1 000582 2 Данное изобретение относится к белку,

1
Данное изобретение относится к белку,
имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID № 1, как указано в Списке последовательностей, соответствующему зрелому
участку белка кости MP52. Изобретение относится также к гомодимерной форме этого белка
и фармацевтической композиции для лечения
заболеваний хрящей и костей, содержащей димерный белок в качестве активного ингредиента. Данное изобретение относится также к способу получения описанного выше белка в большом количестве и с высокой чистотой путем
культивирования клеток E.coli, трансформированных плазмидой, содержащей последовательность ДНК, способную экспрессировать описанный выше белок. Данное изобретение относится также к способу лечения заболеваний
хрящей и костей, включающему введение человеку фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество гомодимерного
белка.
Предшествующий уровень техники
Фармацевтические композиции, содержащие витамин D3, кальцитонин, эстроген или их
производные, а также производные бифосфонатов ранее использовались в клинической практике для предотвращения и лечения заболеваний костей. Недавно сообщалось, что морфогенетический белок костей (далее называемый
BMP), суперсемейство генов TGF-B, содержащее ВМР-2 и ВМР-9, и родственные белки,
имеют костную морфогенетическую активность.
Кроме того, сообщалось о костной морфогенетической активности одного из белков, называемых МР52 (WO 93/16099 и WO 95/04819).
Считают, что зрелый район белка МР52 представляет собой белок, состоящий из 120 аминокислотных остатков, имеющих N-концевой аланин, и его аминокислотная последовательность
описана в этих публикациях.
В Nature, vol. 368, р. 639-643 (1994) и WO
94/15449 описан также белок, называемый GDF5.
Однако эти белки трудно получить в очищенном виде в промышленном масштабе.
Линии клеток млекопитающих, такие как
L-клетки, были испытаны на способность к продуцированию МР52 с использованием методов
генной инженерии. Однако было обнаружено,
что с исследованными системами экспрессии
нелегко получить МР-52 в очищенном виде и с
высоким выходом.
Подробное описание изобретения
Авторы данного изобретения пытались получить МР52 с использованием E.coli в больших
масштабах при использовании методов генной
инженерии. Вкратце, авторы данного изобретения пытались получить МР52 с использованием
E.coli путем присоединения кодона, кодирующего метионин, к ДНК, кодирующей зрелый
участок МР52, который начинается с аланина.
Полученный продукт представлял собой не
000582
2
только МР52, но смесь МР52, белка из 121 аминокислотного остатка, имеющего N-концевой
метионин, и белка из 119 аминокислотных остатков, имеющего удаленный N-концевой аланин и начинающегося с пролина. Было чрезвычайно трудно выделить чистый МР52, по меньшей мере, содержащий зрелый участок из этой
смеси.
Авторы данного изобретения нашли, что
белок c последовательностью SEQ ID № 1, начинающийся с пролина на N-конце, может быть
получен селективно с очень высоким выходом
путем конструирования плазмиды, в которой
кодон, кодирующий метионин, соединен с последовательностью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID № 1,
состоящую из 119 аминокислотных остатков с
элиминацией N-концевого аланина МР52, и путем экспрессии полученной плазмиды в E.coli.
Кроме того, было подтверждено, что гомодимер
белка, имеющего SEQ ID № 1, обладает морфогенетической активностью в отношении хрящей
и костей.
Задачей данного изобретения является получение белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID № 1, как указано в
Списке последовательностей. Белок состоит из
119 аминокислотных остатков и соответствует
зрелому участку морфогенетического белка кости МР52 человека, состоящему из 120 аминокислотных остатков, из которого удален Nконцевой аланин. Белок, полученный согласно
данному изобретению, растворим в воде. Кроме
того, этот белок является низкотоксичным, поскольку он получен на основе белка человека.
Другой задачей данного изобретения является получение фармацевтической композиции
для лечения заболеваний хрящей и/или костей,
содержащей в качестве активного ингредиента
гомодимер белка, имеющего аминокислотную
последовательность SEQ ID № 1. Более конкретно, данное изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения и
лечения остеопороза, остеоартрита, такого как
деформирующий гонартрит и деформирующая
болезнь тазобедренного сустава, или эпифизарного остеомиелита, повреждения хрящей, такого как суставное повреждение мениска, реконструкции дефектных частей костей и хряща,
обусловленных повреждением и онкоэктомией,
дефекта костей и хрящей, перелома костей,
врожденных заболеваний хрящей и костей, таких как хондродисплазия, хондрогипоплазия,
ахондрогенез, расщелина нёба и остеодисплазия, и, кроме того, корешковых и арвекулярных
дефектов, поскольку гомодимерный белок, полученный согласно данному изобретению, обладает хрящевой и костной морфогенетической
активностью. Кроме того, этот гомодимерный
белок может применяться для обработки костных трансплантатов в косметической хирургии.
Эти способы лечения также относятся и к спо-
3
собам лечения в области ветеринарной хирургии.
Ещё одной задачей данного изобретения
является разработка способа получения белка,
состоящего из 119 аминокислотных остатков,
соответствующего зрелому участку белка МР52
человека, и имеющего последовательность SEQ
ID № 1, с использованием E.coli.
