Общая характеристика работы - Гематологический научный центр

На правах рукописи
Пименова Мария Анатольевна
Цитогенетическая характеристика гемопоэтических и стромальных клетокпредшественниц у больных миелодиспластическими синдромами
14.01.21 - Гематология и переливание крови
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2013
3
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
«Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской
Федерации
Научный руководитель:
Савченко Валерий Григорьевич – академик РАМН, доктор медицинских наук,
профессор
Официальные оппоненты:
Грицаев Сергей Васильевич – доктор медицинских наук, Федеральное
государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский
институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического
агентства», главный научный сотрудник клинического отдела химиотерапии
гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга
Куцев Сергей Иванович – доктор медицинских наук, Федеральное государственное
бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии
медицинских наук, заместитель директора по научной работе, заведующий
лабораторией мутагенеза
Ведущее учреждение:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научноисследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится «12 » февраля 2014 года в
час.
на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном
государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр»
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного
бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Автореферат разослан « ___ » ____________________ 2013 года
И. о. ученого секретаря диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор
4
Клясова Г.А.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы Миелодиспластические синдромы (МДС) – группа
клональных заболеваний системы крови, характеризующихся дисплазией одного или
нескольких ростков миелопоэза, неэффективным кроветворением, которое
проявляется цитопеническим синдромом, а также повышенным риском развития
острого миелоидного лейкоза. Несмотря на определенные успехи в лечении МДС,
достигнутые за последнее время, проблема наличия рефрактерных форм и быстрой
прогрессии в острый лейкоз остается крайне актуальной (Савченко В.Г., 1996;
Hofman W.K., 2004; Warlick E.D., 2007; Swerdlow S.H., 2008; Кохно А.В., 2009;
Steensma D.P., 2012). В настоящее время единственным методом биологического
излечения является трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток,
однако ее эффективность ограничена как возможностью выполнения (отсутствие
HLA-совместимого донора, пожилой возраст и тяжелый соматический статус
больного), так и частотой рецидивов заболевания. Результаты химиотерапевтического
лечения остаются неутешительными, что делает необходимым проведение
дальнейших исследований в этой области гематологии с целью получения более
глубокого понимания патогенетических путей развития заболевания и разработки
принципиально новых подходов к терапии.
Известно, что развитие клональных нарушений, приводящих к диспластическим
изменениям в костном мозге, изначально происходит в стволовой кроветворной
клетке (СКК) и ранних гемопоэтических (кроветворных) клетках-предшественницах
(Prchal J.T., 1978; Janssen J.W., 1989; Haase D., 1996; Nimer S.D., 2008). В то же время
функционирование, деление и дифференцировка незрелых кроветворных клеток
обеспечивается их взаимодействием с компонентами стромального микроокружения,
которое строит «дом» для гемопоэтических клеток и во многом определяет их
дальнейшую судьбу (Чертков И.Л., 1984; Watt F.M., 2000). Мезенхимальные
стромальные клетки (МСК) – важный клеточный компонент стромы, они
представляют собой фракцию прилипающих к пластику фибробластоподобных
клеток-предшественниц, образующих колонии in vitro. Они ответственны за
поддержание и регуляцию кроветворения в костном мозге (Deans R.J., 2000).
Согласно литературным данным, функционирование стромы костного мозга при
МДС нарушено (Манакова Т.Е., 2000; Varga G., 2007; Schroeder T.M., 2012).
Изменение функции компонентов стромального микроокружения при МДС важно,
так как наряду с клонально-измененными кроветворными клетками строма является
участником развития заболевания в костном мозге.
Исследование кариотипа клеток костного мозга входит в перечень обязательного
обследования на этапе установления диагноза МДС. Хромосомные аномалии
выявляют примерно у половины больных, они являются критерием подтверждения
диагноза, фактором прогноза ответа на лечение и продолжительности жизни
(Swerdlow S.H., 2008). Вместе с тем изучение цитогенетических особенностей как
5
кроветворных, так и стромальных клеточных компонентов костного мозга имеет
важное теоретическое значение для более глубокого понимания биологических
процессов, лежащих в основе заболевания. Имеющиеся в литературе данные
цитогенетических исследований клеток стромы костного мозга противоречивы
(Soenen-Cornu, V. 2005; Flores-Figueroa E., 2008; Klaus, M., 2010; Blau O., 2011; Song
L.-X., 2012). В связи с чем представляется важным изучение хромосомных аномалий
не только в зрелых кроветворных клетках костного мозга, но и прицельно в
популяциях ранних клеток-предшественниц, принимающих непосредственное
участие в патогенезе МДС, – CD34+ гемопоэтических клетках и мезенхимальных
стромальных клетках.
Цель исследования – охарактеризовать цитогенетические особенности CD34+
гемопоэтических клеток-предшественниц костного мозга и периферической крови и
мезенхимальных
стромальных
клеток
костного
мозга
у
больных
миелодиспластическими синдромами.
1.
2.
3.
4.
5.
Задачи исследования
Оценить частоту и спектр хромосомных аномалий у больных МДС в момент
диагностики
Сопоставить эффективность выявления хромосомных аномалий в клетках
костного мозга методом стандартного цитогенетического исследования и
флюоресцентной in situ гибридизации (FISH)
Охарактеризовать и сравнить изменения кариотипа в CD34+ гемопоэтических
клетках-предшественницах костного мозга и периферической крови с помощью
метода FISH. Охарактеризовать изменения кариотипа в CD34+ клетках в
зависимости от клиникo-лабораторных данных
Оценить свойства мезенхимальных стромальных клеток костного мозга по их
росту в культуре и исследовать наличие связи с клиническим вариантом
заболевания, группой риска IPSS-R и морфологическими особенностями МДС
Изучить и сравнить цитогенетические изменения в МСК костного мозга методом
стандартного цитогенетического исследования и FISH у больных МДС и
здоровых лиц
Научная новизна
Впервые в России проведен комплексный анализ цитогенетических аномалий в
изолированных популяциях кроветворных и стромальных клеток-предшественниц у
больных МДС.
