеличения количества лимфоцитов CD3+CD8+. На более поздней стадии IVА на фоне высокой вирусной нагрузки происходит падение общего числа Т-клеток, что связано с истощении резервов иммунной системы. Результаты раздела «Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с учетом уровня вирусной нагрузки» представлены в публикации: Решетников, И.В. Соотношение между субпопуляциями лейкоцитов у больных ВИЧ-инфекцией / И.В. Решетников, С.В. Квятковская, Т.В. Миркина, Н.В. Смирнова, В.Э. Цейликман // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012. – №2. – С. 27-28. 76 3.4. АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ С УЧЕТОМ УРОВНЯ Т-ХЕЛПЕРОВ Прогрессирование ВИЧ-инфекции характеризуется снижением количества клеток CD4+. Поэтому в мониторинге иммунного статуса ВИЧ-инфицированных пациентов ключевую роль играет определение числа Т-хелперов. На данном этапе работы мы изучали изменение субпопуляционного состава лейкоцитов, сопровождающее падение уровня Т-хелперов. Чтобы исключить влияние антиретровирусной терапии, в исследование вошли пациенты, не получающие ВААРТ. Для исключения влияния стадии заболевания на результаты сравнения был проведен анализ отдельно для пациентов с III и отдельно для пациентов с IVА стадией заболевания. Пациенты были разделены на 3 группы: с числом лимфоцитов CD4+ более 500 клеток/мкл, 200-500 клеток/мкл, менее 200 клеток/мкл. Данные значения довольно условны, но широко используются во всем мире, как в научных исследованиях, так и в клинической практике. Уровень Т-хелперов более 500 клеток/мкл считается условно благоприятным – вероятность появления вторичных заболеваний минимальна; 200-500 клеток/мкл – возможно развитие ряда оппортунистических инфекций; менее 200 клеток/мкл – выраженный иммунодефицит, велика вероятность появления тяжелых и стойких вторичных заболеваний. Среди обследуемых ВИЧ инфицированных лиц с III стадией заболевания уровень Т-хелперов более 500 клеток/мкл был зафиксирован у 29 человек (группа 1), 200-500 клеток/мкл - у 35 человек (группа 2), менее 200 клеток/мкл (группа 3) - у 4 человек. Среди обследуемых ВИЧ инфицированных лиц с IVА стадией заболевания уровень Т-хелперов более 500 клеток/мкл был зафиксирован у 4 человек (группа 1), 200-500 клеток/мкл - у 10 человек (группа 2), менее 200 клеток/мкл - у 8 человек (группа 3). 77 Среди ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией средний возраст в группе 1 составил 29,8±7,0 лет, в группе 2 - 32,0±7,6 лет, в группе 3 - 30,0±3,5 лет. Среди ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией - 26,0±2,6 лет, 31,4±4,3 лет, 34,7±4,7 лет соответственно. Данные представлены в таблицах 3.4.1-3.4.6. Результаты У пациентов с III стадией ВИЧ-инфекции по мере снижения числа Тхелперов мы наблюдаем снижение абсолютного числа лейкоцитов (группа 2 относительно группы 1), лимфоцитов, T- и NK-клеток (таблицы 3.4.1-3.4.2). Это происходит главным образом за счет снижения числа лимфоцитов CD4 – основной мишени вируса. При этом происходит изменение процентного содержания различных популяций лейкоцитов. Снижается доля лимфоцитов, Т- и NK-клеток – в основном, вследствие падения уровня Т-хелперов. На этом фоне доля нейтрофилов, наоборот, возрастает. Интересно отметить, что падение числа Т-хелперов сопровождается снижением абсолютного числа B-клеток (группы 2 и 3 относительно группы 1) при одновременном увеличении относительного числа незрелых B-клеток (группа 3 относительно группы 1). Участие B-лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-инфекции рассмотрено в предыдущих разделах. Очевидно, что по мере роста вирусной нагрузки ВИЧ-инфекции гибель B-клеток усиливается, что сопряжено с увеличенным выходом их предшественников из костного мозга в кровоток. Это согласуется с данными A.S. Faucci и H.S. Lane, которые сообщают о снижении количества B-лимфоцитов на поздних стадиях ВИЧ-инфекции [77]. Также было выявлено увеличение относительного количества моноцитов CD16+ в группах 2 и 3 относительно группы 1. Зависимость числа лимфоцитов CD4+ и моноцитов CD16+ является спорным и мало изученным вопросом. Возможно, изменение концентрации данных субпопуляций лейкоцитов не связано друг с другом напрямую, а является следствием увеличения вирусной нагрузки. Однако, возможны более интересные и сложные механизмы. Прежде всего, нужно 78 Таблица 3.4.1 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией заболевания с учетом уровня Т-хелперов, (M±m) Группа 1 (CD4 > 500 клеток/мкл) Группа 2 (CD4 200-500 клеток/мкл) Группа 3 (CD4 < 200 клеток/мкл) n=29 n=35 n=4 В-лимфоциты 3,16±0,43 2,89±0,26 2,35±0,25 Т- и NK-клетки CD16- 30,24±2,19 29,06±1,61 15,14±4,08* ** Т- и NK-клетки CD16+ 3,73±0,39 4,25±0,39 1,94±0,39 Т-лимфоциты 33,13±2,43 31,30±1,63 16,93±3,58* ** Т-хелперы 12,60±0,89 8,18±0,52* 3,03±0,55* ** Т- и NK-клетки 33,98±2,22 33,30±1,61 17,08±4,38* ** Общее количество лимфоцитов 37,13±2,35 36,19±1,67 19,43±4,53* ** Моноциты CD16- 7,78±0,33 8,40±0,43 9,43±1,34 Моноциты CD16+ 0,81±0,08 1,08±0,09* 1,43±0,57* Общее количество моноцитов 8,59±0,38 9,48±0,49 10,86±1,91 Незрелые гранулоциты 0,56±0,11 0,45±0,11 0,70±0,27 Эозинофилы 2,45±0,28 3,42±0,46 2,72±0,85 Зрелые нейтрофилы 50,39±2,56 49,68±1,68 65,50±6,23** Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа 50,95±2,57 50,13±1,70 66,21±6,38** 0,08±0,01 0,11±0,03 0,14±0,06* 0,08±0,02 0,06±0,02 0,09±0,02 0,02±0,01 0,01±0,00 0,01±0,00 0,19±0,05 0,12±0,02 0,07±0,01 Базофилы 0,51±0,08 0,47±0,08 0,47±0,14 Показатели, % Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 79 Таблица 3.4.2 – Анализ абсолютных показателей иммунной системы и вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией с учетом уровня Тхелперов, (M±m) Группа 1 (CD4 > 500 клеток/мкл) n=29 Группа 2 (CD4 200-500 клеток/мкл) n=35 Группа 3 (CD4 < 200 клеток/мкл) n=4 Общее количество лейкоцитов В-лимфоциты 6220,74±320,91 5128,46±314,05* 4635,07±975,32 182,77±19,83 139,72±12,78* 104,42±9,48* Т- и NK-клетки CD16- 1852,89±172,70 1480,39±128,83* 656,56±133,91* ** Т- и NK-клетки CD16+ 221,34±21,83 219,68±24,79 90,74±24,91 Т-лимфоциты 1980,33±147,61 1566,66±118,30* 760,33±154,62* ** Т-хелперы 753,83±47,82 381,93±13,92* 131,00±10,97* ** Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 2074,23±173,69 1700,07±138,25* 747,30±150,30* ** 2256,99±174,52 1839,79±141,12* 851,72±154,05* ** 479,16±29,88 416,70±27,19 430,91±85,80 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 50,33±5,93 55,54±6,16 65,49±23,58 529,53±34,18 472,24±32,27 496,40±106,78 36,69±7,76 22,87±6,16* 29,62±7,76 Эозинофилы 146,43±17,70 192,72±34,09 141,21±68,64 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы Вирусная нагрузка, копий/мл 3198,11±279,50 2560,02±186,47 3083,12±824,34 3234,84±282,34 2582,89±187,70 3112,75±825,31 5,00±0,53 5,75±1,86 5,80±2,17 5,10±1,35 3,38±1,11 3,68±0,27 1,08±0,31 0,45±0,08 0,38±0,20 11,19±2,63 6,17±1,41* 3,35±1,13* 30,52±4,36 25,06±5,03 19,79±2,98 62708,71±25437,96 182832,97±53043,26* 201166,67±86944,59 Показатели, клеток/мкл Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 80 отметить сообщение T. Fisher-Smith и др. о том, что повышение количества моноцитов CD16+ при ВИЧ-инфекции происходит до того, как будет снижено число Т-хелперов. «воспалительных» По данным моноцитов D.W. Williams, наблюдается уже увеличение на 10-15 количества день после инфицирования (опыты с ВИО на макаках) [145]. Таким образом, моноциты CD16+ оказываются вовлечены в патогенез ВИЧ-инфекции раньше Т-хелперов, являясь ранним биомаркером инфекции. Нельзя исключить возможность того, что моноциты CD16+ сами вносят вклад в снижение количества Т-хелперов. По информации P. Ancuta, «воспалительные» моноциты CD16+ способны придать покоящимся (поэтому резистентным к вирусу) Т-клеткам восприимчивость к ВИЧ-инфекции за счет продукции хемокинов CCL24, CCL2, CCL22, и CCL17 [33]. Связывание данных лигандов с рецепторами CCR3 и CCR4 на Т-хелперах делают последних доступными для продуктивной вирусной инфекции. Таким образом, экспансия моноцитов CD16+ в периферической крови и рекрутирование их в ткани вносит вклад в хроническую активацию иммунной системы, и созданию резервуаров вируса в покоящихся Т-клетках. Выявлено увеличение вирусной нагрузки (группа 2 относительно группы 1). Логично предположить, что первичным в перечисленных выше изменениях является именно усиление вирусной репликации, которое ведет к снижению уровня Т-хелперов и B-лимфоцитов, а также является движущей силой для экспансии моноцитов CD16+. Для того, чтобы избежать использования условно высоких и низких концентраций лимфоцитов CD4+ в группах (200-500 клеток/мкл), дополнительно был проведен анализ корреляционных связей числа Т-хелперов с вирусной нагрузкой и субпопуляционным составом лейкоцитов в той же группе ВИЧинфицированных лиц с III стадией, не получающих ВААРТ (таблица 3.4.3). 