МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СМОЛЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
реклама
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования СМОЛЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Областное государственное бюджетное учреждение здравоохранения СМОЛЕНСКИЙ ОБЛАСТНОЙ ИНСТИТУТ ПАТОЛОГИИ На правах рукописи Бехтерева Ирина Анатольевна ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА ПРЕДРАКА (ПАПИЛЛОМАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ) И РАКА ШЕЙКИ МАТКИ С ПОЗИЦИЙ ПАРЕНХИМАТОЗНО-СТРОМАЛЬНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ (морфометрическое и иммуногистохимическое исследование) 14.03.02 — патологическая анатомия Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор А.Е. Доросевич СМОЛЕНСК 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ....................................................................................................................... 4 Глава 1. Морфологические и иммуногистохимические маркеры предрака и рака шейки матки. Современные представления о канцерогенезе и особенностях паренхиматозно-стромальных взаимоотношений при раке шейки матки (обзор литературы) ............................................................ 14 1.1. Морфофункциональные особенности шейки матки у женщин в различные возрастные периоды.............................................................. 15 1.2. Современные представления о канцерогенезе шейки матки.................. 21 1.3. Особенности взаимодействия паренхимы и стромы, роль сосудистого русла в становлении и развитии рака шейки матки .......... 44 1.4. Иммуногистохимические маркеры предрака и рака шейки матки и их прогностическое значение ................................................................ 60 Глава 2. Материалы и методы исследования ......................................................... 70 Глава 3. Особенности сосудистого компонента коммуникационных систем в интактной шейке матки ............................................................................ 87 3.1. Морфологические и морфометрические характеристики сосудистого компонента (сосуды микроциркуляторного русла и клеточные популяции вокруг них) коммуникационных систем в тканях интактной шейки матки ............................................................. 87 3.2. Иммуногистохимическая характеристика экспрессии р53, Ki-67, bcl-2, NKl, СD4, СD8, СD79α, CD138, CD68, СD34, NGFR в стромальном и/или эпителиальном компоненте тканей интактной шейки матки ................................................................................................. 93 3.3. Корреляционный анализ клеточных популяций вокруг разных сосудов микроциркуляторного русла в тканях интактной шейки матки .......... 103 Глава 4. Особенности сосудистого компонента коммуникационных систем в тканях шейки матки при папилломавирусных поражениях ................ 109 3 4.1. Морфологическая и морфометрическая характеристика сосудистого компонента (сосуды микроциркуляторного русла и клеточные популяции вокруг них) коммуникационных систем в тканях шейки матки при папилломавирусных поражениях ............. 109 4.2. Иммуногистохимическая характеристика экспрессии р53, Ki-67, bcl-2, NKl, СD4, СD8, СD79α, CD138, CD68, СD34, NGFR в стромальном и/или эпителиальном компоненте тканей шейки матки при папилломавирусных поражениях ............................. 121 4.3. Корреляционный анализ клеточных популяций вокруг разных сосудов микроциркуляторного русла в тканях шейки матки при папилломавирусных поражениях .................................................... 143 Глава 5. Особенности сосудистого компонента коммуникационных систем в тканях рака шейки ................................................................................................ 158 5.1. Морфологическая и морфометрическая характеристика сосудистого компонента (сосуды микроциркуляторного русла и клеточные популяции вокруг них) коммуникационных систем в тканях рака шейки матки ..................................................................................... 158 5.2. Иммуногистохимическая характеристика экспрессии р53, Ki-67, bcl-2, NKl, СD4, СD8, СD79α, CD138, CD68, СD34, NGFR в стромальном и/или эпителиальном компоненте тканей рака шейки ......................... 170 5.3. Корреляционный анализ клеточных популяций вокруг разных сосудов микроциркуляторного русла в тканях рака шейки ................. 200 Глава 6. Морфологические особенности сосудистого компонента коммуникационных систем — одно из основополагающих звеньев морфогенеза и прогрессии опухоли (заключение) ............................................... 215 Выводы ..................................................................................................................... 235 Практические рекомендации ................................................................................. 238 Список принятых сокращений ............................................................................... 239 Список литературы ................................................................................................. 241 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. В последнее десятилетие интенсивно изучаются проблемы профилактики, ранней диагностики и лечения больных раком шейки матки. Это обусловлено высокой частотой встречаемости данного процесса в структуре онкологической заболеваемости женщин большинства стран мира. По данным ВОЗ после 1985 года в мире ежегодно выявляется более полумиллиона больных РШМ. В России в последние годы заболеваемость этим видом опухоли держится на уровне 10,8 на 100 000 женского населения с летальностью 5 на 10 000 женщин (Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2005). Кроме того, в России отмечается рост заболеваемости раком шейки матки у женщин репродуктивного возраста, особенно в группе женщин моложе 29 лет. Как причина смерти женщин моложе 30 лет рак шейки матки наблюдается в 8,5% случаев (Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2005). Несмотря на то, что диагностика различных патологических состояний шейки матки относительно легка благодаря доступности шейки матки для скринингового обследования и взятия биопсийного материала, рак шейки матки выявляется довольно часто в запущенных стадиях заболевания (Благодыр О.В., Иванян A.Н., Мелехова Н.Ю., 2006). Отмечается рост в процентах интегрального показателя летальности больных в течение года с момента установления диагноза от числа больных, впервые взятых на учет в предыдущем году. Этот показатель по России при РШМ равнялся: в 1981 г. — 11,5%; в 1985 г. — 13,6%, в 1997 г. — 16,2%, в 1995 г. — 21,0%, в 1997 г. — 20,6%, другими словами, каждая 5-я больная РШМ умирает в течение года после установления диагноза (Марьина Л.А., Чехонадский В.Н., Нечушкин М.И., Киселева М.В., 2004). В совокупности статистические данные о заболеваемости и смертности свидетельствуют, что РШМ в большинстве стран мира продолжает оставаться одним из основных онкологических заболеваний. 5 Одним из главных условий повышения эффективности лечения является профилактика и своевременная диагностика рака шейки матки (Благодыр О.В., Иванян A.M., Мелехова М.Ю., 2006). Роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в становлении и развитии РШМ в настоящее время не вызывает сомнений. По данным ряда авторов (Минкина Г.Н., Манухин И.Б., Франк Г.А., 2001; Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Плотникова Н.А., Кемайкин С.П., Харитонова Т.В., 2006) в 90–95% и даже в 100% случаев в карциномах шейки матки присутствует 16-й, 18-й, либо 31-й, 33-й типы вируса папилломы человека. Поэтому своевременная диагностика и адекватное лечение данной патологии способствуют снижению заболеваемости РШМ. До настоящего времени одной из главных проблем в диагностике дисплазии эпителия и микроинвазивного РШМ является отсутствие достоверных критериев, позволяющих объективизировать полученные патоморфологические данные. При патологии шейки матки, обусловленной вирусом папилломы человека, наблюдается нарушение иммунной, нервной и эндокринной регуляции, что приводит к нарушениям гомеостаза. Интимные механизмы, определяющие возможные морфогенетические потенции патологического процесса, можно раскрыть путем изучения межклеточных взаимодействий, поддерживающих структуру и функцию любой ткани, включая и опухолевую, так как известно, что изменения эпителиального и стромального компонентов происходят синхронно. Эта мысль высказывалась В.Г. Гаршиным еще в 1939 году. Степень разработанности темы исследования. Углубленное исследование структурно-функциональных характеристик тканевых процессов в бассейне микроциркуляторного русла показывает взаимосвязь иммунного инфильтрата и сосудов микроциркуляторного русла в тканях опухоли (Голубев О.А., 2001; Бехтерева И.А., 2004). 6 В последние годы получены новые данные, касающиеся критериев диагностики, морфогенеза, прогноза опухолей шейки матки (Kamura T., Tsukamoto N., Tsuruchi N. et. al., 1992), желудка, яичников и новообразований других локализаций, а также предопухолевых процессов (Аничков Н.М., 1990). Показано значение пролиферативной активности (по Кi67) при патологии женской репродуктивной системы (Зайратьянц О.В., Мовтаева Х.Р., Адамян Л.В. и др., 2007) и митотического индекса при различных формах лейкоплакий шейки матки, обусловленных папилломавирусной инфекцией (Харитонова Л.И., Бехтерева И.А., Мелехова Н.Ю., 2006). Прогноз опухолей различной локализации зависит от ряда морфологических признаков: степень злокачественности, тип гистологического строения, глубина прорастания и распространение по кровеносным и лимфатическим сосудам (Яворский В.В., Аризи В.Н., Пирогова Н.А., 1987; Косников А.Г., Чепик О.Ф., Максимов С.Я., 1998; Карселадзе А.И., Волощук И.Н., 2005; Петровичев Н.Н., Мазуренко Н.Н., Козаченко А.В., 2006). Благодаря иммуногистохимическим методам исследования открылись новые возможности для дифференциальной диагностики злокачественных новообразований, доказано диагностическое и прогностическое значение р53, Ki-67 при опухолях молочной железы (Пожарисский К.М., Семиглазов В.Ф., Упоров А.В., 1999), р16INK4a при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и неинвазивных карциномах шейки матки (Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. и др., 2002; Козаченко А.В., 2006). Обобщение и творческое осмысление известных положений, касающихся морфометрических и иммуногистохимических маркеров прогрессии РШМ, сегодня невозможно без учета изменений стромального компонента опухоли и, прежде всего, коммуникационных систем (КС). Коммуникационные системы — это открытые системы, состоящие из совокупности структурно-функциональных единиц: сосуды микроциркуляторного русла, нервные терминали, непосредственное клеточное окружение указанных структур, находящихся в гистофизиологических взаимоотношениях, обеспечи- 7 вающих структурные основы гомеостаза (Доросевич А.Е., Голубев О.А., Абросимов С.Ю. и др., 1998; Доросевич А.Е., 2007). В осуществлении межклеточных взаимодействий значительная роль принадлежит так называемым внутриклеточным регуляторам (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003). Комплексное исследование взаимоотношений эпителиальных и стромальных элементов различного происхождения невозможно без синхронного изучения различных клеточных регуляторов, таких как р53 (он контролирует активность генов, продукты которых вызывают как остановку клеточного цикла в различных его фазах — G1, G2, так и апоптоз); р16INK4a (продукт гена INK4a), который обладает супрессорной функцией на р53 (следует отметить, что уровень экспрессии р16INK4a при дисплазиях шейки матки и РШМ очень вариабелен); Ki-67, отражающий пролиферативную активность клеток как эпителиального, так и мезенхимального происхождения. Путем уточнения их взаимодействия со специфическими рецепторами на клетках-мишенях в периваскулярных зонах рака шейки матки можно раскрыть вероятную роль таких взаимоотношений в стартовых процессах инвазии РШМ. Анализ механизмов, обеспечивающих прогрессию РШМ, необходим для выявления дополнительных объективных критериев оценки биологических свойств карцином ШМ и возможного построения индивидуального прогноза. С данных позиций представляется важным рассмотреть роль сосудистого компонента коммуникационных систем в процессах становления и прогрессии рака шейки матки и уточнить возможное значение взаимоотношений сосудистого русла и его клеточного микроокружения в прогнозе карцином шейки матки. Цель исследования. Выявление особенностей взаимоотношений сосудистого компонента коммуникационных систем и внутриклеточных регуляторов как морфогенетически значимого звена прогрессии и прогноза рака шейки матки. 8 Задачи исследования: 1. Изучить гистотопографические особенности артериол, капилляров и венул в интактной шейке матки, в ткани шейки матки, пораженной вирусом папилломы человека и вне зоны поражения, в ткани рака шейки матки и контралатеральной зоне (вне опухолевого очага). 2. Провести количественное определение непосредственного клеточного микроокружения вокруг артериол, капилляров и венул в интактной шейке матки, в ткани шейки матки, пораженной вирусом папилломы человека и вне зоны поражения, в ткани рака шейки матки и контралатеральной зоне (вне опухолевого очага). 3. Иммуногистохимическим методом изучить характер распределения р53, Ki-67, bcl-2, NK1, СD4, СD8, СD79а, CD138, CD68, СD34, NGFR как в строме, так и в эпителиальном компоненте в интактной шейке матки, в ткани шейки матки, пораженной вирусом папилломы человека и вне зоны поражения, в ткани рака шейки матки и контралатеральной зоне (вне опухолевого очага). 4. Провести математико-статистическую обработку полученных данных, отмеченных в сосудистом компоненте коммуникационных систем в интактной шейке матки, в ткани шейки матки, пораженной вирусом папилломы человека и вне зоны поражения, в ткани рака шейки матки и контралатеральной зоне (вне опухолевого очага). 5. Оценить результаты интеграционного анализа морфологических и клинических данных и на их основе разработать критерии, способствующие более полному пониманию вопросов диагностики, морфогенеза и прогноза предраковых процессов и рака шейки матки. Научная новизна исследования: Впервые выявлены конкретные межклеточные взаимодействия структурных элементов стромы и внутриклеточных регуляторов в процессах становления и развития предрака и рака шейки матки. 9 Впервые показаны морфогенетическая и прогностическая роль сосудистого компонента коммуникационных систем при предраковых процессах и раке шейки матки. Выявлены морфологические и морфометрические критерии, указывающие на становление, прогрессию и прогноз рака шейки матки. Теоритическая и практическая значимость исследования. Комплексная морфологическая морфометрическая и иммуногистохимическая оценка особенностей гистоархитектоники и гистотопографии сосудов МЦР и их клеточного окружения позволит конкретизировать диагностику предрака и рака шейки матки. Впервые доказано, что: Сочетание морфометрических и иммуногистохимических методов исследования с последующей оценкой состояния сосудистого компонента коммуникационных систем при предраковых и раковых процессах шейки матки необходимо использовать в клинической практике как один из возможных критериев индивидуального прогноза и тактики лечения. При патологоанатомической диагностике предраковых и раковых процессов шейки матки необходимо учитывать особенности состояния стромообразующего, дезинтегрирующего и пролиферирующего факторов шейки матки, стабильность которых зависит от состава клеточных популяций, их количества и внутриклеточных регуляторов. Морфологические, морфометрические и иммуногистохимические изменения в тканях вне зоны поражения ВПЧ и контралатеральной зоне от РШМ позволяют утверждать, что данные зоны ШМ должны исследоваться в клинической и патологоанатомической практике для исключения поражений предопухолевыми и опухолевыми процессами, что позволит дать рекомендации по тактике лечения и разработать критерии индивидуального прогноза. Методология и методы исследования. В основу методологии настоящего исследования положен системный подход к анализу и оценке морфологических 10 изменений при предраковых состояниях и раке шейки матки с позиции всестороннего исследования коммуникационных систем. Данный подход позволяет подробно рассмотреть роль сосудистого компонента коммуникационных систем в процессах становления и прогрессии рака шейки матки и уточнить его возможное значение в прогнозе карцином шейки матки. Для достижения поставленной цели и решения задач исследования в работе использован комплекс методов: информационно-аналитический, макроскопический, гистологический, микроморфометрический, иммуногистохимический и математико- статистической обработки полученных данных. Положения, выносимые на защиту: 1. Целостное представление о морфогенезе рака шейки матки возможно только при комплексном изучении стромального и эпителиального компонентов путем уточнения состояния сосудистого компонента коммуникационных систем с последующей иммуногистохимической индентификацией клеточных популяций. 2. Комплексная морфологическая оценка взаимоотношений сосудистого компонента коммуникационных систем с внутриклеточными регуляторами (p53, bcl-2, Ki-67) при предраковых и раковых процессах шейки матки позволяет значительно увеличить информативность морфометрического исследования. 3. Морфометрическая и иммуногистохимическая характеристика клеточных популяций в интактной ШМ, в тканях шейки матки при поражениях ВПЧ и в тканях рака шейки матки позволяет проследить отдельные этапы дезинтеграции паренхиматозно-стромальных взаимоотношений, наблюдаемые при предраковых и раковых процессах шейки матки, и выявить новые морфологические маркеры развития рака на фоне предраковых заболеваний данной локализации. 4. Морфометрический анализ демонстрирует значимые различия в распределении клеточных популяций вокруг артериол, капилляров и венул при фоновых заболеваниях и плоскоклеточном раке шейки матки. 5. Частный корреляционный факторный анализ морфометрических данных, полученных при изучении непосредственного клеточного окружения вокруг со- 11 судов МЦР, позволил выделить три основных фактора (стромообразующий, дезинтегрирующий и пролиферирующий), которые необходимы для стабильности паренхиматозно-стромальных взаимоотношений в ткани шейки матки, а также определить основные моменты, которые влияют на становление и развитие плоскоклеточного рака шейки матки на фоне предраковых процессов в ней. Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности полученных результатов определяется достаточной базой данных, репрезентативностью выборки, включенных в статистический анализ изученных показателей, а также адекватно подобранным иллюстративным материалом, который четко документирует проведенное гистологическое, иммуногистохимическое, морфометрическое и статистическое исследование. Диссертация прошла апробацию на совместном заседании ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия», ОГБУЗ «Смоленский областной институт патологии» и ОГБУЗ «Смоленский област- ной онкологический клинический диспансер». Материалы диссертации широко отражены и доложены на различных конгрессах, съездах, конференциях, научных форумах, обществах патологоанатомов, в том числе на: VII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2005); Всероссийской конференции, посвященная памяти профессора О.К. Хмельницкого (Санкт-Петербург, 2006); VIII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2006); Международном конгрессе «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии» (Москва, 2006); Республиканской научнопрактической конференции «Актуальные проблемы патологической анатомии» (Республика Беларусь, Гродно, 2010); на II съезде патологоанатомов Республики Беларусь «Проблемы патоморфологической диагностики современных инфекций и других заболеваний» (Гомель, 2011). Внедрение результатов исследования в практику. Материалы диссертационной работы излагаются при проведении практических занятий и чтении лекций на: кафедрах патологической анатомии, акушерства и гинекологии с 12 курсом пренатальной диагностики, акушерства и гинекологии педиатрического и стоматологического факультетов, акушерства и гинекологии ФПК и ППС, онкологии ГБОУ ВПО «Смоленской государственной медицинской академии» Министерства здравоохранения Российской Федерации; на кафедре патологической анатомии, УО «Гомельский государственный медицинский университет», УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», УО «Белорусский государственный медицинский университет» г. Минск. Внедрение результатов работы в практику подтверждены соответствующими актами. Результаты исследования используются для дифференциальной диагностики различных форм папилломавирусных поражений шейки матки и рака шейки матки в отделениях клинической патологии № 1, 2, 3 ОГБУЗ «Смоленского областного института патологии»; патологоанатомическом отделении ОГБУЗ «Смоленского областного онкологического клинического диспансера»; научно-исследовательском центре ГБОУ ВПО «Смоленской государственной медицинской академии»; патологоанатомическом отделенияи ГБУ Рязанской области «Бюро судебно-медицинской экспертизы»; патологоанатомическом отделении ГБОУ Рязанской области «Областной онкологический диспансер»; патологоанатомическом отделении Национального медико-хирургического центра имени Н.И. Пирогова г. Москва; клинико-диагностической лаборатории ГУ «Республиканского научно-практического центра радиационной медицины и экологии человека» г. Гомель. Личный вклад автора в проведенное исследование. Автор принимал непосредственное участие во всех разделах диссертационной работы. Ему принадлежит ведущая роль в выборе концепции исследования, определения цели и задач, основных направлений и программы исследования. Им разработан алгоритм забора операционного материала для морфологического исследования и методика оценки иммуногистохимических результатов с помощью программы «Видео Тест 4». Автор лично осуществлял поэтапное рассмотрение результатов 13 работы, анализировал и оценивал достоверность полученных результатов. Им сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации по материалам исследования. Автору принадлежит определяющая роль во внедрении результатов исследования, в научных публикациях и докладах по материалам диссертации. Доля участия автора в организации сбора и накопления информационных данных составляет 100%, обработка, анализ и обобщение материала порядка – 85%. Публикации. По теме диссертации опубликовано: 24 работы, в том числе 10 статей в научных рецензируемых изданиях, за рубежом — 3. Структура и объем диссертации. Диссертация построена традиционно и состоит из введения и 6 глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, общей характеристики обследованных женщин, результатов собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Работа изложена на 276 страницах компьютерного текста, содержит 53 таблицы, 174 рисунка. Список литературы состоит из 323 источников литературы, из них 187 — на русском и 136 — на иностранных языках. Диссертационная работа выполнена по плану научной работы Смоленской государственной медицинской академии и связана с республиканской проблемой «Морфология опухолей». Номер государственной регистрации 01200803427. Исследование проведено в Смоленской государственной медицинской академии (ректор — д. м. н., профессор И.В. Отвагин) на кафедре патологической анатомии (заведующий — д. м. н., профессор А.Е. Доросевич), все иммуногистохимические исследования проведены в организационно-консультационном отделении ОГБУЗ Смоленского областного института патологии (директор — д. м. н., профессор А.Е. Доросевич). Все клинические исследования проведены на базе медицинского центра «Гинея» (директор — д. м. н., профессор Н.Ю. Мелихова). Операционный материал был предоставлен патологоанатомическим от- 14 делением (зав. отд. — к. м. н. О.А. Шистерова) Смоленского областного онкологического клинического диспансера (главый врач — к. м. н. С.