В частности, данное изобретение относится к конструированию плазмиды, содержащей
последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, состоящую из
119 аминокислотных остатков (SEQ ID № 1) с
дополнительным метионином на N-конце.
Только зрелый район кДНК белка МР52 человека был амплифицирован полимеразной цепной
реакцией (способ ПЦР) с использованием в качестве матричной ДНК плазмидного вектора,
содержащего кДНК, описанную в заявке
WO 93/16099. Способ ПЦР, на который ссылаются авторы, означает амплификацию очень
небольшого количества фрагментов ДНК или
РНК согласно методике, описанной в патенте
США № 4683195.
Для получения заявленного белка конструируют соответствующие экспрессирующие
векторы, содержащие ДНК, кодирующую данный белок, которые затем вводят в желаемые
штаммы-хозяева E.coli при помощи способов
генной инженерии. Для широкомасштабного
получения этого белка используют два следующих усовершенствованных способа:
1) способ увеличения выхода целевых белков путем увеличения эффективности трансляции, описанный М.Nobuhara et al. (Agric.
Biol.Chem., 52(6), 1331-1338, 1988), а именно,
способ увеличения содержания AT около инициирующего кодона ATG, и
2) способ увеличения среднего числа копий плазмид на клетку, а именно, способ замены района ori вектора pBR районом ori вектора
pUC.
Далее,
экспрессирующий
вектор
(рКОТ245) конструируют прямым лигированием промоторного района с последовательностью
ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID № 1 с дополнительным метионином на ее N-конце. Клетки Е.coli, содержащие этот вектор, были депонированы (номер
доступа BIKOKEN-KIP-14895) в National
Institute of Bioscience and Human-Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, который находится по адресу 1-3б Higashi 1chome, Yatake-cho, Taukuba-shi, Ibaraкi-ken, 305
Japan, 14 апреля 1995 года и передепонированы
(номер доступа BIKOKEN-KI ВР-5499) 10 апреля 1996 года согласно Будапештскому договору
о международном признании депонирования
микроорганизмов.
Данное изобретение относится также к
способу получения мономерных белков, предусматривающему
000582
4
конструирование плазмиды, содержащей
последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID № 1 с
метионином на ее N-конце,
введение этой плазмиды в E.coli для
трансформации,
культивирование E.coli для получения телец включения,
солюбилизацию и очистку телец включения с получением мономерных белков,
и к способу получения гомодимерных форм
белка с SEQ ID № 1 посредством повторной
укладки и очистки мономерных белков, полученных, как описано выше. Вкратце, белки в
соответствии с данным изобретением получают
солюбилизацией телец включения E.coli с последующим нанесением на колонку с SPСефарозой и колонку с Сефакрилом S-200 с получением очищенных сульфированных мономеров МР52, которые подвергают вторичной укладке и изоэлектрической преципитации, а затем наносят на колонку RESOURCE RPC
ВЭЖХ с обращенной фазой с получением фракций очищенных димеров указанных белков. Физико-химические свойства этих белков анализируют на основе определения N-концевой аминокислотной последовательности и аминокислотного состава и с применением электрофореза.
Данное изобретение относится также к
способу культивирования клеток E.coli, в которые были введены экспрессирующие векторы, в
культуральной среде при 28-34°С, рН 6-8 и концентрации кислорода 20-50%.
Далее, данное изобретение относится к
способу лечения заболеваний хрящей и костей,
включающему в себя введение человеку фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество гомодимерного белка.
Биологические активности гомодимерного
белка определяют по рентгенограммам мягкого
рентгенографического анализа, по окрашиванию тканей и мониторингом эктопического образования хрящей/костей. Кроме того, на основании результатов воздействия на внутримембранную оссификацию (окостенение), регенерацию суставной хрящевой ткани и заживление
переломов и дефектов костей было показано,
что гомодимерный белок, полученный согласно
данному изобретению, является ценным для
терапии регенерации хрящевой и/или костной
ткани.
Гомодимерный белок, полученный согласно данному изобретению, можно вводить системно внутривенной, внутримышечной или
внутрибрюшинной инъекцией. В случае внутривенного введения можно также использовать
капельное внутривенное вливание, в дополнение к общепринятым внутривенным инъекциям.
Инъецируемые препараты могут быть приготовлены, например, в виде порошков для инъ-
5
екций. В этом случае порошки могут быть приготовлены путем добавления одного или нескольких пригодных водорастворимых наполнителей, таких как маннит, сахароза, лактоза,
мальтоза, глюкоза, фруктоза и т.д., к активному
ингредиенту, растворения этой смеси в воде,
распределения ее во флаконы или ампулы с последующими лиофилизацией и герметичным
закупориванием.
В случае местного введения гомодимерный белок может быть нанесен в виде покрытия
на поверхность хряща, кости или зуба посредством коллагеновой пасты, фибринового клея или
других приклеивающих материалов. В случае
имплантации костей можно использовать как
природную кость, так и обычную искусственную кость. Искусственная кость означает кость,
изготовленную из металла, керамики, стекла и
другого природного или искусственного неорганического вещества. Предпочтительным искусственным веществом считают гидроксиапатит. Например, искусственная кость может быть
изготовлена из стали в качестве плотного материала внутренней части и гидроксиапатита в
качестве пористого материла наружной части.