81 Таблица 3.4.3 – Корреляционные связи между уровнем лимфоцитов CD4+ и субпопуляционным составом лейкоцитов и вирусной нагрузкой у пациентов с III стадией ВИЧ-инфекции Сравниваемые показатели Лимфоциты CD4+ (клеток/мкл) Коэффициент корреляции, r Общее количество лейкоцитов (абс) 0,37 Общее количество лимфоцитов (%) 0,35 Общее количество лимфоцитов (абс) 0,53 Т-лимфоциты (%) 0,32 Т-лимфоциты (абс) 0,59 Т- и NK-клетки CD16- (%) 0,33 Т- и NK-клетки CD16- (абс) 0,53 Т- и NK-клетки (%) 0,33 Т- и NK-клетки (абс) 0,51 Т-хелперы (%) 0,73 В-лимфоциты (абс) 0,39 Предшественники B-лимфоцитов (%) -0,30 Общее количество моноцитов (%) -0,25 Моноциты CD16+ (%) -0,27 Общее количество нейтрофилов (%) -0,26 Вирусная нагрузка (копий/мл) -0,39 Примечание: указаны только статистически значимые показатели, p<0,05 82 В результате выявлены отрицательные корреляционные связи уровня Тхелперов с вирусной нагрузкой, относительным числом незрелых B-клеток, процентным содержанием моноцитов (в том числе, CD16+) и нейтрофилов. Выявлены положительные связи с общим числом лейкоцитов, относительным и абсолютным количеством лимфоцитов (в том числе Т-лимфоцитов), Т- и NKклеток, относительным числом Т-хелперов, абсолютным числом B-лимфоцитов. Сила корреляционной связи во всех случаях оценивается как средняя. В целом, результаты корреляционного анализа подтверждают закономерности соотношения абсолютного числа лимфоцитов CD4+ и состава лейкоцитов, которые были получены мною в ходе проведения сравнительного анализа групп пациентов, разделенным по концентрации Т-хелперов (200-500 клеток/мкл). В группе пациентов с IVА стадией ВИЧ-инфекции были выявлены тенденции, схожие с таковыми у пациентов с III стадией (таблицы 3.4.4-3.4.5). Так, снижение числа Т-хелперов сопровождается снижением относительного и абсолютного числа лимфоцитов, В-лимфоцитов, Т- и NK-клеток, увеличением доли нейтрофилов. Для ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией также был проведен анализ корреляционных связей числа Т-хелперов с вирусной нагрузкой и субпопуляционным составом лейкоцитов (таблица 3.4.6). В результате были выявлены отрицательные связи средней силы между количеством Т-хелперов и незрелых В-клеток, при этом отмечены положительные связи средней силы с числом зрелых В-лимфоцитов. Выявлены сильные положительные связи между числом Т-хелперов и общим числом лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т- и NK-клеток, относительным числом Т-хелперов. Отметим, что связь уровня Т-хелперов с количеством Т-лимфоцитов и лимфоцитов среди пациентов с III стадией ВИЧинфекции была средней силы, что можно связать с частичной компенсацией числа Т-клеток за счет увеличения концентрации лимфоцитов CD8. Вероятно, концентрации лимфоцитов CD4, зрелых и незрелых В-клеток имеют косвенную взаимосвязь через вирусную нагрузку, о чем говорилось в соответствующем разделе данной работы. 83 Таблица 3.4.4 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией с учетом уровня Тхелперов, (M±m) Группа 1 (CD4 > 500 клеток/мкл) Группа 2 (CD4 200-500 клеток/мкл) Группа 3 (CD4 < 200 клеток/мкл) n=4 4,53±0,43 n=10 2,54±0,30* n=8 2,87±0,87 41,92±3,50 29,19±3,23* 17,54±3,13* ** 3,49±0,69 2,66±0,31 3,03±0,74 Т-лимфоциты 43,33±1,99 30,64±3,16* 18,58±3,27* ** Т-хелперы 11,82±0,96 6,38±0,63* 2,33±0,69* ** Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 45,42±3,29 31,86±3,14* 20,57±3,57* ** 49,94±3,68 34,40±3,20* 23,44±3,55* ** 7,89±1,04 8,25±0,67 8,27±1,24 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты Эозинофилы 1,12±0,22 1,11±0,25 1,96±0,58 9,02±1,12 9,35±0,83 10,22±1,81 0,20±0,11 1,32±0,81 0,77±0,22 2,94±1,75 3,02±0,98 6,50±3,53 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники В-лимфоцитов Предшественники Т-лимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 37,33±4,65 51,15±4,06 58,06±5,26 37,53±4,74 52,48±4,09 58,82±5,40* 0,08±0,05 0,18±0,11 0,30±0,18 0,04±0,01 0,16±0,07 0,02±0,01** 0,01±0,00 0,01±0,00 0,03±0,01 0,05±0,00 0,05±0,00 0,22±0,13** 0,39±0,13 0,35±0,08 0,44±0,17 Показатели, % В-лимфоциты Т- и NK-клетки CD16Т- и NK-клетки CD16+ Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 84 Таблица 3.4.5 – Анализ абсолютных показателей иммунной системы и вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией с учетом уровня Тхелперов, (M±m) Группа 1 (CD4 > 500 клеток/мкл) n=4 Группа 2 (CD4 200-500 клеток/мкл) n=10 Группа 3 (CD4 < 200 клеток/мкл) n=8 Общее количество лейкоцитов В-лимфоциты 6351,06±1763,21 5112,82±518,98 5269,84±1486,48 302,23±114,24 129,11±17,27* 104,34±18,23* Т- и NK-клетки CD16- 2774,47±981,36 1390,02±81,22* 829,23±167,80* ** Т- и NK-клетки CD16+ 222,60±75,89 140,81±24,28 128,78±29,13 Т-лимфоциты 2820,00±914,73 1456,88±78,94* 857,14±172,99* ** Т-хелперы 717,33±133,08 308,13±20,83* 126,29±32,31* ** Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 2997,07±1048,86 1530,83±78,26* 958,01±187,69* ** 3299,31±1162,79 1659,94±84,47* 1062,35±192,70* ** 537,56±219,81 419,86±49,46 401,14±113,63 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 74,70±30,67 53,34±9,80 77,16±20,15 612,25±249,03 473,19±53,54 478,30±128,06 10,98±4,44 57,46±31,24 46,32±20,41 Эозинофилы 167,90±83,18 142,80±45,72 182,14±65,59 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы Вирусная нагрузка, копий/мл 2228,63±363,40 2743,90±526,02 3466,04±1255,29 2239,62±364,61 2801,36±520,61 3512,35±1271,29 4,69±2,10 7,66±3,87 8,32±2,32 2,51±1,07 8,15±3,69 1,34±0,78** 0,62±0,18 0,42±0,18 1,08±0,42 2,99±0,70 2,52±0,44 8,90±4,73 21,17±4,93 16,78±4,02 15,05±4,23 Показатели, клеток/мкл 16658,67±8281,16 808164,38±542152,31 213686,57±110410,76 Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 85 Таблица 3.4.6 – Корреляционные связи между уровнем лимфоцитов CD4+ и субпопуляционным составом лейкоцитов у пациентов с IVА стадией ВИЧинфекции Сравниваемые показатели Лимфоциты CD4+ (клеток/мкл) Коэффициент корреляции, r Общее количество лимфоцитов (%) 0,71 Общее количество лимфоцитов (абс) 0,91 Т-лимфоциты (%) 0,76 Т-лимфоциты (абс) 0,89 Т- и NK-клетки (%) 0,72 Т- и NK-клетки (абс) 0,90 Т- и NK-клетки CD16- (%) 0,78 Т- и NK-клетки CD16- (абс) 0,91 Т-хелперы (%) 0,91 В-лимфоциты (абс) 0,58 Предшественники B-лимфоцитов (%) -0,53 Примечание: указаны только статистически значимые показатели, p<0,05 Таким образом, показано, что иммунологические нарушения, которые характерны для ВИЧ-инфицированных лиц в сравнении со здоровыми людьми, усугубляются по мере истощения популяции лимфоцитов CD4+. Это проявляется в увеличении числа моноцитов CD16+ и незрелых В-клеток, в снижении концентрации В-лимфоцитов. Также был проведен сравнительный анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов ВИЧ-инфицированных лиц, разделенных на группы по числу Т-хелперов согласно принятой в мире градации 86 числа Т-хелперов (>500 клеток/мкл, 200-500 клеток/мкл, <200 клеток/мкл). Установлены достоверные различия между группами по числу зрелых и незрелых В-клеток, моноцитов CD16+. Уместно предположить, что причиной наблюдаемых изменений является пропорциональному нарастание усугублению вирусной нагрузки, иммунологических что приводит нарушений у к ВИЧ- инфицированных лиц. Результаты раздела «Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с учетом уровня Т-хелперов» представлены в публикации: Решетников, И.В. Определение посредством проточной цитометрии и системы CytoDiff уровней субпопуляций лейкоцитов у больных ВИЧ-инфекцией / И.В. Решетников, В.Э. Цейликман, Н.В. Смирнова // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – М., 2012. – С. 317. 87 3.5. АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ С IVА СТАДИЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЯ С УЧЕТОМ ПРОВОДИМОЙ ВААРТ В настоящее время основным компонентом лечения больных ВИЧинфекцией является высокоактивная антиретровирусная терапия - одновременное использование трех или более препаратов, направленных на подавление репликации ВИЧ. Снижение концентрации вируса в крови приводит к повышению уровня контролируемого Т-хелперов. течения С помощью заболевания: ВААРТ остановить можно добиться прогрессирование заболевания, предотвратить развития вторичных заболеваний или добиться их регресса, увеличить продолжительность жизни пациента. Как было показано в предыдущих разделах, в патогенез ВИЧ-инфекции тем или иным образом вовлечены различные популяции и субпопуляции лейкоцитов. В научных же работах, посвященных ВААРТ, в основном исследуется влияние тех или иных антиретровирусных препаратов на уровень лимфоцитов CD4+. Аналогично, в клинической практике внимание врачей сконцентрировано на одной субпопуляции лейкоцитов – Т-хелперах. Влиянию же ВААРТ на другие иммунокомпетентные клетки уделяется гораздо меньше внимания. Изучению данного вопроса и посвящен настоящий раздел. На данном этапе мы проводили оценку влияния высокоактивной антиретровирусной терапии на субпопуляционный состав периферической крови ВИЧ-инфицированных лиц. Подавляющее большинство исследуемых ВИЧинфицированных лиц, получающих ВААРТ, - пациенты с IVА стадией заболевания. Таким образом, в группу 1 вошли 22 ВИЧ-инфицированных лица с IVА стадией, не получающих ВААРТ, в группу 2 - 62 ВИЧ-инфицированных лица с IVА стадией, регулярно получающих терапию. Средний возраст пациентов, не получающих ВААРТ, был 32,0±5,0 лет, регулярно получающих терапию - 36,9 ±8,8 лет. 88 Данные представлены в таблицах 3.5.1-3.5.2. Результаты Прежде всего, было выявлено снижение количества копий РНК вируса в крови пациентов, регулярно получающих терапию (23061 копий/мл против 445060 копий/мл). Снижение вирусной нагрузки является первичной целью ВААРТ (вирусологический ответ на терапию). В опытной группе было выявлено снижение относительного количества Тлимфоцитов. При этом повышено относительное и абсолютное число Т-хелперов. Увеличение уровня Т-хелперов (иммунологический ответ на терапию) происходит после снижения вирусной нагрузки. Считается, что начальное повышение числа лимфоцитов CD4+ в периферической крови на фоне ВААРТ происходит за счет выхода Т-хелперов из лимфатической системы в кровь. Вторая стадия характеризуется притоком клеток памяти CD4+ со сниженной способностью к активации и улучшенным иммунным ответом при повторном контакте с антигеном. На третьей стадии, не менее чем через 12 недель ВААРТ, происходит повышение уровня наивных клеток. Через 6 месяцев антиретровирусной терапии восстанавливаются все разновидности лимфоцитов CD4+ [2]. В группе ВИЧ-инфицированных лиц, получающих ВААРТ, зафиксировано повышение относительного и абсолютного числа B-клеток. Интересно отметить, что относительное и абсолютное количество незрелых В-лимфоцитов было снижено. Вероятно, улучшение состояния B-клеточного звена связано со снижением количества вируса в крови, что сопряжено со снижением хронической стимуляции лимфоцитов (фактора апоптоза). Отмечено уменьшение относительного и абсолютного количества «воспалительных» моноцитов в группе 2. О роли «воспалительных» моноцитов CD16+ мы говорили в предыдущих разделах нашей работы. Увеличение их количества в крови расценивается как фактор, способствующий распространению 