Л. Гуло). Аутопсийный материал интактной шейки матки был предоставлен танатологическим отделением (зав. отд. — В.Н. Воробьев) Смоленского областного бюро судебномедицинской экспертизы (начальник — к. м. н., доцент А.Б. Андрейкин). ГЛАВА 1. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПРЕДРАКА И РАКА ШЕЙКИ МАТКИ. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ И ОСОБЕННОСТЯХ ПАРЕНХИМАТОЗНО-СТРОМАЛЬНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ПРИ (обзор РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ литературы) Многочисленные клинические и экспериментальные исследования показали, что в патогенезе злокачественных заболеваний участвуют все системы организма. Морфологическое и функциональное состояние каждой отдельной системы в разных стадиях заболевания различно. Проблема изменения регуляторных системам организма, в частности нервной и сосудистой, при становлении и развитии рака длительное время привлекает внимание исследователей (Кавецкий Р.Е., 1962; Двужильная Е.Д., 1953; Коблова Н.Г., 1983; Гуркало В.К., 1987; Доросевич А.Е., Голубев 2001; Абросимов С.Ю., 2002). Злокачественная опухоль развивается в результате клональной экспансии клеток, которые приобретают селективное преимущество в росте вследствие одного или нескольких изменений в геноме клетки (Заридзе Д.Г., 2004). Однако следует помнить, что при изучении процессов злокачественного роста на уровне клеток-мишеней разностороннее влияние оказывают различные регуляторные системы организма (нервная, сосудистая, иммунная) и разнообразные клеточные и внутритканевые регуляторы, которые необходимы в реализации канцерогенного эффекта. 15 Сосудистое русло как элемент стромы злокачественных образований является важнейшим звеном, показывающим связь опухоли и организма, осуществляемую непосредственно через систему микроциркуляции (Габуния У.А., Цагортин З.Г., 1974; Зербино Д.Д., Дмитрук И.М., 1983; Абросимов С.Ю., Доросевич А.Е., Голубев О.А., 1996; Бехтерева И.А., 2010). Известно, что злокачественные опухоли редко возникают de novo и часто им предшествуют предраковые состояния, из которых с различной долей вероятности могут развиваться данные процессы. В результате гистологических и цитологических исследований и наблюдений за пациентами с доброкачественными опухолями или пролиферативными и диспластическими процессами, такими как аденомы толстой кишки и дисплазии шейки матки, было доказано, что из них с высокой степенью вероятности развивается carcinoma in situ, а затем и инвазивный рак (Bergeron C., Barrasso R., Beaudenon S. еt al., 1992; Заридзе Д.Г., 2004). В связи с этим актуальным является комплексное изучение предраковых и раковых процессов с позиций паренхиматозно-стромальных взаимоотношений. 1.1. Морфофункциональные особенности шейки матки у женщин в различные возрастные периоды Патофизиология и морфология репродуктивной системы женщин в различные возрастные периоды находится под строгим контролем эндокринной, нервной и иммунной систем организма. Рядом отечественных и зарубежных ученых проведена четкая параллель между состоянием шейки матки, влагалища и наружных половых органов у пациенток от подросткового возраста до глубокой постменопаузы (Гуркин Ю.А., 2000; Царева Н.В., 1998; Баггиш М., 2008). Шейка матки и верхняя треть влагалища образуются из парамезонефральных 16 протоков путем их слияния (Волкова О.В., Пекарский М.И., 1976). Процесс начинается с 5–6-й недели внутриутробного развития и заканчивается к 18-й неделе. До 33-й недели шейка матки составляет до 3/4 общей длины матки, к 40-й неделе уменьшается до 2/3. Нижний отдел слившихся парамезонефральных ходов достигает урогенитального синуса и формирует влагалище. Его канализация заканчивается к 21–22-й неделе внутриутробного развития. Шейка матки начинает дифференцироваться с 4-летнего возраста, но обычно ее удается определить с 8–9 лет, когда она составляет 2/3 по отношению к длине матки. К 11–12 годам шейка матки четко дифференцируется, намечается образование угла между телом и шейкой матки. Четко этот угол определяется к 17 годам (Гуркин Ю.А., 2000; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Эпителий шейки матки представлен двумя основными видами: многослойным плоским и цилиндрическим. В постнатальном периоде МПЭ шейки матки вполне зрелый, содержит большое количество гликогена, что обусловлено влиянием материнских эстрогенов. Когда уровень гормонов падает, созревание прекращается, и гликоген быстро исчезает (Иванова О.И., Павлович В.Г., 1983; Хмельницкий О.К., 2004; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Атрофия эпителия сохраняется до периода менархе, после которого под влиянием эстрогенов созревание возобновляется и появляется гликоген (Гуркин Ю.А., 2000; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Цилиндрический эпителий состоит из одного слоя муцинсекретирующего эпителия, расположенного как поверхностно, так и в железистых структурах. Смещение высокого цилиндрического эпителия на участок влагалищной порции шейки матки называют эктопией. У новорожденных девочек шейка матки на 50% покрыта многослойным плоским эпителием и на 50% — цилиндрическим. От наружного зева и до 2/3 эктоцервикса всю видимую поверхность занимает цилиндрический эпителий (врожденная эктопия). В препубертантном периоде эта эктопия практически не изменяется в размерах и уменьшается лишь за счет роста мышечных волокон (Гуркин Ю.А., 17 2000; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). В этом периоде под действием половых гормонов начинается медленная трансформация призматического эпителия в многослойный плоский неороговевающий эпителий. Она происходит не за счет резервных клеток, а за счет смещения многослойного плоского эпителия от периферии по направлению к наружному зеву. К началу половой жизни весь экзоцервикс в норме должен быть покрыт многослойным плоским эпителием. Если девушка-подросток начинает вести активную половую жизнь с 15–16-летнего возраста, то процесс нормальной метаплазии нарушается с формированием зоны трансформации (Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999; Гуркин Ю.А., 2000; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). В шейке матки имеется линия стыка однослойного призматического эпителия с многослойным плоским эпителием, которая называется зоной трансформации (или переходной или стыковой зоной) в виде так называемого метапластического плоского эпителия (Деражне А.Б., 1972; Яковлева И.А., 1979), который встречается настолько часто в различные периоды жизни женщины, что его перестают относить к патологически измененной ткани (Черный А.П., 1986; Черный А.П., Яковлева Н.И., 1990). Локализация оригинальной пограничной линии и распространенность эндоцервикальной эктопии детерминированы эмбриологическим прекращением внутренней миграции плоского эпителия. Определено два пути, по которым происходит замещение цилиндрического эпителия на многослойный плоский эпителий. Первый характерен для нормальной метаплазии у подростков. Он состоит в прямом врастании нативного многослойного эпителия под цилиндрический эпителий (Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999; Гуркин Ю.А., 2000; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Тяжи многослойного плоского эпителия подрастают под цилиндрический и распространяются между последним и его базальной мембраной. Когда клетки МПЭ развиваются и созревают, эндоцервикальные клетки частично смещаются вверх и затем слущиваются (Черный А.П., Яковлева Н.И., 1990; Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). 18 Процесс плоскоклеточной эпидермизации зависит от местных и окружающих факторов внешней среды, основным из которых является низкий рН влагалища (Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999). Второй путь проходит с формированием зоны трансформации. Он основан на дифференцировке резервных клеток цилиндрического эпителия и их превращении в клетки многослойного плоского эпителия. Первая стадия этого процесса характеризуется появлением мелких клеток на базальной мембране цервикального эпителия. Они в большом количестве синтезируют нуклеиновые кислоты и являются бипотентными, то есть способными превращаться как в цилиндрический, так и в многослойный плоский эпителий. Далее происходит ранняя плоскоклеточная дифференцировка резервных клеток и их превращение в клетки МПЭ. Именно в этот период незрелые плоскоклеточные элементы наиболее подвержены воздействию вирусных и бактериальных агентов, а особенно инфицированию вирусом папилломы человека (Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Именно на границе многослойного плоского и цилиндрического эпителия чаще всего и возникает опухоль (Бакшеев Н.С., Миляновский А.И., Ильяшенко Н.А., 1977). Период половой зрелости (репродуктивный) занимает около 30 лет в жизни женщины. Функция репродуктивной системы в этот период направлена на регуляцию овуляторного менструального цикла. В нейронах гипоталамуса происходит пульсирующий выброс релизинг- и лютеотропного гормонов, которые стимулируют выброс двух гонадотропинов, стимулирующих, в свою очередь, гормонопродуцирующую функцию яичников. В этот период слизистая оболочка влагалища претерпевает циклические изменения в соответствии с фазами менструального цикла (Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999; Хмельницкий О.К., 2005; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). В структуре многослойного плоского эпителия различают четыре функциональных слоя. 19 Базальный слой представлен рядом мелких клеток с крупным ядром, цитоплазмой, лишенной гликогена, и гормоночувствительными рецепторами мембраны. Базальные клетки ответственны за рост и регенерацию МПЭ, в патологических случаях они являются источником пролиферативных процессов (Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999; Черный А.П., 1986). Парабазальный слой представлен 2–3 рядами более крупных клеток с большим ядром и базофильной цитоплазмой, не содержащей гликогена. Они обладают высокой митотической активностью и участвуют в процессах роста, регенерации и дифференцировки МПЭ (Яковлева И.А., Кукутэ Б.Г., 1979; Черный А.П., 1986; Коломиец Л.A., Уразова Л.Н., 2002; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006; Ващенко С.Н., Семухина О.В., Грибань А.Н., 2009). Слой промежуточных клеток состоит из 6–12 рядов крупных полигональных клеток с небольшим ядром. Цитоплазма содержит большое количество гликогена, в верхних рядах клеток имеется кератин (Яковлева И.А., Кукутэ Б.Г., 1979; Черный А.П., 1986; Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999). Поверхностный слой хорошо определяется в пролиферативной фазе менструального цикла. Он состоит из 12–18 рядов крупных клеток с маленьким пикнотичным ядром, не содержащих хроматина, богатых гликогеном и кератином (Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Перименопаузальный период, по определению ВОЗ, включает в себя возрастной период от 45 лет до 5 лет после наступления менопаузы. В данный возрастной период преобладают такие процессы, как снижение иммунной защиты, повышается риск аутоиммунных заболеваний, снижение резистентности организма к агрессивным факторам внешней среды, теряется основа костной ткани. В организме происходит сдвиг метаболизма, повышается уровень липопротеидов низкой плотности, холестерина, триглицеридов. В женском организме все перечисленные физиологические процессы протекают на фоне выраженных изменений репродуктивной системы (Царева Н.В., 1998). 20 Старение гипоталамуса означает повышение порога его чувствительности к эстрогенам, что приводит к запуску механизма нарушения отрицательной обратной связи и увеличению количества гонадотропинов. Повышение содержания гонадотропинов характерно для всего пременопаузального периода. Увеличение количества фолликулостимулирующего гормона начинается с 40 лет и увеличивается в 3 раза к менопаузе, а лютеинизирующий гормон начинает расти с 45 лет и к периоду менопаузы увеличивается в 14 раз по сравнению с секрецией в репродуктивном периоде. При физиологическом течении пременопаузального периода происходит постепенное уменьшение гормональной функции яичников, которая клинически характеризуется наступлением менопаузы (Царева Н.В., 1998). В постменопаузальном периоде в репродуктивной системе женщины прогрессируют инволютивные изменения, значительно более интенсивные, чем в пременопаузе, т. к. они протекают на фоне резкого снижения количества эстрадиола. Старение репродуктивной системы определяется снижением репродуктивного потенциала клеток (Царева Н.В., 1998). Одним из следствий гормональных изменений в организме является реакция слизистой оболочки влагалища. Стык между многослойным плоским и цилиндрическим эпителием смещается вглубь канала шейки матки (Яковлева И.А., Кукутэ Б.Г., 1979; Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999). Другой особенностью этого периода является появление атрофических и дистрофических изменений в эпителиальном и соединительнотканном пластах. Уменьшается толщина пластов МПЭ, снижается количество клеток, содержащих гликоген, сглаживаются и исчезают соединительнотканные сосочки, редуцируются сосудистые петли (Краснопольский В.И., 2005; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Учитывая то, что любой орган представлен двумя взаимозависимыми компонентами, такими как паренхима и строма, необходимо дать характеристику последней. Соединительнотканная единица «гистион» как элементарный источник тканевого питания состоит из артериол, капилляров, венул, лимфатиче- 21 ских сосудов, соединительнотканных элементов, специфических для данного органа клеток, снабженных нервными элементами (Смоляр Е.М., Должиков А.А., Польская В.С., 1989; Чернух А.М., Есипова И.Л., 1975). В нормальной ШМ соответственно ее двум слоям — слизистому и мышечному, обнаружена своеобразная двухслойная система специализированных емкостных сосудов, идентифицируемых как синусоидные вены. Первый слой синусоидных вен располагается в виде сети в соединительнотканной основе слизистой оболочки. Глубже он продолжается во второй слой, представленный обширной сетью синусоидных вен мышечного слоя, где они располагаются либо между тонкими пучками мышечных волокон, либо в едином соединительнотканном ложе с артериями, окружая их со всех сторон. Наличие в этом слое «улитковых» артерий свидетельствует о возможности ускоренного кровенаполнения синусоидных вен подобно кавернозным телам (Мягкова М.А., 1988). В ряде работ указано, что в ткани интактной шейки матки имеются вегетативные нервные терминали, как адренергического, так и холинергического типа, которые располагаются субэпителиально и в более глубоких отделах стромы (Бехтерева И.А., Доросевич А.Е., Судиловская В.В., 2005). Основываясь на особенностях строения репродуктивной системы и слизистой оболочки шейки матки в частности, можно предположить наличие клинических и патоморфологических отличий в течении предраковых и раковых процессов. 1.2. Современные представления о канцерогенезе шейки матки Карциномы шейки матки принадлежат к той группе неоплазий человека, для которых вирусная природа представляется очевидной. 22 В 1974–1976 гг. профессор Харальд цур Хаузен (Германия) впервые высказал предположение о возможном участии вирусов папиллом человека (Human Papilloma Virus, HPV) в патогенезе РШМ. До внедрения техники клонирования в 1970-х годах исследование вируса папилломы человека было затруднено, но уже к концу ХХ столетия было идентифицировано более 100 типов ВПЧ. Они подразделены на основании содержания ДНК и порядка идентификации, всем присвоены порядковые номера (Мазуренко Н.Н., 2003; Роговская С.И., 2008; Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Подистов Ю.И., 2003). Современные исследования с применением молекулярно-биологических методов подтвердили причинную связь между РШМ и плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями и различными типами вируса папилломы человека (Иванова И.М., 1992; Козаченко В.П., 2000; Кулаков В.И., Тохиян А.А., 2000; Bosch F.X., Manos M.M., Munoz N. et al., 1995; Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. et al., 2002). Впервые связь между ВПЧ и ЦИН отмечена Meisels et al. в 1987 году. Вирус папилломы человека — высокоспецифичный в отношении эпителия человека, лишенный оболочки ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Papovaviridae. ВПЧ обладает способностью инфицировать и трансформировать эпителиальные клетки. Он представлен частицами диаметром 55 нм, состоящими из 72 капсомеров и имеющими икосаэдрическую форму (Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Заридзе Д.Г., 2004). Главный капсидный белок ВПЧ имеет молекулярную массу 54 000–63 000 Д. Вирусная ДНК состоит из двухнитчатой сверхспирализованной молекулы ДНК, содержащей до 8000 пар оснований с молекулярной массой 5 МД. Открытые рамки считывания (OFR) локализуются на одной кодирующей цепи. Все папилломавирусы имеют одинаковую генетическую организацию: кодирующая цепь содержит до 10 OFR, которые в зависимости от расположения в геноме классифицируют как «ранние» (Е) и «поздние» (L). Некоторые «ранние» участки необходимы для репликации (Е1), транскрипции (Е2) и трансформации (Е5, Е6, Е7). Регуляторный уча- 23 сток содержит локус начала репликации и множество элементов для контроля транскрипции и репликации. Функция гена Е4 окончательно не выяснена. Установлено, что его продукт может оказывать дестабилизирующее действие на внутриклеточную структуру кератиноцитов. Роль OFR Е3 и Е8 в геноме ВПЧ остается неизвестной. OFR Е6 и Е7 кодируют основные трансформирующие белки у онкогенных типов папилломавирусов (Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Мазуренко Н.Н., 2003; Подистов Ю.И., 2003; Заридзе Д.Г., 2004). ВПЧ существует как в свободной эписомальной форме, так и в интегрированной. Когда вирусная ДНК включается в генетический материал клетки хозяина, говорят о его интеграции. К злокачественной трансформации способна только интегрированная форма ВПЧ (Киселев Ф.Л., 1997; Киселев Ф.Л., Мазуренко Н.Н., Киселева Н.П., Кобзаева В.К. и др., 2002; Подистов Ю.И., 2003; Zur Hausen H., 1996). Неинтегрированная форма ВПЧ вызывает продуктивную инфекцию, так как имеются неповрежденные вирусные частицы. Общеизвестно, что неинтегрированная форма ПВИ своим исходом имеет остроконечную кондилому с очень незначительным онкологическим потенциалом (Kadish A.S., Hagan R.J., Ritter D.B. et аl., 1992). Когда же ДНК ВПЧ интегрирована, вирусные частицы не производятся и данная инфекция является непродуктивной, ее исходом является плоская, инвертированная кондилома с высоким риском развития онкологических изменений (Подистов Ю.И., 2003; Petry K.U., 2001). В настоящее время в зависимости от биологических свойств выделяют две группы вирусов папилломы человека: 1. Вирусы, тропные к коже, у больных с генетически обусловленными иммуносупрессивными заболеваниями (1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 10-й типы). 2. Вирусы, тропные к слизистым оболочкам половых органов, ротовой полости и верхних дыхательных путей. Они заслуживают более пристального внимания в связи с участием в канцерогенезе. К ним относятся более 1/3 известных 24 типов ВПЧ. В зависимости от способности вызывать клеточную трансформацию их подразделяют на 3 группы: низкого онкогенного риска — ВПЧ 6, 11, 42, 43 и 44-го типов, среднего риска — ВПЧ 30, 33, 35, 52 и 58-го типов, высокого риска — ВПЧ 16, 18 и 31-го типов (Иванова И.М., 1992; Козаченко В.П., 2000; Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Мазуренко Н.Н., 2003; Подистов Ю.И., 2003; Дмитриев Г.А., Биткина О.А., 2006; Petry K.U., 2001; Sisk E.A., Robertson E.S., 2002; Gaston K., 2001). Трансмиссия ПВИ происходит половым путем. Вероятность заражения при половом контакте составляет 60–67%. Учитывая то, что папилломавирусы инфицируют только незрелые делящиеся клетки, внедрение ВПЧ происходит через микроповреждения, обнажающие базальный клеточный слой или пролифирирующие клетки, находящиеся близко к поверхности эпителия (Трушина О.И., Новикова Е.Г., 2005). Поэтому высок риск инфицирования шейки матки и слизистой влагалища, а также зоны трансформации МПЭ (Прилепская В.Н., Фокина Т.А., 1990; Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Подистов Ю.И., 2003). По мере эпителиальной дифференциации геном папилломавирусов проходит все стадии продуктивной инфекции. Этот процесс завершается в зрелых кератиноцитах и приводит к цитопатическим эффектам, проявляющимся в форме койлоцитоза, остроконечных кондилом и т. д. (Barasso R., 1992; Tyring S.K., 2000). В большинстве случаев наблюдается длительная персистенция ВПЧ-ДНК в клетках базального слоя эпителия (Herrington M.R., 1994). В дальнейшем папилломавирусная инфекция может спонтанно регрессировать, т. е. наблюдается элиминация вируса из клеток, либо, наоборот, прогрессировать, путем включения ВПЧ-ДНК в клеточный геном и появления характерных для злокачественной трансформации морфологических изменений эпителия (Трушина О.И., Новикова Е.Г., 2005; Мелехова И.К., Иванян А.П., Харитонова Л.И. и др., 2006). При этом клетки приобретают повышенную способность к делению. Поскольку 25 синтез собственных белков у них подавлен, их дифференцировка или созревание не наступают. Такие клетки, достигнув границы 2–3-го ряда промежуточного слоя эпителия шейки матки, подвергаются разрушению, нарушая при этом динамику клеточного обновления эпителиального пласта, т. е. возникает неоплазия, в основе которой лежат пролиферация и структурная перестройка эпителиальных клеток. В ядрах наблюдаются гиперхроматоз, гетерогенное распределение хроматина, гипертрофия ядрышек, изменяются количество «ядерных телец» и митотическая активность. Предполагают, что интеграция представляет собой активационный механизм прогрессии неоплазий от тяжелой степени к раку. Она первоначально носит поликлональный характер. Интеграция вирусной ДНК индуцирует нестабильность клеточного генома и, как следствие, индукцию нарушений в различных хромосомах (Киселев Ф.Л., 1997). В практической медицине выделяют 3 основные формы генитальной ПВИ: клиническую, субклиническую и латентную (Краснопольский В.И., 2005). К типичным морфологическим проявлениям ПВИ относят предраковые состояния — цервикальные внутриэпителиальные неоплазии (ЦИН 1, 2, 3) и злокачественные новообразования, а также остроконечные кондиломы, обусловленные 6-м и 11-м типами ВПЧ, расположенные в области шейки матки, влагалища, вульвы или ануса (Кунцевич Л.Д., Щибаева Е.В., Мишанов В.Р., 2005; Schnerder A., Koutsky L., 1992; Villa L.L., 1997). Субклиническая ПВИ представлена эндофитными кондиломами, которые характеризуются ростом внутри эпителия, располагаясь на ШМ, нередко — лейкоплакией (Харитонова Л.И., Мелехова Н.Ю., Иванян А.Н. и др., 2005; Мелехова Н.Ю., Харитонова Л.И., Иванян А.Н. и др., 2006). Гистологически выделяют три разновидности кондилом: плоская, инвертирующая и атипическая. В клинической практике данные формы объединены под термином «плоская кондилома». Она сложна при макроскопической диагностике, но хорошо диагностируется при расширенной кольпоскопии и гистологическом исследовании (Трушина О.И., Новикова Е.Г., 2005; Barasso R., 1992). Известно, что онкогенные типы 26 ВПЧ в большинстве вызывают субклиническую форму инфекции, ассоциированную с ЦИН и РШМ (Курашвили Л.Р., Галустян С.А., Почтаренко О.В. и др., 2007). В 60% случаев имеется сочетание плоской кондиломы с дисплазией, в 5% — с преинвазивной карциномой (Фролова И.И., 2003; Трушина О.И., Новикова Е.Г., 2005). Латентная форма ПВИ характеризуется отсутствием клинически выраженной патологии, минимальными морфологическими изменениями в гистологических и цитологических препаратах (Кузнецова Ю.Н., 2005; Иванян А.Н., Мелехова Н.Ю., Сухарева И.Г. и др., 2006). ВПЧ-инфекция выявляется только с помощью молекулярно-генетических методов (Трушина О.И., Новикова Е.Г., 2005; Wick M.J., 2000; Manos M.M., Ting Y., Wright D.K. et аl., 2001). По мнению ряда авторов, именно пациентки с латентной инфекцией представляют группу риска по развитию предопухолевых состояний (Прилепская В.Н., Кондриков Н.И., 2000; Кондриков Н.И., Казанцева И.А., 2002; Прилепская В.