Заботина Т.Н. №1 02.12.2015 МИНСК
реклама
РОЛЬ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЗАБОТИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России 2 декабря 2015 МИНСК Структура онкологических заболеваний (по возрасту) (данные ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России) ДЕТИ ВЗРОСЛЫЕ 5% 46% 54% онкогематология солидные новообразования 95% онкогематология солидные новообразования Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Взаимодействие опухоли и иммунной системы (The tumor immunoediting concept, Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ. 2011 ) Элиминация Равновесие Иммунологический надзор Персистенция/«спящие» клетки Иммунная система (врожденный и адаптивный Иммунитет) Прогрессия опухолевого роста Генетическая нестабильность и иммунная селекция (редактирование) Нормальные клетки Полное или частичное удаление опухолевых клеток Иммунная система контролирует опухолевую прогрессию. Клинические проявления отсутствуют. Высокоиммуногенные опухолевые клетки Слабоиммуногенные опухолевые клетки Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Основные субпопуляции клеток иммунной системы B клетки Т клетки CD8+ ЦТЛ Th1 CD8+reg NK клетки CD4+ Th2 Tr1 Регуляторные CD4+Т клетки Th3 Антигенпрезентирующие клетки NKT CD4+CD25+ Treg Миелоидние супрессорные клетки Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России • Объект иммунологического исследования у больных солидными новообразованиями Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России • Необходимый и достаточный объем иммунологического исследования больных с солидными новообразованиями Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Линейный анализ лимфоцитов: CD3/CD19 CD3/CD4 CD3/CD8 CD3/CD16+CD56+ CD4/CD8 Контрольная сумма: Т+В+NK=100 5% Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Структура линейных популяций лимфоцитов периферической крови больных раком яичников до и после хирургического лечения (% антигенположительных клеток)(n=54) Маркер СD3+ до операции (M m) 62,5 3,1* CD3ˉCD16+56+ 25,9% 2,3* CD19+ 6,9 0,9 * после операции (M m) 61,8 2,7* доноры (M m) 73,9 2,5 23,2 2,1* 8,4 1,2 16,5 2,0 7,5 1,4 различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05) Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БОЛЬНЫХ ПО ИСХОДНОМУ УРОВНЮ CD3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ 21,4% 42,9% CD3 норма CD3 низкий CD3 высокий 35,7% Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Относительное (%) содержание линейных популяций лимфоцитов периферической крови больных раком яичников до и после операции в зависимости от исходного количества CD3+ Т клеток (M±m) Группы 1 (N CD3) 2 (↓CD3) 3 (↑CD3) до операции 68,5 1,2 44,4 3,9* 80,3 2,2 после операции 64,2 3,4* 54,5 4,4*;** 72,2 4,8 до операции 22,9 1,3* 37,7 3,6* 12,4 1,8 после операции 19,5 1,8 30,7 3,7* 15,0 3,0 до операции 4,9 0,6 10,2 2,1 5,7 0,4 после операции 7,8 1,7 9,5 2,6 7,8 1,0 доноры маркер CD3+ Т клетки CD3ˉCD16+56+ NK клетки CD19+ В клетки 73,9 2,5 16,5 2,0 7,5 1,4 * различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05) ** различия статистически достоверные в подгруппах сравнения до и после операции (<0,05) Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России ВЗАИМОСВЯЗЬ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ С ИСХОДНЫМ УРОВНЕМ CD3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ CD3 норма CD3 низкий CD3 высокий 20,0% 50,0% 50,0% 40,0% 50,0% 50,0% 40,0% Прогрессирование, летальный исход Ремиссия, полный эффект Стабилизация, частичный эффект Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Dotplot анализ CD45+CD3+CD16+CD56+ NK T клеток больных раком яичников CD3 N CD3↓ CD3↑ 