89 Таблица 3.5.1 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом проводимой ВААРТ, (M±m) Показатели, % Группа 1 (стадия IVА ВААРТ -) Группа 2 (стадия IVА ВААРТ +) В-лимфоциты n=22 3,00±0,39 n=62 3,90±0,31* Т- и NK-клетки CD16- 26,78±2,80 27,66±1,29 Т- и NK-клетки CD16+ 2,94±0,33 3,88±0,40 Т-лимфоциты 28,06±2,81 29,88±2,38 Т-хелперы 5,71±0,89 8,90±0,67* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 29,73±2,87 31,55±1,44 32,73±2,97 35,45±1,45 8,19±0,56 8,42±0,26 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 1,44±0,26 0,93±0,11* 9,63±0,78 9,35±0,32 0,92±0,37 0,31±0,06* Эозинофилы 4,36±1,45 3,09±0,25 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 51,53±3,19 50,99±1,63 52,46±3,26 51,30±1,64 0,21±0,08 0,07±0,01* 0,09±0,04 0,07±0,02 0,02±0,00 0,01±0,00 0,11±0,05 0,13±0,05 0,39±0,08 0,53±0,05 Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 90 Таблица 3.5.2 – Сравнительный анализ абсолютных показателей иммунной системы и вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом проводимой ВААРТ, (M±m) Группа 1 (стадия IVА ВААРТ -) Группа 2 (стадия IVА ВААРТ +) n=22 n=62 Общее количество лейкоцитов В-лимфоциты 5380,26±651,86 5053,33±260,87 148,33±25,34 192,50±17,45* Т- и NK-клетки CD16- 1402,68±223,45 1350,85±78,46 Т- и NK-клетки CD16+ 149,76±20,04 197,29±23,40 Т-лимфоциты 1450,83±219,31 1433,55±82,72 Т-хелперы 305,61±54,48 391,73±24,85* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 1552,44±236,82 1548,14±91,10 1700,77±259,49 1740,65±98,12 432,20±57,46 410,16±19,12 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 66,16±9,98 43,37±4,58* 498,36±64,38 453,54±20,86 45,38±15,86 15,36±3,20 Эозинофилы 162,28±33,59 155,20±16,05 Показатели, клеток/мкл 2938,85±530,85 2650,59±189,78 Зрелые нейтрофилы Общее количество 2984,23±535,47 2665,95±190,60 нейтрофилов Предшественники В7,42±1,91 3,47±0,33* лимфоцитов Предшественники Т4,56±1,79 3,57±0,92 лимфоцитов Предшественники 0,71±0,19 0,55±0,07 моноцитов Предшественники 5,08±1,91 5,99±2,21 неустановленного типа 16,84±2,48 24,42±1,95 Базофилы Вирусная нагрузка, 445060,94±248870,14 23061,40±14399,32* копий/мл Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 91 вируса по организму, повышению восприимчивости Т-хелперов к инфицированию ВИЧ и установлению вирусной персистенции. Известно, что репликация ВИЧ – движущая сила для экспансии моноцитов CD16+. В предыдущих разделах данной работы были выявлены положительные корреляционные связи между вирусной нагрузкой и числом моноцитов CD16+. Вероятно, снижение числа «воспалительных» моноцитов на фоне ВААРТ связано с подавлением репликации вируса и уменьшением вирусной нагрузки. В свою очередь, механизмы воздействия вируса на рост числа моноцитов CD16+ пока малоизучены. При этом, по данным P.J. Ellery и др., наряду с покоящимися Тклетками моноциты CD16+ представляют собой резервуар вирусной персистенции при проведении ВААРТ [72]. В результате, полная элиминация ВИЧ из организма не представляется достижимой, и возможно восстановление виремии на фоне временного прерывания или полного прекращения антиретровирусной терапии. Исходя из этих данных, снижение числа моноцитов CD16+ на фоне Гистограммы, ВААРТ представляется демонстрирующие крайне уменьшение позитивным числа явлением. «воспалительных» моноцитов у ВИЧ-инфицированных лиц, получающих ВААРТ, представлены на рисунке 3.1.9. В группе 2 зафиксировано снижение относительного количества незрелых гранулоцитов. Вероятно, это связано с подавлением вторичных заболеваний у пациентов, у которых на фоне антиретровирусной терапии снизилась вирусная нагрузка, повысился уровень Т-хелперов и, следовательно, улучшился иммунный контроль над возбудителями. ВААРТ направлена на максимальное подавление размножения ВИЧ, что выражается в снижении вирусной нагрузки в крови. Подавление репликации ВИЧ останавливает гибель лимфоцитов CD4+, что приводит к восстановлению их популяции и функциональной активности. Восстановление иммунитета ведет к предотвращению развития вторичных заболеваний, а если они уже развились – к их исчезновению (клинический ответ на терапию). Кроме того, эффективное 92 подавление размножения ВИЧ снижает вероятность развития мутаций, приводящих к возникновению резистентных штаммов вируса. а б Рисунок 3.5.1 – «Воспалительные» моноциты CD16+ (М+) крови ВИЧинфицированного лица, получающего ВААРТ (а) и не получающего ВААРТ (б); стадия IVА Применение ВААРТ в первую очередь направлено на снижение количества вируса в крови, что в дальнейшем приводит к повышению уровня Т-хелперов. Данные изменения зафиксированы в группе пациентов, регулярно получающих ВААРТ (снижение вирусной нагрузки, увеличение уровня клеток CD4+). Однако, выявлены и другие позитивные эффекты ВААРТ: увеличение количества зрелых B-лимфоцитов при одновременном снижении числа ранних B-клеток в периферической крови, снижение количества «воспалительных» моноцитов и незрелых гранулоцитов. В предыдущих разделах данной работы было показано, что при естественном течении ВИЧ-инфекции (без использования ВААРТ) рост вирусной нагрузки и падение числа лимфоцитов CD4+ сопровождаются увеличением количества незрелых гранулоцитов, моноцитов CD16+ и незрелых 93 В-клеток, а также снижением числа зрелых В-лимфоцитов. На фоне ВААРТ наблюдается обратная картина. Поэтому можно говорить о том, что эффективная антиретровирусная терапия позитивно сказывается практически на всех субпопуляциях лейкоцитов, вовлеченных в патогенез ВИЧ-инфекции. Результаты раздела «Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом проводимой ВААРТ» представлены в публикациях: 1. Решетников, И.В. Изучение влияния высокоактивной антиретровирусной терапии на иммунный статус больных ВИЧ-инфекцией с использованием проточной цитометрии и системы CytoDiff / И.В. Решетников, В.Э. Цейликман, С.В. Квятковская, Т.В. Миркина // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012. – №4. – С. 213. 2. Квятковская, С.В. Использование панели CytoDiffTM для мониторинга эффективности антивирусной терапии у ВИЧ-инфицированных лиц / С.В. Квятковская, Е.А. Сухачева, И.В. Решетников, Н.В. Долгова, О.Б. Цейликман, В.Э. Цейликман // Клиническая лабораторная диагностика. – 2014. – № 7. – С. 58-61. 3. Tseylikman, V.E. CytoDiffTM panel allowing monitoring effectiveness of the highly active antiretroviral therapy on HIV infected patients / V.E. Tseylikman, I. Reshetnikov, G. Bouvier, S. Kvyatkovskaya, D. Faye, T. Mirkina, E. Gautherot, E. Shatirko, E. Sukhacheva // Book of abstracts of 15th International Congress of Immunology. – Milan, 2013. – P. 559-560. 94 3.6. АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ С УЧЕТОМ СОПУТСТВУЮЩИХ ПАТОЛОГИЙ В ВИДЕ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С И ВНУТРИВЕННОГО УПОТРЕБЛЕНИЯ ОПИОИДНЫХ НАРКОТИКОВ Ведущим путем передачи ВИЧ-инфекции в России продолжает оставаться парентеральное употребление наркотиков. По этой причине число потребителей инъекционных наркотиков среди ВИЧ-инфицированных лиц довольно велико. Влияние же наркотических средств на иммунный статус ВИЧ-инфицированных лиц является малоизученным вопросом. Коинфекция ВИЧ/ВГС широко распространена во всем мире. Это связано, в первую очередь, с общим путем передачи обеих инфекций – внутривенное употребление наркотиков. Большинство авторов приходит к единому мнению, что коинфекция ВИЧ/ВГС обуславливает более быстрое развитие манифестных форм ВГС-инфекции. Вопрос о влиянии ВГС на течение ВИЧ-инфекции до сих пор открыт. В данном разделе мы изучаем особенности субпопуляционного состава лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков с хроническим вирусным гепатитом С. Среди ВИЧ-инфицированных ПИН, вошедших в исследование, большая часть использовала героин или “ханку” (опиоидный наркотик кустарного производства). Для исключения влияния стадии заболевания на результаты сравнения был проведен анализ отдельно для пациентов с III и отдельно для пациентов с IVА стадией заболевания. Для исключения влияния ВААРТ в исследование были включены пациенты, не получавшие терапию. ВИЧ-инфицированные пациенты были поделены на группы – лица без сопутствующих патологий в виде наркомании и ХВГС (группа 1) и лица – потребители инъекционных наркотиков с ХВГС (группа 2). 95 Среди пациентов с III стадией заболевания в группу 1 вошли 25 человек, в группу 2 – 17 человек Среди пациентов с IVА стадией заболевания в группу 1 вошли 5 человек, в группу 2 – 15 человек. Среди ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией в группе 1 средний возраст составил 30,0±6,3 лет, в группе 2 - 29,9±3,3 лет. Среди ВИЧ-положительных лиц с IVА стадией в группе 1 средний возраст составил 26,8±4,1 лет, в группе 2 32,8±4,0 лет. Данные представлены в таблицах 3.6.1-3.6.4. Результаты Среди ВИЧ-инфицированных пациентов с III стадией заболевания в группе 2 относительно группы 1 наблюдается снижение относительного и абсолютного числа Т-хелперов, а также относительного числа клеток-предшественников неустановленного типа. Среди ВИЧ-инфицированных пациентов с IVА стадией заболевания в группе 2 относительно группы 1 наблюдается снижение относительного числа лимфоцитов, T- и NK-клеток, в том числе CD16-негативных. В группе 2 также зафиксировано снижение абсолютного количества Т-хелперов и CD16- негативных T- и NK-клеток. К настоящему времени вопрос о влиянии наркотических средств и ВГС на течение ВИЧ-инфекции изучен недостаточно. Часть ученых полагает, что ВГС-инфекция никак не влияет на течение ВИЧ-инфекции. Но большинство авторов склоняется к мнению, что ВГС-инфекция приводит к быстрому прогрессированию ВИЧ-инфекции и развитию стадии СПИД [144]. Выявлена обратная корреляция между уровнем РНК ВГС и количеством CD4-лимфоцитов [134]. Уже при моноинфекции ВГС фиксируется снижение CD4+ клеток [46]. В контексте же ВИЧ-инфекции у ВГС может быть особая роль. ВГС активирует клетки иммунной системы, а активация клетки является обязательным условием для репликации ВИЧ. 96 Таблица 3.6.1 