Н., 2004). Этиологическая роль вируса папилломы человека предполагает, что ПВИ является необходимой составляющей для развития опухолевого процесса. Показано, что в 90% случаев имеются специфические типы ВПЧ (Иванова О.И., Павлович В.Г., 1983; Киселев Ф.Л., 1997; Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Подистов Ю.И., 2003; Роговская С.И., 2008; Киселев В.И., 2004; Munger K., 2002). Во многих случаях инфекция носит смешанный характер, наиболее распространенными являются сочетание типов 16/18 и 16/11. Смешанная инфекция более часто встречается при низких степенях дисплазии (Максимов С.Я., Савичева А.М., Башмакова М.А. и др., 1999; Подистов Ю.И., 2003; Wilkinson E.J., Guerrero E., Daniel R. еt аl., 1993). Кроме того, как показали исследования, клетки резервноклеточного плоскоклеточного рака содержали геном HPV 16-го или 18-го типа, а эктоцервикальные раки в большинстве случаев либо были негативными на HPV, либо содержали HPV 6-го или 11-го типа. Возможно, это связано с тем, что резервные клетки слизистой оболочки эндоцервикса являются клетка- 27 ми-мишенями для HPV-инфекции (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2012; Broker T.R., Chow L.T., Chin M.T. et al., 1989). По утверждению ряда исследователей, ПВИ является необходимым, но не достаточным фактором в акте канцерогенеза. Для развития заболевания предположительно небходимо несколько инициирующих факторов, которые разделены на эндогенные и экзогенные (Подистов Ю.И., 2003; Афанасьев М.С., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др., 2004; Трушина О.И., Новикова Е.Г., 2005). Кофактором для развития и прогрессирования папилломавирусных поражений шейки матки может быть нарушение в одном из звеньев клеточноопосредованного иммунитета (Мелехова Н.Ю., 1997; Манухин И.Б., Минкина Г.М., Пинегин Б.В. и др., 1998; Подистов Ю.И., 2003; Сухих Г.Т., Матвеева Н.К., 2000; Arany I., Tyring S.K., 1996). Первичными представителями местной иммунной реакции являются клетки Лангерганса и интраэпителиальные лимфоциты, которые находятся в ткани шейки матки, но их взаимодействие может быть нарушено (Минкина Г.Н., Манухин И.Б. и др., 1998; Быков В.Л., 1997). У больных с кондиломами и различными степенями ЦИН отмечено снижение количества клеток Лангерганса (Morris H.B., Gatter K.S., Sykes G. еt al., 1983). Снижение данных клеточных популяций наблюдается при ВПЧ как низкого, так и высокого онкогенного риска, но более очевидно при поражениях низкой степени (Быков В.Л., 1997; Morelli A.E., Senanes C., Di P.G. et al., 1993). Клетки Лангерганса экспрессируют гены гистосовместимости, они же отвечают за распознавание и выработку вирусного антигена и пополнение СD4+ Т-лимфоцитов, необходимых для местного иммунного ответа (Быков В.Л., 1997). У больных с генитальной папилломавирусной инфекцией отмечено снижение содержания в крови лимфоцитов, уменьшение иммунорегуляторного индекса, подавление способности лейкоцитов вырабатывать интерферон (Харлова О.Г., Агикова Л.А., 1996; Frankowski A., Wictorowicz K., Kedria W. еt al., 1997). При изучении иммунного статуса была выявлена корреляционная зависимость распространенности процесса и количества Т-лимфоцитов. Наблюдалось 28 снижение количества и повышение числа CD8+ у пациенток с распространенными процессами ВПЧ-поражений шейки матки (Манухин И.Б., Минкина Г.М., Пинегин Б.В. и др., 1997; Манухин И.Б., Минкина Г.М. и др., 1998; Arany I., Tyring S.K., 1996). У пациенток с тяжелыми дисплазиями и РШМ отмечены значительные сдвиги в субпопуляциях лимфоцитов. По мере прогрессирования злокачественного процесса выявлено снижение содержания общих Т-клеток (CD3+), Т-хелперов/индукторов (CD4+). При РШМ II и III стадий была отмечена выраженная иммунодепрессия, снижались не только CD3+ и CD4+, но и CD8+, CD16+, CD22+ лимфоцитов. Угнетение этих популяций приводило к нарушению соотношения CD4+/CD8+, что свидетельствует о хелперном дефекте, ведущем к развитию неопластического процесса (Чернявская Г.Я., Вагнер В.П., Тютюнова А.М. и др., 1981; Минкина Г.Н., 1999; Белокриницкая Е.У., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н., 2003; Фролова И.И., 2003). Помимо системы клеточного иммунитета, в патофизиологию ВПЧ-поражений вовлечено и его гуморальное звено. Доказательством этого является обнаружение антител (IgG) к различным ВПЧ-компонентам, включая L1, L2, E6 и E7. Причем антитела вырабатываются местно, непосредственно во влагалище и шейке матки; так, Г.Н. Минкина (1999) отмечала снижение концентрации в цервикальной слизи IgА, IgG, sIgA и появление IgM, который не определяется у здоровых женщин. Была изучена роль некоторых факторов неспецифической защиты организма (цитокинов) при ВПЧ-поражениях и модулирующей роли ИЛ-18 на HPV 16-го типа. Была выявлена корреляция между экспрессией белка Е6 HPV 16-го типа и экспрессией ИЛ-18 и провоспалительных цитокинов (Cho Y.S., Kang J.W., Cho C.W. et al., 2001). В работах Е.У. Белокриницкой с соавт. (2003) отмечено, что при умеренных дисплазиях шейки матки по сравнению с показателями здоровых женщин в 5 раз повышены концентрации ИЛ-1α и ИЛ-1β, но снижены ИЛ-8 и ФНО-α. Развитие тяжелой дисплазии и РШМ сопровождается значительным повышением в сыворотке крови ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-8 и ФНО-α (Минки- 29 на Г.Н., 1999; Белокриницкая Е.У., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н., 2003). Таким образом, цитокины, реализуя свое действие через клетки-мишени (макрофаги, лимфоциты), активно регулируют состояние иммунитета и гомеостаза. Развитие РШМ сопровождается усилением продукции провоспалительных цитокинов, развитием хелперного дефекта лимфоцитов и гиперкоагуляции (Белокриницкая Е.У., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н., 2003; Пономарева Ю.Н., Манухин И.Б., Ашрафян Л.А., 2010). Основными противовирусными цитокинами являются интерфероны. Они проявляют антипролиферативную и иммуномодулирующие функции. Интерфероны индуцируют апоптоз (запрограммированную гибель клеток) и играют роль в ограничении распространения вируса и повышении антивирусного статуса инфицированных клеток (Пономарева Ю.Н., 2002; Kyo S., Inoue M., Hayasaka N. et al., 1995). Другим инициирующим фактором прогресса канцерогенеза является коинфицирование другими сексуально-трансмиссивными заболеваниями. Рядом авторов проведен анализ выявления сексуально-трансмиссивных заболеваний у женщин с папилломавирусными поражениями гениталий по сравнению с пациентками, не имеющими патологии шейки матки и являющимися отрицательными на ДНК ВПЧ (Минкина Г.Н., Манухин И.Б., Франк Г.А., 2001; Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Мелехова Н.Ю., 2005; Gubie H.A., Seagar A.L., Beattie G.J. et al., 2000). Кандидоз встречается в 3,5 раза чаще у пациенток с ВПЧ, чем в группе здоровых женщин, хламидийная инфекция — в 4 раза, микоплазмоз — в 3 раза, уреаплазмоз — в 4 раза, ЦМВ — в 2,5 раза, вирус простого герпеса 2-го типа — в 2 раза чаще. То есть ряд ученых рассматривают сопутствующие ИППП как фактор риска развития онкологической патологии у пациенток с ВПЧ (Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1995; Анкирская А.С., 1999; Кисина В.И., Михалко О.Е., Мерзабекова М.А. и др., 2001; Козлова В.И., Пухнер А.Ф., 2003; Афанасьев М.С., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др., 2004; Adam E., Kaufman R.H., Adler-Storthz R., 1985; Antilla T. еt al., 2001; Frega A., 30 Stentella P., Sperga G. et al., 1997). Это, по нашему мнению и с учетом литературных данных, связано с некоторыми экзогенными факторами, инициирующими прогресс ВПЧ (Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1995; Прилепская В.Н., Анкирская А.С., Байрамова Г.Р. и др., 1997; Кисина В.И., Михалко О.Е., Мерзабекова М.А., Полищук М.А., 2001; Adam E., Kaufman R.H., Adler-Storthz R., 1985; Frega A., Stentella P., Sperga G. et al., 1997; Antilla T. еt al., 2001). К внешним инициирующим факторам относятся особенности сексуального поведения, курение, контрацептивный анамнез (Прилепская В.Н., Фокина Т.А. 1990; Заридзе Д.Г., 2004). ПВИ связана с сексуальным поведением, риск развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии почти в 2 раза выше среди женщин с множеством половых партнеров, рано начавших половую жизнь (до 16 лет) (Бохман Я.В., 1989; Голованова В.А., Новик В.И., Гуркин Ю.А., 1999), тех, чьи половые партнеры промискуитетны (Козаченко В.П., 2000; Кустаров В.Н., Линде В.А., 2002; Burk R.D., 1996; Shepherd R., Weston J., Peersman G., Napuli I.Z., 2000). Выявлена связь рака шейки матки и ЦИН с курением (Winkelstein W., 1990; Smith H., Golderberg G., Runowicz C., 1992; Ho G.Y.F., Kadish A.S., Burk R.D. et al., 1998). Никотин и другие компоненты дыма обнаруживаются в отделяемом цервикального секрета, при этом отмечено снижение количества клеток Лангерганса в 2–7,5 раза в эпителии влагалищной порции шейки матки у курящих женщин (Быков В.Л., 1997). С большой вероятностью компоненты табачного дыма (никотин и котинин) являются промоторами процесса канцерогенеза в шейке матки, инфицированного ВПЧ (Заридзе Д.Г., 2004; Thiry L., Vokaer R., 1993). По мнению ряда авторов, прогресс ВПЧ в ЦИН чаще наблюдается у женщин, не применяющих методы барьерной контрацепции (Малевич К.И., Герасимович Г.И., Русакевич П.С., 1992; Кондратенко Н.Н., 2002). Широкое распространение ПВИ в 1960-е годы связывают с увеличением оральных контрацептивов по сравнению с барьерной контрацепцией. В 1992 г. 31 эксперты ВОЗ пришли к выводу, что длительное (в течение 5 лет и более) применение оральных контрацептивов может приводить к незначительному увеличению относительного риска РШМ. Показано, что риск развития аденокарциномы шейки матки при применении оральных контрацептивов повышается в 2 раза (Brinton L.A., Herrero S., Reeves W.S. et al., 1993). Не исключается, что сочетание эстрогенного компонента оральных контрацептивов с влиянием табачного дыма повышает риск развития РШМ (Берштейн Л.М., 2000; King M.M., Holligswrth A., Cuzick J., Garner R.C., 1994). Возраст пациенток, по одним данным, не связан с молекулярногенетическими детерминантами инфекции ВПЧ. По данным других авторов, ВПЧ типов 18 и 16 чаще выявляются у молодых больных (Мелехова Н.Ю., 2005; Ho G.Y.F., Kadish A.S., 1998; Moscicki A.B., Palefsky J., Gonzales J., Schoolnik G.K., 1990). Однако частота ВПЧ-инфицирования у женщин постменопаузального возраста значительно выше, чем предполагалось ранее (Smith E.M., Jonson S.R., Figuerres E.J. et al., 1997). Значение гормонального фактора в генезе фоновых и предраковых заболеваний шейки матки широко обсуждается в научной литературе. А.Б. Деражне (1972) называл гормональный дисбаланс одним из модифицирующих факторов. Отмечено прогрессирование степени неоплазии шейки матки на фоне гиперэстрогенемии (Коханевич Е.В., Ганина К.П., Суменко В.В., 1997). В другом исследовании теми же авторами показано, что гиперэстрогения содействует развитию РШМ, а прогестины блокируют фазу инициации опухоли. При иммуногистохимическом изучении эстрогеновых рецепторов в неизмененном эпителии влагалищной порции шейки матки отмечено, что рецепторы локализуются исключительно в ядрах базального и парабазального слоя. При ЦИН 1 количество клеток с положительной экспрессией на эстрогеновые рецепторы уменьшалось, а у пациенток с ЦИН 2–3 практически все неопластические клетки эпителия лишены рецепторов к эстрогенам. По мере нарастания неопластических изменений в эпителии шейки матки снижается его чувствительность к эстрогенным влияниям 32 (Фролова И.И., Местергази Г.М., Радзинский В.Е. и др., 2002; Gonzales S.J.L., Chavez D.J., Maricela R.A. et al., 2001). В настоящее время ряд авторов придерживаются концепции системной гиперэстрогении (Бохман Я.В., 1989; Бауэр Г., 2002), но имеются также сторонники локальной или органной гиперэстрогении (Савицкий Г.А., Савицкий А.Г., 2000; Hunter R., Cook B., Peyser K., 1983; Liehr J.G., 1994). Г.А. Савицкий с соавторами (2000) сопоставил содержание половых стероидов в крови локтевой и маточных вен у пациенток, оперированных по поводу миомы матки. Концентрация основных половых стероидов в общем кровотоке у обследованных женщин была в пределах нормы, однако содержание эстрадиола и прогестерона в крови из трубно-маточных артериол было выше в 2–8 раз, чем их содержание в крови локтевой вены. С точки зрения R. Hunter и соавт. (Hunter R., Cook B., Peyser L., 1993), обнаружение различия концентрации половых стероидов в разных сосудистых системах является доказательством существования механизма противоточного «переноса» гормонов из яичниковых вен в артериальные сосудистые системы яичника и маточной трубы, что обеспечивает поступление высоких концентраций гормонов к определенным областям внутренних половых органов. Данный факт позволяет предположить, что в женском организме существует субовариальная система регуляции трубно-маточного гормонального гомеостаза (Савицкий Г.А., Савицкий А.Г., 2000), и что источником качественного изменения в продукции эстрогенов, включая образование катехолэстрогенов, могут быть процессы локального, внутритканевого метаболизма (Liehr J., 1994). Обнаружено, что пролиферативная активность клеток эпителия шейки матки в 1,8 раза выше в лютеиновую фазу менструального цикла по сравнению с фолликулиновой и на 33% выше у женщин в пременопаузе по сравнению с постменопаузой (Kinishi P., Fujii S., Nonogaki H. еt al., 1991). Следовательно, чувствительность эпителия шейки матки к экзогенным воздействиям может быть неодинакова в различные возрастные периоды (Бахидзе Е.В., Косников А.Г., Максимов С.Я., 1996). При длительной эстрогенной депривации эстро- 33 геновые рецепторы становятся более чувствительными к эстрогенам и обеспечивают активацию определенных генов (Jeng M.H., Shupnic M.A., Bender T.P., Santen R.J., 1998). L. Israels и S. Israels (1999) показали, что при экспрессии эктопических для данной ткани рецепторов к гормонам последние могут играть роль факторов роста опухоли. Большинство исследователей сходятся во мнении, что опухолевая трансформация происходит под влиянием прямых канцерогенных воздействий, в то время как гормоны могут вызывать активацию опухолевого роста (Берштейн Л.Н., 2000; Henderson B.E., Feigelson H.S., 2000). Ряд авторов выделяют два типа гормонального канцерогенеза: промоторный и генотоксический (Турусов В.С., Белицкий Г.А., Пылев Л.Н. и др., 2004; Yager J.D., Liehr J.G., 1996). Первый является в определенном смысле «естественным» и реализуется в случае избыточной гормональной стимуляции на фоне физиологических (но нередко мутагенных) эффектов гормонов. При генотоксическом варианте гормоны или продукты их метаболизма играют роль истинных канцерогенов (Берштейн Л.Н., 2000; Турусов В.С., Белицкий Г.А., Пылев Л.Н. и др., 2004). По современным представлениям, превращение эстрогенов в катехолэстрогены и в последующие метаболиты в ходе свободнорадикальных реакций является основой для реализации ДНК-повреждающих гормональных эффектов (Liehr J.G., 1997). В литературе не только широко обсуждается роль стероидных гормонов в канцерогенезе РШМ, но и большое значение уделяется воздействию на шейку матки пролактина. Так, обнаружение гиперпролактинемии при инвазивном РШМ позволило высказать предположение о нарушениях нейроэндокринной регуляции у этих больных, возможно, гипофизарного происхождения (Cтруков Е.Л., Сафронникова Н.Р., Бобров Ю.Ф. и др., 1990). Ген пролактина расположен на хромосоме 6, на которой располагается ген HLA-системы. Иммортолизация клеточных линий ШМ человека под воздействием HPV онкогенных типов также связана с дефектом хромосомы 6. Пролактин в организме чело- 34 века обладает как центральным, так и периферическим влиянием. Следовательно, патологические эффекты гиперпролактинемии носят в клиническом плане комбинированный характер. По имеющимся литературным данным, гиперпролактинемия может играть роль модифицирующего фактора в злокачественной трансформации дисплазии ШМ, действующего на фоне HPV-инфекции, что позволяет рассматривать гиперпролактинемию как возможный маркер риска РШМ (Сафронникова Н.Р., Зарайский М.И., Чухловин А.Б., 2003). В настоящее время известно, что стероидные гормоны играют важную роль в формировании и прогрессировании плоскоклеточного рака шейки матки путем увеличения уровня папилломавирусных белков Е2 и Е7, синтезируемых в пораженных вирусом эпителиальных клетках. Кроме того, по данным некоторых авторов, эстрогены и их метаболиты принимают участие в регуляции апоптоза (Kiess W., Gallaher B., 1998). В процессе опухолевой трансформации ключевую роль играют вирусные гены Е6 и Е7 (Киселев Ф.Л., 1997; Scheffner M., Romanczuk H., Munger K. еt al., 1994), активность которых контролируется регуляторным участком вирусного генома, основными точками приложения их являются клеточные гены (р53 и Rb-гены). Геном ВПЧ содержит 8 генов — Е2, Е1, Е4, Е5, Е6, Е7, L1, L2. Ранние гены (Е) преимущественно регулируют жизненный цикл вируса, поздние гены (L) кодируют вирусные капсидные протеины (Herrington M.R., 1994; Southern S.A., Herrington C.S., 1998). Онкобелок Е6 выступает в роли коактиватора, взаимодействующего с факторами транскрипции и элементами основного транскрипционного комплекса (Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Фролова И.И., 2003; zur Hausen H., 1994). Направление действия белка Е6 (супрессорное или трансактивирующее) определяется характером, положением и числом сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторах. Промотор р97 HPV 16-го типа может играть роль в поддержании латентного состояния вирусной инфекции. С онкобелком Е6 HPV типов 16 и 18 взаимодействуют как минимум 7 клеточных белков. В настоящее время из них идентифицировано 3 клеточных 35 белка: р53, Е6/4Р, Е6-ВР. Ген р53 ассоциирован как с контролем клеточного роста, так и с неопластической трансформацией. Делеции или мутации в некоторых случаях превращают р53 в активный онкоген. Не все злокачественные опухоли имеют мутации р53, однако доказан альтернативный механизм инактивации р53 путем связывания с онкобелком Е6 HPV типов 16 и 18, что приводит к потере контроля за пролиферацией клеток (Киселев В.И., Киселев О.И., 2003). Клеточный белок Е6-ДР (E6-associated protein) в комплексе с онкобелком Е6 участвует в деградации р53, а также, возможно, снижает период полужизни и уменьшает уровень р53 в HPV-иммортализованных клетках. Белок Е6-ВР (E6-binding protein) взаимодействует с геном Е6 HPV типов 16 и 18, что в результате приводит к ингибированию процесса дифференцировки клеток и, возможно, создает условия для репликации вирусной ДНК. Таким образом, ген Е6 является мультифункциональным белком, трансактивирующая активность которого реализуется путем взаимодействия с геном р53, что приводит к его деградации и нарушению механизма клеточного роста и процесса дифференцировки клеток (Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Фролова И.И., 2003; zur Hausen H., 1994). Однако до сих пор отсутствует четкое представление о механизме взаимодействия вирусного белка Е6 с клеточными белками in vivo. Вирусный белок Е7 способен нарушать регуляцию контроля клеточного цикла, образуя стабильный неактивный комплекс с серией регулирующих клеточный цикл белков. Он стимулирует развитие событий в S-фазе клеточного цикла путем инициации репликации вирусных генов и нарушения регуляции пролиферации трансформированных клеток. Допускается возможность неконтролируемого синтеза клеточной ДНК под влиянием белка Е7. Таким образом, белок Е7 также является мультифункциональным. За счет взаимодействия с клеточными белками белок Е7 способен отменять остановку клеток в G-фазе клеточного цикла, оказывать митогенное влияние и стимулировать неконтролируемый синтез ДНК (Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002; Фролова И.И., 2003; zur Hausen H., 1994). 36 Сообщения, соотносящие молекулярно-генетические детерминанты HPVинфекции при РШМ с гистопатологическими и клиническими особенностями опухолей и прогнозом РШМ, содержат противоречивые результаты. В нетрансформируемых HPV-инфицированных клетках Е2 протеин HPV регулирует транскрипцию вирусных онкогенов Е6 и Е7 (Sanchez-Perez A.M., Soriano S., Clarc A.R., Gaston K., 1997). Злокачественная трансформация обычно сопровождается деструкцией гена Е2 с последующим нарушением регуляции экспрессии Е6 и Е7. Показано, что повторное внедрение протеина Е2 в HPV-16-трансформированные линии клеток РШМ приводит к снижению скорости роста, а отсутствие сывороточных факторов роста — к гибели клеток через апоптоз. Увеличение уровня протеина Е7 вызывает стимуляцию апоптозной гибели клеток. Полученные авторами данные показывают, что разрушение гена Е2 приводит к появлению HPVтрансформированных клеток, которые менее подвержены апоптозу и, следовательно, более склонны к образованию опухоли шейки матки (McMurray H.R., Nguyen D., Westbrook T.F., McAnce D.J., 2001). Инфицирование HPV является необходимым, но не решающим фактором развития злокачественного процесса. В процессы иммортализации и трансформации вовлечены клеточные факторы, участвующие в регуляции клеточного цикла и в дифференцировке клеток (Киселев Ф.Л., 1997). Нарушения в геноме опухолей связаны с их генетической нестабильностью, которая может быть обусловлена апоптозом. Известно, что усиление клеточной атипии в эпителии шейки матки обусловлено снижением апоптотической активности. Вероятнее всего это связано со снижением скорости нормальной гибели клеток через апоптоз (Nair P., Nair K.M., Jayaprakash P.G., Pillai M.R., 1999; Sheets E.E., Crum C.P., Yeh J., 1996). Апоптоз представляет собой универсальный механизм физиологической и патологической гибели клеток. Опухолевой рост возникает не только за счет неконтролируемой пролиферации клеток, но может быть обусловлен нарастанием клеточной массы за счет нарушения апоптотической гибели клеток (Копнин Б.П., 2000; Evan G.I., Vousden K.H., 2001). В физиологических условиях 37 роль апоптоза сводится к поддержанию постоянного количества клеток в тканях и органах и удалению клеток, завершивших свой жизненный цикл. При этом апоптоз обладает двойной ролью: положительной — самоубийство клеток приводит к гибели антигена, и отрицательной — самоубийство клеток уменьшает содержание иммунокомпетентных клеток (Робинсон М.В., Труфанов В.А., 1991; Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). Феномен апоптоза является результатом действия различных факторов. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, гипоксия, свободные радикалы, радиационное излучение, УФ-излучение и др. (Белушкина Н.Н., Северин С.Е., 2001). Апоптоз начинается с момента повреждения ДНК, вызывающего перерыв в цикле ее репродукции; если «ремонта» ДНК не происходит, то клетки вступают в фазу апоптозной гибели (Sheets E.E., Yeh J., 1997). Если генетические механизмы, вовлеченные в этот процесс, изменяются, смерть клетки может не наступить. Дальнейшие мутации приводят к появлению злокачественного фенотипа и к росту злокачественной опухоли. Генетическая регуляция апоптоза сложна и не до конца изучена. Существуют гены как способствующие апоптозу (ген р53), так и подавляющие апоптоз (ген Bcl 2) (Копнин Б.П., 2000; Белушкина Н.Н., Северин С.Е., 2001). Наиболее универсальным молекулярным изменением при опухолевом росте у человека является инактивация функции белка. Более чем в половине всех опухолей человека (50–60% новообразований более чем 50 различных типов) имеются мутации гена p53. При этом следует отметить, что подавляющее большинство (более 90%) мутаций p53 представляют собой миссенс-мутации, приводящие к замене одной из аминокислот в белковой молекуле на другую. Другой особенностью мутаций р53 в опухолевых клетках является то, что они часто являются гетерозиготными, т. е. поражают только один из двух аллелей гена (Копнин Б.П., 2000; Чумаков П.