3.09% CD3 FITC 7.67% CD16+CD56 PE CD16+CD56 PE CD16+CD56 PE 30.35% CD3 FITC CD3 FITC Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Анализ микрометастазов в костный мозг первичной больной раком яичников СК+ клетки на срезе трепанобиоптата КМ. Иммуногистохимическое исследование, ув. 400 Total Events 1876365 Gated Events 4246 0.22% CD45 PE-Cy5 (5) vs Empty (2) Region X-Mean Y-Mean Events %Total R0 294.7 108.4 1876365 100.00 R1 13.1 31.5 4246 0.22 Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Что характерно для онкологических больных? Первичные нарушения иммунной системы или иммунологические нарушения, индуцированные опухолевым процессом? Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных РМЖ до и после операции в зависимости от стадии заболевания (M±m) Маркер CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD3-CD8+ CD8 CD4/CD8 До и после операции I стадия (n=24) 2А и 2Б стадии (n=38) 3А стадия (n=11) Доноры (n=30) До операции 32,2 1,7*,*** 36,3 1,2* 41,2 4,0 43,4 1,6 После операции 34,2 2,3* 37,0 1,6* 45,8 3,9 До операции 26,0 1,7 26,0 1,7 23,8 2,0 26,9 1,1 После операции 25,1 1,6 25,4 1,7 23,6 2,1 До операции 15,0 1,4* 13,6 1,6* 10,7 1,4 После операции 15,3 1,9* 12,1 1,4* 9,4 До операции 41,0 1,7*,*** 39,6 1,7 34,4 1,3 После операции 40,4 1,5* 37,6 1,6 33,0 2,4 До операции 0,8 0,07* 1,0 0,06* 1,3 0,1 После операции 0,9 0,09* 1,0 1,5 0,08* 7,7 0,6 1,3 34,6 1,4 1,4 1,0 0,2 * - различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05) ***- различия статистически достоверные по сравнению с группой с 3А стадией (р<0,05) Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России DotPlot анализ коэкспрессии антигенов CD3 и CD8 на CD45+лимфоцитах периферической крови больных РМЖ CD3-/CD8+ CD3+/CD8+ 8,4% 17,9% донор CD3-/CD8+ CD3+/CD8+ 28,7% 7,8% больная РМЖ CD3-/CD8+ CD3+/CD8+ 9,2% 33,7% больная РМЖ Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Популяция NKT-лимфоцитов больных первично-операбельным РМЖ % антигенположительных клеток C D 3+ C D 16+ C D 56+ л им ф о циты 16 14 12 10 8 6 4 2 0 до операции после операции Маркер CD3+CD16+CD56+ доноры I стадия (n=24) 2А и 2Б стадии (n=38) 3А стадия (n=11) Доноры (n=30) 8,7 0,8 до операции 17,7 1,3*,*** 14,5 1,2*,*** 9,5 после операции 17,1 1,4*,*** 13,7 1,2* 11,0 1,6 1,7 * - различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05) *** - различия статистически достоверные по сравнению с группой с 3А стадией (р<0,05) Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Современные методы лечения рака: Хирургия Химиотерапия/лекарственная терапия Радио-лучевая терапия Биотерапия/Иммунотерапия Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Иммунотерапия при солидных новообразованиях является Ведущим методом лечения для больных с диагнозом меланома и рак почки Поддерживающим методом лечения больных с солидными новообразованиями в перерывах между основными курсами химио- и лучевой терапии Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Т регуляторные лимфоциты Эффекторные лимфоциты Эффекторные лимфоциты Т регуляторные лимфоциты Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Число больных раком молочной железы, имеющих повышенное количество регуляторных популяций лимфоцитов в периферической крови % CD4 Тreg NKT CD8+CD28-CD11bТ.