Иванов Сергей Михайлович
реклама
на правах рукописи УДК 577.2.08 Иванов Сергей Михайлович РАЗРАЗРАБОТКА ГИДРОГЕЛЕВЫХ МИКРОЧИПОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ БЕЛКАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА 03.00.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2007 Диссертация выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН, на кафедре молекулярной биофизики МФТИ (ГУ). Научный руководитель: кандидат химических наук, старший научный сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН Рубина Алла Юрьевна Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией физики биополимеров ИМБ РАН. Лившиц Михаил Аронович HT TH доктор химических наук, профессор, Несмеянов Владимир Андреевич заведующий лабораторией иммунохимии ИБХ РАН Ведущая организация: ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Защита состоится « 22 » марта 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408–57–00, 408–56–27. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета). Автореферат разослан «___» февраля 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент Брагин В.Е. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В настоящее время белковые микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Для закрепления белков на матрице (микрочипе) используются различные носители, такие как стекло, пластик, различные мембраны, золото, гидрогели и др. Трехмерные гидрогелевые микрочипы, разрабатываемые в Институте молекулярной биологии РАН, обладают существенными преимуществами по сравнению с микрочипами на основе двумерных поверхностей, в особенности для иммобилизации белков. Использование трехмерного геля в качестве носителя при иммобилизации позволяет увеличить количество иммобилизуемого зонда и достичь его равномерного распределения в объеме ячеек. Известно также, что иммобилизация белков в гидрогеле способствует их стабилизации, это справедливо и в отношении гидрогелевых микрочипов. В данной работе предложен новый метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий значительно упростить технологическую процедуру изготовления микрочипов. В результате проведенных исследований показано, что микрочипы, полученные с помощью предлагаемого метода, обеспечивают оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков и сохранение ими исходной биологической активности. Белковые микрочипы, изготовленные методом полимеризационной иммобилизации, позволяют проводить многопараметрический анализ образца и могут найти применение как в клинической практике, так и в области научных исследований. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью исследования является разработка метода получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации и применение разработанных микрочипов для количественного анализа белков. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Разработать способ иммобилизации белковых молекул в гидрогеле, не приводящий к потере ими биологической активности. 2. Упростить процедуру изготовления микрочипов за счет объединения полимеризации гидрогеля и иммобилизации белков в одну стадию. 3. Показать возможность проведения различных вариантов количественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. 3 НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В представленной гидрогелевых белковых работе показана микрочипов на возможность основе получения метода трехмерных полимеризационной иммобилизации. На примере белка барназы исследовано влияние введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности. Проведено исследование взаимодействия белков с различными гелеобразующими мономерами. Подобраны состав компонентов полимеризационной смеси и условия проведения полимеризации, позволяющие проводить иммобилизацию белков без предварительной модификации. На примере барназы методом MALDI TOF масс-спектрального анализа показано, что иммобилизованный в гидрогеле белок сохраняет ферментативную активность и субстратную специфичность. На примере взаимодействия барназы с её природным ингибитором барстаром продемонстрирована возможность проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. Данный тип анализа может быть полезен для проведения исследований в области протеомики. Разработанный метод иммобилизации белков позволил создать микрочипы с иммобилизованными возможность антителами. проведения На полученных количественного микрочипах иммуноанализа на была показана примере ракового эмбрионального антигена (РЭА). Для уменьшения времени проведения и увеличения чувствительности анализа были проведены исследования кинетики образования бинарных и тройных белковых комплексов, и разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе. В результате проведенных исследований были подобраны условия проведения одностадийного сэндвич- иммуноанализа РЭА, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью определять содержание данного маркера в растворах и сыворотках крови. Чувствительность анализа составила 1 нг/мл. Предложенный в работе метод изготовления гидрогелевых микрочипов и разработанный на его основе микрочип для количественного иммуноанализа опухолеассоциированного антигена РЭА могут найти применение для лабораторных и клинических исследований. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на XIV зимней молодежной научной школе «Перспективные (9-12 февраля, направления 2004, Москва). физико-химической Отдельные биологии фрагменты и биотехнологии» диссертационной работы 4 многократно докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН. ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано пять печатных работ. Ссылки на работы даны в конце автореферата. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, трех глав (литературного обзора, экспериментальной части и обсуждения), вывода и списка цитированной литературы. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста, содержит ___ рисунков и ____ таблиц. Библиография включает ___ наименований. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Белковые микрочипы Основной задачей данного исследования являлась разработка метода изготовления гидрогелевых белковых микрочипов, обеспечивающего оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков. Для иммобилизации белковых молекул в гидрогеле был выбран метод фотоиндуцируемой сополимеризации. Данный метод подразумевает участие в реакции радикальной полимеризации модифицированного введением непредельной группы белка и гелеобразующих мономеров. В результате сополимеризации белок образует прочную ковалентную связь с образующейся полимерной сеткой гидрогеля. Было опробовано два способа получения сополимеризационных гелевых микрочипов. На первом этапе работы были использован метод получения белковых гидрогелевых микрочипов включающий стадию предварительной модификации белка введением непредельной группы. На втором этапе работы была решена задача упрощения процесса иммобилизации белков в полимерном носителе. Предложенный метод также основан на фотоиндуцированной сополимеризации, однако модификация белка и полимеризация геля объединены в одну стадию, при этом иммобилизация осуществляется за счет взаимодействия белка с бифункциональными гелеобразующими мономерами. При выборе объекта для проведения исследований учитывали следующие требования: используемый белок должен обладать биологической активностью, наличие которой после прохождения иммобилизации на микрочипе легко детектировать 5 (например, ферментативной активностью); выбранный белок должен иметь относительно небольшую молекулярную массу для возможности осуществления масс-спектрального анализа при проведении различных химических модификаций. В результате, в качестве объекта исследования была выбрана внеклеточная рибонуклеозид-3’-трансфераза барназа, состоящая из трех одинаковых субъединиц с молекулярной массой 12,3 кДа каждая. Барназа образует прочный эквимолярный комплекс с природным ингибитором барстаром, молекулярная масса которого 10 кДа, что делает эти объекты удобными для проведения MALDI TOF MS анализа. Изготовление гелевых микрочипов Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры и белки, подлежащие иммобилизации, наносили с помощью робота (QArray, Genetix, Великобритания) в виде регулярного массива микрокапель на стеклянный слайд, стандартное предметное стекло для микроскопии, обработанный специальным реагентом (Bind Silane) для создания на поверхности непредельной группы. Гелевые ячейки (микрокапли) располагаются на гидрофобной поверхности подложки с определенным периодом; число ячеек на микрочипе и их размер определяются задачей и условиями предполагаемого эксперимента. Для флуориметрических измерений изготавливали микрочипы с диаметром ячеек 100 мкм и периодом 300 мкм; микрочипы для MALDI TOF MS анализа изготавливали на кремниевой подложке, с диаметром гелевых ячеек 0,4 мм, на расстоянии 3 мм друг от друга. Полимеризацию проводили под действием УФоблучения с максимумом при длине волны 350 нм в атмосфере инертного газа. Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа Регистрацию результатов анализа осуществляли флуориметрически или массспектрометрически. Флуоресцентные измерения проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН). Этот прибор, а также специальное программное обеспечение ImaGel (ИМБ РАН) позволяет одновременно анализировать данные со всех элементов микрочипа. Измерения для флуоресцентных красителей Texas Red и Cy5 проводили, используя фильтры 595/625 нм и 650/670 нм (возбуждение/регистрация) соответственно. Для регистрации результатов MALDI-TOF MS анализа была разработана методика прямого MS-анализа непосредственно с гелевых ячеек микрочипа (ИМБ РАН). В работе использовали масс-спектрометр KOMPACT-4 (Kratos Analytical, США). 