М., 2000; Israels L., Israels S., 1999). Следует подчеркнуть, что мутации — не единственный путь нарушения функции белка р53 в опухолевых клетках, и спектр нарушений меняется в зависимости от гис- 38 тогенеза опухоли и/или этиологического фактора. Так, например, при РШМ, ассоциированном с HPV, происходит связывание р53 с вирусным онкобелком Е6, что вызывает деградацию белка р53. В программированной смерти клеток этим белкам принадлежит ключевая роль, они же, вероятнее всего, участвуют в процессах канцерогенеза и могут рассматриваться как прогностические факторы при РШМ (Padovan P., Salmaso R., Marchetti M., Padovan R., 2000; Graflund M., Sorbe B., Karlsson M., 2002; Grace V.M., Shalini J.V., Lekha T.T. et al., 2003). Центральную роль в развитии апоптоза играют так называемый «дикий» (wild) тип гена-онкосупрессора р53 и кодируемый им протеин р53, который контролирует начальную фазу цикла клеточного деления, одной стороной в контрольной точке перехода G1 фазы в S-фазу. Другая сторона связана с запуском многоступенчатой и многокомпонентной, могущей многократно дублироваться и образовывать разнообразные кооперации программы, направленной либо на удаление поврежденного участка ДНК и ее репарацию, либо на уничтожение поврежденной клетки, т. е. развитие апоптоза (Копнин Б.П., 2000; Белушкина Н.Н., Северин С.Е., 2001; Bowen J., Bowen S., Jones A., 1998). К протеинам, блокирующим р53, а следовательно, и апоптоз, относятся эндогенные (Bcl-2) и экзогенные вирусные протеины (Е6, E7 и др.). Белки Е6 и Е7 многофункциональны. Их трансформирующий потенциал обеспечивается путем белок-белкового взаимодействия. Белок Е6 взаимодействует с белками р53 и BAK, вызывая их деградацию по убиквитинзависимому пути (Rapp L., Chen J.J., 1998). Это приводит к предотвращению апоптоза и нарушению защитных регуляторных механизмов, обеспечивающих репарацию ДНК, что способствует дестабилизации генома. P. Beer-Romero и S. Glass полагают, что Е6 подавляет активность р53, стимулируя его деградацию путем протеолиза, в который вовлечен ассоциированный с Е6 белок. При этом данная функция Е6АР наблюдалась только в тканях РШМ, но отсутствовала в нормальном эпителии (Beer-Romero P., Glass S., Rolfe M., 1997). Также Е6 подавляет выработку интерферона, активирует теломеразу и предотвращает деградацию тирозинкиназ се- 39 мейства SRC, таким образом усиливая пролиферацию (Мазуренко Н.Н., 2003; zur Hausen H., 1996). В ряде работ показано, что в клетках цервикальных карцином экспрессируется «дикий» (не мутированный) тип р53, а инактивирующая роль белка Е6 сопоставима с мутацией р53 (Thomas M., Pim D., Banks L., 1999). Известно, что в клетках человека существуют молекулы, способные связываться с Е6, снижая таким образом его антиапоптотический потенциал и защищая клетки эпителия от пролиферации. Одним из наиболее вероятных блокирующих белков для Е6 является белок Е6-1, который был идентифицирован D. Pim и L. Banks. Белок Е6-1, взаимодействуя с нативным Е6 HPV 18-го типа, препятствует деградации р53, опосредованной Е6, и блокирует пролиферацию линии цервикальных раковых клеток. В то же время ингибирование белком Е6-1 транформированного клеточного роста коррелирует с его способностью индуцировать апоптоз по р53-зависимому пути (Pim D., Banks L., 1999). Основным свойством белка Е7 является взаимодействие c продуктом гена Rb, с убиквитинизацией последнего и высвобождением из комплекса рRb-Е2F транскрипционного фактора Е2F, регулирующего клеточную пролиферацию (Киселев Ф.Л., 2000; Seavey S.E., Holubar M., Saucedo L.J., Perry M.E., 1999; zur Hausen H., 2000). Высокая активность фактора Е2F может привести к апоптозу в клетках, экспрессирующих Е7, т. к. при этом активируется синтез ингибитора циклинзависимых киназ Cdk 4,6 р16INK4A. Данный белок является негативным регулятором пролиферации клеток, участвует в сигнальном пути CdkRb-E2F, контролирует переход клетки из фазы G1 в S-фазу клеточного цикла (Евстигнеева Е.Л., Левчик Н.К., Герасимова Н.М. и др., 2005; Копнин Б.П., 2000). В пролиферирующих HPV-инфицированных клетках существует механизм защиты от малигнизации путем подавления функций вирусных онкобелков за счет ингибиторов циклинзависимых киназ, в первую очередь р16 INK4A. Однако, несмотря на высокий уровень р16INK4A, этот белок остается функционально неактивным, так как Е7 также активирует циклины А и Е, стимулирующие вход в S-фазу клеточного цикла. Кроме того, Е7 блокирует функции ингибиторов 40 циклинзависимых киназ р21WAF1/CIP1 и p27KIP1. Белок Е7 способствует дестабилизации хромосом и усиливает мутагенное действие химических канцерогенов. Как недавно показано, Е7 индуцирует анеуплоидию, вызывая амплификацию центриолей на ранних стадиях канцерогенеза (Киселев Ф.Л., 2000; Копнин Б.П., 2000; Ruas M., Peters G., 1998; Sherr C.J., 2001). Каждый из генов Е6 и Е7 способен иммортализовать культуры клеток. Иммортализация клеток in vitro, т. е. способность неограниченно долго пассироваться в культуре ткани, скорее всего, соответствует клинической стадии легкой дисплазии. Однако именно совместная экспрессия этих генов значительно усиливает прогрессию, благодаря уникальному кооперативному эффекту трансформации двумя генами, Е6 и Е7. В HPV-инфицированных клетках р16INK4A синтезируется, но не оказывает влияния на клеточный цикл, так как хотя р16INK4A нейтрализует Е6, белок Е7 минует это подавление, прямо активируя циклины А и Е. Е6 в свою очередь предотвращает Е7-индуцированный апоптоз, деградируя белки р53 и BAK. Поскольку накопление р16INK4A в клетках свидетельствует о трансформации вирусами папиллом, предложено выявлять такие клетки на гистологических срезах или в цитологических мазках по окраске специфическими антителами к р16 INK4A (Киселев Ф.Л., 2000; Копнин Б.П., 2000; Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. и др., 2002). Наряду с исследованием механизмов онкогенного воздействия на эпителиальные клетки ШМ белков HPV широко изучается роль собственных белков организма, обладающих антиапоптотическими свойствами, и их взаимодействия с индукторами апоптоза. Одним из главных эндогенных ингибиторов апоптоза является белок bcl-2, который при различных условиях способен вызывать как клеточную пролиферацию, так и клеточную гибель. Выявление угнетения апоптоза при участии bcl-2 показало даже большую значимость этого процесса для онкогенеза, чем собственно усиление пролиферации (Chao D.T., Korsmeyer S.J., 1998). bcl-2 локализуется на наружной мембране митохондрий и принадлежит к большому се- 41 мейству, насчитывающему 16 членов. Одни из них (bcl-2, bcl-XL, mcll и пр.) ингибируют апоптоз, другие (bax, bak, bid, bik, nbk и др.) его активируют (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). В митохондриях bcl-2 стабилизирует мембрану, управляет транспортом ионов, образуя ионные поры, предупреждает выход ряда факторов, индуцирующих апоптоз. Таким образом, bcl-2 подавляет апоптоз с помощью двух способов: за счет непосредственного влияния на митохондрии для предотвращения повышения проницаемости и за счет эффектов, вызванных взаимодействием с другими белками. На самом деле, полагают, что митохондриальная проницаемость определяется соотношением проапоптозных и антиапоптозных веществ семейства bcl-2 в мембране (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Yang J., Liu X.S., Bhalla K. et al., 1997). В экспериментах in vitro в образцах аденокарцином влагалища и цервикального канала показано, что экспрессия протоонкогена bcl-2 может блокировать апоптоз, опосредованный р53. С целью проверки этого наблюдения в системе in situ было проведено исследование S. Waggoner и соавт. (Waggoner S.E., Baunoch D.A., Anderson S.A. et al., 1998). Во всех образцах, в которых предварительно было показано наличие гена р53, при иммуногистохимическом исследовании был выявлен белок bcl-2, экспрессия его варьировала от умеренной до высокой. Несмотря на присутствие дикого типа р53, только в 4 образцах была отмечена фрагментация ДНК, свидетельствующая об апоптозе. По мнению авторов, несмотря на то, что в результате повреждения ДНК при трансформации нормальных цервикальных клеток в раковые наблюдается суперэкспрессия гена р53, его онкопротективный эффект в большинстве случаев блокируется одновременной экспрессией bcl-2. Таким образом, очевидно, что при карциноме влагалища и шейки матки существует механизм, способный препятствовать развитию апоптоза без мутационных повреждений гена р53. В работах X. Liang и соавт. установлено, что ни в одной из клеточных линий РШМ с активной экспрессией bcl-2 (в отличие от нормальных кератиноцитов) не определяется функционально активный белок р53, либо он представлен мутантным типом, либо инактивирован путем связывания с белком 42 Е6 ВПЧ (Liang X.H., Mungal S., Ayscue A. еt al., 1995). Одновременное повышение уровня экспрессии bcl-2 и снижение уровня продукции или активности р53 на фоне папилломавирусной инфекции могут служить важной предпосылкой развития предраковых процессов и рака цервикального канала. В то же время повышение экспрессии bcl-2, возможно, играет роль не во всех типах рака шейки матки. В работе К. Kokawa и соавт. иммуногистохимическим методом в тканях инвазивного плоскоклеточного рака и инвазивной эндоцервикальной карциномы bcl-2 не был выявлен (Kokowa K., Shikone T., Otani T., Nakano R., 1999). Слабовыраженная продукция гена Вах, являющегося индуктором апоптоза, была отмечена в тканях инвазивного плоскоклеточного РШМ, а в тканях инвазивной эндоцервикальной карциномы экспрессия Вах был высокой и сочеталась с активным апоптозом. Корреляционный анализ полученных данных позволил авторам сделать вывод о том, что апоптоз развивается в клетках инвазивной аденокарциномы цервикального канала в случае высокого уровня экспрессии гена Вах, что подтверждается результатами других исследователей (Nair P., Nair K.M., Jayaprakash P.G., Pillai M.R., 1999). Представленные результаты свидетельствуют о разнообразии путей опосредованного апоптозом блокирования пролиферации трансформированных клеток эпителия шейки матки. В то же время частота случаев цервикального рака довольно высока, и переход нормального роста клеток в неопластический и раковый нередко непредсказуем. Поэтому большое значение приобретают статистические исследования, к которым относится работа С. Isacson и соавт., посвященная оценке корреляционной зависимости между пролиферативной активностью, интенсивностью апоптоза и онкогенностью ВПЧ в тканях цервикальных неоплазий (Isacson С., Kessis T.D., Hedric L., Cho K.R., 1996). Было показано, что активность пролиферации клеток возрастает по мере повышения степени ЦИН. Одновременно с этим увеличивается и количество клеток, подвергшихся апоптозу. Апоптотические клетки выявлялись в единичных случаях при ЦИН 1 и отсутствовали в нормальном эпителии. Статистически значимой зависимости 43 уровня пролиферации и апоптоза от степени онкогенности ВПЧ выявлено не было. О повышении апоптотического индекса по мере прогрессии ЦИН от низкой до высокой степени свидетельствуют также данные Y. Shoji и соавт., которые, кроме того, не обнаружили корреляции между уровнем апоптоза и наличием папилломавирусной инфекции (Shoji Y., Saegusa M., Takano Y., Ohbu M., Okayasu I., 1996). Литературные данные позволяют предположить, что снижение интенсивности апоптоза может отражать атипические изменения в клетках эктоцервикса в процессе их неопластических изменений и что пролиферативная активность в неопластическом эпителии возникает в периоде перехода в carcinoma in situ. Эти данные подтверждают, что степень апоптоза при ВПЧ-инфицировании коррелирует скорее с пролиферативной активностью, чем с типом инфекции (Фролова И.И., 2003). При дисплазии высокой степени продукция циклина В не регулируется и сохраняется в верхних эпителиальных слоях. Напротив, при низкой степени дисплазии отмечается продукция циклина В преимущественно базальными и парабазальными клетками (Southern S.A., McDicken I.W., Herrington C.S., 2000). В некоторых исследованиях установлено, что данный факт связан с типом ВПЧ (Southern S.A., McDicken I.W., Herrington C.S., 2000). Эндотелиин-1 продуцируется кератиноцитами, пораженными ВПЧ, что приводит к повышенной пролиферации эпителиальных клеток (Venuti A., Salani D., Cirilli A., 2002). Очевидно, что прогрессия РШМ от предклинической стадии интраэпителиальных дисплазий до инвазивного рака с метастазированием есть многоступенчатый процесс не только с клинической точки зрения, но и с молекулярногенетической. Вовлеченность различных факторов (вирусных, генетических и эпигенетических) является на сегодняшний день доказанной (Киселев Ф.Л., 2004). Среди этих факторов наибольшее значение имеют различные мутагены и эстрогены, которые могут влиять на активность персистирующей ДНК HPV, что может стимулировать модификацию клеточных генов и индуцировать геномную 44 нестабильность (Киселев Ф.Л., 2004; zur Hausen H., 2000). Это вероятнее всего сопровождается изменениями в структуре и активности вирусных трансформирующих генов и дополнительными мутационными изменениями в генах, связанными с дифференцировкой не только паренхиматозного, но и стромального компонентов опухоли, что определенно накладывает отпечаток на развитие и прогрессию опухоли. 1.3. Особенности взаимодействия паренхимы и стромы, роль сосудистого русла в становлении и развитии рака шейки матки Роль стромы в патогенезе заболеваний различной этиологии и в первую очередь неопластических процессов привлекает к себе внимание исследователей, что вероятнее всего связано с новыми методологическими приемами в патоморфологии, в частности, использованием иммуногистохимических методов исследования с использованием широкой панели антител. Особое внимание уделяется сосудам стромы, не только обеспечивающим нормальное функционирование тканей и органов, но и способствующим развитию опухолевых процессов. Сосудистый компонент в процессе опухолевого роста находится в тесном взаимодействии с паренхимой и с компонентами стромы, такими как клеточный и внеклеточный матрикс (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Капланская И.Б., Гласко Е.Н., Франк Г.А., 2005). Проблема становления и развития рака с регуляторными системами организма, в частности, сосудистой, уже длительное время привлекает внимание исследователей (Шистерова О.А., 2003; Field S.B., Burney I.A., Needham S. et al., 1991; Graflund M., Sorbe B., Hussein A. et al., 2002). Еще в 1930 г. Петр Львович Познанин в свой работе «Проблема развития и роста рака с морфологической стороны» писал, что «…в основе развития и роста плоскоклеточных раков лежит 45 одна причина — корреляция эпителия и соединительной ткани, и раковое заболевание нужно считать поэтому циклическим процессом. Действительно, мы имеем с морфологической стороны в самом росте рака чередование троякого рода изменений: сначала фаза васкуляризации эпителия, затем фаза пролиферации его клеток и, наконец, фаза дифференцировки его клеток. За последней стадией роста и развития рака следует первая — васкуляризация и опять сначала» (Познанин П.Л., 1930). Современные литературные данные подтверждают правильность этого наблюдения, высказанного еще в далекие 30-е годы прошлого столетия. Биология опухолей, как известно, определяется не только нестабильностью генетического аппарата, но и морфогенетическими особенностями, которые складываются, видимо, из синхронности взаимодействия паренхиматозного и стромального компонентов (Зарудин В.В., 1983; Баженов С.М., 1989; Sakakura T., 1991). Следует признать, что синхронное взаимодействие между паренхиматозным и стромальным компонентами опухоли является отражением гистофизиологических особенностей, имеющихся и в нормальной ткани, но только в новых условиях жизнедеятельности организма. Можно предположить, что опухолевые клетки стараются обеспечить такое микроокружение, которое способствовало бы их максимальной выживаемости, несмотря на защитные системы макроорганизма (Доросевич А.Е., 1987). Эпителий и строма представляют собой сопряженную систему, синхронные изменения которой определяют структурнофункциональные проявления любого патологического процесса, в том числе и опухоли (Дикштейн Е.А., Василенко И.В., 1987; Журавлева Т.Б., Рыбакова М.Г., 1996). Опухоль обладает системным и местным действием на организм. Местные изменения возникают в результате прямого влияния опухолевых клеток на неопухолевые клетки и экстрацеллюлярный матрикс стромы путем воздействия на них секретированных новообразованием онкобелков, факторов роста, цито- 46 кинов (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Капланская И.Б., Гласко Е.Н., Франк Г.А., 2005). Кроме того, местные изменения могут быть связаны с воздействием на ткань клеток стромального воспалительного инфильтрата, состоящего из Т-лимфоцитов, NK-клеток, макрофагов, плазмоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов. Стромообразование в опухоли является результатом взаимодействия опухолевых клеток с неопухолевыми клетками соединительной ткани гистиогенного и гематогенного происхождения (Пальцев М.А, Иванов А.А., 1995; Шварцбурд П.М., 2006). Сложность взаимоотношений системы «паренхима—строма» определяется тем, что эти две части опухоли являются многокомпонентными и обладают разнообразными свойствами по отношению друг к другу, поэтому часто бывает трудно решить, какие из них являются первичными и какие вторичными. В процессе эволюции между эпителием и соединительной тканью выработалась функциональная и морфологическая взаимосвязь, проявляющаяся не только в физиологических условиях, но и при патологии. В литературе имеются указания о сохранении этой корреляции при опухолевом росте (Габуния У.А., Цагортин З.Г., 1974; Журавлева Т.Б., Антипова Л.М., 1975; Николаев А.А., Ягубов А.С., 1975). Функциональная роль стромы при опухолевом росте многообразна: это питание, метаболизм, элиминация продуктов обмена. Также строма является механическим каркасом для паренхимы, местом противоопухолевого действия иммунной системы (Басаргин С.Т., 1978; Дикштейн Е.А., Василенко И.В., Ровенская Н.М. и др., 1985). Стромальные элементы опухолей представлены клетками и экстрацеллюлярным матриксом соединительной ткани, сосудами и нервными окончаниями (Абросимов С.Ю., 1992; Бехтерева И.А., 1997; Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003). Внеклеточный матрикс опухолей представлен двумя структурными компонентами: базальными мембранами и интерстициальным соединительнотканным матриксом. В состав базальных мембран входят коллагены IV, VI и VII типов, гликопротеиды (ламинин, фибронектин, витронектин), протеогликаны (гепарансульфат и др.). Интерстициальный соединительнотканный 47 матрикс содержит коллагены I и III типов, фибронектин, протеогликаны и гликозаминогликаны (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Barskay S.H. et al., 1983; Woodley D.T. et al., 1983; Kubota Y. et al., 1988; Strreuli C.H., Bissell M.J., 1990; Ervasti J.M., Compbell K.P., 1993; Meredith J.E. et al., 1993; D’Arcangelo G. et al., 2000; Malcolm R. Alison, 2003). Ведущую роль в механизмах регуляции в системе «эпителий—строма» играют эндокринная (Чумаченко П.А., Хмельницкий О.К., Шлыков И.П., 1987; Bulbrook R.D., 1992) и иммунная системы (Билынский Б.Т., Володько Н.А., Шпарык Я.В., 1991). Нарушение гормонального равновесия может быть определяющим фактором в возникновении и стимуляции роста опухоли. Ведущее значение в патологии тканевого роста имеет дисфункция системы стероидного синтеза, что в конечном итоге приводит к гормональной пролиферации, изменяет антигенную структуру пролиферирующих клеток (Журавлева Т.Б, Антипова Л.М., 1975). В литературе имеются противоречивые данные о влиянии половых стероидов на клетки стромы. Например, эстрогены могут обладать как иммуностимулирующим, так и иммунодепрессивным эффектом на стромальные клетки, однако прямое регулирующее влияние гормональных факторов на строму органов считается доказанным (Журавлева Т.Б., Антипова Л.М., 1975). Глубокая дезорганизация эпителия и соединительной ткани при развитии дисгормональных процессов (включая и опухолевый рост) дает повод анализировать изменения этих двух типов тканей одновременно с учетом степени гормонального дисбаланса. В экспериментальных работах по изучению стромы и эпителия репродуктивного тракта самок золотистых хомячков Т.Б. Журавлевой с соавт. (1975) установлено, что циклические изменения эпителия влагалища шейки матки и тела матки сопровождаются синхронными изменениями стромы. При этом реакция свободных клеток стромы была более выраженной, чем изменения микроциркуляторного русла и волокнистых структур. Наиболее глубокие изменения эпителия репродуктивного тракта развиваются при насыщении организма эстрогенами. В многослойном плоском эпителии влагалища и шейки матки выявля- 48 ются пролиферация клеток базального слоя и гиперкератоз, при этом синхронные изменения наблюдаются и в строме с инфильтрацией ее эозинофильными лейкоцитами, плазмоцитами. Авторы подчеркивают, что накопление лимфоцитов и плазматических клеток в тканях гормонозависимых органов означает участие иммунных механизмов в наблюдающихся тканевых перестройках (Журавлева Т.Б., Антипова Л.М., 1975). В ряде работ подчеркивается, что наличие воспалительной стромальной реакции в инвазивных раках шейки матки является благоприятным прогностическим фактором (Schoppmann S.F., Schind M., Breiteneder-Geleff S. et al., 2001). Известно, что иммунные влияния на паренхиму и строму эпителиальных опухолей могут ускорять или замедлять их рост (Быковская С.Н., Грунтенко Е.В., 1982; Уманский Ю.А., Пинчук В.Г., 1982; Брондз Б.Д., 1987; Суслов А.П., 1990; Schreiber H., 1993; Boon T., Cerottini J.C., Van den Eynde B. еt al., 1994). Злокачественный процесс невозможен без формирования предракового окружения. При этом остается открытым вопрос, являются ли предраковые состояния общим связующим механизмом поддержания злокачественного роста для разных типов опухолей (Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995; Шварцбурд П.М., 2006). Важную роль в стромообразовании опухолей и в разрушении ЭЦМ играют соединительнотканные клетки гистогенного и гематогенного происхождения, формирующие клеточные инфильтраты (Аничков Н.М., Горделадзе А.С., Новицкая Т.А., Чупров И.Н., 1995). Клетки инфильтратов (макрофаги, лимфоциты, плазмоциты, полиморфноядерные лейкоциты) (Краевский Н.А., Смольянников А.В., Франк Г.А., 1986) способны продуцировать как факторы, стимулирующие образование стромы (ростовые факторы, ИЛ-1, ФНОά, ТФР, фибронектин, различные типы коллагена и др.), так и различные протеолитические ферменты (Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995). Ряд авторов в своих работах отмечает, что злокачественные новообразования обладают способностью индуцировать и сохранять вокруг себя in vivo раковое микроокружение. Так, в работе П.М. Шварцбурда (2006) под раковым микроокружением понимается 49 «…комплекс функциональных и метаболических изменений, содействующих выживанию и росту опухолевых клеток в ущерб специализированным клеткам». Данный процесс сопровождается увеличением популяции незрелых эпителиальных клеток, активацией внеклеточного протеолиза, ростом сосудов, последние обеспечивают доставку кислорода и питательных веществ, но при этом ограничивают поступление гематогенных воспалительных клеток и их цитотоксическую активность (Дикштейн Е.А., Василенко И.В., 1987; Bissel M.J., LaBarge M.A., 2005; Liotta L.A., Kohn E., 2001). Подобные изменения временно можно наблюдать при «нормальном» воспалении в регенераторной стадии. При хроническом воспалении длительность регенераторной стадии возрастает, что сопровождается хронической активацией регенераторного микроокружения, идентичного опухолевому (Заридзе Д.Г., 2004; Маянский Д.Н., 1991). Кроме того, наблюдается появление в эпителии предраковых состояний, а именно гиперплазии (Wang W., Fraser A.V., Damber J.E., 2004), дисплазии (SmithMcCune K.K., Weidner N., 1994), метаплазии (Delvenne P., Hubert P., Jacobs N., 2004). Следует подчеркнуть, что ПВИ шейки матки у 64,2% пациенток сочетается с хроническим экзоцервицитом (Ежова Л.С., 1999; Куперт А.Ф., 2000; Роговская С.И., 2008). Морфологическим субстратом ПВИ шейки матки является негнойный цервицит, острый или хронический (100%), с истинными эрозиями и псевдоэрозиями (100%), дисплазией многослойного плоского эпителия (52,4%) и развитием рака в 5% наблюдений. В МПЭ ПВИ вызывает альтеративные, пролиферативные, метапластические изменения в связи с цитолитическим эффектом вироцитов, нарушением апоптоза и митотической активности. Помимо эпителия, значительные альтеративные и пролиферативные изменения развиваются в эндотелиоцитах, преимущественно капилляров. В них наблюдаются клазматоз и появление миелиноподобных структур в цитоплазматических мембранах, вакуолизация цитоплазмы, дехроматинизация ядер с появлением выпячиваний и инвагинаций в кариолемме. Часть клеток подвергается лизису и апоптозу, десквамируется (Холодная Т.