Кроме того, целесообразно наносить гомодимерный белок на участок, из которого удаляют
раковую костную ткань, для ускорения восстановления кости. Он может быть также нанесен
на имплантат хряща.
Доза может изменяться в зависимости от
различных факторов, влияющих на активность
данного белка, таких как вес кости и хряща, которые должны быть восстановлены, поврежденный участок кости и хряща и симптомы заболевания, возраст и пол пациентов, тяжесть инфекции, интервалы введения и другие клинические
факторы. Доза может также изменяться в зависимости от типов носителей, используемых для
повторной структуризации с димерным белком.
В общем, доза находится в диапазоне ≈10-106 нг
гомодимерного белка на сырой вес целевых
кости и хряща при введении в виде композиции,
содержащей носитель. В случае местного и системного введения в виде инъекции предпочтительно вводить 0,1-104 мкг с частотой от одного
раза в неделю до одного раза в день.
Синергическое действие может ожидаться
при введении гомодимерного белка одновременно с известными факторами роста, например, инсулинподобным фактором роста-1, для
регенерации костной и хрящевой ткани. Никогда ранее не сообщалось о способе получения
белка в соответствии с данным изобретением в
промышленном масштабе и в очищенном виде,
как описано выше, и этот гомодимерный белок
применим в составе лекарственной композиции
для лечения заболеваний хрящей и костей, поскольку он обладает хрящевой и костной морфогенетической активностью. Далее, способ
получения белка согласно данному изобретению может быть применим для получения дру-
000582
6
гих белков, членов вышеописанного суперсемейства TGF-B, все из которых до сих пор можно было успешно получать только с использованием линий клеток млекопитающих.
Данное изобретение иллюстрируется следующими далее примерами. Однако не следует
понимать, что данное изобретение ограничено
только этими примерами.
Пример 1. Конструирование экспрессирующего вектора.
(1) Выделение зрелого участка МР52.
кДНК зрелого участка МР52 человека
ПЦР-амплифицировали с использованием плазмидного вектора (pSK52s), содержащего кДНК,
описанную в заявке WO 93/16099, в качестве
матричной ДНК.
В соответствии со способом увеличения
выхода
целевых
белков,
описанным
M.Nobuhara, et al. (Agric. Biol. Chem., 52(6),
1331-1338, 1988), часть ДНК гена зрелого участка МР52 заменяли для увеличения содержания AT около инициирующего кодона ATG.
Мутагенез
был
осуществлен
ПЦРспособом с использованием сконструированного праймера ПЦР, представляющего собой мутантную SEQ ID № 2, как указано в Списке последовательностей. В качестве праймеров ПЦР
использовали ДНК SEQ ID № 2 в качестве обратного (upstream) праймеpa, а ДНК SEQ ID
№ 3, как указано в Списке последовательностей
в качестве прямого (downstream) праймера.
ПЦР проводили путем смешивания матричной ДНК (10 нг), 50 нмоль каждого из праймеров ПДР, dNTP (0,2 ммоль) и MgCl2 (1,5
ммоль) в одной и той же тест-пробирке вместе с
ДНК-полимеразой Tag (5Е).
Выполняли тридцать циклов ПЦР; условия
каждого цикла были: 94°С в течение 1 мин для
денатурации, 55°С в течение 1 мин для отжига
праймеров и 72°С в течение 2 мин для удлинения праймеров.
Продукты, полученные с помощью ПЦР,
выделяли при помощи электрофореза в 1,5%
агарозе с низкой точкой плавления (приобретенной из FMS) и выделяли фрагменты ≈360
п.н. (Фрагмент 1).
(2) Конструирование экспрессирующего
вектора E.coli для получения заявленного белка.
Для увеличения числа копий плазмиды в
расчете на бактерию район ori вектора pBR заменяли районом ori вектора pUC. Экспрессирующий вектор E.coli рКК223-3, коммерчески
доступный (приобретенный от Pharmacia
Biotech), использовали для выделения района
промотора tac путем расщепления рестриктазами Sspi и EcoRi, а также для выделения терминирующего района rrnBt1t2 с использованием
SalI и SspI. Фрагмент ДНК промоторного района tac, который был обработан нуклеазой из
золотистой фасоли (Takara Shuzo Co., Ltd), лигировали ДНК-лигазой Т4 с Фрагментом 1, полученным выше. Полученный фрагмент ДНК
7
расщепляли SalI и повторно лигировали в сайт
SmaI вектора pUC18 для конструирования экспрессирующего вектора {(рКОТ245) (№ депозита ВIКОКЕN-КIР-14895)} (фиг. 1) для получения белка. Длина ДНК рКОТ245 равна 3,7 п.н.
Нуклеотидную последовательность экспрессирующего вектора, сконструированную для получения этого белка, анализировали при помощи секвенатора ДНК (Pharmacia Alf).
(3) Трансформация.
Трансформацию проводили согласно способу трансформации с хлоридом рубидия, описанному Кushner et al. (Genetic Engineering, p.