Научно-практическая ценность исследования
Полученные в исследовании результаты показали, что CD34+ клеткипредшественницы содержат хромосомные аномалии, определяемые в общей
популяции клеток костного мозга. Размер патологического клона в общей популяции
6
клеток костного мозга и CD34+ клетках одинаков. Выраженность клональных
изменений в циркулирующих клетках-предшественницах коррелирует с их
выраженностью в клетках-предшественницах костного мозга. Это имеет
практическое значение, так как использование клеток периферической крови для
проведения цитогенетических исследований у больных может уменьшить кратность
пункций костного мозга.
Установлено, что мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного
мозга больных МДС, обнаруживают сниженную пролиферативную способность по
сравнению с их аналогами у здоровых доноров костного мозга и проявляют
генетическую нестабильность. Определяемые в МСК аномалии кариотипа отличны от
аберраций в кроветворных клетках. Данные результаты имеют большое
теоретическое значение и могут служить заделом для последующих исследований.
1.
2.
Основные положения, выносимые на защиту
Клональные нарушения кариотипа CD34+ клеток-предшественниц, полученных
как из костного мозга, так и из периферической крови, соответствуют аномалиям
кариотипа общей популяции клеток костного мозга при МДС.
Хромосомные аберрации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга
выявлены у 9,5% больных МДС; они отличны от аномалий кариотипа
кроветворных клеток.
Апробация диссертации
Основные положения, материалы и результаты диссертации доложены и
обсуждены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах:
– Конгресс гематологов России (Москва, 2012).
– Международная гематологическая школа «Лейкозы и лимфомы. Терапия и
фундаментальные исследования» (Москва, 2012).
– Научно-практическая
конференция
«Молекулярно-генетические
и
иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (СанктПетербург, 2013).
– 12-й Международный симпозиум по миелодиспластическим синдромам (Германия,
Берлин, 2013).
– 18-й Конгресс Европейской гематологической ассоциации (Швеция, Стокгольм,
2013).
По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисных сообщений.
Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии
“Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения;
ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической
системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)” ФГБУ «Гематологический
научный центр» МЗ РФ 06 ноября 2013 года.
7
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка
литературы, включающего 169 источников, в том числе 18 отечественных авторов. В
работе содержится 21 таблица, 15 рисунков и одно приложение.
Содержание работы
Общая характеристика больных
В исследование включены 43 больных, 20 мужчин и 23 женщины. Медиана
возраста составила 59 лет (от 19 до 77 лет). Распределение по вариантам заболевания
следующее: МДС – 36 больных (РA – 2, РАКС – 3, МДС с del(5q) – 3, РЦМД – 14,
РАИБ1 – 5, РАИБ2 – 9), ОМЛ из предшествующей миелодисплазии – 7 больных. У
двух из указанных больных (РАИБ-2 и ОМЛ) был онкологический анамнез и
проводилась химиотерапия по поводу другой опухоли (вторичный МДС и ОМЛ).
Контрольную группу составили 7 здоровых доноров костного мозга и 4 больных
лимфопролиферативными заболеваниями (диффузная В-крупноклеточная лимфома –
2, лимфогранулематоз – 2). Критериями включения в исследование были впервые
установленный диагноз и отсутствие предшествующего лечения по поводу МДС.
Вариант заболевания устанавливали на основании критериев классификации
ВОЗ 2008 года (Swerdlow S.H., 2008). Пациентам проводился анализ показателей
гемограммы, цитологическое, цитохимическое и цитогенетическое исследования
пунктата костного мозга, а также гистологическое исследование трепанобиоптата
подвздошной кости.
Методы исследования
Получение CD34+ клеток проводили методом позитивной иммуномагнитной
селекции с использованием моноклонального антитела к CD34 (MicroBead kit,
Miltenyi Biotec, Germany). Фракция мононуклеарных клеток из костного мозга и
периферической крови была пропущена через пресепарационный фильтр для
устранения склеивания и закупорки магнитной колонки. Выполняли подсчет
количества клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь пропускали через
помещенную в магнитное поле и предварительно смоченную буферным раствором
колонку. После удаления негативной немеченой антителом фракции клеток, в
эпендорф собирали позитивную фракцию.
Для пробы с количеством мононуклеаров до 2х108 использовали колонку MS
MACS Column с соответствующим количеством буфера. Буферный раствор готовили
из фосфатно-солевого буфера с pH=7,2, 0,5% бычьего альбумина, 2 мМ
этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), разведенной в основном растворе
(MACS BSA Stock Solution) 1:20 с раствором auto MACS Rinsing Solution.
Использовали дегазированный буферный раствор. Контроль чистоты полученной
8
фракции клеток был выполнен методом проточной цитометрии с использованием
моноклональных антител анти-CD34-PE и анти-CD45-FITS (BD, USA). Чистота
полученной фракции составила 94,5%.
Для получения МСК использовали аспират костного мозга. Мононуклеарную
фракцию ресуспендировали в стандартной среде для культивирования, состоящей из
среды -МЕМ (HyClone, USA), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone,
USA), 2 мМ L-глутамина (BioWest)), 100 ед/мл пенициллина (Ферейн, Россия) и
50 ед/мл стрептомицина (Ферейн, Россия). Клетки рассаживали в концентрации 18x106 клеток во флаконы для культивирования с площадью дна 25 и 75 см2 (Costar) и
культивировали в 5% CO2 в воздухе при t=37С. После образования конфлюэнтного
монослоя клетки промывали раствором версена (0,02% раствор ЭДТА в
физиологическом растворе (Sigma)), а затем обрабатывали 0,25% раствором трипсина
(ICN) и пассировали в концентрации 4x103 клеток на 1 см2 поверхности дна флакона.