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией заболевания с учетом сопутствующих патологий, (M±m) Показатели, % Группа 1 (ПИН-, ХВГС-) Группа 2 (ПИН+, ХВГС+) В-лимфоциты n=25 3,25±0,26 n=17 2,73±0,33 Т- и NK-клетки CD16- 31,05±2,63 26,81±2,51 Т- и NK-клетки CD16+ 3,76±0,44 4,12±0,63 Т-лимфоциты 31,53±2,45 29,75±2,28 Т-хелперы 10,01±0,72 7,23±1,04* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 34,81±2,60 30,92±2,85 38,06±2,62 33,65±2,89 8,15±0,51 7,82±0,36 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 0,91±0,11 1,01±0,11 9,06±0,60 8,82±0,43 0,52±0,12 0,45±0,12 Эозинофилы 2,82±0,41 3,14±0,62 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 48,65±2,86 53,20±2,86 49,17±2,89 53,65±2,90 0,08±0,01 0,11±0,05 0,06±0,01 0,05±0,01 0,02±0,01 0,01±0,00 0,21±0,06 0,13±0,04* 0,53±0,10 0,43±0,11 Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 97 Таблица 3.6.2 – Сравнительный анализ абсолютных показателей иммунной системы и вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц с III стадией заболевания с учетом сопутствующих патологий, (M±m) Группа 1 (ПИН-, ХВГС-) Группа 2 (ПИН+, ХВГС+) n=25 n=17 Общее количество лейкоцитов 5356,59±367,60 5606,97±425,77 В-лимфоциты 166,85±13,34 145,14±19,34 Т- и NK-клетки CD16- 1596,64±161,14 1535,66±206,59 Т- и NK-клетки CD16+ 199,36±28,14 225,94±36,20 Т-лимфоциты 1688,90±150,36 1668,29±196,51 Т-хелперы 536,45±31,39 405,43±47,84* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 1795,99±166,26 1761,60±226,79 1962,84±167,98 1906,74±230,37 421,92±32,02 430,99±30,00 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 44,61±5,01 58,77±8,57 466,53±35,48 489,76±37,55 29,57±7,36 21,78±4,93 Эозинофилы 144,81±21,95 193,63±51,30 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 2706,51±327,06 2950,93±248,53 2736,08±331,43 2972,70±248,12 3,86±0,48 6,79±3,68 3,40±0,82 2,76±0,60 0,84±0,34 0,67±0,16 11,80±3,32 7,47±2,40 26,44±5,02 26,45±9,02 Вирусная нагрузка, копий/мл 114086,40±39849,40 163996,29±76112,67 Показатели, клеток/мкл Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 98 Таблица 3.6.3 – Сравнительный анализ относительных показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом сопутствующих патологий, (M±m) Показатели, % Группа 1 (ПИН-, ХВГС-) Группа 2 (ПИН+, ХВГС+) В-лимфоциты n=5 3,33±0,87 n=15 2,98±0,52 Т- и NK-клетки CD16- 39,60±4,09 22,29±3,12* Т- и NK-клетки CD16+ 2,95±0,71 2,86±0,37 Т-лимфоциты 39,72±3,36 23,18±3,23* Т-хелперы 9,63±1,18 4,56±1,05* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 42,56±4,31 25,15±3,23* 45,89±4,87 28,13±3,33* 7,07±1,10 8,74±0,71 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 0,96±0,23 1,59±0,37 8,03±1,23 10,33±1,04 0,30±0,11 0,65±0,20 Эозинофилы 2,18±0,78 5,57±2,11 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 42,89±6,05 54,43±4,13 43,18±6,16 55,08±4,22 0,26±0,22 0,20±0,11 0,05±0,01 0,10±0,05 0,01±0,00 0,02±0,01 0,05±0,00 0,15±0,08 0,35±0,07 0,43±0,11 Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 99 Таблица 3.6.4 – Сравнительный анализ абсолютных показателей иммунной системы и вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц с IVА стадией заболевания с учетом сопутствующих патологий, (M±m) Группа 1 (ПИН-, ХВГС-) Группа 2 (ПИН+, ХВГС+) n=5 n=15 Общее количество лейкоцитов 5630,46±1416,83 5543,81±874,43 В-лимфоциты 215,92±106,94 134,33±15,63 Т- и NK-клетки CD16- 2327,21±793,33 1146,21±158,68* Т- и NK-клетки CD16+ 176,20±69,30 143,03±18,97 Т-лимфоциты 2326,25±768,55 1179,67±166,31 Т-хелперы 543,00±150,71 246,50±50,67* Т- и NK-клетки Общее количество лимфоцитов Моноциты CD16- 2503,42±856,84 1289,24±167,16 2719,34±961,60 1423,57±177,19 434,34±180,03 457,28±65,22 Моноциты CD16+ Общее количество моноцитов Незрелые гранулоциты 59,90±26,21 69,60±12,49 494,23±205,06 526,88±72,32 14,86±4,69 39,03±14,79 Эозинофилы 109,10±27,89 197,43±46,62 Зрелые нейтрофилы Общее количество нейтрофилов Предшественники Влимфоцитов Предшественники Тлимфоцитов Предшественники моноцитов Предшественники неустановленного типа Базофилы 2259,20±360,85 3320,01±774,89 2274,07±363,80 3359,04±783,59 10,66±7,96 6,45±1,51 2,95±0,63 5,50±2,67 0,57±0,17 0,76±0,28 2,78±0,63 6,39±2,82 16,79±0,60 17,81±3,63 Вирусная нагрузка, копий/мл 61430,75±51052,88 246614,50±117180,15 Показатели, клеток/мкл Примечание: * - достоверность различий показателей в группе 2 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р<0,05 100 Согласно данным иностранных ученых, регулярный прием героина вызывает повышение количества Т-хелперов [127]. По другим данным, морфин и героин усиливают апоптоз лимфоцитов, активируя клетки через их μ-опиоидные рецепторы. В контексте ВИЧ-инфекции, активация клеток может играть дополнительную роль, поскольку активация клетки необходима для репликации вируса. Возможны и другие причины. Согласно литературным данным, у ВИЧинфицированных ПИН наблюдается повышенный уровень кортизола [23]. При этом известно, что кортикостероиды оказывают негативное влияние на лимфоциты: индуцируют апоптоз и эмиграцию тимоцитов, вызывают апоптоз и подавляют пролиферацию зрелых лимфоцитов. ВИЧ и ВГС имеют общие пути передачи, и число инъекционных наркоманов с коинфекцией ВИЧ/ВГС в мире очень велико. Благодаря полученным данным, установлено негативное влияние коморбидной патологии в виде наркотической зависимости и ХВГС на течение ВИЧ-инфекции, что выражается в более выраженном дефиците лимфоцитов CD4+. Результаты раздела «Анализ показателей иммунофенотипирования лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с учетом сопутствующих патологий в виде хронического вирусного гепатита С и внутривенного употребления опиоидных наркотиков» представлены в публикации: Решетников, И.В. Влияние хронического вирусного гепатита С на иммунный статус ВИЧинфицированных потребителей инъекционных наркотиков / И.В. Решетников // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 4. – С. 5-11. 101 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВИЧ-инфекция - это медленно прогрессирующее инфекционное заболевание, последняя стадия которого известна как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Пандемия ВИЧ-инфекции далеко вышла за рамки проблемы одной страны, одной специальности, одной медицины. В новый век мир вошел с проблемой ВИЧ-инфекции, инфекций, передающихся половым путем, нарастающего экологического стресса, обусловливающего иммуносупрессию, и связанной с этим проблемой патологий, вызванных условно патогенными возбудителями. Несмотря на все успехи антиретровирусной терапии последних десяти лет, искоренение вируса у ВИЧ-инфицированных по-прежнему остается недостижимым. Лечение ВИЧ-инфекции столкнулось и с новыми проблемами — ранней и отдаленной токсичностью препаратов и устойчивостью вируса как у отдельных больных, так и в целом. Дальнейший ход пандемии ВИЧ-инфекции во многом зависит от того, появится ли в ближайшем будущем вакцина для профилактики этой инфекции. Главное условие, без которого невозможно ни упрочить завоеванных позиций в лечении и профилактике ВИЧ-инфекции, ни достичь новых — будь то иммунотерапия или получение вакцин, — это понимание иммунопатогенеза ВИЧинфекции. Сейчас уже не вызывает сомнения, что в патогенез ВИЧ-инфекции вовлечены не только Т-хелперы, но и другие клетки иммунной системы. Динамика изменения всего субпопуляционного состава лейкоцитов (как зрелых клеток, так и предшественников) представляет собой значительную ценность для построения целостной картины иммунопатогенеза ВИЧ. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния тяжести ВИЧинфекции, антиретровирусной субпопопуляционный инфицированных лиц. состав терапии и лейкоцитов сопутствующих патологий периферической крови на ВИЧ- 102 На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ субпопуляционного состава лейкоцитов крови условно здоровых доноров и ВИЧинфицированных лиц. По сравнению с контрольной группой в исследованной когорте пациентов снижено относительное и абсолютное содержание Т-хелперов при одновременном увеличении общего уровня Т-лимфоцитов. Механизмы гибели Т-хелперов довольно хорошо изучены. Значительное снижение числа лимфоцитов CD4+, наблюдаемое в опытной группе, лишний раз подтверждает, что именно Т-хелперы – главная мишень вируса. Установлено, что в патологический процесс вовлечено и B-клеточное звено. Для больных ВИЧ-инфекцией характерно снижение содержания В-лимфоцитов при одновременном увеличении содержания незрелых В-клеток в крови. Вероятно, снижение количества B-лимфоцитов обусловлено их гибелью по механизму апоптоза, который, в свою очередь, явился результатом хронической антигенной стимуляции лимфоцитов. Увеличение количества предшественников B-клеток может являться компенсаторной реакцией на гибель зрелых клеток. Для ВИЧ-инфицированных лиц исследованной группы характерно увеличение содержания «воспалительных» моноцитов CD16+ и незрелых гранулоцитов. Роль моноцитов CD16+ в патогенезе ВИЧ-инфекции представляет собой чрезвычайный интерес. Предполагается, что данная субпопуляция моноцитов участвует в распространении вируса и поддержании его персистенции. Таким образом, установлено, что количественным изменениям при ВИЧинфекции подвергаются лимфоциты CD4+, зрелые и незрелые В-клетки, моноциты CD16+, незрелые гранулоциты – представители основных популяций лейкоцитов периферической крови. Для изучения связи нарушений иммунной системы ВИЧ-инфицированных лиц и клиническими проявлениями ВИЧ-инфекции нами был проведен сравнительный анализ показателей иммунитета у больных с различными стадиями заболевания согласно классификации по Покровскому. Установлено, что переход ВИЧ-инфекции из латентной стадии III в стадию вторичных 103 заболеваний IVА сопровождается ростом вирусной нагрузки. Было выявлено снижение относительного и абсолютного содержания Т-хелперов у пациентов с IVА стадии ВИЧ-инфекции по сравнению со стадией III. В то же время, достоверных количественных изменений со стороны В-клеток, NK-клеток, моноцитов и гранулоцитов не зафиксировано, что