17, Elsevier, 1978). Вкратце, рКОТ245 использовали для трансформации штамма-хозяина E.coli
W3110M согласно описанному выше способу с
получением трансформантов E.coli для получения целевого белка.
Пример 2. Культивирование.
(1) Культивирование.
E.coli, экспрессирующую заявленный белок, предварительно культивировали в модифицированной среде SOC (бактотриптон 20 г/л,
бакто-дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 0,5 г/л,
MgCl2⋅6H2O 2,03 г/л, глюкоза 3,6 г/л). 100 мл
суспензии бактерий использовали для инокулирования 5 л cреды для получения продукта
(бактотриптон 5 г/л; лимонная кислота 4,3 г/л;
К2НРO4 4,675 г/л; КН2РO4 1,275 г/л; NaCl 0,865
г/л; FeSO4⋅7H2O 100 мг/л; CuSO4⋅5H2O 1 мг/л;
МnSO4⋅nН2О 0,5 мг/л; CaCl2⋅2H2O 2 мг/л;
Na2B4O7⋅10Н2О 0,225 мг/л; (NН4)6Мo7O24⋅4Н2O
0,1 мг/л; ZnSO4⋅7H2O 2,25 мг/л; СоСl2⋅6Н2О
6 мг/л: MgSO4⋅7H2O 2,2 г/л; тиамин-HCl
5,0 мг/л; глюкоза 3 г/л), которую культивировали в 10-литровом ферментере с аэрациейперемешиванием и затем по достижении ранней
стадии логарифмической фазы роста (ОD550=5,0)
добавляли изопропил-β-D-тиогалактопиранозид
до конечной концентрации 1 мМ и культивирование продолжали до достижения OD550=150. Во
время культивирования температуру поддерживали на уровне 32°С, а величину рН на уровне
7,15 добавлением аммиака. Для предотвращения
снижения концентрации растворенного кислорода перемешивание проводили со скоростью,
достаточной для поддержания концентрации
растворенного кислорода 50% от насыщения
воздухом. Культивирование продолжали добавлением 50% раствора глюкозы до уровня 0,2%
для получения высокой плотности клеток, о которой свидетельствовало резкое увеличение
концентрации растворенного кислорода.
(2) Получение телец включения Е.соli.
Культуральный бульон, полученный описанным выше способом, центрифугировали для
сбора клеток, которые затем суспендировали в
25 мМ Трис-НСl-буфере, содержащем 10 мМ
этилендиаминтетрауксусную кислоту (рН 7,3).
Клетки разрушали пропусканием их через гомогенизатор (APV Gaulin Inc.) и снова центрифу-
000582
8
гировали для сбора осадка, содержащего тельца
включения.
Пример 3. Очистка.
(1) Солюбилизация телец включения E.coli
После промывания 1% тритоном Х-100 три
раза тельца включения E.coli центрифугировали
при 3000 g в течение 30 мин при 4°С и затем
полученный осадок солюбилизировали обработкой ультразвуком в 20 мМ Трис-НСl-буфере,
рН 8,3, 8 М мочевине, 10 мМ ДТТ и 1 мМ
ЭДТК.
(2) Получение мономеров.
Солюбилизированный раствор центрифугировали при 20000 g в течение 30 мин и полученный супернатант собирали. Полученный
супернатант наносили на колонку с Сефарозой
SP FF (Pharmacia AB), уравновешенную 20 мМ
Трис-НСl-буфером, рН 8,3, 6 М мочевиной и 1
мМ ЭДТК, и затем после промывания тем же
самым раствором, колонку элюировали тем же
раствором, содержащим 0,5 М NaCl. Белок в
элюате сульфировали добавлением Na2SO3 и
Na2S4O6 до конечной концентрации, соответственно 111 мМ и 13 мМ и инкубированием при
4°С в течение 15 ч.
Сульфированный раствор подвергали гельфильтрации на колонке с Ceфакрилом S-200 HR
(Pharmacia AB), уравновешенной 20 мМ ТрисНСl-буфером, рН 8,3, 6 М мочевиной, 0,2 NaCl и
1 мМ ЭДТК, с получением сульфированных
мономеров белка в соответствии с данным изобретением.
(3) Повторная укладка.
Раствор сульфированных мономеров добавляли в 9-кратный объем 50 мМ Naглицинового буфера, рН 9,8, 0,2 М NaCl, 16 мМ
CHAPS, 5 мМ ЭДТК, 2 мМ GSH (восстановленного глутатиона) и 1 мМ GSSG (окисленного
глутатиона) и затем инкубировали в течение 24
ч при 4°С для окисления и повторной укладки
белка в соответствии с данным изобретением.
(4) Получение гомодимеров.
Раствор для повторной укладки разбавляли
таким же объемом очищенной воды и затем доводили рН приблизительно до 7,4 6н. НСl и помещали для изоэлектрического осаждения.