В работе использовали клетки после 2-3 пассажей (в двух случаях – после 4 и в двух
случаях – после 5 пассажей), за которые происходило истощение кроветворных
клеточных элементов, и достигалась чистая культура фибробластов. За 16-24 часа до
снятия клеток в флакон добавляли колхицин или колцемид в количестве,
необходимом для достижения конечной концентрации в среде 1 г/мл. МСК снимали
с флаконов 0,05% раствором трипсина. Количество снятых со дна флакона клеток
подсчитывали в камере Горяева, их жизнеспособность определяли по отсутствию
окраски трипановым синим.
Все клетки имели характерную для фибробластов веретеновидную форму. МСК
были охарактеризованы иммунофенотипически на наличие маркеров МСК
моноклональными антителами к CD73, CD90, CD105 (BD) и на отсутствие маркеров
гемопоэтических клеток антителами к CD45 (Sigma), CD34, CD14 (BD), HLA-DR
(DAKO). Была подтверждена способность полученных МСК к остеогенной и
адипогенной дифференцировке in vitro.
G-дифференциальную окраску хромосом осуществляли по модифицированной
методике M.Seabright (Seabright, M., 1971). Цитогенетические препараты помещали в
сухожаровый шкаф при t=950С на 35 минут. Далее стекла погружали на 3-5 сек в
0,025% раствор трипсина (Sigma) с последующим двукратным отмыванием в 0,9%
растворе натрия хлорида. Стекла окрашивали красителем Wright (Merck, Germany) в
течение 1-1,5 минут и сушили под проточным воздухом. Цитогенетическое
исследование МСК выполняли по методу, описанному Z.Zhang (Zhang, Z.X., 2007).
Хромосомный анализ проводили под иммерсионным объективом (увеличение
12,5х100). Подсчитывали 20 метафаз. Кариотип анализировали в соответствии с
критериями Международной цитогенетической номенклатуры ISCN 2005 года
(Shaffer L.G., 2005). Клональной считали структурную аномалию и трисомию при
обнаружении минимум в двух метафазах и моносомию – минимум в трех. При
обнаружении структурной перестройки в одной метафазе ее обозначали как
9
неклональную (спонтанную). Единичные неполные митозы могли не учитываться как
неклональные аномалии из-за возможности потерь хромосом при обработке
клеточного осадка.
Для постановки FISH-исследования использовали следующие ДНК-зонды: LSI
(5q31-q34) EGR-1 SpectrumOrange / D5S721/D5S23 SpectrumGreen Probe
(VysisAbbott®, USA) для выявления делеции и моносомии 5; LSI (7q31)
SpectrumOrange / CEP 7 SpectrumGreen Probe для выявления делеции и моносомии 7;
CEP 8 SpectrumOrange DNA ProbeKit к центромере 8 для выявления моносомии и
трисомии; LSI AML1 / ETO Dual Color Fusion Translocation Probe для выявления
транслокации (8;21)(q22;q12-q21) и моносомии 21; CEP X SpectrumOrange / CEP Y
SpectrumGreen DNA Probe для выявления моносомии и трисомии X, +Y; LSI D20S108
(20q12) SpectrumOrange Probe для выявления делеции и моносомии 20; EVI
t(3;3),inv(3)(q21;q26) Break Dual-Color Probe (Kreatech Diagnostics®, Netherlands) для
выявления inv(3)(3q26).
Суспензию клеток наносили на предметное стекло. Под световым микроскопом
определяли области нанесения зонда. Зонд предварительно готовили путем
разбавления буферным раствором и дистиллированной водой согласно инструкции
производителя. На стекло наносили 1,5 л готового зонда, накрывали покровным
стеклом и заклеивали.
Денатурацию и гибридизацию проводили в приборе
TM
Termobrite Slide Hybridization/Denaturation System (Abbott), время денатурации – 2
минуты при t=740С, время гибридизации – 16-24 часа при t=370С. После завершения
гибридизации с предметного стекла снимали клей и покровное стекло, затем препарат
обрабатывали с целью удаления избытка зонда: в течение 2-х минут, поместив стекло
в емкость с раствором 0,4 SSC/0,3%NP-40 (SSC – Abbott) в паровой бане при t=730С;
в течение 1-й минуты в растворе 2 SSC/0,1%NP-40 при комнатной температуре. После
высушивания на препарат наносили раствор DAPI II (Abbott) и накрывали покровным
стеклом.
Анализ сигналов проводили с помощью флюоресцентного микроскопа ZeissAxioscope (Germany) с использованием тройного фильтра Orange/Green/Dapi. Для
каждого зонда анализировали по 200 интерфазных ядер с четкими сигналами.
Границы нормальных значений процента позитивных ядер для каждого зонда
были определены по формуле  + 3, где  – среднее по совокупности, равное
(n1+n2+n3+n4+n5)/5,  – стандартное отклонение, равное [(n1-)2+(n2-)2+(n3-)2+(n4)2+(n5-)2]/(5-1). Анализировали 1000 ядер мононуклеарных клеток периферической
крови от 5 здоровых доноров, n1, n2, n3... и т.д. – количество ядер, содержащих
аномалию, у первого, второго, третьего… и т.д. доноров.
Статистический анализ данных
Оценка достоверности различий между группами осуществлялась с
использованием методов описательной статистики, парного и непарного t-тестов,
анализа кривых выживаемости. Корреляционный анализ проводили методом
10
попарной корреляции Пирсона. Результаты оценивались статистически значимыми
при р0,05. Данные представлены в виде средних значений и величины стандартного
отклонения, медианы с указанием минимального и максимального значений.
Результаты были обработаны с помощью статистического пакета SAS и R.