6 Введение в молекулу барназы непредельных групп Для иммобилизации барназы в полиакриламидном геле был выбран способ модификации, предполагающий участие в реакции аминогрупп белка. В белок вводили непредельную группу с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира 6- метакриламиногексановой кислоты. O O O HN O N O Схема 1. N-гидроксисукциниммидный эфир 6-метакриламиногексановой кислоты Далее модифицированный белок и мономеры геля (такие как: акриламид, N,N’метиленбисметакриламид и др.) участвовали в реакции полимеризации гидрогеля. Максимальное количество непредельных групп, которое может быть введено в молекулу барназы равно девяти, так как в её структуре содержится восемь лизинов (т.е. 8 εаминогрупп), а также N-концевая α-аминогруппа, и не содержится цистеинов (т.е. -SH групп). Варьирование условий модификации (соотношения белок/реагент, pH реакционной смеси и времени реакции) позволяет вводить в белок различное количество непредельных групп. Путём подбора условий реакции в белок вводили от 1 до 9 метакрильных групп; количество введенных непредельных групп оценивали при помощи MALDI TOF масс-спектрометрии. Оценка эффективности иммобилизации Эффективность иммобилизации барназы качественно проверяли с помощью гельэлектрофореза. Перед проведением фореза модифицированный белок подвергали предварительной химически индуцируемой сополимеризации с мономерами гидрогеля. Образцы барназы с разной степенью модификации были иммобилизованы в лунках 10% акриламидного геля, в качестве контроля использовали немодифицированный белок. Далее гель с образцами подвергали электрофорезу для удаления не иммобилизовавшегося белка из гелевых лунок. После прохождения фореза и окрашивания геля «Кумасси голубой», визуально определяли эффективность сополимеризации для каждого образца. Было обнаружено, что барназа с различным количеством метакрильных групп полностью остается в лунках, в то время как немодифицированный белок имеет хорошую электрофоретическую подвижность и практически не задерживается в лунке с гелем, т.е. 7 не иммобилизуется. Из картины фореза также было видно, что количество непредельных групп не влияет на эффективность иммобилизации белка в полиакриламидном геле. Для количественной оценки эффективности иммобилизации барназы на микрочипе использовали данный белок с введенной флуоресцентной меткой. Были изготовлены микрочипы, в каждой ячейке которых была иммобилизована меченная Texas Red барназа, содержащая определенное количество метакрильных групп. С помощью флуоресцентного микроскопа получали значения интенсивности сигналов от каждой ячейки. Эти значения принимали за 100%. Затем микрочип отмывали от непрореагировавших компонентов полимеризационной смеси, в том числе белка, до постоянного значения флуоресцентных сигналов и рассчитывали эффективность иммобилизации для каждого случая. Было показано, что эффективность иммобилизации не зависит от количества введенных в белок метакрильных групп и составляет для барназы 70-75%. В качестве контроля использовали ячейки, содержащие немодифицированную барназу, эффективность иммобилизации которой в данных условиях составила менее 2-3%. Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности Для изучения влияния степени модификации белка на сохранение им биологической активности использовали взаимодействие барназы с её природным белковым ингибитором барстаром, с которым она образует прочный эквимолярный комплекс (Kасс=10-14М). B B P P Барназа, содержащая различные количества (от одной до девяти) непредельных групп, была иммобилизована в гелевых ячейках микрочипа. После проведения взаимодействия с флуоресцентно-меченым барстаром и отмывки от неспецифически связавшегося белка, были получены значения флуоресцентных сигналов для каждого случая модификации (рис. 1). Для увеличения точности эксперимента при расчетах использовали медианный сигнал от четырех одинаковых ячеек. Было обнаружено, что биологическая активность модифицированной барназы зависит от количества метакрильных групп, введенных в молекулу белка перед иммобилизацией. Введение пяти и менее непредельных групп (ряд 3,4) практически не влияет на способность барназы связывать барстар, в то время как введение 9 групп (ряд 2), т.е. модификация всех возможных аминогрупп барназы, приводит к полной потере активности. В качестве контроля использовали ячейки, не содержащие иммобилизованной барназы (ряд 1). 