Осадки, собранные центрифугированием при
3000 g в течение 20 мин, солюбилизировали в
растворе с 30% ацетонитрила, содержащем 0,1%
ТФК. Раствор разбавляли таким же объемом
очищенной воды и наносили на колонку
RESOURCE RPC (Pharmacia АВ) ВЭЖХ с обращенной фазой, уравновешенную 25% ацетонитрилом, содержащим 0,05% ТФК, и затем
элюировали линейным градиентом 25-45% ацетонитрила, содержащего 0,05% ТФК. Элюат
подвергали мониторингу на поглощение при
280 нм. Фракции очищенного гомодимерного
белка собирали и лиофилизировали при помощи
концентратора SpeedVac (Servant Co.).
9
(5)
Определение
физико-химических
свойств очищенного белка в соответствии с
данным изобретением.
а) Анализ N-концевой аминокислотной последовательности.
Анализ N-концевой аминокислотной последовательности для очищенных белков выполняли при помощи секвенатора аминокислот
Model 476A (Applied Biosystems Inc.) для подтверждения аминокислотной последовательности от N-конца до 30-ой аминокислоты SEQ ID
№ 1, как указано в Списке последовательностей.
б) Анализ аминокислотного состава.
Анализ аминокислотного состава очищенных белков, полученных, как описано выше,
выполняли при помощи секвенатора аминокислот (PICO TAG Systems, Waters). Результат приведен в табл. 1. Цифры, представленные в
табл.1, указывают число аминокислотных остатков в расчете на мономерный белок.
Таблица 1
АминокисФактическое
Ожидаемое
лота
число
число
Asx
11,5
12
Glx
10,9
11
Ser
8,4
9
Gly
4,3
4
His
4,0
4
Arg
7,7
7
Thr
5,4
6
Ala
7,3
7
Pro
10,2
10
Tyr
2,9
3
Val
5,7
7
Met.
5,1
4
1/2 Cys
2,6
7
Ilе
4,9
6
Leu
10,0
10
Phe
4,0
4
Lys
5,9
6
Тур
-*
2
119
Длина последовательности
*
не определено
в) Анализ при помощи электрофореза.
Было показано, что молекулярная масса
очищенных белков, полученных как описано
выше, равна ≈28 кДа при электрофорезе в
ПААГ-ДСН в невосстанавливающих условиях.
Из результатов, представленных выше в
разделах а), б) и в), видно, что белок в соответствии с данным изобретением содержит 119
аминокислотных остатков и начинается с Nконцевого Pro.
Пример 4. Определение биологических активностей.
(1) Активность в эктопическом костеобразовании у мышей.
000582
10
Приблизительно 500 мкг гомодимерного
белка, полученного в примере 3, растворяли и
разбавляли в 50 мкл 10 мМ соляной кислоты с
получением растворов с концентрацией 1 мкг/10
мкл, 10 мкг/10 мкл и 100 мкг/10 мкл. Десять мкл
каждого раствора смешивали с 150 мкл раствора
коллагена типа-I свиного сухожилия (Koken,
0,5%, рН 3, I-AC), нейтрализовали, лиофилизировали и полученную смесь имплантировали в
карманы, созданные в мышцах бедра 8недельных самцов мышей ICR. На 21-й день от
имплантации животных умерщвляли и бедра
вырезали. После снятия кожи встречаемость
кальцифицированных тканей оценивали мягкой
рентгенографией. Как показано в табл.2, имплантация 1 мкг или более димерного белка индуцировала калъцифицированную ткань у части
мышей этой группы, а дозы 10 мкг и более индуцировали кальцифицированную ткань у всех
тестируемых животных.
Таблица 2
Доза гомодимерного Встречаемость кальцибелка
фицированной ткани
Контроль (только
0/4
коллаген типа-I)
1 мкг/участок
10 мкг/участок
100 мкг/участок
3/4
4/4
4/4
Фиг. 2 иллюстрирует типичные примеры
мягких рентгенограмм кальцифицированной
ткани, индуцированной различными дозами
белка МР52. Фиг. 2А, 2В и 2С иллюстрируют
примеры мягких рентгенограмм бедер мышей,
имплантированных
1
мкг/участок,
10
мкг/участок и 100 мкг/участок гомодимерного
белка, соответственно. Эти рентгенограммы
показывают, что гомодимерный белок индуцировал появление кальцифицированной ткани в
бедре мыши и увеличивал ее количество в зависимости от дозы. Для определения, была ли образованная кальцифицированная ткань хрящевой или костной тканью, срезы фиксированных
бедер мышей, в которые был имплантирован
гомодимерный белок в концентрации 10
мкг/участок, окрашивали по фон Коссу, алциановым синим или гематоксилином-эозином.
На фиг. 3 приведены полученные под световым микроскопом фотографии срезов, окрашенных соответствующими способами.
На фиг. 3А (окрашивание по фон Коссу)
зоны, обозначенные как ct и сс, представляют
собой кальцифицированную ткань и кальцифицированные хондроциты, соответственно. На
фиг. 3В (окрашивание алциановым синим) зоны,
обозначенные как rc, представляют собой оставшуюся хрящевую ткань. На фиг. 3С (окрашивание гематоксилином-эозином) элементы,
обозначенные как ad, bm, lb, ob и wb, представляют собой адипоциты, клетки костного мозга,
ламеллярную костную ткань, остеобласты и
11
волокнистую костную ткань, соответственно.