О., Дерижанова И.С., Пименова В.В., 2007). При тя- 50 желых дисплазиях ШМ выявляется массивная инфильтрация стромы гранулоцитами, лимфоцитами и плазмоцитами. Нарастание интенсивности клеточной инфильтрации стромы может свидетельствовать об участии иммунокомпетентных клеток в защитной реакции организма в ответ на усиление пролиферативных процессов в тканях (Железнова Б.И., Ежова Л.С., Беляева Л.А., 1989). В экспериментальной и клинической онкологии состояние хронического воспаления называют синдромом «незаживающей раны». Патогенез данного синдрома и хронического воспаления имеет общие закономерности и при этом активируются одни и те же механизмы (Шубич М.Г., Авдеева М.Г., 1997; Рыбакова М.Г., Нутфуллина Г.М., 1995). Правомерность таких предположений рассматривается на примере перманентного роста сосудов (Капланская И.Б., Гласко Е.Н., Франк Г.А., 2005; Шварцбурд П.М., 2006). Формирование новых сосудов происходит из примитивных отростков сосудов или из отростков предшествующих сосудистых структур, что наблюдается при различной патологии — хроническое воспаление, заживление ран, опухолевый рост. Известно, что опухолевый рост сосудов поддерживается состоянием хронической гипоксии (De S., Razorenova O., McCabe N.P. et al., 2005) и постоянной активацией ферментативных систем и их рецепторов, в частности: матриксных металлопротеиназ (Ганусевич И.И., 2010; Coussens L.M., Werb Z., 2002) и циклогеназы стромы (Amano H., Hayashi I., Endo H. et al., 2003; Majima M., Amano H., Hayashi I., 2003), гем-оксигеназы в ассоциированных с опухолью сосудах и макрофагах (Berberat P.O., Dambrauskas Z., Gulbinas A. et al., 2005). Модифицирующее влияние стромы на опухолевые клетки развивается через адгезивные молекулы и интегриновые рецепторы, передающие сигнал элементам цитоскелета и далее, вероятно, в геном клетки (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003). На современном этапе в качестве основного механизма неоплазии предполагаются дефицит адгезивных взаимодействий (Бочарова О.А., 2002) и постоянно меняющиеся адгезивные свойства опухолевых клеток за счет изменений в экспрессии ими рецепторов для коллагена IV типа, ла- 51 минина, витронектина, фибронектинов, протеогликанов, кадгеринов, из суперсемейства ICAM (молекулы межклеточного прилипания), что обеспечивает инвазивный рост и метастазирование опухолей (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Hart I.R., Goode N.T., Wilson R.E., 1989). Суперсемейство иммуноглобулинов ICAM, состоящее из ICAM-1, ICAM-2 и VCAM-1, вовлекается в Т-клеточно-эндотелиальное взаимодействие. На эндотелиальных клетках они являются поверхностными лигандами (контрецептор или встречный рецептор) для интегринов LFA-1 и VLA-4. Различная регуляция экспрессии ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 играет важную роль в адгезии Т-лимфоцитов. Высокий уровень экспрессии ICAM-2 выявляется на покоящихся эндотелиоцитах, и экспрессия не усиливается при активации. Наоборот, ICAM-1 плохо выявляется на покоящихся эндотелиоцитах, а VCAM-1 просто отсутствует. При активации эндотелия экспрессия этих молекул быстро усиливается (Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995; Шубич М.Г., Авдеева М.Г., 1997). VCAM-1 содержит либо 6, либо 7 иммуноглобулиновых доменов Н-типа и экспрессируется только после стимуляции клеток ИЛ-1, ФНОά или эндотоксином. Контррецептором для VCAM-1 является VLA-4-интегрин, найденный на лимфоцитах, моноцитах, эозинофилах (Шубич М.Г., Авдеева М.Г., 1997; Lobb R.R., 1992). VCAM-1 обладает селективной лейкоцитарной адгезией, обеспечивая накопление моноклеарных клеток в процессе смены острой фазы воспаления на хроническую (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Шубич М.Г., Авдеева М.Г., 1997). Дефицит гистонеспецифических молекул адгезии, с одной стороны, ведет к ослаблению контактных взаимодействий опухолевых клеток, а с другой стороны — к усилению мембранной экспрессии на опухолевых клетках молекул адгезии к субстрату, например, из семейства интегринов (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Бочарова О.А., 2002). Данные изменения приводят к недостаточности взаимодействия молекул из суперсемейства ICAM c их лигандами, обеспечивающими в норме прикрепление иммунных эффекторов к 52 клеткам-мишеням, сводя к минимуму элиминацию опухолевых клеток макрофагами, нейтрофилами, NK-клетками, цитотоксическими лимфоцитами (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Бочарова О.А., 2002), что приводит к экранированию опухолевых клеток от противоопухолевого иммунного надзора. Усиление мембранной экспрессии адгезивных молекул на опухолевых клетках сопровождается формированием собственной сосудистой сети опухоли через индукцию экспрессии VCAM-1 (Бочарова О.А., 2002). Ослабление межклеточной адгезии в тканях является специфичным свойством опухолевого роста (процесс с увеличением клеточной массы ткани), при патологии другого генеза с потерей клеточной массы органа (воспаление, деструктивные процессы), характеризуется увеличением клеточной адгезии и соответственно повышением экспрессии молекул LFA-1, ICAM-1, ICAM-2 в ответ на медиаторы воспаления (противовоспалительные цитокины, гормоны, инфекции). Данный процесс сопровождается увеличением хелперно-супрессорного (СD4/СD8) соотношения, активацией NK-клеток, макрофагов, нейтрофилов. Подавление повышенной экспрессии этих молекул с помощью моноклональных антител, а также глюкокортикоидов и кортикостероидов приводит к терапевтическому эффекту, снижая степень воспалительной реакции. При спонтанной регрессии злокачественной опухоли на мембранах ее клеток определена повышенная экспрессия ICAM-1 при множественной инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами (Бочарова О.А., 2002). Высокий уровень экспрессии VEGF является неблагоприятным прогностическим признаком для РШМ, однако не отмечена корреляция между экспрессией VEGF и стадией болезни или дифференцировкой опухоли (Швец Н.А., Зайратьянц О.В., 2006). Новообразование сосудов, сопутствующее опухолевому росту, является одним из важнейших факторов, регулирующих процессы пролиферации и влияющих на регрессию злокачественных новообразований (Дикштейн Е.Н., Василенко И.В., Данильченко С.А. и др., 1990; Зербино Д.Д., Дмитрук И.М., 1983; Козлов Д.В., Зорин Н.А., Голубев О.А., 1996). В последнее время получены дан- 53 ные о существовании интерстициальных пространств, которые объединяют совокупность клеточных и неклеточных элементов соединительной ткани, расположенных между сосудистыми звеньями МЦР и рабочими клетками органов (Куприянов В.В., Караганов Я.Л., Козлов В.И., 1975; Бобрик И.И., Черкасов В.Г., Шевченко Е.А., 1989). Основное назначение системы микроциркуляции — создание сбалансированного транспорта веществ через стенку сосудов, соответствующего функциональным потребностям органа. Комплекс мембранных элементов, располагающихся на границе между кровью и клетками паренхимы органа, получил название гистогематического барьера (Шахламов В.А., 1971). Основная функция его — проницаемость, которая находится под контролем нервной системы. Нервный контроль осуществляется по бессинаптическому («диффузный синапс») принципу за счет нервных терминалей различной медиаторной природы (Aroesty J., Gross J., 1970; Dewhirst M.W., Vinuya R.Z., Ong E.T. et al., 1992). Физиологически активные вещества по действию на МЦР делят на: регуляторы системного действия — нейромедиаторы (норадреналин, адреналин, ацетилхолин), гормональные (половые гормоны) и регуляторы местного действия — гистамин, серотонин, брадикинин, простагландины (Гедеванишвили И.Ю., 1967; Писарев А.А., 1981). Половые гормоны изменяют проницаемость капилляров, активизируют поверхность эндотелиоцитов. Ангиогенным стимулом в опухолевой ткани являются различные гуморальные факторы, которые продуцируются как клетками опухоли (гепарин-связанные факторы роста эндотелия, активаторы плазминогена), так и лимфоцитами (Peoples G.E., Blotnick S., Takahashi K. et al., 1995), макрофагами (Hildenbrand R., Dilger I., Horlin A., Stutte H.J., 1995-1, 2), тучными и эндотелиальными клетками. Гистамин, серотонин способствуют неоваскуляризации, протеазы разрушают базальную мембрану (Козлов Д.В., Зорин Н.А. и др., 1996; Ганусевич И.И., 2010). Гепарин, присутствующий на эндотелиоцитах, является промотором ангиогенеза (Peoples G.E., Blotnick S., 1995). К медиаторам ангиогенеза относится простагландин Е1, который продуцируют лимфоциты (Gullino P.M., 1981), макрофаги, эндотелиоциты и 54 тучные клетки (Gullino P.M., 1995). Макрофаги и опухолевые клетки способны вырабатывать урокиназный активатор плазминогена, что приводит к формированию клеток сосудов (Hildenbrand R., Dilger I., Horlin A., Stutte H.J., 1995). Кроме неоваскуляризации и ангиоинвазии урокиназный активатор плазминогена может активировать опухолевую прогрессию и метастазирование. Дефект сосудистой стенки, вызванный действием урокиназного активатора плазминогена, с одной стороны, может стимулировать пролиферацию эндотелиоцитов с формированием новых микрососудов, а с другой — обеспечивать место инвазии опухолевых клеток (Hindelbrand R., Dilger I., Horlin A., Stutte H.J., 1995-1). Система кровообращения злокачественных опухолей характеризуется неполной зрелостью, атипией и полиморфизмом. Она включает внесосудистое звено, представленное псевдососудами — примитивными тканевыми каналами и щелями, ограниченными опухолевыми клетками, и сосудистое звено, в котором выделены микрососуды типа протокапилляров, капилляров, синусоидов, венул, различающихся по структурным характеристикам и степени зрелости (Балонина Н.В., Шехонин В.П., 1946; Бобро Л.И., 1973; Габуния У.А., Цагортин З.Г., 1974; Дикштейн Е.Н., Василенко И.В., Данильченко С.А. и др., 1990; Жданов Д.А., Этинген Л.Е., Ахмедов Б.П., 1974). Следует отметить, что отсутствие эндотелиальной выстилки, базальной мембраны и прочих компонентов, обеспечивающих структурно-функциональную полноценность гистогематического барьера, исключает возможность иннервации подобных структур, избирательного транспорта веществ, необходимых для специализированных функций паренхимы, что является одним из условий для клеточного атипизма (Козлов Д.В., Зорин Н.А., Голубев О.А., 1996; Бобро Л.И., 1973). В работах по изучению иннервации злокачественных образований влагалищной порции шейки матки было выявлено, что в тканях инвазивных плоскоклеточных раков отмечались изменения в гистоархитектонике, распределении вегетативных нервных терминалей (ВНТ) и степени восприятия красителя (использовались метод Falck для выявления катехоламинсодержащих ВНТ и Kar- 55 novsky-Roots для выявления холинсодержащих ВНТ). Адренергические нервные терминали (АНТ) были представлены единичными пучками слабо люминесцирующих нервных волокон с неравномерным распределением медиатора по их ходу. В непосредственной близости от сосудистого компонента адренергические, нервные волокна встречались редко. Холинэргические нервные терминали (ХНТ) были представлены немногочисленными нервными волоконцами, хаотично расположенными в строме. Распределение ацетилхолинэстеразы по ходу волокон было неравномерным, отмечался глыбчатый распад ХНТ. Они часто выявлялись рядом с сосудами МЦР. Клеточный состав вокруг ВНТ в тканях инвазивных плоскоклеточных раков характеризовался увеличением количества фибробластов (что свидетельствует об идущих процессах стромообразования), лимфоцитов, плазмоцитов и эндотелиальных клеток. Вне зоны опухоли (контрлатеральная зона ШМ) АНТ сохраняли свое гистологическое строение, количество их было умеренным. АНТ имели вид тонких нитей изумрудно-зелѐного цвета. АНТ выявлялись вблизи сосудов и вплотную подходили к эпителиальному компоненту. ХНТ выявлялись в виде крупных стволов с высоким содержанием ацетилхолинэстеразы и окрашивались в коричневый цвет. Местами распределение ацетилхолинэстеразы по ходу волокон было неравномерным. Холинергические нервные структуры были обнаружены вблизи не только сосудистого компонента, но и паренхиматозного. В непосредственном окружении от ВНТ были следующие клеточные популяции: фибробласты, клетки паренхимы, фиброциты, эндотелиоциты, лимфоциты, плазмоциты, макрофаги (Бехтерева И.А., Доросевич А.Е., Судиловская В.В., 2005-1, 2). Ангиоархитектоника злокачественных опухолей во многом зависит от гистологического типа (Сулава Т.А., 1981; Якимова Т.П., 1982), глубины инфильтративного роста (Зарецкая А.И., Лушников Е.Ф., 1982; Попов Л.Н., 1951). Следует отметить, что, независимо от пускового момента, развитие внутриопухолевых сосудов в целом однообразно. Раньше всего на опухолевый имплантант начинают реагировать венулы. Размножение опухолевых клеток начинается после 56 того, как образуются контакты между сосудистой сетью и опухолевыми клетками (Жданов Д.А., Этинген Л.Е., Ахмедов Б.П., 1974; Сулава Т.А., 1981). С увеличением объема новообразования отмечается снижение объема сосудистого русла, митотическая активность и жизнеспособность клеток падает с увеличением расстояния от стенки ближайшего сосуда (Габуния У.А., Цагортин З.Г., 1974; Зарецкая А.И., Лушников Е.Ф., 1982). Если в зоне опухолевого очага обнаруживаются сосуды с нормально развитой мускулатурой, они не являются новообразованными. Некоторые авторы полагают, что по мере стабилизации роста опухолевые сосуды становятся более дифференцированными. В их стенках развиваются мышечный слой и альфа-рецепторы (Field S.B., Burney I.A., Needham S. et al., 1991; Kasa P., Pakaski M., Joo F., Lajtha A., 1991). Анализ изученной литературы показал, что в неизмененной ШМ в различные возрастные периоды обнаруживается вариабельность соотношения паренхимы и стромы, проявляющаяся изменениями эпителия, клеточных и волокнистых элементов стромы, сосудов, качественными и количественными особенностями клеточного инфильтрата и распределения веществ, выявляющихся гистохимически (Деражне А.Б., 1969; Гуркин Ю.А., Иванова О.И., Павлович В.Г., 1983; Мягкова М.А., 1988; Черный А.П., Яковлева Н.И., 1990; Царева Н.В., 1998; Хмельницкий О.К., 2004). По мере нарастания катаплазии происходит увеличение ангиогенеза (Сулава Т.А., 1981; Козлов Д.В., Зорин Н.А., Голубев О.А., 1996; Lenczewski A., Terlikowski S., Famulski W. et al., 2001; Tjalma W.A., Weyler J.J., Bogers J.J. et al., 2001). В ряде работ, посвященных васкуляризации шейки матки при различной патологии, такой как деформация и гипертрофия ШМ, которые, как известно, нередко сочетаются с эндоцервикозом, лейкоплакией, ВПЧ-поражениями, отмечено, что кровеносные сосуды подвергаются выраженной перестройке и нередко сопровождаются образованием ангиоматозных гнезд. Последние представляют собой растянутые и переполненные кровью синусоидные вены, располагающиеся по ходу артерий, либо состоят из широких вен и полнокровных синусоидных вен с тонкими стенками (Мягкова М.А., 57 1988). При электронной микроскопии Т.О. Холодная, И.С. Дерижанова (2007) проследили ангиогенез при ПВИ. Вначале происходит размножение и выпячивание эндотелиальных клеток внутрь сосуда и кнаружи от базальной мембраны, далее между ними появляются узкие щели и каналы. Сопряженная пролиферация эпителиоцитов и эндотелиоцитов приводит к образованию своеобразных сосудисто-эпителиальных розеток в эпителиальном пласте, представляющих очень характерный морфологический признак ПВИ. Они могут прогрессировать или подвергаться регрессии. При раках количество их резко увеличивается, отмечается выраженный атипизм эндотелиоцитов, окруженных полиморфными опухолевыми клетками, в которых имеется положительная реакция с АТ к мутантному гену р53. При ИГХ исследовании антигены вируса HPV, значительная пролиферативная активность выявлялись как в эпителиоцитах, так и эндотелиоцитах капилляров, что свидетельствует об общности патогенеза их изменений. Сочетание пролиферации эпителиоцитов и сосудов лежит в основе патогномоничного для ПВИ признака — формирования кондилом, которые могут быть экзофитными (остроконечная кондилома), плоскими и инвертированными. Морфологически можно выделить прогрессирующую и стационарную форму ПВИ шейки матки. Стационарная форма чаще всего наблюдается у пожилых женщин или после лечения. Она характеризуется слабо выраженной воспалительной реакцией в субэпителиальных отделах слизистой оболочки, койлоцитозом, некоторым утолщением многослойного плоского эпителия со слабо выраженной базальноклеточной гиперактивностью. Прогрессирующие формы ПВИ характеризуются выраженными альтеративными и воспалительными изменениями в слизистой оболочке ШМ, часто осложняются образованием истинных эрозий и железистых псевдоэрозий, присоединением вторичной инфекции вследствие блокады местного иммунитета. Таким образом, ПВИ значительно ухудшает течение таких состояний, как истинная эрозия, железистая псевдоэрозия, обусловливая их хронизацию и развитие грубых морфологических изменений в виде кондилом, резко выраженного пара- и гиперкератоза МПЭ, формирования лейкоплакий, ретенци- 58 онных кист. Выявленные ЦИН составили 55,4% к общему числу наблюдений, среди них 1-й степени — 19,02% наблюдений, 2-й — 28,8%, 3-й — 7,6% случаев. ЦИН 2-й и 3-й степени чаще выявляются в инвертированных кондиломах и при заживлении эрозий. При ИГХ исследовании в эпителиальном пласте происходило увеличение содержания клеток с положительной реакцией на Ki-67. В базальных отделах появлялись клетки, содержащие мутантный ген р53 в ядрах. По-видимому, размножающиеся клетки при регенерации являются местом наименьшего сопротивления для трансформирующего воздействия вируса. Именно здесь создаются условия для развития рака (Дерижанова И.С., Гамалеева Т.О., 1999; Пименова В.В., Холодная Т.О., 2005; Холодная Т.О., Дерижанова И.С., 2007). Известно, что пролиферативная активность опухолевых клеток зависит от их близости к кровеносному руслу, при этом пролиферация эндотелия происходит значительно быстрее, чем в нормальных тканях (Ушморов А.Г, Александров В.А., 1989). Ангиогенез в условиях опухолевого роста идет непрерывно. Новообразованные сосуды анастомозируют только с функционирующими микрососудами (Ярыгин М.Е., Николаева Т.Н., Кораблев А.В., 1993). Ангиогенез в опухоли может протекать несколькими путями: 1) прямым, обусловленным ангиогенными факторами, которые выделяются опухолевыми клетками, что приводит к образованию «сосудистого ободка», который располагается по периферии опухоли; 2) непрямым — через стимуляцию клеток стромы (макрофагов и эндотелиоцитов), вызывающим усиление стромальной васкуляризации (Engels K., Fox S.B., Whitehouse R.M., Gatter K.C., Harris A.L., 1997). Клетки опухоли выделяют целую группу полипептидных ангиогенных факторов, таких как факторы роста фибробластов (основной bFGF и кислый αFGF), эпидермальный ростовой фактор (EGF), трансформирующие ростовые факторы (TGFά и TGF1), фактор некроза опухоли (TNFά), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбоцитарный ростовой фактор клеток эндотелия (PD-ECGF), ангиогенин, ИЛ-8 и др. (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Карамыше- 59 ва А.Ф., 2004; Rissau W., 1997). Однако не все из указанных факторов являются специфичными для клеток эндотелия. Они могут стимулировать размножение и других типов клеток. Наиболее важными считаются bFGF, aFGF, которые высокоэффективны в отношении стимуляции пролиферации клеток сосудов эндотелия in vitro и индукции ангиогенеза in vivo. Для них характерна выраженная аффинность к гепарину (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Карамышева А.Ф., 2004). VEGF отводится ключевая роль в ангиогенезе опухолей. Он является сильным митогеном клеток эндотелия сосудов, при этом, очевидно, не обладает заметной митогенной активностью в отношении других типов клеток (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Карамышева А.Ф., 2004; Folkman J., 1990). VEGF вызывает миграцию клеток эндотелия, их инвазию в коллагеновый гель и образование трубчатых структур, также он повышает проницаемость сосудов. Действием именно этого фактора обусловлена повышенная проницаемость опухолевых сосудов (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Карамышева А.Ф., 2004; Folkman J., 1990). Действие данных факторов вызывает врастание капилляров в опухоль из окружающих «нормальных» тканей. Нарушение межклеточных и стромально-паренхиматозных взаимоотношений в опухолевой ткани на фоне измененного ЭЦМ приводит к развитию неполноценных сосудов капиллярного типа с прерывистой базальной мембраной и нарушенной эндотелиальной выстилкой (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003). VEGF экспрессируется клетками большинства солидных опухолей. Повышенная его экспрессия обнаружена в карциномах легкого, щитовидной железы, молочной железы, желудка, толстого кишечника, почки, мочевого пузыря, яичника и шейки матки и др. опухолях человека (Senger D.R., Van De Water L., Brown L.F. et al., 1993; Ferrara N., 1995; Martiny-Baron G., Marme D., 1995; Terlikowski S., Lenczewski A., Sulkowska M. et al., 2001). Высокая прогностическая значимость степени выраженности ангиогенеза продемонстрирована для многих опухолей, включая рак шейки матки. Было показано, что высокая экспрессия та- 60 ких факторов, как сосудистый эндотелиальный фактор (тимидин-фосфорилаза), сопровождается большей инвазией, развитием метастазов и неблагоприятным исходом заболевания (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2004). Нарушение баланса между этими системами отражают изменения паренхиматозно-стромальных взаимоотношений, следовательно, каждому этапу морфогенеза новообразований должны соответствовать определенные изменения в системе эпителий — строма, кульминацией которых является злокачественная опухоль (Доросевич А.Е., 1987). 1.4. Иммуногистохимическая характеристика предрака и рака шейки матки и их прогностическое значение В шейке матки развиваются различные по происхождению и морфологии опухоли. Среди них на долю плоскоклеточного рака приходится от 67,7% до 90%, железистого рака — от 5% до 22,2%, низкодифференцированного рака — от 5% до 10%. Редко встречаются мукоэпидермоидный рак и мезонефроидная аденокарцинома. Разнообразие гистологических форм РШМ связано с различными источниками их происхождения: многослойным плоским эпителием экзоцервикса, призматическим эпителием и его резервными клетками в эндоцервиксе, эпителием гартнерова хода (Бахидзе Е.В., Косников А.Г., Максимов С.Я., 1996; Пальцев М.А., Аничков Н.М., 2005). При раке, возникшем на фоне ПВИ, имеются своеобразные морфологические изменения: мультицентричный рост на фоне тяжелой дисплазии, значительная васкуляризация атипичного эпителия с выраженной пролиферацией эндотелиоцитов и усиленным новообразованием сосудов, койлоцитарная атипия, интенсивная положительная реакция на мутантный ген р53 в ядрах клеток (Холодная Т.О., Дерижанова И.С., Пименова В.В., 2006). 61 В литературе активно обсуждается вопрос о происхождении плоскоклеточного рака шейки матки из двух источников: базальных клеток эктоцервикса и резервных клеток призматического эпителия цервикального канала (Яковлева И.А., Кукутэ Б.Г., 1979; Яковлева И.А., Черный А.П., Ботнарь Э.Р., 1981; Петров С.В., Райхлин Н.Т., 1992), но имеется и другая точка зрения, что все плоскоклеточные РШМ имеют резервноклеточный генез (Vooijs G.P., 1991). Однако в работе Д.Г. Силагадзе с соавт. показано, что плоскоклеточные РШМ экспрессируют в цитоплазме базальноклеточный антиген (БКАГ), который обнаруживается уже на 8–9-й неделе в однослойном эмбриональном эпидермисе, а на 16-й неделе, когда все слои многослойного плоского эпителия сформированы, БКАГ выявляется исключительно в цитоплазме клеток базального слоя (Силагадзе Д.Г., Белецкая Л.В., Челедзе П.