Результаты исследований
Цитогенетическое исследование клеток костного мозга
Всем 43 пациентам, включенным в исследование, выполнено кариотипирование
клеток костного мозга. При стандартном цитогенетическом исследовании
нормальный кариотип определен у 23 (53,5%) из 43 больных, у одного из них
выявлена конституциональная инверсия хромосомы 9 – inv(9)(p13q21), у 16 (37,2%)
больных выявлены аномалии кариотипа и у 4 (9,3%) больных кариотип не исследован
вследствие отсутствия достаточного количества или удовлетворительного качества
митозов. Среди выявленных аномалий преобладали изолированные хромосомные
аберрации – у 9 (56,3%) из 16 больных: делеция 5q, моносомия 7, изохромосома 14 и
инверсия хромосомы 3; у 2 (12,5%) больных выявлено сочетание 2 аномалий: делеции
5q с моносомией 7 и трисомии Х с моносомией 7; и у 5 (31,2%) больных определены
комплексные нарушения кариотипа: 3 и более аномалии.
Следующим этапом у пациентов с хромосомными аномалиями применили метод
FISH к соответствующим цитогенетическим маркерам с целью их подтверждения. У
пациентов с нормальным кариотипом или отсутствием митозов с целью возможного
выявления «скрытых» аномалий выполнили FISH-исследование с использованием
набора ДНК зондов к хромосомам 5, 7 и 8. Зонды к данным цитогенетическим
маркерам выбраны с учетом наиболее распространенных и клинически значимых
аномалий при МДС.
У 7 (16,3%) из 43 больных с помощью FISH-исследования выявлены скрытые
хромосомные аномалии, которые не были определены при кариотипировании. У 2 из
них при стандартном исследовании не были получены митозы, и методом FISH
выявлены: в первом случае – одновременно del(5q) и del(7q) в 84% клеток, во втором трисомия 8 в 67% клеток. У 4 больных определен нормальный кариотип, однако с
помощью FISH-исследования у двух из них выявлена del(5q) в 75% и 67% клеток,
соответственно; у одного больного выявлена моносомия 7 в 45% клеток и у одной
больной – трисомия 8 в 19% клеток. Еще у 1 больного, у которого в кариотипе
определена изолированная del(5q), FISH анализ позволил выявить дополнительно
трисомию 21 в 52% клеток. Таким образом, после применения двух методов
цитогенетического анализа количество больных с аномалиями кариотипа
увеличилось с 16 (37,2%) до 22 (51,2%). Число больных без хромосомных аномалий в
клетках костного мозга составило 21 (48,8%). Распределение выявленных аномалий
по прогнозу согласно шкале IPSS-R было следующим: аномалии очень хорошего
прогноза не были выявлены ни в одном случае; у 6 (27,3%) больных выявлены
аномалии хорошего прогноза (нормальный кариотип, del(5q) изолированно и в
11
сочетании со второй аномалией); у 3 (13,6%) больных определены аномалии
промежуточного прогноза (i(14) и +8); у 9 (40,9%) больных – аномалии плохого
прогноза (3 аномалии, -7/del(7q) изолированно и в сочетании со второй аномалией,
inv(3)) и у 4 (18,2%) больных определены аномалии очень плохого прогноза (более 3
аномалий).
Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS,
WPSS и IPSS-R
Пациенты с МДС были стратифицированы на группы риска в зависимости от
результатов цитогенетического исследования, количества бластных клеток в костном
мозге и выраженности диспластических изменений в миелокариоцитах, показателей
гемограммы и наличия трансфузионной зависимости в соответствии с критериями
прогностических шкал IPSS, WPSS и IPSS-R. Больным с вторичными МДС и
больным, у которых при стандартном цитогенетическом исследовании не были
получены митозы и методом FISH «скрытые» аномалии не выявлены, группа риска не
определялась.
Основные изменения в прогнозе у больных в соответствии с разными шкалами
были определены в категории промежуточного риска. Так, по шкале IPSS эта группа
(промежуточный-1 и промежуточный-2 риск) составила 19 из 34 больных, тогда как
для WPSS – 7 и для IPSS-R – 8 больных. Распределение больных в группы более
низкого или более высокого риска осуществлено в первом случае за счет наличия или
отсутствия зависимости от гемотрансфузий, во втором – за счет прогностического
значения аномалий кариотипа, градации цитопенического синдрома и количества
бластных клеток в костном мозге. Всего у 25 из 34 больных группа риска по трем
прогностическим шкалам отличалась, и у 9 из них прогноз совпадал. У 2 больных
категория риска была изменена согласно шкале IPSS-R на более высокий вследствие
прогностического значения кариотипа.
В таблице 1 представлено распределение больных по группам риска после
проведения стандартного исследования кариотипа и после применения
дополнительно к нему FISH-исследования:
Таблица 1
Распределение больных на группы риска по шкале IPSS-R после проведения
стандартного цитогенетического исследования и после применения FISH
Группа риска
Очень низкий
Низкий
Промежуточный
Высокий
Очень высокий
Не определена
СЦИ, n=32
0 (0,0%)
13 (40,6%)
7 (21,9%)
8 (25,0%)
4 (12,5%)
3*
Количество больных
СЦИ+FISH, n=34
0 (0,0%)
13 (38,3%)
8 (23,5%)
8 (23,5%)
5 (14,7%)
1**
Примечание: * больные, у которых при СЦИ не получены митозы; ** больной, у
которого после применения FISH цитогенетические маркеры не выявлены
12
Как видно из таблицы, после проведения кариотипирования 3 больных не
представлялось возможным стратифицировать на группы риска вследствие
отсутствия данных цитогенетического исследования (не получены митозы), тогда как
после выполнения дополнительно FISH-исследования у 2 из них были выявлены
цитогенетические аномалии, позволившие определить одного больного в группу
промежуточного риска и другого – в группу очень высокого риска.
Результаты динамического наблюдения за больными
Время наблюдения за больными составило от 2,3 до 21 месяца (медиана 11,6
месяцев). Больным в зависимости от варианта заболевания применяли следующие
виды терапевтического воздействия: сопроводительная терапия, ростовые факторы,
иммуномодулирующая терапия, химиотерапия, эпигенетическая терапия и
трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Данные
представлены в таблице 2:
Таблица 2
Лечение больных
Вид лечения
Количество больных
Сопроводительная терапия
(гемотрансфузии, витамины группы В)
Ростовые факторы (ЭПО)
Иммуномодулирующая терапия (леналидомид)
Гипометилирующие препараты (азацитидин)
Химиотерапия (малые дозы Ara-C, «7+3»)
Алло-ТГСК
Отказ от лечения
15
1
4
8
8
3
1
За время наблюдения умерли 5 больных, все – от прогрессии в острый лейкоз.