8 1 2 3 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 1 2 3 4 Рис.1 Оценка сохранения активности барназы с различной степенью модификации: (1) ячейки, не содержащие иммобилизованной барназы; (2) ячейки, содержащие барназу с 9 непредельными группами; (3) ячейки, содержащие барназу с 5 непредельными группами; (4) ячейки, содержащие барназу с 1 непредельной группой. Таким образом, проведенные исследования показали, что при модификации белка введением непредельных групп в достаточно широком диапазоне (от 1 до 5) не происходит потери биологической активности необходимо выбирать мягкие условия проведения реакции (боратный буфер, pH 9.3, 30 мин при комнатной температуре, молярное отношение белка к реагенту от 1/1 до 1/5), позволяющие вводить в белок такое количество непредельных групп, при котором иммобилизуемая молекула не теряет своей активности. Метод полимеризационной иммобилизации Следующей задачей было упростить метод изготовления белковых микрочипов, исключив стадию предварительной модификации белка. При исследовании иммобилизации барназы в гелях было обнаружено, что немодифицированный белок также способен в небольшой степени (2-3%) иммобилизоваться. Известно, что при синтезе полимеров методом радикальной полимеризации, независимо от способа ее инициирования (фотохимическое, термическое, радиационное или химическое), реакция протекает через стадии инициирования, роста и обрыва цепи. Такая природа радикальной полимеризации создает благоприятные условия для включения в структуру полимера различных соединений, в том числе, белков, содержащих в своей структуре амино-, сульфгидрильную или другие активные группы. Возможны, по меньшей мере, два пути включения: участие в реакции передачи цепи с образованием активных радикалов и участие в реакции нуклеофильного присоединения к ненасыщенным соединениям, существующим на разных стадиях полимеризации, а 9 именно, к исходным мономерам, растущим ненасыщенным макрорадикалам и ненасыщенным макромолекулам. При изготовлении сополимеризационных микрочипов, когда белки иммобилизованы за счет предварительного введения в их структуру непредельных групп, были использованы гели на основе акриламида с pH полимеризационной смеси 7.0-7.2. Затем было проведено исследование взаимодействия барназы с различными гелеобразующими мономерами в условиях, при которых частично депротонированы ε-аминогруппы лизина. Реакцию проводили в боратном буфере при pH 9.5, температуре 22°С, время реакции 12 ч, при перемешивании. Молярное отношение белка к модифицирующим реагентам составляло 1/1000. После проведения реакции белок очищали гель-фильтрацией на спинколонке с сефадексом G-25. Количество молекул мономера, введенных в одну молекулу белка, определяли с помощью MALDI TOF MS анализа (табл. 1). Таблица 1. Оценка взаимодействия барназы с различными мономерами гидрогеля. Название мономера Количество введенных Структурные формулы мономеров групп акриламид 9 метакриламид 0 N,N’-метиленбисакриламид 5 N,N’-метиленбисметакриламид 0 (2-акрилоилоксиэтил)метакрилат 4 N-(2-акрилоилоксоэтил)-метакриламид 4.5 N,N’-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид 1.7 10 Исходя из полученных данных, в качестве основного мономера был выбран метакриламид, не взаимодействующий в данных условиях с аминогруппами белка и, соответственно, не выводящий активные группы белка из последующей реакции сополимеризации. В качестве сшивающего бифункционального агента был выбран N,N’метиленбисакриламид. При большом избытке гелеобразующих мономеров по отношению к иммобилизуемому белку, а именно такой избыток в смеси для полимеризации, в результате алкилирования ε-аминогруппы лизина в белок вводится одна из непредельных групп бифункционального агента, в то время как вторая непредельная группа остается свободной и принимает участие в формировании растущей полимерной структуры. Состав полимеризационной смеси Т4%С2,5% (где Т% – суммарная масса всех гелеобразующих мономеров к объему геля, С% – отношение веса сшивки к суммарному весу всех гелеобразующих мономеров) был выбран таким образом, чтобы максимально повысить пористость получаемого гидрогеля. При подобранных условиях для изготовления сополимеризационных микрочипов была получена эффективность иммобилизации белков, сравнимая с эффективностью иммобилизации, получаемой при использовании метода с предварительной модификацией белковых молекул. Было показано, что эффективность иммобилизации не зависит от размера молекулы белка, а в большей степени определяется структурой и аминокислотным составом (таблица 2). Таблица 2. Эффективности иммобилизации различных белков Белок Мол. масса (кДа) Эффективность иммобилизации (%) Иммуноглобулины IgG 150 60-70 L-Аспартат аминотрансфераза 90 60 Бычий сывороточный альбумин 67 65 Пероксидаза 44 55 Белок А 42 70 