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Перфорин-позитивные субпопуляции лимфоцитов доноров CD45+CD8+CD16-CD3+ (T лимфоциты) CD45+CD16+CD8-CD3(NK клетки) CD45+CD16+CD8+CD3+ (NKТ лимфоциты) 7,1 2,2% 9,2 3,4% 0,6 0,4% Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Экспрессия перфорина в СD16 и CD8 лимфоцитах онкологического больного Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Фенотип CD8 лимфоцитов онкологических больных Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Коэкспрессия CD8 и СD16 антигенов на поверхности перфорин-позитивных лимфоцитов периферической крови онкологических больных в процессе вакцинотерапии (терапевтический режим) стабилизация прогрессирование CD16+CD8-NK клетки CD8+CD16+ лимфоциты CD8+CD16Т лимфоциты CD16+CD8NK клетки CD8+CD16+ лимфоциты Выделение популяции Perforin+ лимфоцитов для исследования CD8+CD16Т лимфоциты Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Гранзим-В - CD8+CD16 Т лимфоциты CD4+Т лимфоциты - CD16+CD8 NK клетки CD8+CD16+ лимфоциты Перфорин Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Коэкспрессия внутриклеточного Granzyme В в популяции CD4 лимфоцитов онкологических больных до начала вакцинотерапии CD4+Granzyme B+ 0,7% CD4 FITC прогрессирование Granzyme B PE Cy-5 Granzyme B PE Cy-5 стабилизация CD4+Granzyme B+ 15,3% CD4 FITC Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Динамика изменений минорной субпопуляции CD45 + CD4 +GranzymeB+ Т-клеток у больных диссеминированной меланомой в процессе терапии Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Фенотип Т регуляторных клеток человека CD4 CD11a CD25 CD38 positive high positive positive and negative subsets CD62L low and high subsets CD95(Fas) high CD103 positive and negative subse CD122 (IL-2Rβ) positive CD134 (OX-40) positive and negative subsets CD45RO CD54 (ICAM-1) CD8 CD45RA CD45RB CD86 CD154 (CD40L) CD127 CD152 (CTLA-4) FoxP3/scurfin GITR IL-10 TGFβ positive high negative negative low negative negative low high positive high positive positive Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Иммунофенотип больного меланомой и его корреляция с сывороточным маркером S100 (мкг/л) CD25+ 3.4% 04/04/07 CD25+CD4+ 5.9 % CD25+ 4.2% 26/06/07 CD25+CD4+ 9.6% CD4+ CD25+ 9.1% 04/09/07 CD25+CD4+ 14.6% CD4+ S100 – 0,052 CD4+ S100 - 0,115 N < 0,120 мкг/л S100 - 0,298 Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Фенотипирование Т регуляторных клеток больной раком молочной железы Total Events 15241 Gated Events 4526 29.70% 7.91% Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Динамика популяции Т reg лимфоцитов CD4+CD25high+FoxP3+ больной раком молочной железы (протокол Герцептин) Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Анализ регуляторной субпопуляции CD4+CD25+Foxp3+ лимфоцитов онкологической больной (РМЖ) 0,5% донор 9,1% больная РМЖ Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Динамика популяции Т reg лимфоцитов CD4+CD25high+CD127low+ больной раком яичников после операции до операции 9,96% 3,54% Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Высокотехнологичные методы иммунотерапии, используемые в онкологии, требуют адекватного иммуномониторинга эффективности проводимой терапии, а также использования иммунологических критериев для отбора больных Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Популяция CD3+CD16+CD56+ лимфоцитов периферической крови больных меланомой Больной меланомой кожи (локальная форма) 7,9% донор 3,2% Больной меланомой кожи (диссеминированная форма) 18,7% Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Динамика CD45+CD8+CD11b+ цитотоксических Т-клеток у больных меланомой, получающих дендритноклеточную вакцину Количество вакцинаций 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 % ЦТ Т-клеток % Терапевтический режим Стабилизация 0 1 2 3 4 5 6 % ЦТ Т-клеток Терапевтический режим Прогрессирование % ЦТ Т-клеток 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Профилактический режим Ремиссия Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Прогностическое значение CD3+CD16+CD8+ лимфоцитов больных меланомой