подтверждает первостепенную роль числа лимфоцитов CD4+ в развитии иммунодефицита и появлению вторичных заболеваний. Далее были изучены изменения иммунного статуса ВИЧ-инфицированных лиц, сопровождающие рост вирусной нагрузки и падение уровня Т-хелперов. Интересно отметить, что практически все нарушения, выявленные нами ранее в группе ВИЧ-инфицированных лиц по сравнению с условно здоровыми донорами, усугубляются в ходе прогрессирования заболевания. Так, по мере нарастания вирусной нагрузки и снижения числа Т-хелперов, наблюдается снижение количества зрелых B-лимфоцитов при одновременном увеличении уровня незрелых В-клеток, увеличение числа «воспалительных» моноцитов CD16+ и незрелых гранулоцитов. Зарубежные коллеги также отмечают увеличение количества моноцитов CD16+ на фоне нарастания виремии. Таким образом, можно предположить, что именно вирусная репликация является движущей силой экспансии «воспалительных» моноцитов. Крайне интересным представляются сообщения T. Fisher-Smith о том, что повышение количества моноцитов CD16+ при ВИЧ-инфекции происходит еще до снижения уровня Т-хелперов. Согласно D.W. Williams, увеличение количества «воспалительных» моноцитов наблюдается уже на 10-15 день после инфицирования. Таким образом, минорная субпопуляция моноцитов может оказаться первым иммунологическим маркером ВИЧ- инфекции. Дальнейшее изучение моноцитов CD16+ в контексте ВИЧ-инфекции представляется крайне интересным. Часть нарушений, наблюдаемых по мере прогрессирования заболевания, может быть следствием роста виремии и усиления патогенного воздействия вируса на различные типы клеток. Нельзя также забывать про ослабление 104 «хелперной» поддержки других клеток лимфоцитами CD4+ и дисбаланс цитокинового фона. Увеличение количества моноцитов CD16+ вследствие нарастания вирусной нагрузки может содействовать снижению уровня Т- хелперов. С помощью протокола CytoDiff нам удалось оценить влияние высокоактивной антиретровирусной терапии на концентрации лейкоцитов различных субпопуляций. Прежде всего, зафиксировано увеличение количества Т-хелперов, происходящее на фоне подавления вирусной репликации и снижения вирусной нагрузки. Однако выявлены и другие позитивные эффекты ВААРТ: увеличение количества В-лимфоцитов при одновременном снижении числа незрелых В-клеток, снижение количества «воспалительных» моноцитов и незрелых гранулоцитов. Поэтому мы можем говорить о том, что эффективная антиретровирусная терапия позитивно сказывается практически на всех субпопуляциях лейкоцитов, вовлеченных в патогенез ВИЧ-инфекции. Одна из важнейших причин нормализации состава лейкоцитов при ВААРТ – это снижение концентрации вируса в крови. Однако нельзя забывать о восстановлении количества и функциональной активности лимфоцитов CD4+, которые оказывают поддержку другим типам клеток. Также нельзя исключить влияние «воспалительных» моноцитов CD16+, число которых падает при ВААРТ, на другие клетки, в частности T-хелперы. Моноциты CD16+ способны усиливать восприимчивость Т-хелперов к инфицированию ВИЧ за счет продукции ряда цитокинов. Научная группа P.J. Ellery, считает «воспалительные» моноциты источником вирусной персистенции в период терапии. Отчасти благодаря моноцитам CD16+ полная элиминация ВИЧ из организма не представляется достижимой, и возможно восстановление виремии на фоне временного прерывания или полного прекращения антиретровирусной терапии. Очевидно, снижение числа «воспалительных» моноцитов CD16+ при антиретровирусной терапии происходит в результате подавления вирусной 105 репликации и уменьшения вирусной нагрузки. Учитывая перечисленные выше данные, можно предположить, что именно моноциты CD16+ первыми из иммунокомпетентных клеток отвечают на терапию. Таким образом, уровень «воспалительных» моноцитов может являться более ранним (относительно Тхелперов) маркером эффективности терапии. Использование моноцитов CD16+ для анализа эффективности ВААРТ позволит врачу-инфекционисту сократить срок для оценки иммунологического ответа на терапию. Таким образом, мы можем говорить о том, что «воспалительные» моноциты CD16+ вносят значительный вклад в развитие ВИЧ-инфекции, и данная субпопуляция моноцитов заслуживает особого внимания как в фундаментальных научных исследованиях, так и в рутинной практике. В данной научной работе также было изучены особенности иммунного статуса ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков (ПИН), инфицированных ВГС. Вирусы иммунодефицита и гепатита С имеют общие пути передачи, поэтому число ПИН с коинфекцией ВИЧ/ВГС очень велико. Влияние вирусного гепатита С и употребления наркотических средств и на течение ВИЧинфекции является на данный момент спорным вопросом. Было зафиксировали негативное влияние коморбидной патологии в виде наркотической зависимости и ХВГС на течение ВИЧ-инфекции, что выражается в более выраженном дефиците лимфоцитов CD4+. С помощью проточной цитометрии и панели CytoDiff нам удалось выявить особенности расширенного субпопуляционного состава лейкоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных лиц с III и IVА стадиями заболевания относительно здоровых доноров. Также мы оценили влияние на иммунный статус пациентов с ВИЧ-инфекцией таких факторов, как степень тяжести заболевания, сопутствующие патологии в виде употребления наркотиков и ХВГС, а также прием высокоактивной антиретровирусной терапии. Результаты исследования содержат субпопуляционный данные состав о влиянии лейкоцитов комплекса периферической факторов крови на ВИЧ- 106 инфицированных лиц. Получены данные в малоизученных отраслях, касающихся иммунопатогенеза ВИЧ. В частности, изменение количества ранних и зрелых Влимфоцитов, «воспалительных» моноцитов CD16+ при естественном течении ВИЧ-инфекции, а также на фоне высокоактивной антиретровирусной терапии. 107 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что субпопопуляционные сдвиги лейкоцитарных клеток при ВИЧ-инфекции не ограничиваются снижением уровня Т-хелперов. Помимо этого наблюдается нарастание гранулоцитов, а также уровня моноцитов CD16+ и незрелых увеличение содержания незрелых В-клеток при одновременном снижении числа зрелых B-лимфоцитов. 2. Переход ВИЧ-инфекции из субклинической стадии III в стадию вторичных заболеваний IVА сопряжен с повышением вирусной нагрузки и снижением числа лимфоцитов CD4+. Достоверного изменения концентраций Вклеток, моноцитов и гранулоцитов не наблюдаются. 3. У ВИЧ-инфицированных лиц при естественном течении ВИЧ- инфекции с ростом вирусной нагрузки и снижением концентрации Т-хелперов ассоциируется увеличение уровня моноцитов CD16+, а также снижение числа зрелых В-лимфоцитов и повышение количества незрелых В-клеток. 4. При использовании высокоактивной антиретровирусной терапии помимо снижения вирусной нагрузки и увеличения количества Т-хелперов отмечается падение уровня моноцитов CD16+ и незрелых гранулоцитов, а также повышение содержания зрелых B-лимфоцитов при одновременном снижении числа незрелых В-клеток в периферической крови. 5. Сопутствующие патологии в виде хронического вирусного гепатита С и внутривенного употребления опиоидных наркотиков приводят к более выраженному дефициту Т-хелперов у ВИЧ-инфицированных лиц. 108 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Протокол CytoDiff может быть использован для мониторинга иммунологических нарушений при ВИЧ-инфекции. В дополнение к стандартной методике определения количества клеток CD4+ и вирусной нагрузки система CytoDiff помогает оценивать иммунный статус ВИЧ-инфицированных пациентов, а также иммунологическую эффективность ВААРТ. 2. Число «воспалительных» моноцитов CD16+ является критерием оценки эффективности ВААРТ: помимо увеличения количества Т-хелперов эффективная антиретровирусная терапия вызывает снижение уровня моноцитов CD16+. Оценка количества «воспалительных» моноцитов может являться более ранним маркером иммунологической эффективности ВААРТ по сравнению с количеством лимфоцитов CD4+. 3. Потребители инъекционных наркотиков с коинфекцией ВИЧ/ВГС требуют особого контроля со стороны клиницистов, так как у них отмечается более интенсивное истощение популяции Т-хелперов. 109 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ПРИНЯТЫХ В ДИССЕРТАЦИИ АРВТ – антиретровирусная терапия ВААРТ – высокоактивная антиретровирусная терапия ВГС – вирусный гепатит С ВИО – вирус иммунодефицита обезьян ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВН – вирусная нагрузка ДК – дендритная клетка ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИБ – иммунный блоттинг ИЛ – интерлейкин ИФА – иммуноферментный анализ ИФН – интерферон Мо – моноцит Мф – макрофаг ПИН – потребители инъекционных наркотиков ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита ФНО – фактор некроза опухолей ХВГС – хронический вирусный гепатит С CD – кластер дифференцировки ECD – фикоэритрин -Техасский красный FITC – флуоресцеина изотиоцианат HLA – человеческий лейкоцитарный антиген IFN – интерферон MHC – главный комплекс гистосовместимости NK – натуральные киллеры 110 PC5 – фикоэритрин-цианин 5 PE – фикоэритрин RD1 – R-фикоэритрин TcR – Т-клеточный рецептор 111 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Аронин, С.И. ВИЧ-инфекция: вопросы терапии / С.И. Аронин // Казанский медицинский журнал. – 2005. – Т. 86, № 6. – 443-450. 2. Бартлетт, Дж. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции / Дж. Бартлетт, Дж. Галлант, П. Фам. – М.: Р. Валент, 2010. – 490 с. 3. Боровиков, В. STATISTICA. Искусство анализа данных на компьютере: Для профессионалов. (+CD) / В. Боровиков. – Санкт-Петербург, 2003. – 688 с. 4. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика и лечение / под ред. В.В. Покровского. – Москва, 2000. – 224 с. 5. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение / под ред. С.В. Хайдукова, А.В. Зурочки. – Челябинск, 2008. – 195 с. 6. Галегов, Г.А. Высокоэффективная химиопрофилактика перинатальной передачи ВИЧ-инфекции у ВИЧ-инфицированных беременных женщин / Г.