Иммуноглобулин Е (IgE)

Иммуноглобулин Е (IgE)
(Хемилюминесцентные тесты CIA)
Код товара: 2375-300
Назначение:
Количественное определение концентрации иммуноглобулина Е (IgE) в
человеческой
сыворотке
при
помощи
хемилюминесцентного
иммуноферментного анализа.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Диагностику аллергических реакций, которые становятся всё более широко
распространенными, обычно проводят на основе истории болезни и клинических
симптомов. Анализы in vitro и in vivo играют ключевую роль в подтверждении
клинического диагноза и назначении лечения. Измерение иммуноглобулина Е в
сыворотке широко используется для диагностики аллергических реакций и инфекций,
вызываемых паразитами. Причиной множества аллергий является реакция между
аллергеном и специализированными клетками, опосредованная иммуноглобулинами
подкласса IgE. Молекулы IgE (молекулярный вес - 200,000) привязаны к поверхности
тучных клеток и базофильных гранулоцитов. Следовательно, связывание аллергена
с IgE, прикрепленному к клетке, вызывает высвобождение из клеток гистамина и
других вазоактивных веществ. Поступление гистамина в организм запускает
общеизвестную аллергическую реакцию.
Перед назначением терапевтического лечения важно выяснить, служит ли IgE
медиатором аллергической реакции или нет. Для этого необходимы измерение
общего IgE
в пробе сыворотки и другая вспомогательная диагностическая
информация. Измерение циркулирующего общего IgE позволяет рано выявить
аллергию у детей и предупредить возникновение атопических заболеваний.
Принимая решение о терапии, необходимо учесть всю релевантную клиническую
информацию, включая результаты теста на специфический аллерген.
Концентрация IgE в детстве постепенно снижается, достигая взрослого уровня на
второе десятилетие жизни. Обычно уровень общего IgE повышен у лиц, страдающих
аллергией, и зависит от числа предшествующих контактов с аллергенами. Очень
высокая концентрация IgE может наблюдаться у индивидов с повышенной
чувствительностью, а также при миеломах, лёгочном аспергиллёзе, во время
активной фазы инфекций, вызванных паразитами.
Для проведения теста сначала вносят калибратор IgE, препарат пациента и контроль
в лунку, покрытую стрептавидином. После этого добавляют биотинилированное
моноклональное антитело (специфичное для иммуноглобулина Е) и реагенты
смешивают. В результате реакции между антителами и нативным IgE формируется
иммунный комплекс, который оседает в лунке, покрытой стрептавидином. Далее
лунки промываются, чтобы удалить излишек белков сыворотки, и добавляется
другое антитело, специфичное к IgE и помеченное энзимами. Антитело, помеченное
энзимами, прикрепляется в ферритину, уже находящемуся в планшете. Избыток
энзимов удаляется при промывании планшета. Добавляется субстрат для
считывания
светового
сигнала.
Интенсивность
люминисценции
прямо
пропорциональна концентрации иммуноглобулина Е в пробе.
ПРИНЦИП
Иммуноферментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
высокоафинные и
специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке,
и нативный антиген.
При этой процедуре иммобилизация происходит во время теста на поверхности
лунки микропланшета при взаимодействии стрептавидина и добавления извне
моноклонального антитела к IgE.
При смешивании моноклонального антитела, антитела, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, в результате которой формируется растворимый комплекс
антиген-антитело. Взаимодействие описывается следующим уравнением:
- биотинилированное моноклональное антитело (в избытке)
- нативный антиген (переменное количество)
- комплекс антиген-антитело (переменное количество)
- постоянная скорость ассоциации
- постоянная скорость диссоциации
- иммобилизованный стрептавидин на поверхности лунки.
(IC) - комплекс антиген-антитело на поверхности лунки.
После достижения равновесия, фракция антиген-антитело отделяется от
несвязанного антигена при помощи декантации или аспирации. Добавляется другое
антитело (направленное на другой эпитоп), помеченное энзимами. Происходит еще
одна реакция, в результате которой формируется комплекс антитело-антигенбиотинилированное антитело на поверхности лунки. Проводится промывание для
удаления избытка ферментов из лунки. Добавляют подходящий субстрат для того,
чтобы интенсивность света можно было измерить при помощи микропланшетного
люминометра. Активность ферментов в фракции связанных антител прямо
пропорциональна концентрации нативного антигена. Используя несколько различных
известных контрольных показателей антигена, можно построить кривую дозовой
зависимости и найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
- антитело, меченое ферментами (в избытке)
- комплекс антиген-антитело
- постоянная скорость ассоциации
- постоянная скорость диссоциации
РЕАГЕНТЫ:
A. Калибраторы человеческой сыворотки–1мл/пробирка - Обозначения A-F
Шесть (6) пробирок с калибраторами человеческой сыворотки для уровней 0(A),
5(B), 25(C), 50(D), 150(E) и 400(F) IU/ml. Хранить при 2-8°C. Консервирующее
вещество добавлено.
(Калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны при
использовании эталонного препарата, составленного по WHO 2rd IRP 75/502 для IgE.)
B. Биотинилированный реагент IgE —13 ml/пробирка E
Одна (1) пробирка, содержащая моноклональные мышиные антитела к
человеческому IgE на стабилизованной белками матрице. Хранить при температуре
2-8°C.
C. Меченый реагент IgE - 13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка анти-человеческого конъюгата IGE-HRP на стабилизованной
белками матрице. Консервант добавлен. Хранить при температуре 2-8°C.
D. Лунки со Стрептавидином - 96 лунок - Значок
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-8°C.
E. Концентрат промывающего раствора -- 20ml – значок
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30°C (см. Раздел по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент А – 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре 2-8°C. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент B – 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (H2O2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8°C (см. Раздел по подготовке реагентов).
H. Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 28°C.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объемов 25 и 50 µl с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Микропланшетный люминометр.
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20°С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.050 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°C) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор индикаторного реагента – готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора ‘A’ и раствора ‘B’ в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27° C).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°C.
2. Внесите 0.025 ml (25µl) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100µl) биотинированного реагента IgE в каждую лунку.
Необходимо вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300µl промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний – три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (100µl) помеченных ферментами антител к IgE в каждую лунку.
9. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
10. Инкубируйте при комнатной температуре в течение тридцати (30) минут.
11. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
12. Добавьте 300µl промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний – три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
13. Добавьте 0.100 ml (100µl) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подготовке реагентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
14. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
15.
Считайте
RLU
(относительные
световые
единицы)
при
помощи
микропланшетного люминометра на 96 лунок (0.2-1.0 секунды на лунку). Измерение
должно проводиться в течение тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации IgE в препаратах используется кривая
дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации IgE в ng/ml.
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию IgE, отложите среднее RLU каждого
препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с кривой и по
горизонтальной оси графика определите концентрацию (в ng/ml) (можно найти
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В приведенном
ниже примере, среднее RLU (32233) пересекает калибровочную кривую при
концентрации IgE 106 ng/ml. (См. рисунок 1).
ОБРАЗЕЦ 1
RLU x 1000
Пациент
Значения IgE в ng/ml
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
@100,000 RLU для калибратора
‘F’ (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Кривая дозового ответа (пересечения в 80%; 50% и 20% ) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
3. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
4. Не допускается использование препаратов с сильной микробной контаминацией, с
повышенным содержанием липидов и гемолизированных препаратов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
6. Концентрация IgE в сыворотке зависит от множества факторов: включая
чувствительность пациента, количество контактов с аллергеном, и т.д.
Только концентрации общего IgE недостаточно для оценки клинического состояния
пациента. При диагностике необходимо учитывать всю клиническую информацию,
включая результаты теста на специфический аллерген. Поскольку иммуноглобулин Е
участвует не во всех атопических реакциях, необходимо принимать во внимание всю
историю болезни, перед тем как выносить решение о пациенте, показатели IgE
которого находятся в рамках нормы.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Приблизительные пределы нормальных показателей для различных возрастных
групп приведены в таблице 1:
ТАБЛИЦА 1
Возраст (лет)
0-3
3-16
взрослые
Количество
31
43
145
Среднее
6.4
25.0
43
Диапазон
не определяется - 46
не определяется - 280
0-200
(только для справки)
Каждой лаборатории рекомендуется найти собственный диапазон нормальных и
анормальных значений, поскольку они всегда зависят от популяции,
местоположения, методов лаборатории и т.д.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
A. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - IU/ml)
Для оценки внутрианалитической сходимости теста Monobind IgE CIA™ были
проанализированы 20 копий каждого препарата сыворотки (на низком, среднем и
высоком диапазоне дозового ответа). Была получена внутрианалитическая
сходимость от 3.7 до 8.2%.
Количество
Среднее
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации %
Низкий
20
44.8
3.7
8.2
Средний
20
154.4
7.0
4.6
Высокий
20
282.2
10.3
3.7
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
Для оценки межаналитической сходимости метода Monobind CIA™ был
проанализирован один дубликат каждой из трех проб смешанной сыворотки (в
низком, среднем и высоком диапазоне кривой дозовой зависимости) в 10 тестах,
проведенных за 6 месяцев, что потребовало пяти разных наборов реагентов и трех
различных операторов. Была получена межаналитическая сходимость от 3.3 до
9.5%.