Все больные из группы низкого риска были живы в течение периода наблюдения. В
группе промежуточного риска умерли двое и в группе с высоким риском – трое
больных. Учитывая, что смерти зафиксированы в группах промежуточного и
высокого риска, мы проанализировали выживаемость больных, объединив эти две
группы в одну. Графики представлены на рисунке 1:
1
Cum. Survival
.8
.6
низкий риск
.4
.2
0
0
2.5
5
7.5
10
12.5
Time
15
17.5
20
22.5
высокий/
промежуточный
риск
Рисунок 1. Общая выживаемость больных МДС в зависимости от группы риска по шкале
IPSS-R
13
Как видно из графика, выживаемость больных в группе низкого риска составила
100%, а в группе промежуточного/высокого риска – 66% (p=0,07). Несмотря на
отсутствие достоверных различий, очевидно, что выживаемость лучше у больных из
группы низкого риска. Тем не менее, в группе высокого/промежуточного риска
достигнута относительно хорошая выживаемость (в сравнении с выживаемостью
больных согласно шкале риска), что обусловлено, в первую очередь, тем, что все
больные высокого риска получали лечение.
Содержание CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови
С помощью проточной цитометрии было подсчитано процентное содержание
CD34+ клеток в популяции CD45+ клеток лимфоцитарной, моноцитарной и
гранулоцитарной клеточных линий у 12 пациентов: РАИБ – 8, РЦ (МДС с del(5q) и
РЦМД) – 4. Результаты представлены в таблице 3:
Таблица 3
Процент
клеток в костном мозге и периферической крови у больных МДС,
здоровых доноров и больных лимфопролиферативными заболеваниями
CD34+
РАИБ+РЦ (n=12)
Доноры КМ
(n=5)
Больные ЛПЗ
(n=4)
Процент CD34+
клеток КМ
5,1083,855*
(0,700-13,400)
1,114±0,604
(0,591-2,109)
0,918±0,863
(0,260-2,10)
*p<0,05
Процент бластных
клеток КМ
8,4305,430
(0,400-18,200)
-
Процент CD34+
клеток ПК
1,5101,400*
(0,02-4,30)
0,023±0,012
(0,009-0,033)
0,007±0,08
(0,001-0,017)
*p<0,05
Примечание: КМ – костный мозг, ПК – периферическая кровь, РЦ – рефрактерная
цитопения, РАИБ – рефрактерная анемия c избытком бластов; ЛПЗ –
лимфопролиферативные заболевания
Как видно из таблицы, среднее содержание CD34+ клеток-предшественниц в
группе больных МДС составило 5,11% (0,70-13,40) в костном мозге и 1,51% (0,024,30) – в периферической крови. Содержание CD34+ клеток у больных МДС было
значимо больше, чем в контрольных группах как в костном мозге, так и в
периферической крови (p<0,05).
Во всех исследованных клеточных образцах в группе больных МДС имела место
гетерогенность популяции CD34+ клеток по экспрессии антигена CD34, а также
наблюдалась более интенсивная гранулярность цитоплазмы в проекции бокового
светорассеяния.
Было проведено сравнение количества бластных клеток в костном мозге и
содержания CD34+ клеток-предшественниц в костном мозге. Значимой зависимости
между этими показателями получено не было, однако корреляция не нулевая (индекс
Пирсона 0,31, p=0,32).
14
Исследование цитогенетических аномалий в CD34+ клетках
У 16 пациентов с выявленными аномалиями кариотипа выполнено FISHисследование
фракции
CD34+
кроветворных
клеток-предшественниц
с
соответствующими ДНК-зондами. Хромосомные аберрации были выявлены у всех
исследованных больных в CD34+ клетках как костного мозга, так и периферической
крови. Средний процент ядер с положительными флюоресцентными сигналами в
общей популяции клеток костного мозга был несколько меньше, чем в CD34+
клетках, значения составили: 58,8123,99% – в общей популяции клеток костного
мозга, 69,3026,35% – в CD34+ клетках костного мозга и 65,4026,65% – в CD34+
клетках периферической крови. Значимое различие размера патологических клонов в
этих клеточных популяциях не было получено (p=0,09, 0,33 и 0,11, соответственно).
На рисунке 2 представлено распределение процента аномальных ядер в этих
клеточных популяциях:
100
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
75
●
●
●
●
●
●
●
%
label
●
50
●
●
25
●
●
BM cells
●
CD34+cells BM
●
CD34+cells PB
●
●
●
●
●
●
CD34+cells BM
CD34+cells PB
CD34+ КМ
CD34+ ПК
●
●
●
BM cells
КМ
Рисунок 2. Средние значения процента ядер с хромосомными аномалиями в общей
популяции клеток костного мозга и в CD34+ клетках
Примечание: КМ – клетки костного мозга; CD34+ КМ – CD34+ клетки, костный мозг;
CD34+ ПК – CD34+ клетки, периферическая кровь
Было проанализировано наличие зависимости между процентным содержанием
клеток с аберрантным кариотипом в общей популяции клеток костного мозга и среди
CD34+ клеток костного мозга и периферической крови (метод попарной корреляции
Пирсона). Выявлена прямая корреляционная зависимость данных показателей
(p<0,05). На рисунке 3 (а, б, в) представлены графики зависимости размера
патологического клона в общей популяции клеток костного мозга и в CD34+ клетках:
15
60
40
20
% in CD34+cells BM
80
а)
20
30
40
50
60
70
80
90
Индекс Пирсона=0,62; p<0,05
% in BM cells
60
40
20
% in CD34+cells PB
80
б)
20
30
40
50
60
70
80
90
Индекс Пирсона=0,60; p<0,05
% in BM cells
60
40
20
% in CD34+cells PB
80
в)
20
40
60
80
Индекс Пирсона=0,98; p<0,05
% in CD34+cells BM
Рисунок 3. Зависимость процента клонально-измененных ядер среди CD34+ клеток
и общей популяции клеток костного мозга
Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга и CD34+ клетки костного
мозга; б) общая популяция клеток костного мозга и CD34+ клетки периферической крови; в)
CD34+ клетки костного мозга и периферической крови
16
Далее
FISH-исследование
изолированной
фракции
CD34+
клетокпредшественниц костного мозга и периферической крови выполнено у больных, у
которых аномалии кариотипа в клетках котного мозга не были выявлены.