А. Галегов // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. – Т. 54, № 3-4. – С. 56-80. 7. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – Москва, 1998. – 459 с. 8. Глобальный доклад: Доклад ЮНЭЙДС о глобальной эпидемии СПИДа [Электронный ресурс]. – 2012. – Режим доступа: http://www. unaids.org. 9. Зуева, Е.Е. Иммунофенотипирование в диагностике острых лейкозов / Е.Е. Зуева // Рос. биомед. журн. – 2003. – Т.4. – С. 471-478. 10. Зурочка, А.В. Изменение представлений об оценке иммунного статуса человека, новые проблемы и подходы к их решению / А.В. Зурочка, С.В. Хайдуков // Мед. иммунология. – 2007. – Т.9, № 2-3. – С. 339-340. 11. Иванкова, А.В. Роль ВИЧ-1 белка NEF в патогенезе ВИЧ-1 инфекции / А.В. Иванкова, С.В. Бойчук, И.Г. Мустафин и др. // Казанский медицинский журнал. – 2010. – Т. 91, №1. – С. 79-85. 12. Клиническая диагностика и лечение ВИЧ-инфекции / под ред. В.В. Покровского. – Москва, 2001. – 93 с. 112 13. Кравченко, А.В. ВИЧ-инфекция на стадии первичных проявлений: особенности клинической картины и диагностики / А.В. Кравченко, А.В. Мирошниченко, В.Г. Канестри, и др. // Инфекционные болезни. – 2005. – Т. 3, № 3. – С. 18-22. 14. Луговская, С.А. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, Н.Н. Тупицын. – Тверь, 2005. – 168 с. 15. Мазус, А.И. ВИЧ-инфекция: динамика эпидемического процесса / А.И. Мазус, А.А. Голиусов, Г.Ю. Панкова и др. // Российский медицинский журнал. – 2006. – № 4. – С. 3-7. 16. Макарова, М.В. Роль антигенпрезентирующих клеток в репликации ВИЧ-1 / М.В. Макарова, С.В, Бойчук, И.Г. Мустафин и др. // Аллергология и иммунология. – 2007. – Т. 8, № 1. – С. 251. 17. Покровский, В.В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИД / В.В. Покровский. – Москва, 1996. – 246 с. 18. Покровский, В.В. Протоколы лечения больных ВИЧ-инфекцией / В.В. Покровский, О.Г. Юрин, А.В. Кравченко // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. – 2011. – № 3. – С. 1-24. 19. Полетаев, А.И. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине / А.И. Полетаев. – Москва, 1989. – Т. 12. – 88с. 20. Правила количественных проведения методов внутрилабораторного клинических лабораторных контроля качества исследований с использованием контрольных материалов: приказ Минздрава РФ № 220 от 26 мая 2003 г. – Москва, 2003. – 18 с. 21. Приказчикова, Т.А. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1 как новый компонент противовирусной защиты / Т.А. Приказчикова, А.М. Сычева, Ю.Ю. Агапкина // Успехи химии. – 2008. – Т. 77, № 5. – С. 445-459. 113 22. Робсон, А. Основы медицинской иммунологии / А. Робсон, А. Ройт, П. Делвз. – Москва, 2006. – 320 с. 23. Санникова, О.Е. Социально-психологические аспекты дезадаптации ВИЧ-инфицированных лиц в пенитенциарной среде / О.Е. Санникова, А.Г. Соловьев, П.И. Сидоров // Экология человека. – 2009. – № 4. – С. 20-24. 24. Сахно, Л.В. Фенотипическая и функциональная характеристика моноцитов у больных туберкулезом легких / Л.В. Сахно, М.А. Тихонова, В.С. Кожевников и др. // Медицинская Иммунология. – 2005. – Т. 7, № 1. – С. 49-56. 25. Сотниченко, С.А. Особенности продукции цитокинов при ВИЧ- инфекции / С.А. Сотниченко // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 5. – С. 13-15. 26. Хаитов, Р.М. СПИД / Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева. – Москва, 1992. – 27. Хаитов, Р.М. Оценка иммунного статуса в норме и патологии / Р.М. 353 с. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. – 2001. – № 4. – С.4-6. 28. Хаитов, Р.М. Иммунология / Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. – Москва, 2002. – 536 с. 29. Чередеев, А.Н. CD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий / А.Н. Чередеев, Н.К. Горлина, И.Г. Козлов // Клинич. лаб. диагностика. – 1999. – № 6. – С. 25-31. 30. Шмаров, Д.А. Лабораторно-клиническое значение проточно- цитометрического анализа крови / Д.А. Шмаров, Г.И. Козинец. – Москва: МИА, 2004. – 128с. 31. Ясавеев, И.Г. Распространение ВИЧ/СПИДа в России как социальная проблема / И.Г. Ясавеев // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2006. – № 6. – С. 20-23. 32. Aiken, C. Nef induces CD4 endocytosis: Requirement for a critical dileucine motif in the membrane-proximal CD4 cytoplasmic domain / C. Aiken, J. Konner, N.R. Landau et al. // Cell. – 1994. – Vol. 76. – Р. 853-864. 114 33. Ancuta, P. CD16+ Monocyte-Derived Macrophages Activate Resting T Cells for HIV Infection by Producing CCR3 and CCR4 Ligands / P. Ancuta, P. Autissier, A. Wurcel et al. // Journal of Immunology. – 2006. – Vol. 176. – P. 57605771. 34. Ancuta, P. Transcriptional profiling reveals developmental relationship and distinct biological functions of CD16+ and CD16- monocyte subsets / P. Ancuta, K.-Y. Liu, V. Misra et al. // BMC Genomics. – 2009. – Vol. 10. – P. 403-414. 35. Antoni, B.A. Inhibition of apoptosis in human immunodeficiency virus- infected cells enhances virus production and facilitates persistent infection / B.A. Antoni, P. Sabbatini, A.B. Rabson et al. // J. Virol. – 1995. – Vol. 69. – P. 2384-2392. 36. Badley, A.D. Mechanisms of HIV-associated lymphocyte apoptosis / A.D. Badley, A.A. Pilon, A. Landay et al. // Blood. – 2000. – Vol. 96. – P. 2951-2964. 37. Baenziger, S. Triggering TLR7 in mice induces immune activation and lymphoid system disruption, resembling HIV-mediated pathology / S. Baenziger, M. Heikenwalder, P. Johansen et al. // Blood. – 2009. –Vol. 113. – P. 377-388. 38. Balboa, L. Impaired dendritic cell differentiation of CD16-positive monocytes in tuberculosis: role of p38 MAP kinase / L. Balboa, M.M. Romero, E. Laborde et al. // European Journal of Immunology. – 2012. – Vol. 43. – P. 335-347. 39. Banda, N.K. Cross-linking CD4 by HIV gp120 primes T cells for activation induced apoptosis / N.K. Banda, J. Bernier, D.K. Kurahara et al. // J. Exp. Med. – 1992. – Vol. 176. – Р. 1099-1106. 40. Barbaro, G. Highly active antiretroviral therapy: current state of the art, new agents and their pharmacological interactions useful for improving therapeutic outcome / G. Barbaro, A. Scozzafava, A. Mastrolorenzo et al. // Curr. Pharm. Des. – 2005. – Vol. 11. – Р. 805-843. 41. Bennett, D.E. The World Health Organization's global strategy for prevention and assessment of HIV drug resistance / D.E. Bennett, S. Bertagnolio, D. Sutherland et al. // Antivir. Ther. – 2008. – Vol. 13, № 2. – P. 1-13. 115 42. Bernard, P.S. Сolor multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping / P.S. Bernard, G.H. Ptithman, C.T. Wittwer // Analytical Biochemistry. – 1999. – № 273. – Р. 221-228. 43. Birch, M.R. An examination of signs of disease progression in survivors of the Sydney Blood Bank Cohort (SBBC) / M.R. Birch, J.C. Learmont, W.B. Dyer et al. // J. Clin. Virol. – 2001. – Vol. 22. – P. 263-270. 44. Bosch, R.J. Pretreatment factors associated with 3-year (144-week) virologic and immunologic responses to potent antiretroviral therapy / R.J. Bosch, K. Bennett, A.C. Collier et al. // Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. – 2007. – Vol. 44. – P. 268-277. 45. Bour, S. The HIV type 1 vpu protein specifically binds to the cytoplasmic domain of CD4: Implications for the mechanism of degradation / S. Bour, U. Schubert, K. Strebel // J. Virol. – 1995. – Vol. 69. – Р. 1510-1520. 46. Braitstein, P. Immunologic response to antiretroviral therapy in hepatitis C virus-coinfected adults in a population-based HIV/AIDS treatment program / P. Braitstein, C. Zala, B. Yip et al. // Journal of Infectious Diseases. – 2006. – Vol. 193. – P. 259-268. 47. Braitstein, P. Mortality of HIV-1-infected patients in the first year of antiretroviral therapy: comparison between low-income and high-income countries / P. Braitstein, M.W. Brinkhof, F. Dabis et al. // Lancet. – 2006. – Vol. 367. – P. 817–824. 48. Brenchley, J.M. CD4 T cell depletion during all stages of HIV disease occurs predominantly in the gastrointestinal tract / J.M. Brenchley, T.W. Schacker, L.E. Ruff et al. // J. Exp. Med. – 2004. – Vol. 200. – Р. 749-759. 49. Brenchley, J.M. T-cells subsets that harbor human immunodeficiency virus (HIV) in vivo: implications for HIV pathogenesis / J.M. Brenchley, B.J. Hill, D.R. Ambrozak et al. // J. Virol. – 2004. – Vol. 78. – Р. 1160-1168. 50. Brenchley, J.M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection / J.M. Brenchley, D.A. Price, T.W. Schacker et al. // Nature Medicine. – 2006. – Vol. 12. – P. 1365-1371. 116 51. Brenner, M. Identification of a putative second T cell receptor / M. Brenner, J. McLean, D. Dialynas et al. // Nature. – 1986. – Vol. 322. – P. 145-149. 52. Chaussabel, D. Unique gene expression profiles of human macrophages and dendritic cells to phylogenetically distinct parasites / D. Chaussabel, R.T. Semnani, M.A. McDowell et al. // Blood. – 2003. – Vol.102. – P. 672-681. 53. Cheng-Mayer, E. Viral determinants of human immunodefciency virus type 1 T-cell or macrophage tropism, cytopathogenicity, and CD4 antigen modulation / E. Cheng-Mayer, M. Quiroga, J.W. Tung et al. // J. Virol. – 1990. – Vol. 64. – P. 43904398. 54. Chouquet, C. Correlation between breadth of memory HIV-specific cytotoxic T cells, viral load and disease progression in HIV infection / C. Chouquet, B. Autran, E. Gomard et al.// AIDS. – 2002. – № 16. – Р. 2399-2407. 55. Chun, T.W. Quantification of latent tissue reservoirs and total body viral load in HIV-1 infection / T.W. Chun, L. Carruth, D. Finzi et al. // Nature. – 1997. – Vol. 387. – Р. 183-188. 56. Cicala, C. HIV envelope induces a cascade of cell signals in non- proliferating target cells that favor virus replication / C. Cicala, J. Arthos, S.M. Selig et al. // The Proceedings of the National Academy of Sciences Online (U.S.). – 2002. – Vol. 99. – P. 9380-9385. 57. Coberley, C.R. Impact on genetic networks in human macrophages by a CCR5 strain of human immunodeficiency virus type 1 / C.R. Coberley, J.J. Kohler, J.N. Brown et al. // Journal of Virology. – 2004. – Vol. 78. – P. 11477-11486. 