при лечении дендритноклеточной вакциной % антиген-положительных клеток Стабилизация Профилактический режим p<0,05 Прогрессирование Терапевтический режим Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Рецепторы Т- клеток как мишени для терапевтических моноклональных антител Стимуляция 4-1BB (CD137) Анти4-1ВВ BMS-663513 GITR Подавление CTLA-4 TIM-3 CD28 PD-1 Анти-CD28 OX40 Анти-OX40 Анти-CTLA-4 Ipilimumab Tremelimumab Анти-PD-1 BMS-663513 BMS-936558 CT-011 MK-3475 PD-L1 Anti-PD-L1 MDX-1105 (BMS-936559) Опухолевая или антигенпрезентирующая клетка Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Некоторые моноклональные антитела (мАТ), используемые для восстановления противоопухолевого иммунного ответа. Мишень, Экспрессия мАТ или fusion protein CTLA-4 (активированные Т-клетки, регуляторные Т-клетки) Анти-CTLA-4 PD-1 (B7-H1, CD274) (активированные Т-, Вклетки, макрофаги, Т-рег) Анти-PD-1 PD-L1 = лиганд PD-1, (Т-, В-, NK- клетки, макрофаги, ДК, опухолевые клетки) Анти-PD-L1 PD-L2 = лиганд PD-1 (преимущественно активированные макрофаги и ДК, В-клеточные лимфомы) AMP-224, (PD-L2 ̶ Ig) Рекомбинантный белок, состоящий из PD-L2 и Fc фрагмента IgG1 CD40 (B-клетки; ДК; макрофаги; фибробласты; эндотелиальные клетки; некоторые гранулоциты; опухолевые клетки) Анти-CD40 CP-870,893 Dacetuzumab (SGN-40) Ипилимумаб Тремелимумаб BMS-936558 (Ниволумаб) CT-011 MK-3475 (Ламбролизумаб) MDX-1105 (BMS-936559) Механизм действия Блокируя сигнал с CTLA-4, продлевают активацию Тклеток и восстанавливают их пролиферацию, что повышает Т-клеточный иммунитет и восстанавливает способность пациента к эффективному противоопухолевому иммунному ответу Взаимодействие PD-1 – PD-L1 играет центральную роль в ускользании опухоли от иммунологического надзора. Блокада этого взаимодействия восстанавливает количество и функцию опухолеспецифических CD8+клеток-эффекторов и отменяет супрессорную функцию регуляторных Т-клеток. Высокий уровень экспрессии PD-L1 на опухолевых клетках коррелирует с плохим прогнозом заболевания у больных различными формами рака. Экспрессия PD-L2 зависит от сигналов в микроокружении. Основная функция PD-L2 ̶ регуляция Th2- Т-клеточного иммунного ответа. Значение блокирования PD-L2 для противоопухолевого иммунитета до конца не установлено. Непрямое действие – активация иммунных клеток. Прямое действие – индукция апоптоза опухолевых клеток и нарушение опухолевого роста. Различие путей передачи сигнала с CTLA-4 и PD-1 TCR CD28 CTLA-4 PD-1 — PI3K Bcl-xL — PP2A Akt IL-2 James L. Riley, Immunol Rev. 2009; 229: 114. Glukose metabolism Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Клиническая эффективность одновременного применения Nivolumab (anti PD-1) и Ipilimumab (anti-CTLA-4) у больных меланомой Wolchok J.D. et al. N Engl J Med. 2013 Jul 11;369(2):122-133. В. Изменение величины поражения, по сравнению с исходными уровнями, у индивидуальных больных, получавших препараты одновременно. В общей сложности 47 пациентов получили лечение. Пунктирная линия обозначает 80% снижение размера очагов поражения по сравнению с исходным значением. Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России Для разработки индивидуальных подходов к лечению онкологических больных, в частности для отбора пациентов, лечение которых будет эффективным, необходимо установление иммунологических критериев, коррелирующих с течением заболевания и с ответом на иммунотерапию, в частности, моноклональными антителами, взаимодействующими с рецепторными молекулами лимфоцитов. Мониторинг иммунологических показателей должен являться неотъемлемым компонентом в лечении онкологических больных Т.Н.Заботина ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России