Исследование проведено с применением набора ДНК зондов к хромосомам 5, 7 и 8. У
всех исследованных больных определено отсутствие, по крайней мере искомых,
цитогенетических аномалий в изолированной фракции клеток-предшественниц как
костного мозга, так и периферической крови.
Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клинического
варианта заболевания, прогностической значимости хромосомных аберрраций,
клеточности костного мозга и фиброза
Среди пациентов с аномалиями кариотипа (n=16) в клетках костного мозга был
1 больной РА, 2 больных МДС с del(5q), 5 больных РЦМД, 6 больных РАИБ и 2
больных ОМЛ. Больные без увеличения бластных клеток в костном мозге были
объединены в одну группу (РЦ), а больные с увеличением количества бластных
клеток – в другую (РАИБ и ОМЛ). Среднее содержание клонально-измененных ядер в
первой группе составило в костном мозге и периферической крови, соответственно,
70,624,6% и 68,423,7%; во второй группе – 67,330,3% и 62,130,7%. Значимые
различия не получены (p=0,79 и p=0,64).
Среди исследованных больных у 7 определены благоприятные хромосомные
аномалии (del(5q)), у 8 больных – хромосомные аномалии промежуточного прогноза
(моносомия 20, трисомия 21, трисомия 8, дополнительная Y хромосома) и у 5
больных – неблагоприятные аномалии (inv(3), моносомия 7). Среднее содержание
клонально-измененных ядер в костном мозге в группах с благоприятными,
промежуточными и неблагоприятными аномалиями составило, соответственно,
82,610,1%, 60,228,8% и 64,635,5%; в периферической крови в тех же группах –
79,88,8%, 57,926,9% и 59,738,9%. Несмотря на отличие размера патологического
клона в клетках с благоприятными хромосомными аномалиями, достоверное различие
не получено (p>0,05).
При анализе гистологических препаратов трепанобиоптатов подвздошной кости
увеличение клеточности костного мозга по сравнению с возрастной нормой
определено у 8 больных, снижение клеточности и преобладание жирового костного
мозга – у 5 больных и нормальная клеточность – у 1 больного. Для проведения
анализа больные со сниженной и нормальной клеточностью костного мозга
объединены в одну группу, больные с увеличенной клеточностью – в другую.
Среднее содержание клонально-измененных ядер в первой группе составило в
костном мозге и периферической крови, соответственно, 52,729,7% и 53,229,2%;
во второй – 74,224,0% и 70,023,9%. Достоверные различия в группах не получены
(p=0,16 и p=0,26, соответственно).
Коллагеновый фиброз оценивался морфологически при микроскопии
гистологических препаратов костного мозга. Трепанобиопсия костного мозга была
17
выполнена у 39 больных. Обращала на себя внимание частая встречаемость
признаков фиброза в костном мозге исследованных пациентов – у 13 (33,3%) из 39. В
костном мозге больных с цитогенетическими аномалиями фиброз встречался в 1,7 раз
чаще, чем у больных без аномалий кариотипа – в 42,1% (8 из 19 больных) и в 25% (5
из 20 больных), соответственно (p=0,43).
Было проведено сравнение размера патологического клона среди CD34+ клеток в
зависимости от наличия фиброза в костном мозге. В первую группу вошли больные с
фиброзом, во вторую – без фиброза. Среднее содержание клонально-измененных ядер
в первой группе составило в костном мозге и периферической крови, соответственно,
74,322,9% и 67,020,8%, во второй – 62,529,8% и 62,529,8%. Достоверные
отличия в группах не получены (p=0,36 и p=0,37, соответственно).
Темпы роста культуры МСК у больных и здоровых лиц
Культура МСК получена у 36 из 43 больных; у 4 больных не получен рост
клеточной культуры и у 3 больных исследование не проводили. Сравнительная
характеристика МСК больных и здоровых доноров представлена в таблице 4:
Таблица 4
Сравнительная характеристика МСК костного мозга больных МДС
и здоровых доноров
Параметр
Группа
Больные (n=24)
Кол-во посаженных
Конфлюэнтность,
клеток х106
%
(разброс)
6,4 (5,0-8,0)
50-100
Время получения
подслоя (2 пассаж),
дни (разброс)
46,6 (27-89)
- митозы
получены (n=18)
45,1 (27-89)
- митозы
не получены (n=6)
51,3 (39-77)
Доноры (n=7)
8,2 (7,8-8,5)
100
33,8 (12-54)
Как видно из таблицы, плотность клеточного подслоя (конфлюэнтность) на
площади дна пластикового матраса у больных не доходила до 100%. Среднее время
формирования монослоя на втором пассаже у больных превышало время в
контрольной группе здоровых доноров, составив 46,614,5 и 33,815,2 дней,
соответственно. Достоверное отличие темпов роста культуры МСК у больных МДС и
18
здоровых доноров не получено (p=0,14). Несмотря на статистически не значимые
различия показателей динамики роста МСК, нельзя утверждать, что кинетика роста
МСК больных МДС и здоровых лиц одинакова, так как проанализировано небольшое
количество случаев, а также не были учтены больные, у которых клеточный монослой
не сформировался (n=4).