β-лактоглобулин 18 60 барназа 12 70-75 11 Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы Белок барназа – внеклеточная рибонуклеозид-3’-трансфераза. Барназа специфична по отношению к рибо-G-нуклеотидам, но также способна с меньшей эффективностью расщеплять и другие рибонуклеотиды (рибо-U). Для проверки ферментативной активности барназы, иммобилизованной на микрочипе, олигонуклеотиды состава 5’-TTGAA-(рибо-G)-ACT-3’и 5’-TTTT-(рибо-UUU)TTTTT-3’ наносили на гелевые ячейки микрочипа индивидуально, каждый на отдельную ячейку. После инкубации (Т 22оС) микрочипа был проведен прямой MALDI TOF MS P анализ продуктов реакции P непосредственно с ячеек микрочипа. В качестве отрицательного контроля использовали ячейки, не содержащие иммобилизованную барназу, на которые также наносили исследуемые олигонуклеотиды. Полное расщепление рибо-G-содержащего олигонуклеотида на ячейках с иммобилизованной барназой произошло менее, чем за 1 мин (рис. 2). Рис. 2. Масс-спектральный анализ гидролиза 5’-TTGAA-(рибо-G)-ACT-3’ при комнатной температуре (1 мин), на микрочипе с иммобилизованной барназой: (1) спектр исходного олигонуклеотида, полученный с ячеек не содержащих барназу (контроль); (2) спектр продуктов гидролиза, полученный с ячеек с иммобилизованной барназой. Гидролиз рибо-U-содержащего олигонуклеотида под действием иммобилизованной барназы протекал менее эффективно чем рибо-G олигонуклеотида, время прохождения реакции превышало несколько часов. При уменьшении температуры до 2°С наблюдали гидролиз рибо-G олигонуклеотида в течении 30 мин: уменьшался пик с массой, 12 соответствующей исходному олигонуклеотиду (m/z 2750) и увеличивался пик с массой, соответствующей 5’-TTGAA-рибо-G фрагменту (m/z 1928) (рис.3). Рис. 3. Масс-спектральный анализ гидролиза 5’-TTGAA-(рибо-G)-ACT-3’ при температуре 2oC , время инкубации: 2 (1), 5 (2), 20 (3) и 25 (4) мин. P P Полученные данные позволяют сделать вывод, что иммобилизованная в гелевых элементах микрочипа барназа сохраняет не только ферментативную активность, но и субстратную специфичность. Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах Для прямого масс-спектрального анализа барстара были изготовлены микрочипы с иммобилизованной в различных концентрациях (от 1 до 100 мкг/мл) барназой. После инкубации микрочипов с раствором барстара и отмывки от неспецифически сорбировавшегося белка, проводили элюирование в условиях, разрушающих комплекс, образованный барстаром с иммобилизованной барназой. Микрочип обрабатывали насыщенным раствором матрицы для МALDI TOF MS анализа (sinapinic acid) в растворе 10% муравьиной кислоты в 30%-ном водном ацетонитриле, выдерживали 20 мин при комнатной температуре во влажной камере, и затем высушивали на нагревательном столике при 40оС. Далее проводили прямой масс-спектральный анализ с каждого гелевого P P элемента микрочипа, и идентифицировали белок по его молекулярной массе и способности связываться с иммобилизованным лигандом (рис 4). 13 В результате было обнаружено, что наблюдается корреляция между абсолютной интенсивностью пиков иммобилизованной молекулярных барназы. Масс-спектры ионов с барстара гелевых и ячеек, концентрацией не содержащих иммобилизованную барназу, но инкубированных с раствором барстара, не содержали пиков, соответствующих молекулярной массе барстара. Рис. 4. Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипе с иммобилизованной барназой: (1) концентрация иммобилизованной барназы 100 мкг/мл (интенсивность I=21мВ); (2) концентрация иммобилизованной барназы 10 мкг/мл (интенсивность I=2.5 мВ); (3) концентрация иммобилизованной барназы 1 мкг/мл (интенсивность I=1.2 мВ). Полученные данные свидетельствуют о возможности проведения прямого массспектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. Такой анализ не требует введения флуоресцентной или другой метки в исследуемый белок, что особенно важно при анализе минорных белков в образцах, содержащих большое количество различных белков (сывороток крови, лизатов и др.). Данный тип анализа может быть полезен для проведения исследований в области протеомики. Разработка процедуры сэндвич-иммуноанализа на белковых микрочипах (на примере РЭА) В клинической практике и научных исследованиях количественное определение многих белков выполняется с помощью твердофазного иммуноферментного анализа 14 (ИФА), основанного на использовании специфических к исследуемому белку антител. Для практических целей представлялось интересным разработать процедуру проведения иммуноанализа на белковых микрочипах. Известно, что наиболее чувствительным из возможных типов иммуноанализа является сэндвич-иммуноанализ с использованием антител, специфичных к разным эпитопам белковой молекулы. В случае сэндвич-иммуноанализа B микрочип B содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда (образец) содержит антиген, и на первой стадии происходит образование специфического бинарного комплекса антиген- иммобилизованное антитело. После завершения инкубации с антигеном и отмывки микрочипа от неспецифически связавшегося белка микрочип обрабатывают проявляющими флуоресцентно мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антигена. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше регистрируемый флуоресцентный сигнал. В результате получают график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих антитела, от концентрации антигена в растворе (калибровочную кривую), по которой далее определяют неизвестную концентрацию антигена в исследуемом образце. В качестве объекта для разработки иммуноанализа на микрочипах был выбран широко используемый серологический онкомаркер - раковый эмбриональный антиген (РЭА). Уровень РЭА при развитии опухолей различной локализации повышается в крови и отражает состояние злокачественного процесса. Падение уровня РЭА является показателем эффективности проводимого лечения, а вторичный подъем свидетельствует о развитии рецидива и метастазировании. РЭА представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 175-200 кДа. Одна из существенных особенностей его молекулярной структуры - высокое (до 60 %) содержание углеводов, что определяет высокую гетерогенность его физико-химических свойств. Чтобы осуществить иммуноанализ на микрочипе, необходимо было выбрать пару специфических моноклональных антител к различным эпитопам РЭА, и определить, какие именно антитела должны быть иммобилизованы на микрочипе, а какие – выступать в качестве проявляющих. Для работы использовали пару моноклональных антител CEA-1 и CEA-10 (CanAg, Швеция), рекомендованную к использованию в стандартном варианте твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетах. Были изготовлены микрочипы, содержащие ячейки с иммобилизованными антителами СЕА-1, СЕА-10 в равных концентрациях, и ячейки, не содержащие иммобилизованных белков (для контроля неспецифических взаимодействий). На микрочипе проводили кинетические измерения взаимодействия флуоресцентно меченого 15 красителем цианиновым-5 (Су5, Amersham, Великобритания) антигена РЭА (концентрация 200 нг/мл) с иммобилизованными антителами. Как видно из кинетических кривых (рис. 5), образование бинарного комплекса РЭА-Су5 с иммобилизованными антителами СЕА-1 происходит значительно быстрее (интенсивность флуоресцентного сигнала прямо пропорциональна концентрации белкового комплекса), чем с антител с иммобилизованными антителами СЕА-10. Рис.5 Кинетические кривые взаимодействия флуоресцентно-меченным антигеном: иммобилизованных (1) иммобилизованы антитела СЕА-1; (2) иммобилизованы антитела СЕА-10. Поскольку концентрации иммобилизованных антител СЕА-1 и СЕА-10 одинаковы, то из формулы [AB] = Кass[A][B], где концентрация комплекса пропорциональна B B флуоресцентному сигналу, видно, что антитела СЕА-1 обладают большей аффинностью к антигену, чем антитела СЕА-10. Поэтому в качестве антител для иммобилизации были выбраны СЕА-1, а в качестве проявляющих антител были выбраны СЕА-10. Для подтверждения правильности выбора пары антител был проведен также сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах с иммобилизованными антителами СЕА-1 и СЕА-10 в равных концентрациях. В качестве проявляющих антител использовали СЕА10-Су5 и СЕА-1-Су5 также в равных концентрациях. Полученные калибровочные кривые подтвердили правильность выбора пары антител для проведения сэндвич-иммуноанализа РЭА (рис. 6). 16 Рис.6. Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа РЭА: (1) пара СЕА-1/СЕА-10-Су5 (антитела для иммобилизации СЕА-1) (2) пара СЕА-10/ СЕА-1-Су5 (антитела для иммобилизации СЕА-10). Подбор условий проведения иммуноанализа Для оптимизации процедуры иммуноанализа было исследовано влияние температуры реакционной смеси. Микрочипы, содержащие иммобилизованные антитела СЕА-1, инкубировали с раствором РЭА (в концентрациях от 0.5 до 40 нг/мл) в течение 17 ч при различных температурах. После отмывки, микрочипы инкубировали в течение двух часов с флуоресцентно мечеными антителами СЕА-10-Су5 при температуре 20°С. В результате были получены зависимости интенсивности флуоресценции гелевых ячеек с иммобилизованными антителами от концентрации РЭА в растворе (калибровочные кривые) для различных температур (рис.7). Рис.7. Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа РЭА на микрочипах, полученные для различных температур: (1) температура инкубации 37оС; (2) температура инкубации P P 23оС; (3) температура инкубации 4оС. P P P P 17 Как видно из рисунка 7, при увеличении температуры инкубации с антигеном до о 37 C, значения флуоресцентных сигналов от гелевых ячеек с иммобилизованными на P P микрочипе антителами увеличиваются. Необходимо отметить, что фоновый сигнал при всех температурах оставался постоянным. В дальнейших экспериментах для увеличения чувствительности анализа инкубацию на микрочипах проводили при температуре 37°С. Одностадийный сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах Для практических приложений важно, чтобы протокол проведения анализа был наиболее простым. Разработанный ранее протокол проведения сэндвич-анализа включал две стадии: инкубацию антигена с иммобилизованными на микрочипе антителами (17 ч) и связывание проявляющих флуоресцентно меченых антител с образованным на микрочипе бинарным комплексом (2 ч). После каждой стадии необходимо производить отмывку микрочипов от неспецифически сорбировавшегося белка. Для упрощения процедуры анализа объединили в одну стадию инкубацию микрочипа с антигеном и флуоресцентно мечеными антителами. Смесь каждой из концентраций антигена с проявляющими антителами инкубировали на микрочипе в течение 17 ч при 37оС. В результате было P P обнаружено, что такой протокол проведения анализа позволяет не только добиться результатов, сравнимых с двустадийным анализом, но и повысить чувствительность анализа (рис. 8). Рис. 8. Сравнение калибровочных кривых сэндвич-иммуноанализа РЭА: (1) одностадийный анализ; (2) двустадийный анализ. 18 Увеличение чувствительности анализа можно объяснить увеличением времени взаимодействия антигена с проявляющими антителами. Ранее было показано, что константа ассоциации иммобилизованных антител (СЕА-1) с антигеном существенно выше константы ассоциации РЭА с проявляющими антителами (СЕА-10). Увеличение времени взаимодействия антигена с проявляющими антителами с двух часов до семнадцати часов позволило добиться увеличения сигнала. Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови С использованием микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела СЕА-1, получили калибровочную кривую для РЭА в диапазоне концентраций от 0 нг/мл до 75 нг/мл. На аналогичных микрочипах по полученной калибровочной кривой провели определение концентраций РЭА в трех образцах сывороток крови. Эксперимент проводили в 5-и повторах. В качестве референсных значений использовали значения концентраций РЭА в этих же образцах, измеренные с помощью ИФА набора фирмы СanАg (Швеция). Калибровочная кривая с нанесенными на неё величинами интенсивности флуоресцентного сигнала от образцов сывороток крови представлена на рис. 9. Для точек, соответствующих образцам сывороток крови, по оси абсцисс отложены значения концентраций, измеренных ИФА; по оси ординат отложены значения флуоресцентных сигналов, полученные на микрочипах, указаны стандартные отклонения. Рис. 9. Сэндвич-иммуноанализ сывороток, содержащих РЭА, - точки, соответствующие образцам сывороток крови 19 Как видно из рисунка, данные, полученные на микрочипах и с помощью ИФА, хорошо коррелируют между собой. Таким образом было показано, что методом сэндвичиммуноанализа на микрочипах можно определять значение концентраций антигена в клиническом образце. Ускорение иммуноанализа на микрочипе с помощью механического перемешивания образца Микрочипы, используемые для анализа, должны удовлетворять двум условиям: давать возможность анализировать низкие концентрации вещества, при этом анализ должен занимать минимально возможное время. Кинетические исследования показали, что взаимодействие антигена с иммобилизованными на микрочипе антителами происходит довольно медленно, сигнал не выходит на насыщение даже за 40 ч (рис.5). Скорость кинетики насыщения определяется величиной константы ассоциации образуемого бинарного комплекса «иммобилизованное антитело-антиген» и скоростью диффузии антигена. Эта стадия является лимитирующей при проведении иммуноанализа на микрочипе. Для уменьшения времени диффузии и, следовательно, времени проведения анализа было выбрано механическое перемешивание образца на микрочипе. Для этого была разработана специальная камера, содержащая две микротрубочки для подвода раствора образца (рис. 10А), а также был модифицирован перистальтический насос для совершения возвратно-поступательных движений, что позволило перемешивать исследуемый образец без существенного увеличения объема. А Б Рис. 10. (А) - фотография камеры для перемешивания. (Б) - схематический рисунок камеры. На микрочипе с иммобилизованными антителами СЕА-1 были получены кинетические кривые реакции образования комплекса «антиген-иммобилизованное» антитело с флуоресцентно меченым РЭА (С = 200 нг/мл) для диффузионно-реакционной 20 кинетики (без перемешивания) и кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса. Реакционную смесь общим объемом 