В. и др., 1987). Анализ изученной литературы позволяет выделить биологические особенности плоскоклеточных РШМ в зависимости от их гистогенеза. Если РШМ развивается из резервных клеток эндоцервикса, то средний возраст больных составляет около 40 лет, рост опухоли осуществляется по железам чаще в пределах ШМ, инвазия происходит крупным пластом, имеется позднее лимфогенное метастазирование, рост данного вида РШМ усиливается стимуляцией гестогенами. При развитии плоскоклеточного РШМ из базальных клеток эктоцервикса средний возраст пациенток составляет 56 лет, рост опухоли сопровождается ранним распространением за пределы ШМ, инвазия в строму у эктоцервикального плоскоклеточного РШМ имеет гнездный характер и раннее лимфогенное метастазирование, рост данного типа РШМ стимулируется эстрогенами. Также имеется разная чувствительность этих опухолей к облучению радиоактивными веществами (Марьина Л.А., Чехонадский В.Н., Нечушкин М.И., Киселева М.В., 2004) и при одинаковой стадии инвазивного рака рекомендуется различная хирургическая тактика. Так, при эндоцервикальном (резервноклеточном, метапластическом) раке выполняется простая экстирпация, а при истинном плоскоклеточном 62 (эктоцервикальном) раке — радикальная гистерэктомия (Петров С.В., Райхлин Н.Т. и др., 1996). Следует отметить иммуногистохимическую неоднородность нормальной эпителиальной выстилки влагалищной порции шейки матки в эмбриональном периоде. Так, в 20–26 недель развития эпителий шейки матки эмбриона отличается от дефинитивного эпителия экспрессией ЦКР № 17 в цилиндрических клетках эндоцервикса и в базальных клетках плоского эпителия влагалища, экспрессией ЦКР № 8 в супрабазальных слоях эктоцервикса, отсутствием в последнем ЦКР № 1, 2, 10 (Петров С.В., Райхлин Н.Т. и др., 1996). В ряде работ при иммуногистохимическом исследовании было отмечено, что набор ЦКР в эктоцервиксе вблизи стыка с эндоцервиксом отличался от такового в эктоцервиксе, который располагался рядом с влагалищным сводом. Если в первом случае ЦКР № 1, 10 выявлялись в поверхностном слое слабо, то во втором — значительно сильнее. В стыковой зоне в базальных клетках эктоцервикса спорадически отмечалась экспрессия ЦКР № 8, однако вблизи влагалищного свода он не выявлялся. Для призматического эпителия эндоцервикального канала характерна экспрессия ЦКР № 8, 18 (Петров С.В., Райхлин Н.Т. и др., 1996). Резервные клетки экспрессируют как ЦКР № 8, 18, которые характерны для однослойных эпителиев, так и ЦКР № 1, 2, 5, 6, 10, 14, 17, специфичные для переходного, неороговевающего и ороговевающего плоского эпителия (Петров С.В., Райхлин Н.Т. и др., 1996; Moll R., Franke W., Schiller D. et al., 1982; Moll R., Levy R., Czernobilsky B. et al., 1983). При иммуногистохимическом методе исследования в базальном и парабазальном слоях выявляются ЦКР № 5 и 14 (Петров С.В., Райхлин Н.Т. и др., 1996), в промежуточном и поверхностном слое был выявлен ЦКР № 1, 2 и 10 (Петров С.В., Райхлин Н.Т., и др., 1996). Иммуногистохимический анализ выявил существенные различия иммуногистохимических фенотипов эктоцервикального и эндоцервикального рака. При истинном плоскоклеточном раке определялась экспрессия ЦКР многослойного 63 плоского эпителия (№ 1, 2, 10, 14), но была негативной реакция на РЭА (раковый эмбриональный антиген) и к ЦКР № 8, 17. Для метапластического плоскоклеточного рака был характерен высокий уровень экспрессии ЦКР № 8, 17, но негативная реакция с ЦКР № 1, 2, 10, 14 и с РЭА. Кроме того, как показали исследования G. Dallenbach-Hellweg и G. Lang (1990), клетки резервноклеточного плоскоклеточного рака содержали геном ВПЧ 16-го и 18-го типов, в то время как эктоцервикальные раки в большинстве случаев либо негативны на HPV, либо содержали HPV 6-го или 11-го типа. Возможно, это связано с тем, что резервные клетки слизистой оболочки эндоцервикса являются клетками-мишенями для HPV-инфекции (Петров С.В., Райхлин Н.Т. и др., 1996; Smedts F., Ramaekers F., Trojanovsky S.M. et al., 1992; Moll R., Franke W., Schiller D. et al., 1982; Moll R., Levy R., Czernobilsky B. et al., 1983). В работах С.В. Петрова с соавт. (1994) выявлено, что в базальных клетках нормального эктоцервикса отмечалась цитоплазматическая экспрессия белка c-ras(pan) и слабая реакция на белок ets2. Клетки промежуточного и поверхностного слоев не экспрессировали исследованных онкобелков. Резервные клетки эндоцервикса имели ядерную реакцию с антителами к онкопротеинам р53, c-fos, а также цитоплазматическую экспрессию к c-ras. Результаты исследований свидетельствуют об увеличении экспрессии онкобелков myc, fos, ets2, р53, ras в метапластическом плоском эпителии, в участках дисплазии и опухолях по сравнению с нормальными тканями шейки матки. В группах наблюдений с тяжелыми дисплазиями и раком in situ экспрессия различалась. Однако иммуногистохимический анализ белка с-mус выявил его качественные отличия: цитоплазматическую локализацию при тяжелой дисплазии и ядерное окрашивание в раке in situ. Мелкоклеточный рак характеризовался высокой интенсивностью экспрессии данных онкобелков. В ряде работ отмечено, что избыточная экспрессия онкобелка c-myc способствует развитию РШМ, устойчивого к лучевой терапии, и экспрессия c-erb2 коррелировала с радиорезистентностью опухоли и низкой выживаемостью пациенток (Швец Н.А., Зайратьянц О.В., 2006). В то же время имеются различия в экспрессии онкопро- 64 теинов в истинном плоскоклеточном (эктоцервикальном) и метапластическом (резервноклеточном или эндоцервикальном) плоскоклеточном раке. В первом случае экспрессия онкобелков с-fos, c-ets2, p53, src была существенно ниже, чем во втором. Анализ экспрессии онкогенов на разных этапах развития опухоли, в частности, при начальном (стадия Iа) и далеко зашедшем (стадии Iб — 3) раке, показал увеличение экспрессии онкогенов ets2, p53 и с-mус, в то время как изменения остальных онкобелков были незначительными. Видимо, в плоскоклеточных вариантах рака шейки матки активация этих онкогенов сопровождает прогрессию опухоли. Имела место синхронизация экспрессии mус- и rasонкопротеинов в ряде инвазивных форм рака различного гистологического типа и стадии развития. Вероятно, неблагоприятное течение ракового процесса может быть связано с низким уровнем (до начала лечения) экспрессии большинства онкобелков (Петров С.В., Мазуренко Н.Н., Сухова Н.М. и др., 1994). До настоящего времени неясно, каким образом предраковые изменения тканей шейки матки переходят в рак. E. Sheets и соавт. изучили процесс расщепления хроматина как показатель апоптоза и нашли, что его индекс при переходе предопухолевого состояния тканей ШМ к опухоли значительно снизился (p < 0,001): 3,5 ± 0,4% в нормальном эпителии, 4,8 ± 0,4% при слабовыраженной дисплазии плоского эпителия, 1,4 ± 0,4% при выраженной дисплазии и 0,4 ± 0,1% при плоскоклеточном раке. По сравнению с нормальным эпителием общее число клеток на 10 мм2 площади ткани значительно увеличилось (p < 0,001): 124 ± 12 в нормальном эпителии, 162 ± 9,7 при слабовыраженном повреждении плоского эпителия, 315 ± 31 при выраженном его повреждении и 413 ± 32 при плоскоклеточном раке. Авторы считают, что усиление атипии клеток ШМ связано со снижением активности апоптоза (Sheets E.E., Crum C.P., Yeh J., 1996; Sheets E.E., Yeh J., 1997). В ряде работ исследовали зависимость между гипоксией и апоптозом на эпителиальных клетках человека, экспрессирующих онкопротеины HPV-16. In vitro гипоксия стимулировала индукцию p53 и апоптоз в первичных эпителиальных клетках ШМ с генами HPV E6 и E7, но не с фибробластами ШМ, 65 инфицированными E6 и E7. Линии клеток HPV-зависимого плоскоклеточного РШМ человека были менее чувствительны к апоптозу, вызванному гипоксией, вероятнее всего, за счет приобретенных дополнительных генетических изменений, которые снизили чувствительность к апоптозу (Kim C.Y., Tsai M.H., Osmanian C. et al., 1997). В работах Y. Shoji с соавт. изучалась роль апоптоза в развитии РШМ (исследовались интраэпителиальная неоплазия, микроинвазивная карцинома и инвазивная плоскоклеточная карцинома) и клеточная пролиферация. Выявлена значительная положительная корреляция между степенью гистологической злокачественности при интраэпителиальной неоплазии и степенью инвазии опухоли в строму. Апоптоз при злокачественной неоплазии шейки матки может быть тесно связан с дифференциацией и прогрессированием злокачественных клеток. Однако не представляется вероятным, что HPV сам по себе имеет прямое отношение к путям управления апоптозом (Shoji Y., Saegusa M., TakanoY. et al., 1996). С целью оценки неопластических изменений в эпителии шейки матки H. Furuya и соавт. (Furuya H., Yabushita H., Noguchi M., Nakanishi M., 1995) исследовали популяции клеток в состоянии апоптоза и на фоне пролиферативных циклов в нормальном и диспластическом эпителии, при карциноме in situ и при инвазивной карциноме. Относительное содержание клеток в состоянии апоптоза снижалось по мере прогрессирования процесса и было максимально низким при карциноме in situ. При дисплазии этот показатель был выше. Наоборот, относительное содержание клеток в цикле пролиферации повышалось по мере прогрессирования процесса и было выше при дисплазии, чем в норме (Фролова И.И., Мастергази Г.М., Радзинский В.Е., 2002). Отмечается наличие положительной корреляции между степенью лучевого патоморфоза и хорошим прогнозом при РШМ и экспрессией bax, а отрицательной — с экспрессией Bcl-2 (Швец Н.А., Зайратьянц О.В., 2006). По данным M. Ueda, в культуре клеток рака шейки матки (ОМС-1 плоскоклеточный рак и ОМС-4 аденокарцинома) после внутривенного введения 5-фторурацила в дозе 0,1–10 мг/мл наступила дозозависимая ингибиция числа живых 66 клеток и повышение поглощения 6-3H-дезоксиуридина в ДНК (Ueda M., Kumagai K., Ueki K. et al., 1997). Эти результаты хорошо коррелируют с показателями апоптоза клеток, определяемого in situ методом TUNEL. Авторы наблюдали фрагментацию ДНК в клетках при экспозиции с 10 мг/мл препарата. Флоуцитометрический анализ показал, что экспрессия Fas антигена клетками повышается при инкубации с 10 мг/мл 5-фторурацила. Более того, TUNEL срезов тканей резецированной матки показал, что апоптоз появляется более часто у больных, леченных до операции 5-фторурацилом по 500 мг/м2 в сутки в течение 8 дней, по сравнению с больными, не получавшими препарат. Эти данные указывают, что достигаемый терапевтический уровень препарата тормозит рост клеток и синтез ДНК и приводит к гибели апоптозных клеток. Однако остаются неизученными отношения между вызванным 5-фторурацилом апоптозом и системой Fas ligand/Fas. В литературе отмечается прямая корреляция между экспрессией р53, Ki-67, pl61NK4a и тяжестью патологических изменений эпителия (Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., Минкина Г.Н. и др., 2005). В результате иммуногистохимических исследований обнаружено, что при всех степенях дисплазии число клеток, положительно реагирующих на Ki-67, определенно увеличивалось по сравнению с нормой. Микроскопически при этом формировались два типа структур. В одних случаях очаги дисплазии (независимо от их степени) имели изолированногнездный вид и были отделены друг от друга участками эпителия, в которых Ki-67-положительные клетки находились только в парабазальном слое. В других случаях, которые встречались реже, число клеток с Ki-67-положительными ядрами постепенно нарастало. Такие клетки выявлялись в самых разных слоях эпителия, в основном в очагах дисплазии. В работах Г.М. Волгарева с соавт. (2002) было выявлено, что по мере нарастания степени дисплазии увеличивалось количество Ki-67-позитивных клеток. Так, при дисплазии I степени число клеток с Ki-67-позитивными ядрами составляло от 10 до 30%, преимущественно они располагались в парабазальном 67 слое, при дисплазии II степени — 30–50% при этом нарастало число Ki-67позитивных ядер в разных слоях эпителия. При дисплазии III степени частота клеток с Ki-67-положительными ядрами была от 50 до 90%. При этом положительно реагирующие клетки выявлялись во всех слоях эпителия. Авторы также отмечали, что в цервикальных железах с признаками эпидермизации пласты МПЭ, выстилающие просвет желез, были позитивны по Ki-67 — в 20–50% всей клеточной популяции. Наружные пласты МПЭ содержали до 100% Ki-67noложительных клеток. При микроинвазивном РШМ почти все ядра были Ki-67-позитивными. По мере нарастания инвазии Ki-67-положительные клетки чередовались с прослойками опухолевых клеток, содержащих Ki-67-отрицательные ядра. Ki-67-положительные ядра обнаружены и во многих лимфогистиоцитарных элементах и в стенке кровеносных сосудов. Экспрессия белка pl6INK4a при дисплазии разной степени тяжести была также различной. При дисплазии I степени тяжести реакция была слабой и отмечена авторами только в клетках базального и шиповатого слоев эпителия. При дисплазии II степени реакция наблюдалась в клетках нижних 2/3 МПЭ. Реакция была цитоплазматической. Дисплазии III степени в основном характеризовались интенсивной смешанной реакцией без вовлечения клеток наружного слоя эпителия. Экспрессия pl6INK4a наблюдалась в койлоцитах. Реакция на pl6INK4a в акантотических тяжах была смешанная, но в акантотических структурах с инвазией наблюдалось усиление экспрессии. Уменьшение интенсивности реакции наблюдалось в клетках с признаками ороговения. Отрицательной иммунореактивностью к pl6INK4a характеризовались клетки в составе «раковых жемчужин» в инвазивном РШМ. Как отмечают авторы, при сравнении особенностей экспрессии Ki-67 и pl6INK4a в одних и тех же структурах примерно в половине случаев отмечено совпадение результатов иммуногистохимических реакций на Ki-67 и pl6INK4a (одинаковая экспрессия обоих маркеров в количественном и качественном отношении в тех или иных клеточных группах, в одних и тех же структурах). Без- 68 условно, буквальное совпадение результатов иммуногистохимической окраски на Ki-67 (белок, свидетельствующий о нахождении клетки в определенных фазах цикла) и на pl6INK4a (белок, указывающий на активацию онкопротеинов Е6 и Е7) сложно установить (Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Франк Г.А. и др., 2002; Козаченко А.В., 2006; Gisela D.H., Marcus J.T., Magnus K.D., 2004). В качестве критериев предраковых изменений многослойного плоского эпителия шейки матки рассматривается пролиферативная активность, изученная с помощью моноклональных антител РС-10 к антигену ядер пролиферирующих клеток (PCNA). Иммуногистохимический анализ показал, что слабая реакция (окрашено до 25% ядер) наблюдалась при низкой степени плоскоклеточного интраэпителиального поражения (Н-ПИП), при этом экспрессия наблюдалась только в базальном слое многослойного плоского эпителия. Умеренная экспрессия PCNA (окрашено от 38,8% до 49% всех ядер) наблюдалась при высокой степени плоскоклеточного интраэпителиального поражения (В-ПИП), позитивно окрашенные ядра наблюдались в парабазальном и базальном слое МПЭ. Высокий уровень экспрессии PCNA встречался при В-ПИП, при этом позитивно окрашенные ядра выявлялись по всему эпителиальному пласту (Манухин И.Б., Минкина Г.Н., Франк Г.А. и др., 1997). В ряде зарубежных работ выявлена значительная корреляционная зависимость между типом ВПЧ и пролиферативным индексом. Последний был значительно выше при наличии 16-го и 18-го типов ДНК ВПЧ (Park T.W., Kim S.N., 1996; Maeda M.Y., Simoes M., Wakamatsu A. et al., 2001). В литературе последних лет уделяется много внимания экспрессии различных молекулярных онкобелков, их прогностическому значению, а также резистентности РШМ к лучевой и химиотерапии. Так, Н.Л. Чазова с соавт. обнаружила, что высокая экспрессия р53 до начала лечения сопровождается более низким терапевтическим эффектом, и наоборот, отсутствие экспрессии сопровождается выраженным терапевтическим патоморфозом. Высокий уровень экспрессии PTEN свидетельствует о высоком эффекте от проводимой терапии, при- 69 чем интенсивность экспрессии после проведения лечения может возрастать. Большинство плоскоклеточных карцином ШМ до начала лечения отличаются высокой экспрессией pl6INK4a. При выраженном посттерапевтическом патоморфозе интенсивность экспрессии pl6INK4a снижается и отсутствует в клетках с выраженным патоморфозом. Авторы предполагают, что опухолевые клетки с интенсивной ядерной экспрессией pl6INK4a у пациенток с предоперационной терапией могут стать источником местного рецидива. Высокая экспрессия СОХ-2 коррелирует с низкой степенью терапевтического патоморфоза (Чазова Н.Л., Берщанская А.М., Мельникова Н.В., Швец Н.А., 2007). Независимо от гистологического варианта РШМ выраженным лучевым патоморфозом, высокой радиочувствительностью и благоприятным прогнозом при лучевой терапии обладают опухоли с низкой экспрессией р53, VEGF, bax и высокой экспрессией c-erB2 и bcl-2 (Швец Н.А., Зайратьянц О.В., 2006). Завершая обзор литературы, необходимо подчеркнуть, что ключ к решению проблемы снижения заболеваемости РШМ находится в области профилактики, ранней диагностики, своевременного и адекватного лечения фоновых и предраковых заболеваний шейки матки. Наиболее перспективными направлениями в данной области исследований являются разработка методов ранней диагностики РШМ и поиск дополнительных маркеров, которые могут быть использованы в клинической практике как факторы, определяющие прогноз заболевания. 70 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовался операционный и аутопсийный материал от 90 женщин, было получено 180 парафиновых блоков, из которых изготовлено 3006 гистологических препаратов. Весь исследуемый материал был разделен на три группы. Возраст больных от 18 до 55 лет. Первая группа представлена тканью интактной шейки матки: передняя губа — 30 случаев и задняя губа — 30 случаев, материал забирался у женщин, скончавшихся от травм и острых отравлений. Вторая группа — ткань шейки матки после электроконизации, производившейся пациенткам в виде расширенной биопсии или лечебной эксцизии по поводу ВПЧ поражения шейки маки или ЦИН различной степени. Забиралась ткань ШМ с признаками поражения вирусом папилломы человека — 30 случаев, контралатеральная зона ткани шейки матки вне зоны поражения — 30 случаев. В данной группе наблюдений перед электроконизацией ШМ проводилось скрининговое обследование (кольпоскопия, биопсия ШМ, исследование на ДНК ВПЧ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45-го типов) и определение онкопротеина Е7 на ВПЧ 16-го, 18-го типов с целью подтверждения эписомальных интегрированных форм. Третья группа — ткань рака шейки матки — 30 случаев, контралатеральная зона (вне опухолевого роста) — 30 случаев. Обязательным условием было, что опухоль должна иметь размеры не более 4,0 см и быть ограничена пределами шейки матки, что в соответствии с классификацией по системе ТNM не превышает стадию pT1b1N0M0 (Виттекинд К., 2007). Данный материал забирался после проведения оперативного лечения (операция Вертгейма). Распределение по возрастам представлено в таблице 1. 71 Вырезка материала проводилась сразу после операции (при РШМ). Кусочки вырезались через всю толщу ткани из зоны опухоли и из контралатеральной зоны (КЛЗ), где макроскопически не было признаков опухолевого роста. Таблица 1 — Количественное распределение больных по возрасту и нозологическим группам Возраст Группы наблюдения 18–25 26–35 36–45 46–55 Нормальная ШМ 5 9 9 7 30 ШМ при инфекции 9 8 7 6 30 Ткань РШМ 4 8 9 9 30 Итого 18 25 25 22 90 ВПЧ Итого В случаях с поражением шейки матки ВПЧ забирался полностью весь конус, полученный при электроконизации (после электроконизации патологический очаг прошивался шовным материалом). При данной патологии вырезались также два фрагмента из патологического очага и контралатеральной зоны. При заборе материала интактной шейки матки материал вырезался не позднее чем через 6 часов после смерти. Для исследования использовался фрагмент нижней и верхней губы шейки матки. Морфологическое исследование операционного и секционного материала проводилось на парафиновых срезах. Фиксация материала осуществлялась в 10% нейтральном забуференном формалине. Затем кусочки подвергали стандартной проводке с последующей заливкой в парафин. Из полученных блоков готовили срезы 5–7 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Для идентификации и уточнения локализации сосудистых структур в препаратах срезы окрашивали пикрофуксином по ван Гизону, Габу-Дыбану (Меркулов Г.А., 1969). Обзорный морфологический анализ производили на световом микросокопе «ZEISS» с цифровой камерой. 72 Гистологическую форму опухоли устанавливали в соответствии с Международной гистологической классификацией форм опухолей ВОЗ от 2002 г. (WHO Classification of Tumours Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs, 2003). Для определения стадии использовали FIGO и категории TNM (Кратенка В.Е., Короткевич Е.А., 1998). Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах. Иммуногистохимия — это метод выявления и определения точной локализации антигена в тканях с помощью иммунологических и гистохимических реакций, в основе которого лежит реакция антиген—антитело (Dabbs D.J., 2002). Иммуногистохимическое исследование включает в себя комбинацию обязательных этапов (ингибирование эндогенной пероксидазы, демаскировка антигенов, обработка нормальной (неспецифической) сывороткой, выбор и разведение антител, инкубация срезов с антителами, промывания, визуализация результатов с помощью хромогена, контрольные реакции), содержание которых влияет на качество получаемых препаратов (Криволапов Ю.А., Леенман Е.Е., 2006). Использовались стрептавидин-биотиновый метод окрашивания и следующая панель моноклональных антител: 1. р53 (clone DO-7) — является ядерным фосфопротеином с молекулярной массой 53 kDa и состоит из 392 аминокислот. Он существует в двух вариантах — «диком» и мутированном. «Дикий» тип существует в большинстве нормальных клеток, но он имеет короткий период жизни (до нескольких минут) и поэтому с трудом выявляется при иммуногистохимическом исследовании. Мутированный тип гена р53 выявляется в 76% 212 злокачественных новообразований. 2. Ki-67 (clone Mib-1) — маркер пролиферативной активности. Он является ядерным белком, антитела к антигену Ki-67 реагируют с пролиферирующими (G1, S, M, G2 стадии клеточного цикла), но не с покоящимися клетками 73 (стадия G0), что позволяет проводить оценку в клетках опухоли. Окрашивание ядерное или ядрышковое. 3. Bcl-2 (clone124) (В-сell Lymphoma/Leukaemia-2) является онкопротеином, который блокирует апоптотическую гибель клетки (супрессор апоптоза). Bcl-2 кодируется геном, который вовлекается в хромосомную транслокацию t (14; 18) (q32; q21). В нормальной лимфоидной ткани Bcl-2 обнаруживается в малых лимфоцитах зоны мантии фолликулов, во множестве Т-клеток в Т-зонах и единичных клетках зародышевых центров. Экспрессия цитоплазматическая. 4. NK1 клетки (clone NK1) — реагируют с лимфоцитами в различных тка- нях. NK1 окрашивают большие гранулярные лимфоциты в герментативных центрах миндалины и лимфатического узла. К нему также чувствительны многие клетки не лимфоидной ткани (периферические нервы в коже, железистый эпителий матки и предстательной железы, очагово окрашивается канальцевый эпителий почек, с преимущественной локализацией в апикальной его части). NK1 также лабилен по отношению к популяции эпителиальных клеток желудка и толстой кишки, к клеткам островков поджелудочной железы, надпочечников, гепатоцитам. Позитивное окрашивание наблюдается в опухолевых клетках карциноидов, карциномах предстательной железы, астроцитомах, карциномах щитовидной железы. Негативное окрашивание в лейомиомах, саркоме Юинга, злокачественной фиброзной гистиоцитоме, рабдомиосаркоме, почечно-клеточном раке, аденокарциноме толстой кишки, мезотелиоме. 5. СD34 class II (clone QBEnd-10) является трансмембранным белком с мо- лекулярной массой около 116 kDa. Антиген гемопоэтических клеток-предшественников. В норме экспрессируется на ранних гемопоэтических клеткахпредшественниках и клетках эндотелия капилляров, на глиальных клетках нервной ткани, эмбриональных фибробластах. При опухолях кроветворной системы экспрессируется на клетках лимфобластных лимфом/лейкозов из клеток-предшественников (Т- и В-клеточных) и острых лейкозов миелоидного происхожде- 74 ния. Применяются при диагностике опухолей мягких тканей. Характерно мембранное окрашивание, эндотелий является внутренним позитивным контролем. 