На рисунке 4 представлено распределение времени формирования конфлюэнтного
подслоя МСК на втором пассаже у больных МДС и здоровых доноров:
p=0,14
Рисунок 4. Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных и доноров
Темпы роста культуры МСК в зависимости от клинического варианта
заболевания, группы риска IPSS-R, клеточности костного мозга и наличия фиброза
В анализ включены больные, у которых формирование конфлюэнтного
монослоя достигнуто на втором пассаже (n=24). Распределение клинических
вариантов заболевания было следующим: 1 больной РА, 2 больных РАКС, 2 больных
МДС с del(5q), 11 больных РЦМД, 2 больных РАИБ-1, 2 больных РАИБ-2 и 4
больных ОМЛ. Для сравнительного анализа больные без увеличения бластных клеток
в костном мозге (РА, РАКС, МДС с del(5q) и РЦМД) были объединены в одну группу,
а больные с избытком бластных клеток (РАИБ-1 и РАИБ-2) и больные ОМЛ – в
другую. Среднее время роста культуры МСК в первой группе составило 44,915,8
дней, во второй – 50,213,0 дней. Достоверные различия не получены (p=0,39).
Распределение по группам риска согласно шкале IPSS-R было следующим: 10
больных группы низкого риска, 6 больных группы промежуточного риска, 3 больных
высокого и 1 больной – очень высокого риска. Мы сравнили среднее время получения
культуры МСК у больных их разных групп риска. Больные с высоким и очень
высоким риском были объединены в группу высокого риска. Среднее время роста
культуры МСК в группе низкого риска составило 46,913,9 дней, в группе
промежуточного риска – 40,812,0 дней и в группе высокого риска – 44,215,7. Таким
образом, время роста не зависело от группы риска (p=0,83).
19
Далее проведен анализ связи между кинетикой роста МСК и морфологическими
особенностями костного мозга.
При анализе гистологических препаратов костного мозга клеточность была
снижена у 6 больных, соответствовала возрастной норме у 4 больных и превышала ее
у 13 больных. Одному больному гистологическое исследование костного мозга не
проводили. Для получения сопоставимых по количеству больных групп больные с
гипо- и нормоклеточным костным мозгом были объединены. Получено значимое
отличие времени роста МСК: у больных с гиперклеточным костным мозгом время
получения конфлюэнтного монослоя было достоверно меньше, чем у больных со
сниженной и нормальной клеточностью (p<0,05), как представлено в таблице 5:
Таблица 5
Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных в зависимости от
клеточности костного мозга
Клеточность КМ
Время получения МСК, дни
Снижена/нормальная, n=10
Увеличена, n=13
52,5±16,6
39,8±7,8
p<0,05
Наличие признаков коллагенового фиброза в трепанобиоптатах костного мозга в
этой группе наблюдалось у 5 (21,7%) из 23 больных. Среднее время формирования
культуры МСК не отличалось и составило у больных с фиброзом 45,614,3 дней, без
фиброза – 44,412,4 дня (p=0,86).
Стандартное цитогенетическое исследование МСК
Кариотипирование МСК выполнено у 27 из 36 больных (МДС – 23 и ОМЛ – 4) и
у 7 здоровых доноров костного мозга. При анализе цитогенетических препаратов
МСК от 9 больных не были получены делящиеся клетки либо качество/количество
имевшихся митозов не было достаточным для проведения исследования. Нормальный
кариотип определен у всех больных ОМЛ и у 21 больного МДС, у одного из которых
в кариотипе МСК определялась конституциональная инверсия хромосомы 9. У 2
(9,5%) из 23 пациентов с МДС выявлены аномалии кариотипа МСК. У одного из них
с конституциональной инверсией хромосомы 9 получена неклональная транслокация
в одной метафазе: 46,ХY,t(2;22)(p10;q11),inv(9)(p13q21)[1]/46,ХY,inv(9)(p13q21)[19].
У второго пациента в кариотипе МСК выявлена клональная перестройка в 7
метафазах из 20: 46,ХY,add(2q)[7]/46,ХY[13]. Клетки костного мозга этого больного
содержали комплексные нарушения кариотипа. Таким образом, у 9,5% больных МДС
выявлены цитогенетические изменения МСК, которые были отличны от аномалий
кариотипа в кроветворных клетках.
У пациентов с инверсией хромосомы 9 в клетках костного мозга и МСК ее
конституциональный характер был подтвержден исследованием кариотипа культуры
фитогемагглютинин(ФГА)-стимулированных лимфоцитов периферической крови.
20
Цитогенетический анализ культур МСК, полученных из костного мозга
здоровых доноров, выявил нормальный кариотип во всех исследованных клеточных
образцах.
Запись кариотипа клеток общей популяции костного мозга и мезенхимальных
стромальных клеток у больного с клональными изменениями МСК представлена на
рисунке 5 (а, б):
а)
Кариотип: 45-46,XY,-5,+mar ?del(13q21),der(19),add(?q13or ?p13),-20,+2mar
б)
Кариотип: 46XY,add(2)(q36)
Рисунок 5. Кариограмма пациента с клональными изменениями кариотипа МСК
Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга; б) мезенхимальные
стромальные клетки
21
Цитогенетическое исследование МСК методом FISH
Исследование выполнено у 11 больных: 2 – МДС с del(5q), 3 – РЦМД, 2 – РАИБ1, 2 – РАИБ-2 и 2 – ОМЛ. У всех этих больных в клетках костного мозга были
выявлены хромосомные аномалии: у 5 больных – изолированные del(5q), моносомия
7 и inv(3), у 2 больных - сочетание 2 аномалий (моносомия 7 и трисомия X, del(5q) и
del(7q)) и у 4 больных – комплексные нарушения кариотипа. Размер клонов,
исследованных в клетках костного мозга с использованием соответствующих ДНКзондов, составил 20-85%. При стандартном цитогенетическом исследовании МСК у 9
из 11 больных определен нормальный кариотип
(у 1 из них выявлена
конституциональная инверсия хромосомы 9), у 1 больного – клональные аномалии
кариотипа и у 1 больного исследование не выполнено вследствие отсутствия митозов.