Таким образом, очевидно, что имплантация гомодимерного белка с коллагеном типа-I в бедра
мышей индуцирует появление кальцифицированных хондроцитов остеобластов и клеток костного мозга в местах имплантации.
Таким образом, было показано, что гомодимерный белок обладает активностью в эктопическом образовании хрящевой и костной ткани.
(2) Мониторинг эктопического костеобразования у мышей.
Димерный белок (3 мкг), полученный в
примере 3, смешивали с раствором коллагена
типа-I и нейтрализовали, как описано в примере
4 (1), и лиофилизированные препараты имплантировали в бедра самца мыши ICR. На 3-й, 7-й,
10-й, 14-й, 21-й и 28-й дни от имплантации бедра вырезали и фиксировали в 10% формалине и
затем срезы окрашивали гематоксилиномэозином или по фон Коссу. На фиг. 4 приведены
полученные под световым микроскопом фотографии окрашенных срезов.
На 3-й день (фиг. 4А, окрашивание гематоксилином-эозином) недифференцированные
мезенхимные клетки (mc), в том числе морфологически волокнистые соединительно-тканные
клетки, появились в пространстве между имплантированными волокнами коллагена (со) и
мышечными клетками (m). Между 7-ым и 10-ым
днями (фиг. 4В и 4С, соответственно, окрашивание гематоксилином-эозином) это пространство заполнялось недифференцированными мехензимными клетками (mc), и эти клетки были
гипертрофированными и дифференцировались в
предхрящевую ткань. На 14-й день (фиг. 4D,
окрашивание гематоксилином-эозином и фиг.
4Е, окрашивание по фон Коссу) наблюдали
кальцифицированную хрящевую ткань (ос) и
костную ткань (b). На 21-й день (фиг. 4D, окрашивание гематоксилином-эозином и фиг. 4Е,
окрашивание по фон Коссу) кальцифицированную хрящевую ткань не наблюдали вообще, и
ткань, наблюдаемая на 14-ый день, повидимому, заменялась костью (b) с костным
мозгом (bm). На 20-ый день (фиг. 4Н, окрашивание гематоксилином-эозином) выявлялось
большое количество клеток костного мозга и
образованная кость, по-видимому, находилась в
состоянии процесса резорбции.
Таким образом, очевидно, что гомодимерный белок индуцирует эндохрящевую оссификацию (окостенение) посредством образования
хрящевой ткани в эктопических участках, что
наблюдалось ранее при использовании других
BMP.
(3) Действие на внутримембранную оссификацию.
Гомодимерный белок, полученный в примере 3, растворяли в забуференном фосфатом
солевом растворе (рН 3,4), содержащем 0,01%
человеческий сывороточный альбумин, и гото-
000582
12
вили растворы с концентрацией 0,01 мкг/20 мкл,
0,1 мкг/20 мкл и 1 мкг/20 мкл. Аликвоту объемом 20 мкл каждого раствора инъецировали 12
раз ежедневно в периост (надкостницу) теменной кости новорожденной крысы при помощи
микрошприца, начиная с 1-го дня после рождения. Такой же объем носителя инъецировали на
противоположной стороне теменной кости каждой крысы. Тот же объем носителя инъецировали также на обеих сторонах теменных костей
контрольных крыс. На 1-ый день от последней
инъекции крыс умерщвляли и обе стороны теменных костей вырезали и фиксировали и затем
готовили срезы с удаленным известковым веществом, окрашенные гематоксилином-эозином,
для измерения толщины теменных костей в
инъецированных участках на фотографиях под
световым микроскопом. Рассчитывали отношение толщины теменных костей каждой крысы в
инъецированном гомодимерным белком/ инъецированном носителем участках. Как показано в
табл. 3, гомодимерный белок увеличивал толщину теменной кости в зависимости от дозы.
Типичный пример микрофотографий среза при
участке, инъецированном 0,1 мкг гомодимерного белка, показан на фиг. 5В в сравнении с микрофотографией противоположной стороны инъецированного носителем участка (фиг. 5А).
Инъекция гомодимерного белка индуцировала
активацию и пролиферацию клеток периоста
(р), и в теменной кости и на теменной кости выявлялись активированные остеобласты (b). Эти
результаты показывают, что гомодимерный белок стимулирует внутримембранную оссификацию при местном введении, и является полезным для терапии остеопороза, перелома костей
и дефектов альвеолярного отростка челюсти и
периодонтальных дефектов.
Таблица 3
Толщина теменной
Доза гокости, мкм
модимерного бел- Инъеци- ИнъецироОтношение
ка
ванный
рованный
(В/А)
(мкг/учас- носителем MP52 учаток/день) участок
сток (В)
(А)
0 (носи128±7
141±20
1,10±0,16
тель)
0,01
134±9
161±30
1,27±0,33
0,1
119±19
190±29
1,60±0,10*
1
132±9
225±25
1,70±0,14**
Величины представляют собой средние
значения ±среднее квадратичное отклонение
(SD), * р<0,05, **р<0,01 в сравнении с отношением в группе, животным которой носитель инъецировали в обе стороны кости (тест Вильямса).