58. Cocchi, C. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells / F. Cocchi, A. DeVico, A. Garzino-Demo et al. // Science. – 1995. – Vol. 270. – P. 1811-1815. 59. Collins, K.L. HIV-1 nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes / K.L. Collins, B.K. Chen, B.D. Walker et al. // Nature. – 1998. – Vol. 391. – Р. 397-401. 117 60. Coutlee, F. Coamplification of HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in a nonisotopic polymerase chain reaction assay to control for amplification affiency / F. Coutlee, Y. He, P. Saint-Antoine et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. – 1995. – № 11. – Р. 363-371. 61. Covvadia, H. Antiretroviral agents – how best to protect infants from HIV and save their mothers from AIDS / H. Covvadia // N. Engl. J. Med. – 2004. – Vol. 351, № 3. – Р. 289-292. 62. Cozzi-Lepri, A. Evolution of drug resistance in HIV-infected patients remaining on a virologically failing combination antiretroviral therapy regimen / A. Cozzi-Lepri, A.N. Phillips, L. Ruiz et al. // AIDS. – 2007. – Vol. 21. – P. 721-732. 63. Dalgleish, A.G. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus / A.G. Dalgleish, P.C. Beverle., P.R. Clapham et al. // Nature. – 1984. – Vol. 312. – Р. 763-767. 64. Das, H. MICA engagement by human Vgamma2Vdelta2 T cells enhances their antigen-dependent effector functions / H. Das, V. Groh, C. Kuijl et al. // Immunity. – 2001. – Vol. 15. – P. 83-93. 65. Das, S.R. Biology of the HIV Nef protein / S.R. Das, S. Jameel // Indian J. Med. Res. – 2005. – Vol. 121. – Р. 315-332. 66. Davis, M.M. T-cells antigen receptor genes and T-cell recognition / M.M. Davis, P.J. Bjorkman // Nature. – 1988. – Vol. 334, № 6181. – P. 395-402. 67. Deng, H.K. Expression cloning of new receptors used by simian and human immunodeficiency viruses / H.K. Deng, D. Unutmaz, V.N. Kewalramani et al. // Nature. – 1997. – Vol. 388. – Р. 296-300. 68. Di Nicola, M. Qantization of CD34+ peripheral blood hematopoietic progenitors for autografting in cancer patients / M. Di Nicola, S. Siena, M. Bregni et al. // Int. J. Artif. Organs. – 1993. – № 5. – P. 80-82. 69. Donaghy, H. Loss of blood CD11c(+) myeloid and CD11c(-) plasmacytoid dendritic cells in patients with HIV-1 infection correlates with HIV-1 RNA virus load / H. Donaghy, A. Pozniak, B. Gazzard et al. // Blood. – 2001. – Vol. 98. – P. 2574. 118 70. Egger, M. Prognosis of HIV-1-infected patients starting highly active antiretroviral therapy: a collaborative analysis of prospective studies / M. Egger, M. May, G. Chene et al. // Lancet. – 2002. – Vol. 360. – P. 119-129. 71. Egger, M. Antiretroviral therapy in resource-poor settings: scaling up inequalities? / M. Egger, A. Boulle, M. Schechter et al. // International Journal of Epidemiology. – 2005. – Vol. 34. – P. 509-512. 72. Ellery, P.J. The CD16+ Monocyte Subset Is More Permissive to Infection and Preferentially Harbors HIV-1 In Vivo / P.J. Ellery, E. Tippett, Y.-L. Chiu et al. // Journal of Immunology. – 2007. – Vol. 178, № 10. – P. 6581-6589. 73. Embretson, J. Massive covert infection of helper T lymphocytes and macrophages by HIV during the incubation period of AIDS / J. Embretson, M. Zupancic, J.L. Ribas et al. // Nature. – 1993. – Vol. 362. – Р. 359-362. 74. Faucher, J-L. “6 markers/5 colors” extended white blood cell differential by flow cytometry / J-L. Faucher, C. Lacronique-Gazaille, E. Frébet et al. // Cytometry Part A. – 2007. – Vol. 71A, № 11. – P. 934–944. 75. Fauci, A.S. The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) / A.S. Fauci, H.C. Lane // Harrison's principles of internal medicine. – 1991. – P. 1402-1410. 76. Fauci, A.S. Immunopathogenic mechanisms of HIV infection / A.S. Fauci, G. Pantaleo, S. Stanley et al. // Ann. Intern. Med. – 1996. – Vol. 124. – P. 654-663. 77. Fauci, A.S. Human immunodeficiency virus (HIV) disease: AIDS and related disorders / A.S. Fauci, H.C. Lane // Harrison's principles of internal medicine. – 1997. – P. 1791-1856. 78. Fischer-Smith, T. CD163/CD16 coexpression by circulating monocytes/macrophages in HIV: potential biomarkers for HIV infection and AIDS progression / T. Fischer-Smith, E.M. Tedaldi, J. Rappaport // AIDS Res. Hum. Retroviruses. – 2008. – Vol. 24. – P. 417-421. 79. Freedberg, K.A. The cost effectiveness of combination antiretroviral therapy for HIV disease / K.A. Freedberg, E. Losina, M.C. Weinstein et al. // New England Journal of Medicine. – 2001. – Vol. 344. – P. 824-831. 119 80. Gallo, R.C. Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS) / R.C. Gallo, P.S. Savin, E.P. Gelmann et al. // Science. – 1983. – Vol. 220. – Р. 865-867. 81. Gandhi, R.T. HIV-1 directly kills CD4+ T cells by a Fas-independent mechanism / R.T. Gandhi, B.K. Chen, S.E. Straus et al. // J. Exp. Med. – 1998. – Vol. 187. – P. 1113-1122. 82. Gendelman, H.E. A selective defect of interferon alpha production in human immunodeficiency virus-infected monocytes / H.E. Gendelman, R.M. Friedman, S. Joe et al. // Journal of Experimental Medicine. – 1990. – Vol. 172. – P. 1433-1442. 83. Ganesh, L. The gene product murr1 restricts HIV-1 replication in resting CD4+ lymphocytes / L. Ganesh, E. Burstein, A. Guha-Niyogi et al. // Nature. – 2003. – Vol. 426. – Р. 853-857. 84. Giri, M.S. Circulating monocytes in HIV-1-infected viremic subjects exhibit an antiapoptosis gene signature and virus- and host-mediated apoptosis resistance / M.S. Giri, M. Nebozyhn, A. Raymond et al. // Journal of Immunology. – 2009. – Vol. 182. – P. 4459-4470. 85. Goldie, S.J. Cost-effectiveness of HIV treatment in resource-poor settings – the case of Côte d'Ivoire / S.J. Goldie, Y. Yazdanpanah, E. Losina et al. // New England Journal of Medicine. – 2006. – Vol. 355. – P. 1141-1153. 86. Gougeon, M.L. Programmed cell death in peripheral lymphocytes from HIV-infected persons: increased susceptibility to apoptosis of CD4 and CD8 T cells correlates with lymphocyte activation and with disease progression / M.L. Gougeon, H. Lecoeur, A. Dulioust et al. // J. Immunol. – 1996. – Vol. 56. – Р. 3509-3520. 87. Greub, G. Clinical progression, survival, and immune recovery during antiretroviral therapy in patients with HIV-1 and hepatitis C virus coinfection: the Swiss HIV Cohort Study / G. Greub, B. Ledergerber, M. Battegay et al. // Lancet. – 2000. – Vol. 356. – P. 1800-1805. 120 88. Grossmam, Z. Pathogenesis of HIV-infection: what the virus spares is as important as what it destroys / Z. Grossmam, M. Meier-Schellersheim, W.E. Paul et al. // Nat. Med. – 2006. – Vol. 12. – Р. 289-295. 89. Hammer, S.M. Treatment for adult HIV infection: 2006 recommendations of the International AIDS Society – USA panel / S.M. Hammer, M.S. Saag, M. Schechter et al. // The Journal of the American Medical Association. – 2006. – Vol. 296. – P. 827-843. 90. Hammer, S.M. International AIDS Society-USA. Antiretroviral treatment of adult HIV infection: 2008 reccomendations of the International AIDS Society-USA panel / S.M. Hammer, J.J. Eron, P. Jr. Reiss et al. // The Journal of the American Medical Association. – 2008. – Vol. 300, № 5. – Р. 555-570. 91. Harari, A. Analysis of HIV-1 and CMV specific memory CD4 T cell responses during primary and chronic infection / A. Harari, G.P. Rizzardi, K. Ellefsen et al. // Blood. – 2002. – Vol. 100. – Р. 1381-1387. 92. Harrington, M. Hit HIV-1 hard, but only when necessary / M. Harrington, C.C. Carpenter // Lancet. – 2000. – Vol. 355. – P. 2147-2152. 93. Heggelund, L. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences / L. Heggelund, J.K. Damas, A. Yndestad et al. // Clinical and Experimental Immunology. – 2004. – Vol. 138. – P. 116-121. 94. Heid, C.A. Real-time quantitative PCR / C.A. Heid // Genome Res. – 1996. – №6. – Р. 986-994. 95. Heikinheimo, O. Contraception and HIV infection in women / O. Heikinheimo, P. Lahteenmaki // Human Reproduction Update. – 2009. – Vol. 15, №2. – P. 165-176. 96. Herbein, G. Distinct mechanisms trigger apoptosis in human immunodeficiency virus type 1-infected and in uninfected bystander T lymphocytes / G. Herbein, C. Van Lint, J.L. Lovett et al. // Virol. – 1998. – Vol. 72. – P. 660-670. 97. Higuchi, R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA 121 amplification reactions / R. Higuchi // Biotechnology. – 1993. – №11. – Р. 1026-1030. 98. Hughes, M.D. Monitoring plasma HIV-1 RNA levels in addition to CD4 + lymphocyte count improves assessment of antiretroviral therapeutic response. ACTG 241 protocol virology substudy team / M.D. Hughes, V.A. Johnson, M.S. Hirsch et al. // Annals of Internal Medicine. – 1997. – Vol. 126. – P. 929-938. 99. Jaworowski, A. Normal CD16 Expression and Phagocytosis of Mycobacterium avium Complex by Monocytes from a Current Cohort of HIV-1– Infected Patients / A. Jaworowski, P. Ellery, C.L. Maslin et al. // The Journal of Infectious Diseases. – 2006. – Vol. 193. – P. 693-697. 100. Kari, L. Classification and prediction of survival in patients with the leukemic phase of cutaneous T cell lymphoma / L. Kari, A. Loboda, M. Nebozhyn et al. // Journal of Experimental Medicine. – 2003. – Vol. 197. – P. 1477-1488. 101. Kim, W.K. Monocyte heterogeneity underlying phenotypic changes in monocytes according to SIV disease stage / W.K. Kim, Y. Sun, H. Do et al. // Journal of Leukocyte Biology. – 2010. – Vol. 87. – P. 557-567. 102. Kirchhoff, F. Brief report: Absence of intact nef sequences in a long-term survivor with nonprogressive HIV-1 infection / F. Kirchhoff, T.C. Greenough, D.B. Brettler et al. // N. Engl. J. Med. – 1995. – Vol. 332. – Р. 228-232. 103. Klein, M.B. The impact of hepatitis C virus coinfection on HIV progression before and after highly active antiretroviral therapy / M.B. Klein, R.G. Lalonde, S. Suissa // Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. – 2003. – Vol. 33. – P. 365-372. 