При FISH-анализе МСК были применены ДНК зонды к выявленным в кроветворных
клетках цитогенетическим маркерам. Ни в одном случае в МСК не были определены
хромосомные аномалии кроветворных клеток костного мозга.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
1.
Выводы
У больных миелодиспластическими синдромами в дебюте заболевания методом
стандартного цитогенетического исследования хромосомные аномалии в
костном мозге выявлены у 37,2% больных, нормальный кариотип получен у
53,5% и отсутствие митозов – у 9,3% больных.
Применение метода флюоресцентной in situ гибридизации в дополнение к
стандартному цитогенетическому исследованию позволило выявить «скрытые»
аномалии кариотипа в 16,3% случаев, таким образом, процент больных с
хромосомными аберрациями составил 51,2%.
Установлено, что в CD34+ гемопоэтических клетках-предшественницах в
костном мозге и периферической крови определены те же аномалии кариотипа,
что и в клетках общей популяции костного мозга.
Выявлена прямая корреляционная зависимость между величиной клона в
клетках общей популяции костного мозга и в CD34+ гемопоэтических клеткахпредшественницах костного мозга и периферической крови.
Получена зависимость времени формирования подслоя мезенхимальных
стромальных клеток от клеточности костного мозга: культура росла быстрее у
больных с гиперклеточным костным мозгом.
Определены структурные (клональные и неклональные) аномалии кариотипа
мезенхимальных стромальных клеток у 9,5% больных миелодиспластическими
синдромами, отличные от аномалий кариотипа клеток костного мозга.
Список опубликованных работ по теме диссертации
Пименова М.А., Паровичникова Е.Н., Кохно А.В., Домрачева Е.В., Манакова
Т.Е., Мальцева Ю.С., Коннова М.Л., Шишигина Л.А., Савченко В.Г.
Цитогенетическая характеристика гемопоэтических и стромальных клеток22
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
предшественниц при миелодиспластическом синдроме // Терапевтический архив
2013; №7: С.34-42.
Паровичникова Е.Н., Пименова М.А., Кохно А.В., Савченко В.Г. Хромосомные
аномалии в кроветворных и стромальных клетках-предшественниках при
миелодиспластическом синдроме // Гематология и трансфузиология 2013; №4:
С.33-40.
Пименова М.А., Соколов А.Н., Бирюкова Л.С., Устинова Е.Н., Шафоростова
И.И., Донскова И.А., Богданов Р.Ф., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г.
Экстремально высокая концентрация метотрексата в сыворотке крови,
сопровождавшаяся острой почечной недостаточностью у больного острым
лимфобластным лейкозом после проведения высокодозной консолидации //
Терапевтический архив. 2011. №7: С.58-61.
Пименова М.А., Кохно А.В., Домрачева Е.В., Дризе Н.И., Манакова Т.Е.,
Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. Характеристика цитогенетических
изменений в клетках костного мозга, мезенхимальных стромальных клетках и
лимфоцитах периферической крови у больных миелодиспластическим
синдромом и острым миелобластным лейкозом // Гематология и
трансфузиология. 2012; №3: С.70-71, Материалы Конгресса гематологов России,
июль 2012, Москва.
Pimenova M., Kokhno A., Domracheva E., Maltseva Yu., Shishigina L., Konnova M.,
Drize N., Manakova T., Parovichnikova E., Savchenko V. Cytogenetic characteristic
of mesenchymal and hematopoietic progenitor cells in myelodysplastic syndromes and
acute myeloid leukemias with myelodysplasia-related changes // Blood, ASH annual
meeting abstracts, 2012. 120: abstr. 4899.
Pimenova M., Kokhno A., Domracheva E., Drize N., Manakova T., Konnova M.,
Maltseva Yu., Shishigina L., Parovichnikova E., Savchenko V. Chromosomal analysis
of hematopoietic and stromal progenitor cells in patients with myelodysplastic
syndrome (MDS) // Leukemia Research. 2013; № 37: S1 S137: abstr. P-254. 12th
International Symposium on Myelodysplastic Syndromes (MDS), Berlin, Germany,
May 2013, Poster presentation.
Пименова М.А., Паровичникова Е.Н., Кохно А.В., Домрачева Е.В., Манакова
Т.Е., Сарибекян Р.А., Гальцева И.В., Савченко В.Г. Гемопоэтические и
стромальные клетки-предшественницы при миелодиспластическом синдроме
(МДС): цитогенетическая характеристика // Вестник гематологии 2013. № 2.
С.43-44.
Материалы
конференции
Молекулярно-генетические
и
иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога, апрель
2013, Санкт-Петербург.
Pimenova M., Parovichnikova E., Kokhno A., Domracheva E., Manakova T.,
Saribekyan R., Galtseva I., Savchenko V. Cytogenetic characterization of CD34+
hematopoietic progenitor cells and mesenchymal stromal cells in myelodysplastic
23
syndrome // Hematologica 2013; № 98. S1: abstr. P178. Annual congress of EHA,
June 2013. Poster presentation.
Список сокращений
МДС – миелодиспластические синдромы
СКК – стволовая кроветворная клетка
МСК – мезенхимальные стромальные клетки
РА – рефрактерная анемия
РЦ – рефрактерная цитопения
РАКС – рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами
РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией
РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов
ОМЛ – острый миелоидный лейкоз
Алло-ТСГК – трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток
HLA – человеческий лейкоцитарный антиген (главный комплекс
гистосовместимости)
IPSS – международная прогностическая шкала риска
WPSS – прогностическая шкала риска Всемирной организации здравоохранения
IPSS-R – пересмотренная международная прогностическая шкала риска
FISH – флюоресцентная in situ гибридизация
CD – кластер дифференцировки
ЭПО – эритропоэтин
Ara-C – цитозин-арабинозид
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ФГА – фитогемагглютинин
24