13
(4) Действие на регенерацию суставного
хряща.
Для этого исследования использовали
шесть 12-недельных самцов новозеландских
белых кроликов. Кожу и суставную капсулу
правого колена разрезали и создавали костнохрящевой дефект толщиной 5х5 мм в канавке
надколенной чашечки при помощи стоматологического бора таким образом, чтобы не повредить окружающие ее сухожилия. Дефекты заполняли либо тампоном из лиофилизированного
коллагена типа-I, либо таким же тампоном, содержащим 10 мкг гомодимерного белка, полученного, как описано в примере 4 (1), и затем
разрез суставной капсулы и кожи зашивали.
Через 3 недели после этой операции кроликов
умерщвляли и бедренные головки вырезали и
фиксировали в 10% формалине и затем срезы с
удаленным известковым веществом окрашивали
алциановым синим. Типичные примеры фотографии этих срезов, полученных под световым
микроскопом, показаны на фиг. 6. Обработанные димерным белком дефекты (фиг. 6С и 6D)
обнаружили регенерацию хондроцитов (ch) с
экстрацеллюлярными матриксами, которые интенсивно окрашивались алциановым синим, по
сравнению с контрольными дефектами, имплантированными тампоном с коллагеном типа-I,
которые были заполнены волокнистой тканью
(f). Хрящевая ткань, индуцированная димерным
белком, обнаружила зональную структуру,
включающую в себя покоящиеся хондроциты,
растущие хондроциты и гипертрофированные
хондроциты, подобную структуре нормальной
суставной хрящевой ткани. Индуцирование
хондроцитов белком МР52 наблюдали в дефектах всех тестируемых кроликов (n=3). Эти результаты указывают на то, что димерный белок
эффективен для peпaрации поврежденной хрящевой ткани у пациентов, например, больных
остеопорозом.
(5) Действие на заживление переломов и
дефектов костей.
Для этого исследования использовали тридцать крыс Sprague-Dawley (в возрасте приблизительно 15 недель). Латеральным образом всю
мышечную и надкостничную ткань снимали с
диафиза бедренной кости. Создавали дефект в
виде сегмента 5 мм в средней части правой
стержневидной структуры бедренной кости при
помощи бора и затем фиксировали специально
изготовленную полиэтиленовую пластинку винтами из нержавеющей стали вдоль кортикального слоя бедра. Готовили тампоны из коллагена
типа-I, а также содержащие 0, 1, 10 и 100 мкг
гомодимерного белка, как описано в примере 4
(1), и имплантировали их в сегментные дефекты
кости и затем рану зашивали. Сразу же после
операции и через 12 недель после нее эти дефекты оценивали при помощи мягкой рентгенографии. Как показано на фиг. 7, гомодимерной
белок в концентрации 10 мкг/участок и
000582
14
100мкг/участок стимулировал образование каллуса (сs) в дефектах и вызывал костные сращения, но его действие в концентрации 1
мкг/участок не было явным по сравнению с контрольным, имплантированным коллагеном дефектом, где наблюдали только краевое эндостальное костеобразование. Через 12 недель
после операции крыс умерщвляли и бедренную
кость с дефектом вырезали и измеряли минеральное содержимое костей (накопленное минеральное содержимое в соответствии с тремя (в
среднем) сканированиями в дефекте) при помощи абсорбциометрии с использованием рентгеновских лучей с двойной энергией (dual energy
X-ray) (Aloka, Model DCS-600) в режиме с шириной сканирования 1 мм после удаления полиэтиленовой пластинки. Оба конца бедренной
кости фиксировали смолой, затем измеряли
максимальный предел прочности при кручении
для нарушения сращения образцов при помощи
системы для натяжения костей (Malto, model
MZ-500d) при скорости скручивания 180°/мин.
(табл. 4). Данные таблицы показывают, что гомодимерный белок увеличивает как минеральное содержимое костей, так и прочность костей
при дефекте бедренной кости крысы, в который
был имплантирован этот белок, и свидетельствует об эффективности данного белка для заживления переломов восстановления кости с
указанными дефектами.
Таблица 4
Доза
гомоди- Минеральное Максимальный
мерного содержимое в предел проч- Чисбелка дефекте бедра ности при кру- ло
чении (кгс-см)
крысы (мг)
(мкг/уча
сток)
Только
120,2±24,5
2,92±0,09
6
коллаген
1
176,9±36,4
6,24±1,00
8
10
277,4±63,9
9,35±3,14
8
100
374,8±67,1*
40,34±7,64*
8
Величины представляют собой средние
значения ± SЕ (стандартная ошибка), *р<0,05 по
сравнению с группой с одним коллагеном (tтест Стъюдента).
Из результатов, приведенных в примере 4,
следует что гомодимерный белок в соответствии с данным изобретением обладает хрящевой
и костной морфогенетической активностью.
Белок, состоящий из гомодимера белка,
имеющего аминокислотную последовательность
SEQ ID № 1, обладает хрящевой и костной морфогенетической активностью и применим в виде фармацевтической композиции для лечения
заболеваний хрящей и костей. Кроме того, белок, заявленный в соответствии с данным изобретением, может быть получен в промышленном масштабе и в чистом виде при использова-
15
нии методов генной инженерии путем культивирования клеток Е. coli, трансформированных
высококопийным экспрессирующим вектором
экспрессии данного белка.