104. Kumarasamy, N. High frequency of clinically significant mutations after first-line generic highly active antiretroviral therapy failure: implications for second-line options in resource-limited settings / N. Kumarasamy, V. Madhavan, K.K. Venkatesh et al. // Clin. Infect. Dis. – 2009. – Vol. 49. – P. 306-309. 105. Lane, H.C. Correlation between immunologic function and clinical subpopulations of patients with the acquired immune deficiency syndrome / H.C. Lane, H. Masur, E.P. Gelmann et al. // Am. J. Med. – 1985. – Vol. 78. – P. 417-422. 122 106. Lane, H.C. The generation of CD4 T lymphocytes in patients with HIV infection / H.C. Lane // J. Biol. Regul. Homeostatic Agents. – 1995. – Vol. 9. – P. 107109. 107. Lange, C.G. Nadir CD4 + T-cell count and numbers of CD28 + CD4 + Tcells predict functional responses to immunizations in chronic HIV-1 infection / C.G. Lange, M.M. Lederman, K. Medvik et al. // AIDS. – 2003. – Vol. 17. – P. 2015-2023. 108. Lederman, M.M. Immune restoration with antiretroviral therapies: implications for clinical management / M.M. Lederman, H. Valdez // The Journal of the American Medical Association. – 2000. – Vol. 284. – P. 223-228. 109. Levy, J.A. Controlling HIV pathogenesis: the role of the noncytotoxic antiHIV response of CD8+ T cells / J.A. Levy, C.E. Mackewicz, E. Barker // Immunol. Today. – 1996. – Vol. 17. – Р. 217-224. 110. Liao, F. STRL-33, a novel chemokine receptor-like protein, functions as a fusion cofactor for both macrophage-tropic and T cell line-tropic HIV-1 / F. Liao, G. Alkhatib, K.W.C. Peden et al.// J. Exp. Med. – 1997. – Vol. 185. – Р. 2015-2023. 111. Lichterfeld, M. HIV-1 specific cytotoxicity is preferentially mediated by a subset of CD8+ T cells producing both interferon gamma and tumor necrosis factor alpha / M. Lichterfeld, X.G. Yu, M.T. Waring et al.// J. Exp. Med. – 2004. – Vol. 104. – Р. 487-494. 112. Liu, S.L. Divergent patterns of progression to AIDS after infection from the same source: HIV type 1 evolution and antiviral responses / S.L. Liu, T. Schacker, L. Musey et al. // J. Viral. – 1997. – Vol. 71. – Р. 4284-4295. 113. Luider, J. Impact of the new Beckman Coulter Cytomics FC 500 5-color flow cytometer on a regional flow Cytomerty clinical laboratory servise / J. Luider, M. Cyfra, P. Johnson et al. // Laboratory Hematology. – 2004. – Vol.10. – P. 102-108. 114. Mariani, R. Species-specific exclusion of APOBEC3G from HIV-1 virions by vif / R. Mariani, D. Chen, B. Schrofelbauer et al. // Cell. – 2003. – Vol. 114. – Р. 2131. 123 115. Mazzoli, S. HIV-specific mucosal and cellular immunity in HIVseronegative partners of HIV-seropositive individuals / S. Mazzoli, D. Trabattoni, S. Lo Caputo et al. // Nat. Med. – 1997. – № 3. – Р.1250-1257. 116. McElrath, M.J. Mononuclear phagocytes of blood and bone marrow: comparative roles as viral reservoirs in human immunodeficiency virus type 1 infections / M.J. McElrath, J.E. Pruett, Z.A. Cohn // The Proceedings of the National Academy of Sciences Online (U.S.). – 1989. – V. 86. – P. 675-679. 117. McMichael, A.J. Cellular immune responses to HIV / A.J. McMichael, S.L. Rowland-Jones // Nature. – 2001. – Vol. 410. – P. 980-987. 118. Mellors, J.W. Plasma viral load and CD4 + lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection / J.W. Mellors, A. Munoz, J.V. Giorgi et al. // Annals of Internal Medicine. – 1997. – Vol. 126. – P. 946-954. 119. Menz, C. Dendritic cell maturation by innate lymphocytes: coordinated stimulation of innate and adaptive immunity / C. Menz, R. Steinman, S. Fujii // J. Experimental Medicine. – 2005. – Vol. 202. – P. 203-207. 120. Miller, R.H. HIV accessory proteins as therapeutic targets / R.H. Miller, N. Sarver // Nat. Med. – 1997. – № 3. – Р. 389-394. 121. Mocroft, A. Normalization of CD4 counts in patients with HIV-1 infection and maximum virological suppression who are taking combination antiretroviral therapy: an observational cohort study / A. Mocroft, A.N. Phillips, J. Gatell et al. // Lancet. – 2007. – Vol. 370. – P. 407-413. 122. Napravnik, S. Gender difference in HIV RNA levels: a meta-analysis of published studies / S. Napravnik, C. Poole, J.C. Thomas et al. // Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. – 2002. – Vol. 31. – P. 11-19. 123. Noraz, N. HIV-induced apoptosis of activated primary CD4+ T lymphocytes is not mediated by Fas-Fas ligand / N. Noraz, J. Gozlan, J. Corbeil et al. // AIDS. – 1997. – Vol. 11. – P.1671-1680. 124 124. Oh, S.Y. Identification of HIV-1 envelope glykoprotein in the serum of AIDS and ARC patients / S.Y. Oh, W.W. Cruickshank, J. Raina et al. // J. Acquired Immune Defic. Syndr. – 1992. – № 5. – Р. 251. 125. Olivetta, E. HIV-1 Nef induces the release of inflammatory factors from human monocyte/macrophages: involvement of Nef endocytotic signals and NF-kappa B activation / E. Olivetta, Z. Percario, G. Fiorucci et al. // Journal of Immunology. – 2003. – Vol. 170. – P. 1716-1727. 126. Orenstein, J.M. Macrophages as a source of HIV during opportunistic infections / J.M. Orenstein, C. Fox, S.M. Wahl // Science. – 1997. – Vol. 276. – P. 1857-1861. 127. Owens, M.A. Flow cytometry principles for clinical laboratory practice. Quality Assurance for Quantitative Immunophenotyping / M.A. Owens, M.R. Loken. – New York, 1995 – 25 p. 128. Pahwa, S. Pediatric acquired immunodeficiency syndrome: demonstration of B lymphocyte defects in vitro / S. Pahwa, S. Fikrig, R. Menez et al. // Diagn. Immunol. – 1986. – Vol. 4, № 1. – P. 24-30. 129. Pantaleo, G. HIV infection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease / G. Pantaleo, C. Graziosi, J.F. Demarest et al.// Nature. – 1993. – Vol. 362. – Р. 355-358. 130. Pantaleo, G. The immunopathogenesis of human immunodeficiency virus infection / G. Pantaleo, C. Graziosi, A.S. Fauci // N. Engl. J. Med. – 1993. – Vol. 328. – P. 327-335. 131. Peter, F. HIV nef: The mother of all evil / F. Peter // Immunity. – 1998. – № 9. – Р. 433-437. 132. Rapaport, E. Mapping of HIV-1 determinants of apoptosis in infected T cells / E. Rapaport, C.R. Casella, F. Mustafa et al. // Virology. – 1998. – Vol. 252. – P. 407-417. 125 133. Robbins, G.K. Comparison of sequential three-drug regimens as initial therapy for HIV-1 infection / G.K. Robbins, V. De Gruttola, R.W. Shafer et al. // New England Journal of Medicine. – 2003. – Vol. 349. – P. 2293-2303. 134. Rockstroh, J.K. Influence of hepatitis C virus infection on HIV-1 disease progression and response to highly active antiretroviral therapy / J.K. Rockstroh // Journal of Infectious Diseases. – 2005. – Vol. 15. – P. 992-1002. 135. Rosenberg, E.S. Vigorous HIV-1-specific CD4 T cell responses associated with control of viremia / E.S. Rosenberg, J.M. Billingsley, A.M. Caliendo et al. // Science. – 1997. – Vol. 278. – Р. 1447-1450. 136. Sack, U. Multiplex analysis of cytokines in exhaled breath condensate / U. Sack, R. Schiebe, M. Wotzel et al. // Cytometry A. – 2006. – Vol. 69, № 3. – P. 169172. 137. Saha, K. Isolation of primary HIV-1 that target CD8+ T lymphocytes using CD8 as a receptor / K. Saha, J. Zhang, A. Gupta et al. // Nat. Med. – 2001. – Vol. 7. – Р. 65-72. 138. Shafer, R.W. Comparison of four-drug regimens and pairs of sequential three-drug regimens as initial therapy for HIV-1 infection / R.W. Shafer, L.M. Smeaton, G.K. Robbins et al. // New England Journal of Medicine. – 2003. – Vol. 349. – P. 2304-2315. 139. Shapiro, H.M. Practical flow cytometry / H.M. Shapiro. – New York, 1995. – 542 p. 140. Sunila, I. Gpl20 is present on the plasma membrane of apoptotic CD4 cells prepared from lymph nodes of HIV-1-infected individuals: an immunoelectron microscopic study / I. Sunila, M. Vaccarezza, G. Pantaleo et al. // AIDS. – 1997. – № 11. – P. 27-32. 141. Sykes, P.J. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution / P.J. Sykes, S.H. Neoh, M.J. Brisco et al. // BioTechniques. – 1995. – № 13. – Р. 444-449. 142. Thibault, S. TLR2 and TLR4 triggering exerts contrasting effects with regard to HIV-1 infection of human dendritic cells and subsequent virus transfer to 126 CD4+ T cells / S. Thibault, R. Fromentin, M.R. Tardif et al. // Retrovirology. – 2009. – Vol. 6. – P. 42. 143. Tyagib, S. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization / S. Tyagib, F.R. Kramer // Nat. Biotechnol. – 1996. – № 14. – Р. 303-308. 144. Van Asten, L. Infection with concurrent multiple hepatitis C virus genotypes is associated with faster HIV disease progression / L. Van Asten, M. Prins // AIDS. – 2004. – Vol. 18. – P. 2319-2324. 145. Williams, D.W. Mechanisms of HIV Entry into the CNS: Increased Sensitivity of HIV Infected CD14+CD16+ Monocytes to CCL2 and Key Roles of CCR2, JAM-A, and ALCAM in Diapedesis / D.W. Williams, T.M. Calderon, L. Lopez et al. // PLoS One. – 2013. – Vol. 8, № 7. – P. 1-15. 146. Wu, H. Multiple CD4 + cell kinetic patterns and their relationships with baseline factors and virological responses in HIV type 1 patients receiving highly active antiretroviral therapy / H. Wu, E. Connick, D.R. Kuritzkes et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. – 2001. – Vol. 17. – P. 1231-1240. 147. Zack, J.A. HIV-l entry into quiescent primary lymphocytes: Molecular analysis reveals a labile, latent viral structure / J.A. Zack, S.J.Arrigo, S.R. Weitsman et al. // Cell. – 1990. – Vol. 61. – P. 213-222. 148. Zhang, D. Most antiviral CD8 T cells during chronic viral infection do not express high levels of perforin and are not directly cytotoxic / D. Zhang, P. Shankar, Z. Xu et al. // Blood. – 2003. – Vol. 101. – P. 226-235. 149. Zhang, L. Quantifying residual HIV-1 replication in patients receiving combination antiretroviral therapy / L. Zhang, B. Ramratnam, K. Tenner-Racz et al. // New England Journal of Medicine. – 1999. – Vol. 340. – P. 1605-1613. 150. Ziegler Heitbrock, H.W. The novel subset of CD14+ /CD16+ blood monocytes exhibits features of tissue macrophages / H.W. Ziegler Heitbrock, G. Fingerle, M. Strobel et al. // European Journal of Immunology. – 1993. – Vol. 23. – P. 2053-2058.