6. СD4 (clone RIV7) — антиген Т-лимфоцитов-хелперов и индукторов. Экс- прессируется большинством Т-клеток периферической крови и 80–90% кортикальных тимоцитов. Экспрессия мембранная. 7. СD8 (clone C8/144B) — трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 68 kDa. Антиген супрессорных/цитотоксических Т-клеток, нормальных и опухолевых. CD8 антиген экспрессирует примерно 30% периферических мононуклеарных клеток и 60–85% кортикальных тимоцитов. В норме антитела к CD8 могут метить также NK-клетки, клетки эндотелия, клетки, выстилающие синусы красной пульпы селезенки. Инфекционные и воспалительные процессы могут менять нормальное соотношение 2 : 1 между СD4+/СD8+ субпопуляциями лимфоцитов. Экспрессия мембранная. 8. СD79α (clone JCB117) является дисульфидподобным трансмембранным гетеродимером с молекулярной массой 82–95 kDA. Это пан-В-клеточный антиген. Антитело JCB117 распознает экстраклеточный эпитоп молекулы СD79α. Экспрессия СD79α возникает на стадии предшественников В-лимфоцитов и сохраняется до стадии плазматических клеток. Экспрессия цитоплазматическая (может быть мембранная), внутренним позитивным контролем служат В-лимфоциты. 9. CD138 (клон MI15) — маркер плазматических клеток. Экспрессия CD138 специфична для плазматических клеток, содержащих иммуноглобулины в цитоплазме. Антитела к CD138 дают позитивную реакцию при плазмоклеточной миеломе, лимфоплазмоцитарной лимфоме, хроническом лимфолейкозе. Среди негемопоэтических тканей антиген CD138 в норме экспрессирован на фибробластах, клетках эпителия и эндотелиальных клетках, может утрачиваться при малигнизации. Экспрессия цитоплазматическая. 75 10. СD68 (клон PG–M1) — маркер моноцитов, макрофагов и гистиоцитов. Экспрессируется в цитоплазме моноцитов, макрофагов, остеокластов и тучных клеток. CD68-позитивными могут быть также активированные Т-клетки, субпопуляция зрелых В-клеток, эпителий (в цитоплазме). Опухоли лимфоидного происхождения обычно негативны в отношении антител к CD68. Антитела к CD68 используются для выявления реактивных макрофагов в тканевых срезах в норме и при патологии и при иммунофенотипировании опухолей. Антитела к CD68 метят органеллы (лизосомы), поэтому их линейная специфичность условна. Характер окрашивания антителами — внутрицитоплазматический гранулярный или диффузный. Тканевые макрофаги являются внутренним позитивным контролем. 11. NGFR, p75 NGFR (clone NGFR5) — рецептор фактора роста нервов. NGF необходим для развития, дифференцировки и выживания нервов. Его активность связана с двумя клеточными рецепторами p140protork и p75NGFR (низкоаффинный NGFR). Для формирования высокоаффинных NGF-связанных участков требуются коэкспрессия и связывание с двумя рецепторами p140protork и p75NGFR. Моноклональное антитело NGFR5 распознает 75kD NGF рецептор p75NGFR. Антитело связывается с экстрацеллюлярным доменом рецептора и реагирует с интактным и редуцированным, а также и с денатурированным NGFR. NGFR5 определяется в тканях и человека и обезьян. Рецептор p75NGFR является членом суперсемейства рецепторов NGF/TNF. Эти рецепторы являются трансмембранными гликопротеинами и функционируют как медиаторы клеточной смерти. Функция p75NGFR еще не полностью выяснена. In vitro несвязанный p75NGFR выявляется как промотор нейрональной клеточной смерти, а связанный p75NGFR с NGF лигандом или антителом показан как ингибитор p75NGFR индуцированной клеточной смерти. В нормальных тканях клон NGFR5 определяется в нейрональных аксонах, Швановских клетках и периневральных клетках периферических нервов. Он четко выявляется в периферических нервах и чувствительных рецепторах дермы и во всех тестируемых тканях, которые имеют чувствительную и симпатическую 76 иннервацию. Позитивное окрашивание имеют адвентиция естественных кровеносных сосудов, миоэпителий молочной железы, слюнных и потовых желез, наружные клетки влагалища корешка волосяного фолликула, базальный эпителий языка и бронхиол и эпителий десны. Субпопуляция лимфоцитов селезенки, лимфатических узлов, фолликулярные дендритические клетки герментативных центров реактивных лимфатических узлов и миндалины также экспрессируют NGFR5. В опухолевой ткани NGFR5 экспрессируется в опухолях с дифференцировкой периферического нерва, феохромоцитомах, параганглиомах, меланомах. В большинстве мезенхимальных опухолей не нейрогенного происхождения (хондросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, менингиома, лейомиосаркома) экспрессия NGFR5 негативная. Иммунореактивность в карциномах вариабельна, в плоскоклеточных раках (12/16), в некоторых аденокарциномах позитивно окрашивается базальный эпителий. Адвентиция вновь образованных кровеносных сосудов в опухолевой ткани более интенсивно окрашивается по сравнению с нормальными тканями. Протокол иммуногистохимического окрашивания парафиновых срезов (стрептавидин-биотиновый метод) (LSAB2). Все используемые антитела были фирмы DAKO (Дания): 1. Срезы помещали на 30 минут в термостат при 56 °С. 2. Депарафинизация — парафин удаляли с неостывших срезов инкубацией в сменах ксилола. Длительность инкубации 5–10 минут. 3. Дегидратация проводилась в 3 сменах абсолютного спирта по 3 минуты, и промывали в дистиллированной воде. 4. Промывали в трис-буфере 10 минут. 5. Для восстановления антигенных детерминант (демаскировки антигенов) тканей перед нанесением первичного антитела срезы обрабатывали на водяной бане в течение 30–35 минут при температуре 96–98 °С. Перед началом исследования проводили пробную реакцию в зависимости от используемых антител с различными рН цитратного буфера (6,0 и 9,0) или ЭДТА 77 с рН 9,0 и выбирали оптимальное время для демаскировки антител. Данная процедура проводилась со всеми моноклональными и антителами. 6. Оставляли на 20 минут при комнатной температуре. 7. Промывали в дистиллированной воде. 8. Избыток жидкости удаляли с предметного стекла вокруг срезов при помощи салфетки и срезы обводили специальным гидрофобным карандашом. 9. 10. Ставили на 10 минут в трис-буфер. Для блокирования эндогенной пероксидазы препараты обрабатывали 3% перекисью водорода в течение 10 минут при комнатной температуре (за исключением СD4). 11. Ополаскивали в дистиллированной воде. 12. Ставили на 5–10 минут в трис-буфер. 13. Предметные стекла располагали горизонтально во влажной камере, наносили протеин-блок и инкубировали 30 минут. 14. Стряхивали протеин-блок на салфетку. 15. Далее срезы инкубировали с первичными антителами со стандартным предварительно подготовленным разведением. Перед началом исследования проводили пробную реакцию с различными сроками инкубации. 16. Срезы промывали в трис-буфере 10 минут. 17. Затем раскапывали биотин на 30 минут. 18. Срезы промывали в трис-буфере 10 минут. 19. Наносили стрептавидин на 30 минут. 20. Отмывали в трис-буфере 10 минут. 21. На следующем этапе использовали систему визуализации DAKO (Дания) — Liquid DAB Substrate Chromogen System, в качестве хромогена применяли 3,3'-диаминобензидин (ДАБ). Окрашивание под контролем микроскопа: если 5-минутная инкубация не давала необходимой интенсивности окраски, продолжали инкубацию с ДАБ от 1 до 5 минут. 22. Промывали в 3 порциях дистиллированной воды по 2 минуты. 78 23. Препараты докрашивали гематоксилином. 24. Помещали срезы в трис-буфер до восстановления ядер. 25. Препараты обезвоживали в спиртах и ксилоле и заключали в канадский бальзам. При стандартизации использовались отрицательные контроли из стан- дартного набора. Оценивались гистологические структуры, которые экспрессировали то или иное моноклональное антитело. Площадь сосудистого русла (по СD34), NGFR, CD4, CD8, CD79α, NK1 клетки определяли с помощью программы «ВидеоТест 4.0». Исследования микропрепаратов, окрашенных стрептавидин-биотиновым методом различными антителами, выполнялись на микроскопе «Axiostar plus» (Carl Zeiss, Германия), совмещенном с видеокамерой «Progres C10 Plus» (Jenoptik Jena, Германия). Документирование результатов осуществлялось при помощи компьютерной программы «ВидеоТест 4.0. Морфология», в которой были созданы методики для дифференцировки клеточных элементов и тканевых структур микропрепаратов, измерения их количества, морфологических (общая и внутренняя площадь, периметр, параметры формы и размеров) и оптических параметров (яркостные и цветовые составляющие, оптические плотности) с последующим статистическим анализом данных. При этом использовано ручное выделение масок объектов и фаз с установкой двух порогов интенсивности для составляющих цветовой модели (в работе методик применена модель цвета HLS с заданием порогов по яркости (L), насыщенности (S), цвету (H), а также модель цвета RGB с отдельно установленными порогами по красному (R), синему (B), зелѐному (G) цветам). После выделения масок объектов выполнялась морфологическая операция «Заполнение». При получении изображения от микроскопа и видеокамеры использовано увеличение микроскопа 400. Изображения в 10 полях зрения каждого микропрепарата обрабатывались с помощью фильтров программы 79 (яркость, контраст, сглаживание, выравнивание фона), затем по заданным параметрам (площадь объекта, цветовая гамма, размеры по осям X, Y, яркость, оптическая плотность и др.) производились выделение и идентификация объектов, распределение на классы (рисунки 1–9). Границы классов измеренных объектов определялись с помощью задания числовых пределов в соответствующей таблице классов по указанным выше параметрам. Хранение результатов исследования и первичная статистическая обработка материала проводились в базе данных Microsoft Excel. Рисунок 1 — Определение площади Рисунок 2 — Определение площади сосудистого русла в ткани РШМ сосудистого русла (СD34) в ткани РШМ в КЛЗ с помощью программы (зона опухоли) с помощью программы «ВидеоТест 4.0» «ВидеоТест 4.0» 80 Рисунок 3 — Определение экспрессии Рисунок 4 — Определение экспрессии NGFR в ткани РШМ (зона опухоли) NGFR в ткани РШМ в КЛЗ с помощью с помощью программы «ВидеоТест 4.0» программы «ВидеоТест 4.0» Рисунок 5 — Определение экспрессии Рисунок 6 — Определение экспрессии CD8 в ткани РШМ (зона опухоли) CD8 в ткани РШМ (вне зоны опухоли) с помощью программы «ВидеоТест 4.0» с помощью программы «ВидеоТест 4.0» 81 Рисунок 7 — Определение Рисунок 8 — Определение экспрессии CD68 в ткани РШМ экспрессии CD68 в ткани РШМ (зона опухоли) с помощью (зона опухоли) с помощью программы «ВидеоТест 4.0» программы «ВидеоТест 4.0» Рисунок 9 — Определение экспрессии CD79α в ткани РШМ в зоне опухоли с помощью программы «ВидеоТест 4.0» Морфометрическое исследование препаратов проводили следующим образом. После обзорного морфологического изучения микропрепрата с учетом окрашенных дополнительными гистохимическими методиками параллельных 82 срезов находили гистотопографически удаленные друг от друга артериолу, венулу и капилляр, что исключало возможность «перекрывания» периваскулярных зон сосудов МЦР, и при увеличении микроскопа в 400 раз производили подсчет абсолютного числа клеточных элементов в 10 полях зрения вокруг каждой сосудистой единицы. Подсчет клеточных элементов производили в непосредственной близости от них, при этом сосуд старались гистотопографически поместить в центр поля зрения. Для этого в окуляры устанавливали измерительную шкалу с ценой деления 100 мкм. С учетом технических характеристик микроскопа при данном увеличении диаметр поля зрения составляет 2100 мкм и соответственно радиус подсчета от изучаемой структуры составлял 1050 мкм (10,5) делений линейки. В дальнейшем полученные данные морфометрических исследований подвергались статистическому анализу. Интенсивность иммунного окрашивания оценивали полуколичественно и выделяли 4 типа реакции: 1) отсутствие антигенположительных клеток в срезе; 2) с минимальной инфильтрацией (единичные антигенположительные клетки в срезе, расположенные разрозненно или мелкими группами); 3) с умеренной инфильтрацией (умеренное число антигенположительных клеток, расположенных разрозненно или небольшими группами; немногочисленные пенетрирующие в паренхиму опухоли клетки); 4) с выраженной инфильтрацией (крупные антигенположительные инфильтраты; множественные группы антигенположительных клеток; множество пенетрирующих паренхиму опухоли клеток). Для Кi-67, p53 определяли процент клеток с положительной реакцией в ядрах, для bcl-2 определяли процент клеток с положительной реакцией в цитоплазме на 200 опухолевых клеток. Методы статистической обработки Задача статистического анализа результатов морфометрических исследований заключалась в проверке статистической гипотезы, которая выражается 83 в том, что статистические распределение изучаемых клеточных элементов в зоне опухоли и вне зоны опухоли не имеют значимых различий. Альтернативная статистическая гипотеза состояла в том, что имеют место значимые различия между статистическими распределениями изучаемых клеточных элементов в различных зонах во всех трех группах наблюдений. В качестве показателя, характеризующего различия статистических распределений, обычно используют среднее арифметическое значение, которое количественно характеризует типичное (наиболее вероятное) значение изучаемого признака. Среднее арифметическое значение можно использовать в качестве количественного показателя типичного числа клеток в поле зрения в том случае, когда анализируемое статистическое распределение является нормальным. Проверка гипотезы о нормальности распределения осуществлялась по критерию 2 (Пирсона) (Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б., 2000) на уровне значимости α = 0,05. Для проверки статистической гипотезы об отсутствии значимых различий между типичными уровнями анализируемых распределений использовался непараметрический критерий Манна—Уитни (Герасимов А.Н., 2007; Кобзарь А.И., 2006; Гланц С., 1998). Корреляционый анализ проводился с целью повышения точности и глубины познания сложных явлений или процессов, когда возникает необходимость в увеличении общего числа признаков (морфологических элементов), используемых для их описания. При большом числе признаков возникает необходимость в «сжатии» (редукции) имеющейся информации. Одним из методов такой редукции является понижение размерности исходного признакового пространства путем перехода к новым, обобщенным переменным, причем независимым между собой. Такими новыми переменными являются главные компоненты. Метод главных компонент называют также компонентным анализом. 84 С помощью метода главных компонент решались следующие задачи: — обнаружение скрытых, но объективно существующих закономерностей; — описание исследуемого процесса или явления числом главных компонент, значительно меньшим, чем число исходных признаков, этим достигается редукция имеющейся информации с минимальными потерями; — выявление и изучение стохастических связей исходных признаков (морфологических элементов) с главными компонентами, что позволяет определить исходные признаки, наиболее тесно связанные с найденными главными компонентами. Исходными данными для компонентного анализа являлись коэффициенты парных частных корреляций. Частные коэффициенты корреляции количественно выражают тесноту статистической связи между двумя переменными, исключая влияние остальных переменных. Из матрицы парных корреляций вычисляются собственные значения главных компонент. Главные компоненты рассматриваются как объективные причины, факторы, объясняющие совместную изменчивость исходных переменных. На начальном этапе анализа число главных компонент равно числу исходных переменных. Собственное значение главной компоненты (фактора) — это показатель, который характеризует вес (вклад), значимость каждого фактора в найденном факторном решении. Более точно, собственное значение каждого фактора — это его вклад в дисперсию переменных, объясняемую влиянием общих факторов. Сумма всех собственных значений равна числу исходных переменных. Собственные значения главных компонент позволяют оценить их информативность. Информативность — это процент объясняемой дисперсии исходных переменных, содержащейся в корреляционной матрице. Собственное значение, деленное на количество переменных и умноженное на 100, есть процент дисперсии (информативность), соответствующий определенной компоненте (фактору). Все 100% дисперсии исходных переменных будут 85 объясняться числом главных компонент (факторов), равным числу исходных переменных. Собственные значения главных компонент, их индивидуальная и накопленная информативность представлены в таблицах. Главные компоненты расположены в таблице по убыванию собственных значений главных компонент. Информативность главных компонент связана с величиной их собственных значений. Исходя из того, что исходные анализируемые выборочные значения, полученные в результате морфометрического исследования, являются, по сути, случайными величинами, выборочные коэффициенты корреляции и вычисленные на их основе собственные значения главных компонент также являются случайными величинами. В связи с этим нулевая статистическая гипотеза может быть сформулирована как предположение об отсутствии значимых различий между собственными значениями главных компонент, а наблюдаемые различия являются результатом ошибки, которая всегда имеет место при выборочном статистическом исследовании (ошибка выборки). При истинной нулевой гипотезе главные компоненты не информативны. Альтернативная гипотеза может быть сформулирована как предположение о том, что не все собственные значения равны между собой. Для проверки нулевой гипотезы использовалась статистика (Болч Б., Хуань К. Дж., 1979). С целью установления значимости выявленных главных компонент сформулировали следующие статистические гипотезы: — гипотеза Н0: собственные значения главных компонент равны между собой и равны единице, вычисленные главные компоненты не обладают выраженной информативностью; — гипотеза Н1: не все собственные значения равны между собой, вычисленные главные компоненты обладают выраженной информативностью. 86 Нулевую гипотезу проверяли на уровне значимости 0,05 . Для проверки гипотезы Н0: можно использовать статистику 2 (1): 2р (n 1) ln R , где R — определитель корреляционной матрицы; n — объем выборки. Статистика 2 имеет 2 — распределение с числом степеней свободы df m m 1 , где m — число главных компонент. Для нашего случая m 7 и, 2 следовательно, df 7 7 1 21 . 2 2кр 0,05; df 21 32,67 . 2 2р (n 1) ln R = 325,54. Так как 2р 325,54 кр 32,67 , то имеются основания отклонить нулевую гипотезу и принять альтернативную. Главные компоненты обладают выраженной информативностью. Для определения числа факторов использовался критерий Кайзера: число факторов равно числу главных компонент, собственные значения которых больше единицы. Из анализа табличных данных можно сделать вывод о том, что для дальнейшего анализа можно использовать первых три главных компоненты. Факторная структура и факторные (компонентные) нагрузки представлены в таблицах соответствующих глав. Факторные (компонентные) нагрузки, по сути, являются коэффициентом корреляции анализируемой переменной с главной компонентой (фактором). Для анализа и интерпретации выявленной факторной структуры были использованы факторные нагрузки, значение которых больше или равно 0,3 (в таблице они выделены значком*)1. 1 Автор выражает искреннюю благодарность кандидату технических наук, доценту Л.Л. Лямцу за помощь в про- ведении математико-статистического исследования. 87 ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ СОСУДИСТОГО КОМПОНЕНТА КОММУНИКАЦИОННЫХ СИСТЕМ В ИНТАКТНОЙ ШЕЙКЕ МАТКИ 3.1. Морфологические и морфометрические характеристики сосудистого компонента (сосуды микроциркуляторного русла и клеточные популяции вокруг них) коммуникационных систем в тканях интактной шейки матки Кровеносные сосуды МЦР в тканях интактной ШМ представлены артериолами, капиллярами и венулами (рисунки 10–15). При обзорной микроскопии гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону и Габу-Дыбану (для выявления эластических и коллагеновых волокон), структурные изменения в соединительнотканном каркасе сосудов не выявлены. Базальная мембрана сохранялась, границы ее везде четкие, коллагеновые и эластические волокна окрашены равномерно в зеленый или фиолетовый цвет. Следует отметить, что гистотопографически к многослойному плоскому эпителию ближе располагались капилляры, венулы залегали на отдалении от эпителия (рисунки 10, 11). Наиболее отдаленно располагались артериолы (рисунки 10, 13, 14). Артериолы имели диаметр 30–40 мкм и типичное трехслойное строение (рисунки 13, 14). Относительно крупные артериолы имеют интиму, состоящую из эндотелия (рисунки 16, 17), базальную мембрану, среднюю оболочку, содержащую гладкомышечные клетки (до 3 слоев) и наружную оболочку, представленную коллагеновыми и эластическими волокнами (рисунок 13). Капилляры имели извилистый ход, различный диаметр. Большая часть капилляров была представлена эндотелиальными клетками с формированием трубочек (рисунки 11, 15), которые располагались непосредственно под эпителием. Венулы, 88 как правило, имели диаметр около 30 мкм, отличались от капилляров более крупным диаметром и количеством перицитов (рисунки 11, 14, 15). Рисунок 10 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 33). Видны сосуды различного строения (капилляры, венулы, артериолы), артериолы лежат в глубоких отделах. Окраска гематоксилином и эозином, ×100 Рисунок 11 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 33). Видны сосуды различного строения (капилляры, венулы). Окраска по ван Гизону, ×100 89 Рисунок 12 — Ткань интактной ШМ Рисунок 13 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 33). Видны сосуды (наблюдение № 33). Артериола с отчет- различного строения (капилляры, ливым трехслойным строением. Окраска венулы, артериолы). Видны неизме- по Габу-Дыбану, × 400 ненные коллагеновые и эластические волокна. Окраска по Габу-Дыбану, ×100 Вокруг сосудов МЦР клеточный инфильтрат стромы в интактной ШМ как в передней, так и в задней губе был крайне скудным. Клетки стромы были представлены фиброцитами, фибробластами, макрофагами, единичными лимфоцитами, плазмоцитами и единичными полиморфноядерными лейкоцитами. Количественный их состав вокруг артериол, венул и капилляров представлен в таблицах 2, 3, 4. Задача статистического анализа результатов морфометрических исследований заключалась в проверке статистической гипотезы, которая выражается в том, что статистические распределения изучаемых клеточных элементов в тканях передней и задней губы ШМ не имеют значимых различий. Альтернативная статистическая гипотеза состояла в том, что имеют место значимые различия между статистическими распределениями изучаемых клеточных элементов в тканях передней и задней губы ШМ. 90 Статистические распределения изучаемых клеточных элементов в тканях передней губы и задней губы ШМ значимо отличаются от нормального распределения (p < 0,05). Проверка гипотезы о нормальности распределения осуществлялась по критерию 2 (Пирсона) на уровне значимости 0,05. Проверка статистической гипотезы об отсутствии статистически значимых различий между статистическими распределениями изучаемых клеточных элементов в тканях передней губы и задней губы ШМ сводилась к проверке статистической гипотезы H0 об отсутствии значимых различий между типичными уровнями (значениями) анализируемых статистических распределений (типичным является тот факт, что в тканях передней губы и задней губы шейки матки наблюдаемое число клеточных элементов статистически одинаково). Альтернативная статистическая гипотеза H1 — типичные уровни анализируемых статистических распределений значимо различаются (типичным является тот факт, что в тканях передней губы ШМ наблюдаемое число клеточных элементов больше (меньше), чем в тканях задней губы шейки матки. Рисунок 14 — Ткань интактной ШМ Рисунок 15 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 33). Капилляры и арте- (наблюдение № 33). Видны множестриолы c классическим строением венные капилляры различного стенок. Окраска гематоксилином диаметра. Окраска гематоксилином и эозином, ×200 и эозином, ×400 91 14 Рисунок 16 — Ткань интактной ШМ Рисунок 17 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 21). Мембранная (наблюдение № 26). Мембранная экспрессия эндотелиального маркера экспрессия CD34 преимущественно CD34 в артериолах, капиллярах в сосудах капиллярного и венулярного и венулах, ×200 типов в субэпителиальных отделах, ×400 Рисунки 16, 17: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Таблица 2 — Распределение клеточных популяций вокруг артериол в ткани интактной шейки матки Средний ранг выборки Показатель Статистика критерия Критерий Передняя губа Задняя губа V1 V2 W ФЦ 295,31 304,68 1212,50 0,283 >0,05 ФБ 300,05 299,95 15,00 0,497 >0,05 ЛФ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 ПЛ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 МФ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 ГРЛ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 ПАР 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 Манна—Уитни P 92 Таблица 3 — Распределение клеточных популяций вокруг венул в ткани интактной шейки матки Средний ранг выборки Показатель Статистика критерия Критерий Передняя губа Задняя губа V1 V2 W ФЦ 299,79 300,21 62,00 0,488 >0,05 ФБ 310,91 289,06 3272,50 0,061 >0,05 ЛФ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 ПЛ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 МФ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 ГРЛ 302,05 289,95 464,00 0,193 >0,05 ПАР 305,41 294,57 1623,00 0,068 >0,05 Манна—Уитни P Для анализа ввели понятие среднего ранга выборки: V1 — выборка в передней губе, V2 — выборка в задней губе. При анализе клеточных популяций фиброцитов, фибробластов, лимфоцитов, плазмоцитов, макрофагов, гранулоцитарных лейкоцитов, клеток паренхимы вокруг артериол, венул и капилляров (гипотеза Н0: в передней губе и в задней губе типичное наблюдаемое число клеточных элементов одинаково, и гипотеза Н1: типичным является тот факт, что в передней губе наблюдаемое число клеточных элементов значимо меньше, чем в задней губе), как видно из таблиц 2, 3, 4, по результатам проверки гипотезы Н0 по критерию Манна—Уитни во всех наблюдениях нет оснований отклонить гипотезу Н0. Таким образом, в передней губе и в задней губе типичное наблюдаемое число клеточных элементов одинаково. 