225 мкл, содержащую РЭА-Cy5, заливали в камеру через встроенные трубки при помощи пипетки, причем 75 мкл смеси находилось в камере, а оставшиеся 150 мкл распределены между трубками. Если эксперимент проводился без перемешивания, то трубки герметично замыкались друг на друга. Флуоресцентный сигнал от каждого гелевого элемента измеряли с выдержкой 1 сек с интервалом в 60 сек в течение всего эксперимента. Для перемешивания реакционной смеси в камере встроенные трубки присоединяли к модифицированному перистальтическому насосу Minipulse 2 (Gilson, France). Перемешивания реакционной смеси достигали автоматическим переключением направления потока с прямого на обратное каждые 2 сек. Скорость потока в камере варьировали от 2 до 7 мл/мин. Все эксперименты для данной концентрации антигена и данной скорости потока проводились дважды. Результаты эксперимента представлены на рис. 11. Как видно из рисунка, время выхода на насыщение флуоресцентного сигнала уменьшается с 90 ч (без перемешивания) до 25 ч (с перемешиванием). Рис. 11. Кинетика образования бинарного комплекса флуоресцентно меченного РЭА с иммобилизованными антителами: (1) с перемешиванием образца; (2) без перемешивания образца. Кроме того, было показано, что при увеличении скорости перемешивания время выхода на насыщение также уменьшается, т.е. даже при максимально возможной скорости потока (~ 7 мл/мин) не происходит механической денатурации белкового комплекса и 21 вымывания антигена из ячеек микрочипа. Поэтому в дальнейшей работе использовали максимальную из доступных скоростей перемешивания образца. Получение калибровочных кривых при проведении анализа с механическим перемешиванием образца Разработанную систему перемешивания образца на микрочипе использовали для получения калибровочных кривых при проведении одностадийного сэндвич- иммуноанализа РЭА. В качестве контроля в этом же эксперименте были получены калибровочные кривые для одностадийного сэндвич-иммуноанализа РЭА без перемешивания инкубационной смеси. Для одновременного перемешивания нескольких образцов камеры соединяли последовательно, а исследуемые образцы разделяли воздушной пробкой, таким образом, на каждом микрочипе реакции с перемешиванием проходили в одних и тех же условиях (температура, скорость, время). На рис.12 представлены калибровочные кривые, полученные при перемешивании образца и без перемешивания. Инкубацию образцов на микрочипах проводили равное количество времени. Рис. 12. Калибровочные кривые иммуноанализа РЭА: (1) с перемешиванием образца; (2) без перемешивания образца. Как видно из рисунка, перемешивание образца приводит к значительному возрастанию флуоресцентных сигналов, при этом не происходит увеличения фонового сигнала. Проведенные перемешивания исследования позволяет значительно показали, сократить что использование время анализа без системы потери чувствительности. 22 Выводы: 1. Разработан метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий проводить иммобилизацию белка без его предварительной модификации. 2. Продемонстрировано сохранение исходной биологической активности иммобилизованных на микрочипах белков на примере белка барназы и антител. 3. Продемонстрирована возможность проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. 4. Разработана процедура одностадийного сэндвич-иммуноанализа ракового эмбрионального антигена, позволяющая с высокой чувствительностью определять содержание данного онкомаркера в растворах и сыворотках крови. 5. Разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе. Публикации автора 1. Рубина А.Ю., Паньков С.В., Иванов С.М., Дементьева Е.И. и Мирзабеков А.Д.// Белковые микрочипы. //Доклады Академии Наук, 2001, N5, том. 381, C. 701-704. 2. A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, A.A. Stomakhin, E.L. Darii, S.V. Pan’kov, V.E. Barsky, S.M. Ivanov, E.V. Konovalova, and A.D. Mirzabekov. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. //Biotechniques 34: 1008–1022 (May 2003). 3. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Стомахин А.А., Иванов С.М., Крейндлин Э.Я., Иванов Д.С., Родин Д.В., Деев С.М., Прасолов В.С. и Мирзабеков А.Д. Белковые микрочипы: анализ экспрессии рекомбинантного Барстара. //Доклады Академии Наук, 2003, N1, том. 393, C. 116-120. 4. D.A. Zubtsov, S.M. Ivanov, A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, V.R. Chechetkin, A.S. Zasedatelev. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips. //Journal of Biotechnology 122: 16-27 (2006). 5. Иванов С.М., Рубина А.Ю. Разработка методов иммобилизации белков в гелевых микрочипах. Тезисы докладов и стендовых сообщений ХVI зимняя молодежная научная школа школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 9-12 февраля 2004г. С. 17-18. 23