Количество
Среднее
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации %
Низкий
10
45.5
4.3
9.5
Средний
10
160.3
10.4
6.5
Высокий
10
295
9.7
3.3
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind IgE Microplate CIA™ со стандартным
иммуноферментным тестом (Elisa) путем анализа препаратов с низкой, нормальной
и высокой концентрацией. (диапазон значений от 0.8 до 3100 IU/ml).
Общее количество исследованных препаратов - 219. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для IgE CIA по
сравнению с обычным методом. Полученные данные представлены в таблице 4.
ТАБЛИЦА 4.
Метод
Monobind CIA “X”
Monibind Elisa “Y”
Среднее (х)
178
157
Регрессия
методом
наименьших
квадратов
х=-12.9+1.21(y)
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент корреляции
показывают отличную согласованность методов.
C. Параллелизм
Два препарата с сывороткой были протестированы методом Monobind IgE CIA™ в
растворе (нулевого калибратора) и нерастворенными. Полученные и ожидаемые
значение приведены в таблице 5.
Проба
Смесь 1
Смесь 1/2
Смесь 1/4
Смесь 1/8
Смесь 2
Смесь 2/2
Смесь 2/4
Смесь 2/8
Смесь 2/16
Полученный
результат
106.8
50.8
25.3
13.4
395.9
189.5
106.1
48.0
25.8
Ожидаемое
значение
53.4
26.7
13.3
197.9
98.9
49.5
24.7
Процент
соответствия
95.1
94.8
100.6
95.8
107.2
96.9
104.2
D. Чувствительность
Чувствительность
(предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией 0 ng/ml при использовании
статистики 2 SD для расчета минимальной дозы. Чувствительность метода Monobind
IgE CIA™ равна 1.0 IIU/ml.
E. Специфичность
Перекрестная реактивность метода IgE CIA™ на сходные иммуноглобулины
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
концентрациях вдвое выше физиологических. Не было отмечено никакой
перекрестной чувствительности между используемыми антителами и тестируемыми
молекулами.
F. Линейность
Две смеси сыворотки с известной концентрацией IgE были проанализированы
методом Monobind IgE CIA™. Полученные и ожидаемые значение приведены в
таблице 6.
Проба
Смесь 1
Смесь 1 + 25
Смесь 1 + 50
Смесь 1 + 100
Смесь 1 + 200
Смесь 2
Смесь 2 + 25
Смесь 2 + 50
Смесь 2 + 100
Смесь 2 + 200
Полученный
результат IU/ml
25.7
50.7
74.8
122.7
232.0
12.3
41.7
62.6
109.4
197.2
Ожидаемое
значение IU/ml
50.7
75.7
125.7
225.7
37.3
62.3
112.3
212.3
Процент
соответствия
100.0
101.2
97.6
102.7
111.2
100.6
97.4
92.8
G. сверхдозовый эффект:
Поскольку тест проводится последовательно, высокие концентрации IgE не приводят
к сверхдозовому эффекту. Пробы IgE у пациентов с миеломой с концентрациями
выше 8 миллионов IU/ml показали очень высокую абсорбцию.
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Plebani M, Bernardi D, Basso D, Faggian D, and Borghesan F, “ Measurement of
specific immunoglobulin E: intermethod comparison and standardization”, Clin Chem,
44:9 (1998).
2. Geha RS, “ Human IgE”, J Clinical Immunology, 74:109-120 (1984).
3. Barbee RA, et al,”Distribution of IgE in a community population sample: correlation
with age, sex and allergen skin reactivity”, J. of Clinical Immunology, 68: 106-111
(1981).
4. Nye L, Marrett TG, Landon J, White RJ, “A detailed investigation of circulating levels
of IgE in a normal population”, Clin Allergy, 1:13-24 (1975).
5. Mandy FF, Perelmutter L, “Laboratory measurement of total human serum IgE”,
Journal Clinical Immunoassay, Jun; 6(2):140-146 (1983).
6. Hamilton RG, Adkinson RF,”Clinical laboratory methods and allergic disease”, Lab
Management, Dec 21(12): 37-50 (1983).
7. Halpern GM, “Markers of human allergic disease”, J Clin Immunoassay, Jun 6(2): 131
139 (1983).
8. Homberger HA, Yuninger JW,”Laboratory testing in the diagnosis and management of
allergic diseases”, Clin Lab, 2:351-388 (1983).
9. National Committee for Clinical laboratory Standards: Procedures for the collection of
blood specimens by venipuncture, 3rd Ed. NCCLS Doc. H3-A3, 1991.
10. Tietz NW, Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd Ed Philadelphia, WB Saunders,
p358 (1995).
Редакция: 1.
Date: 06.26.04
Cat# 2575-300.
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email: info@monobind.com
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.