Список последовательностей SEQ ID № 1
Длина последовательности: 119
Тип последовательности: аминокислота
Топология: линейная
Тип молекулы: пептид
Тип фрагмента: N-концевой фрагмент
Исходный источник
Организм: Homo sapiens
Название ткани: плод
Признаки:
Другая информация: от 383 до 501 аминокислотная последовательность аминокислотной
последовательности МР52
Описание последовательности:
SEQ ID № 1:
000582
16
Описание последовательности:
SEQ ID № 2:
SEQ ID № 3
Длина последовательности: 26
Тип последовательности: нуклеиновая кислота
Количество цепей: одна
Топология: линейная
Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота
Исходный источник: нет
Организм: нет
Название ткани: нет
Признаки:
Другая информация: Прямой (downstream)
праймер ПЦР МР52 зрелого типа
Описание последовательности:
SEQ ID № 3:
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
SEQ ID № 2
Длина последовательности: 27
Тип последовательности: нуклеиновая кислота
Количество цепей: одна
Топология: линейная
Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота
Исходный источник: нет
Организм: нет
Штамм: нет
Признаки: Обратный (upstream) праймер
ПЦР МР52 зрелого типа
1. Белок, соответствующий зрелому участку морфогенетического белка кости МР-52,
имеющий следующую структуру:
Рrо-Leu-Ala-Thr- ... (SEQ ID № 1).
2. Белок, охарактеризованный в п.1, в гомодимерной форме.
3. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и дефектов хрящей и костей,
содержащая терапевтически эффективное количество очищенного белка по п.2 формулы и
фармацевтически приемлемый носитель.
4. Фармацевтическая композиция по п.3,
отличающаяся тем, что заболевания хрящей и
костей представляют собой остеоартрит или
эпифизарный остеомиелит.
5. Фармацевтическая композиция по п.3,
отличающаяся тем, что заболевание хрящей и
костей представляет собой остеопороз.
6. Фармацевтическая композиция по п.3,
отличающаяся тем, что заболевание хрящей и
костей представляет собой перелом кости.
7. Фармацевтическая композиция по п.3,
отличающаяся тем, что дефекты хрящей и костей представляют собой корешковые и арвекулярные дефекты.
8. Способ получения белка, охарактеризованного в п.1 формулы, заключающийся в том,
что клетки Escherichia coli трансформируют
плазмидой, содержащей последовательность
ДНК
17
000582
18
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что
заболевание хрящей и костей представляет собой остеопороз.
13. Способ по п.10, отличающийся тем, что
заболевание хрящей и костей представляет собой перелом кости.
14. Способ по п.10, отличающийся тем, что
дефекты хрящей и костей представляют собой
корешковые и арвекулярные дефекты.
кодирующую указанный белок с Nконцевым метионином, культивируют трансформированные клетки, cолюбилизируют тельца включения, выделяют белок из полученного
раствора и очищают его.
9. Способ получения белка, охарактеризованного в п.2 формулы включающий осуществление следующих стадий:
а) конструирование плазмиды, содержащей последовательность ДНК, структура которой приведена в п.8 формулы;
б) трансформацию указанной плазмидой
клеток Е. coli;
в) культивирование трансформированных
клеток;
г) солюбилизацию телец включения;
д) выделение заданного белка в мономерной форме из полученного раствора; и
е) повторную укладку белка с получением
его димерной формы и последующей очисткой.
10. Способ лечения заболеваний и дефектов хрящей и костей, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции по
п.3 формулы.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что
заболевания хрящей и костей представляют собой остеоартрит или эпифизарный остеомиелит.
Фиг. 1
Краткое описание рисунков
На фиг. 1 приведена карта плазмидного
вектора рКОТ245 для экспрессии белка, заявленного в соответствии с данным изобретением,
как описано в примере 1(2).
На фиг. 2 приведена рентгенограмма кальцифицированной ткани, индуцированной в бедре мыши, как описано в примере 4(1).
На фиг. 3 приведена сделанная под световым микроскопом фотография окрашенной
кальцифицированной ткани в бедре мыши
[пример 4(1)].
На фиг. 4 приведена сделанная под световым микроскопом фотография окрашенной
кальцифицированной ткани, образующейся в
бедре мыши с течением времени [пример 4(2)].
На фиг. 5 приведена сделанная под световым микроскопом фотография окрашенной теменной кости крысы, как указано в примере
4(3).
На фиг. 6 приведена сделанная под световым микроскопом фотография дефектов окрашенного суставного хряща в головке бедра кролика, как указано в примере 4(4).
На фиг. 7 приведена рентгенограмма костеобразования в костных дефектах бедренных
костей крыс, как указано в примере 5(5).
Фиг. 2
19
000582
20
Фиг. 4
Фиг. 3
Фиг. 5
21
000582
22
Фиг. 6
Фиг. 7
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, Москва, ГСП 103621, М. Черкасский пер., 2/6