93 Таблица 4 — Распределение клеточных популяций вокруг капилляров в ткани интактной шейки матки Средний ранг выборки Показатель Статистика критерия Критерий Передняя губа Задняя губа V1 V2 W ФЦ 301,65 298,34 495,00 0,408 >0,05 ФБ 303,42 296,57 1026,50 0,314 >0,05 ЛФ 303,00 298,00 750,00 0,221 >0,05 ПЛ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 МФ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 ГРЛ 300,50 300,50 0,00 1 >0,05 ПАР 320,99 279,08 6276,50 0,161 >0,05 Манна—Уитни P 3.2. Иммуногистохимическая характеристика экспрессии р53, Ki-67, bcl-2, NKl, СD4, СD8, СD79α, CD138, CD68, СD34, NGFR в стромальном и/или эпителиальном компоненте тканей интактной шейки матки Иммуногистохимическое исследование проведено в 30 случаях в каждой зоне (передняя и задняя губа) в тканях интактной шейки матки. Экспрессия выше указанных маркеров в тканях передней и задней губы ШМ принципиально не имела существенных отличий, поэтому приводим единое описание иммуногистохимической картины. При анализе экспрессии маркера апоптоза р53 выявлена слабая ядерная экспрессия (рисунок 32) данного моноклонального антитела в единичных клетках базального и шиповатого слоя многослойного плоского эпителия (экспрессия обнаружена в 11 случаях из 30). При этом в 5 случаях окрашивание наблюдалось 94 в тканях передней и задней губы ШМ, в 5 случаях — только в тканях передней губы и в одном случае в тканях задней губы. Экспрессия р53 в клетках стромы не выявлена ни в одном случае. 60 50 40 P53 30 Ki-67 bcl-2 20 10 0 Передняя губа эпителий Задняя губа эпителий Передняя губа строма Задняя губа строма Рисунок 18 — Распределение экспрессии р53, bcl-2, Ki-67 в тканях интактной шейки матки Маркер супрессора апоптоза bcl-2 экспрессировался в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия (рисунок 26). Окрашивание было слабым (реже умеренным) цитоплазматическим и отмечалось в 15 из 30 случаев, при этом в 9 случаях данный маркер определялся в эпителии передней и задней губы и только в одном случае в тканях передней губы. Окрашивание клеток стромы bcl-2 не было обнаружено ни в одном исследованном случае. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 определялась в клетках шиповатого и базального слоев многослойного плоского эпителия в 14 из 30 случаев. При этом экспрессия данного антитела определялась в тканях передней и задней губы. Окрашивание было ядерное от слабо до умеренно выраженного (рисунок 22). В одном наблюдении была выявлена экспрессия в клетках стромы 95 (лимфоцитах и фибробластах). Пролиферативный индекс по Ki-67 в эпителии был менее 5% (в клетках стромы менее 1%). 1000 900 800 700 600 500 Передняя губа 400 Задняя губа 300 200 100 0 СD 4 СD79? СD 138 СD 8 NK 1 СD 68 Рисунок 19 — Распределение иммунодетекции клеточных маркеров (CD4, CD79α, CD138, СD8, NK1, CD68) в ткани интактной шейки матки Количественное распределение экспрессии р53, bcl-2, Кi-67 в строме и эпителии представлено в рисунке 18: как видно, наибольшая экспрессия приходится на маркер супрессии апоптоза bcl-2 в эпителии. Следует отметить, что в тканях передней губы количество позитивных клеток больше (98%), чем в задней (76%), в строме позитивных клеток не выявлено. Вторым по частоте экспрессии в эпителии был Ki-67, который выявлялся с одинаковой частотой в задней (54%) и передней (55%) губе в строме (13% и 6% соответственно). Наименьшая доля приходится на экспрессию p53, который выявлялся в эпителии передней (17%) и задней губы (14%), в клетках стромы данного маркера не выявлено. Однако достоверных различий в обеих зонах по данным маркерам не было выявлено (р > 0,05). 96 60 50 40 30 20 10 0 Площадь сосудистого русла (доля в %) Экспрессия NGFR (доля в %) Передняя губа 49,88 55,05 Задняя губа 50,12 44,94 Рисунок 20 — Площадь сосудистого русла (по CD34) и экспрессия NGFR в ткани интактной шейки матки Как было отмечено выше, клеточный инфильтрат в нормальной шейке матки был крайне скудный и представлен следующими клеточными популяциями: фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами, гранулоцитарными лейкоцитами. Уточнение иммунодетекции в клетках инфильтрата проводилось с помощью следующих моноклональных антител: NK1, CD4, CD8, CD79α, СD138, CD68. Как видно из рисунка 19, в ткани интактной ШМ в клеточном инфильтрате преобладала экспрессия СD68. На его долю приходилось 80% всех клеточных популяций. Экспрессия умеренная (рисунки 27, 28). Данный маркер определялся в макрофагах и клетках Лангерганса стромы, а также отмечена его экспрессия в клетках, лежащих в просвете сосудов (моноцитах). Экспрессия CD68 выявлялась во всех исследуемых случаях без исключения как в передней, так и в задней губе шейки матки. Как видно из рисунка 19, их количество практически одинаково в обеих зонах (достоверных различий не выявлено — р > 0,05). В изучаемых зонах интактной ШМ иммунодетекция Т-клеточных маркеров (рисунок 19) была вариабельна. 97 NK1-позитивные клетки определялись в 11 случаях из тридцати — как в передней, так и в задней губе ШМ. На их долю приходилось около 5% клеток в клеточном инфильтрате. Как видно из рисунка 19, их количество практически одинаково в обеих зонах (достоверных различий не выявлено — р > 0,05). Экспрессия была умеренной, мембранной (рисунок 21). Как правило, NК1-позитивные клетки располагались дискретно, субэпителиально. Следует отметить, что NK1-позитивные лимфоциты располагались рядом с сосудами венулярного и капиллярного типа. Вокруг артериол позитивных клеток выявлено не было. Рисунок 21 — Ткань интактной ШМ Рисунок 22 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 45). Экспрессия (наблюдение № 45). Экспрессия Т-клеточного маркера NK1 в клетках маркера клеточной пролиферации базального и шиповатого слоев много- Ki-67 в клетках базального и шипо- слойного плоского эпителия и лимфо- ватого слоев многослойного плоского цитах стромы, ×400 эпителия, ×400 Рисунки 21–24: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 98 Рисунок 23 — Ткань интактной ШМ Рисунок 24 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 45). Мембранная экс- (наблюдение № 45). Цитоплазматиче- прессия Т-клеточного маркера CD8 ская экспрессия В-клеточного маркера в единичных лимфоцитах стромы и CD79α в единичных лимфоцитах в базальных клетках многослойного стромы, ×400 плоского эпителия, ×400 Рисунок 25 — Ткань интактной ШМ Рисунок 26 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 45). Умеренная цито- (наблюдение № 45). Слабая цитоплаз- плазматическая экспрессия CD138 матическая экспрессия bcl-2 в клетках маркера плазматических клеток в еди- базального слоя многослойного плос- ничных клетках стромы и в клетках кого эпителия, ×400 базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия, ×400 99 Рисунок 27 — Ткань интактной ШМ Рисунок 28 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 47). Умеренная цито- (наблюдение № 45). Умеренная цито- плазматическая экспрессия CD68 плазматическая экспрессия CD68 в единичных клетках стромы, ×400 в единичных клетках стромы и просвете венулы, ×400 Рисунки 25–28: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Экспрессия CD4 была выявлена в 12 случаях из 30. На долю этой популяции Т-клеток пришлось 3% от всего клеточного инфильтрата. Иммунодетекция CD4 была от слабой до умеренной, мембранная (рисунок 33) и определялась как в передней, так и в задней губе. Достоверных различий в количественном соотношении в обеих зонах выявлено не было (р > 0,05). CD4-позитивные клетки располагались дискретно, субэпителиально, рядом с сосудами венулярного и капиллярного типа. Вокруг артериол данные клетки не выявлены. Иммунодетекция CD8 была выявлена в 12 случаях из 30, экспрессия имела мембранный характер, умеренная (рисунок 23). На долю данной популяции Т-лимфоцитов пришлось около 5% всего клеточного инфильтрата. Достоверных различий по экспрессии CD8 в передней и задней губе не выявлено (р > 0,05). CD8-лимфоциты лежали одиночно, как субэпителиально, так и в более глубоких 100 отделах стромы, но преимущественно рядом с венулами и капиллярами. Вокруг артериол данные клетки выявлены не были. При анализе экспрессии маркеров В-лимфоцитов (CD79α) положительные клетки обнаруживались в 10 случаях из 30. Экспрессия была умеренная, мембранная (рисунок 24), на долю данной популяции пришлось около 5% всего клеточного инфильтрата. В-лимфоциты располагались дискретно, субэпителиально. Достоверных различий по экспрессии CD79α в передней и задней губе не выявлено (р > 0,05). Данная клеточная популяция обнаруживалась и в более глубоких отделах стромы, причем исключительно вокруг венулярного и капиллярного отдела МЦР. Рисунок 29 — Ткань интактной ШМ Рисунок 30 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 45). Экспрессия NGFR (наблюдение № 45). Отсутствие эксв нервном волокне, ×100 прессии NGFR в строме и в базальных клетках многослойного плоского эпителия, ×100 101 Рисунок 31 — Ткань интактной ШМ Рисунок 32 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 47). Слабая экспрессия (наблюдение № 45). Слабая ядерная NGFR в базальных клетках многослой- экспрессия р53 (маркера апоптоза) ного плоского эпителия, ×400 в единичных клетках многослойного плоского эпителия, ×400 Рисунки 29–32: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Экспрессия СD138 (маркера плазматических клеток) выявлена в 9 случаях из 30. Иммунодетекция была слабой, цитоплазматической, на долю данных клеток пришлось 2% всего клеточного инфильтрата. Достоверных различий по экспрессии CD138 в передней и задней губе не выявлено (р > 0,05). Плазматические клетки располагались преимущественно субэпителиально и дискретно, исключительно вокруг венул и капилляров, рядом с артериолами данные клетки не выявлены. Следует отметить, что выраженная цитоплазматическая экспрессия CD138 также была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоя многослойного плоского эпителия (рисунок 25). 102 23 20 21 30 33 Рисунок 33 — Ткань интактной ШМ (наблюдение № 45). Мембранная экспрессия Т-клеточного маркера CD4 в единичных лимфоцитах стромы, ×400. Стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином Анализ экспрессии эндотелиального маркера (CD34) показал, что положительная экспрессия была обнаружена во всех исследуемых случаях и во всех исследуемых зонах. Была выявлена выраженная мембранная иммунодетекция в эндотелиальных клетках всех типов сосудов (рисунки 16, 17). Также было проведено определение площади сосудистого русла на срезах, окрашенных данным антителом, с помощью программы «ВидеоТест 4.0» (подробно методика изложена в главе 2). Как видно из рисунка 20, площадь сосудистого русла в передней и задней губе практически одинакова и отличается всего на 0,24% (достоверных различий в экспрессии выявлено не было р > 0,05). Экспрессия NGFR (рецептор фактора роста нервов) в нервных структурах в тканях передней и задней губы интактной ШМ была выявлена во всех исследуемых случаях. Отмечалась выраженная мембранная иммунодетекция в нервных волокнах шейки матки (рисунок 29). При этом большинство нервных волокон располагалось в глубоких отделах стромы (на отдалении от покровного эпителия ШМ). Следует отметить, что данное антитело накапливалось в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия (рисунок 31). При этом экспрессия была слабой, в редких случаях — умеренной. В ряде наблюдений отме- 103 чалась неравномерность экспрессии NGFR в клетках эпителия на протяженности всего среза, встречались участки с негативной реакцией (рисунок 30). С помощью программы «ВидеоТест 4.0» (подробное описание методики изложено в главе 2) определили количество NGFR позитивных элементов в обеих зонах ШМ (рисунок 20). Как видно из данного рисунка, в ткани передней губы шейки матки показатель экспрессии NGFR значимо выше (р 0,05) — на 10,11% по сравнению с задней губой шейки матки. 3.3. Корреляционный анализ клеточных популяций вокруг разных сосудов микроциркуляторного русла в тканях интактной шейки матки Корреляционный анализ проводился в два этапа. Вначале был выполнен парный корреляционный анализ клеточных популяций в ткани передней и задней губы интактной ШМ вокруг различных сосудистых единиц (артериол, венул, капилляров). Так как парные корреляции не дают полного представления о происходящих межклеточных взаимоотношениях и не исключают влияния иных клеточных элементов на выявленные корреляционные связи, то был проведен частный корреляционный анализ. Следует отметить, что система частных корреляций между клеточными популяциями вокруг различных звеньев сосудистого русла была представлена немногочисленными (всего было выявлено 28 корреляционных связей), но разнообразными по силе и характеру взаимосвязями. Все представленные корреляционные взаимосвязи являлись статистически значимыми (коэффициент корреляции /r/ — от 0,3 до 0,7, p < 0,05) и носили прямой характер. Частный корреляционный анализ позволил получить матрицы корреляций, которые и явились исходным материалом для проведения факторного анализа. Факторный анализ позволяет провести редукцию имеющейся об- 104 ширной информации путем перехода к новым обобщенным переменным, которые независимы между собой. Такими новыми переменными являются главные компоненты. Исходными данными для компонентного анализа были коэффициенты парных частных корреляций (таблицы 5, 8). Учитывая, что при частном корреляционном анализе вокруг артериол было обнаружено по одной достоверной связи (в передней губе /r/ — 0,7114, p < 0,05; в задней губе /r/ — 0,5151, p < 0,05) между фибробластами и фиброцитами, а вокруг капилляров присутствовала единственная достоверная связь между фибробластами и фиброцитами (в передней губе /r/ — 0,4271, p < 0,05; в задней губе /r/ — 0,5044, p < 0,05), в результате факторного анализа после редукции исходных данных достоверных корреляций выявлено не было. Поэтому далее мы приводим только анализ значимых результатов вокруг венулярного звена МЦР в тканях передней и задней губы ШМ (подробно проведение данного анализа изложено в главе 2). В тканях интактной ШМ в передней и задней губе с помощью факторного анализа (объем выборки: n = 300 единиц наблюдения) было установлено, что наиболее активным в плане формирования клеточных корреляционных связей является венулярный отдел МЦР. Так, вокруг венул в ткани передней губы ШМ были выявлены три главных компоненты, накопленная информативность которых составила 87,752% (таблица 6). В задней губе ШМ вокруг венул накопленная информативность трех главных компонент составила 94,213% (таблица 9). Вокруг капиллярного отдела МЦР передней губы ШМ накопленная информативность трех главных компонент составила 86,424% (таблица 12). Для анализа и интерпретации выявленной факторной структуры использовали факторные нагрузки, значение которых больше или равно 0,3 (в таблицах 7, 10, 13 они выделены значком *). 105 Таблица 5 — Значения коэффициентов парных частных корреляций вокруг венул в интактной ШМ (передняя губа) ФЦ ФБ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,4757 0,1060 0,0438 ФБ 0,4757 1 –0,0438 –0,0511 ГРЛ 0,1060 –0,0438 1 –0,0559 ПАР 0,0438 –0,0511 –0,0559 1 Как видно из таблиц, в интактной ШМ вокруг венул как в передней (таблица 7), так и в задней губе (таблица 10) с первым фактором наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ и ФБ, имеющие наибольшее собственное значение 1,48 и информативность 37,001% (в передней губе), в задней губе собственное значение равнялось 1,65205 и информативность — 41,301%. Таблица 6 — Собственные значения главных компонент вокруг венул в интактной ШМ (передняя губа) Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,48 37,001 37,001 2 1,0547 26,366 63,367 3 0,97539 24,385 87,752 4 0,48993 12,248 100 информативность (процент дисперсии) Со вторым фактором, имеющим собственное значение 1,0547 и информативность 26,366%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ГРЛ (передняя 106 губа — таблица 7). В задней губе аналогичная ситуация: собственное значение 1,08351 и информативность 27,088% (таблица 10). С третьим фактором в передней губе (таблица 7), имеющим собственное значение 0,97539 и информативность 24,385%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ПАР, в задней губе (таблица 10) прослеживается та же тенденция, собственное значение 1,03294 и информативность 25,824%. Таблица 7 — Факторные нагрузки вокруг венул в интактной ШМ (передняя губа) Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,853453* 0,170129 0,103184 ФБ 0,864161* –0,13666 –0,10463 ГРЛ 0,017723 0,9875* –0,03669 ПАР –0,00217 –0,0359 0,993777* Таким образом, выделив три основных фактора, которые обеспечивают постоянство паренхиматозно-стромальных взаимоотношений в интактной ШМ, можно условно назвать первый фактор стромообразующим, т. к. основными клетками в системе корреляционных связей были установлены фибробласт и фиброцит, они являются основными элементами в процессе стромообразования. 107 Таблица 8 — Значения коэффициентов парных частных корреляций вокруг венул в интактной ШМ (задняя губа) ФЦ ФБ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,6476 –0,1435 –0,0906 ФБ 0,6476 1 0,2093 0,1272 ГРЛ –0,1435 0,2093 1 –0,0612 ПАР –0,0906 0,1272 –0,0612 1 Таблица 9 — Собственные значения главных компонент вокруг венул в интактной ШМ (задняя губа) Главные Собственное Информативность Накопленная компоненты значение (процент дисперсии) информативность 1 1,65205 41,301 41,301 2 1,08351 27,088 68,389 3 1,03294 25,824 94,213 4 0,231492 5,787 100 (процент дисперсии) Таблица 10 — Факторные нагрузки вокруг венул в интактной ШМ (задняя губа) Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,916824* –0,21093 –0,13817 ФБ 0,897684* 0,256241 0,1629 ГРЛ 0,012974 0,987348* –0,04011 ПАР 0,008101 –0,03743 0,994096* 108 Второй основной фактор имеет корреляционные связи с гранулоцитарными лейкоцитами, которые одними из первых реагируют на клеточные повреждения и запускают механизм клеточной дезинтеграции. Следовательно, данный фактор можно условно назвать дезинтегрирующим. Третий основной фактор в данной ситуации имеет устойчивые корреляции с паренхимой органа. Как известно, паренхиматозные клетки (в нашей ситуации это многослойный плоский эпителий) начинают активно реагировать на любое повреждение путем пролиферации и созревания резервных клеток. Таким образом, они запускают механизмы регенерации. Учитывая данный факт, нам представляется возможным назвать третий фактор пролиферирующим. Выделение этих трех основных факторов в интактной шейке матки поможет нам в дальнейшем в проведении корреляционного анализа при различной патологии ШМ, а именно при ВПЧ инфекции и раке шейки матки. Как известно, прогрессия папилломавирусных поражений шейки матки приводит к дисплазии эпителия, а в дальнейшем и плоскоклеточному РШМ. Патогенетические механизмы, определяющие возможные морфогенетические потенции патологического процесса, можно раскрыть путем изучения межклеточных взаимодействий, поддерживающих структуру и функцию любой ткани, включая и опухолевую, так как известно, что изменения эпителиального и стромального компонентов происходят синхронно. 109 ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ СОСУДИСТОГО КОМПОНЕНТА КОММУНИКАЦИОННЫХ СИСТЕМ В ТКАНЯХ ШЕЙКИ МАТКИ ПРИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНЫХ ПОРАЖЕНИЯХ 4.1. Морфологические и морфометрические характеристики сосудистого компонента (сосуды микроциркуляторного русла и клеточные популяции вокруг них) коммуникационных систем в тканях шейки матки при папилломавирусных поражениях Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ. При обзорной микроскопии срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, под многослойным плоским неороговевающим эпителием на различной глубине располагались сосуды МЦР. Микрососуды в данной зоне были представлены артериолами, капиллярами и венулами (рисунки 34–38). На светооптическом уровне МЦР сохраняло типичное гистологическое строение: артериолы имели трехслойное строение, характерное для сосудов артериального типа (рисунки 34, 38). Строение венул и капилляров также соответствовало классическим описаниям данных структур (рисунки 35– 39). При изучении гистологических срезов, окрашенных по ван Гизону и ГабуДыбану для выявления эластических и соединительнотканных волокон, отмечалась однотипность строения одноименных сосудов. Эластический и коллагеновый каркас во всех типах сосудов был сохранен, имел непрерывное строение (рисунки 35–37). Таким образом, строение сосудов МЦР вне зоны поражения ВПЧ практически полностью соответствует строению сосудов в интактной шейке матки. 110 Рисунок 34 — Ткань ШМ вне зоны Рисунок 35 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 6). поражения ВПЧ (наблюдение № 6). Видны сосуды различного строения Капилляры и венулы типичного строе- (капилляры, венулы, артериолы), ния. Окраска по ван Гизону, ×200 артериолы лежат в глубоких отделах. Окраска гематоксилином и эозином, ×200 Рисунок 36 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 6). Сосуды различного строения (капилляры, венулы, артериолы), артериолы лежат в глубоких отделах. Видны не измененные коллагеновые и эластические волокна. Окраска по Габу-Дыбану, ×100 111 Рисунок 37 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 6). Видны капилляры, венулы с сохраненным эластическим и коллагеновым каркасом стенки. Окраска по Габу-Дыбану, ×200 Рисунок 38 — Ткань ШМ вне зоны Рисунок 39 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 6). поражения ВПЧ (наблюдение № 6). Артериола в глубоких отделах, В строме видны капилляры, венулы. с типичным трехслойным строением Стрептавидин-биотиновый иммуно- стенки. Стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод (СD34), докраска иммунопероксидазный метод (СD34), гематоксилином, ×400 докраска гематоксилином, ×400 112 Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ. Во всех исследованных случаях была проведена ПЦР диагностика для выявления различных типов ВПЧ (таблица 11). Таблица 11 — ПЦР диагностика ВПЧ-поражений шейки матки Тип ВПЧ Количество женщин в абсолютных значениях 6 3 11 3 16 15 18 10 31 11 33 7 Сочетание типов вируса 10 Как видно из данных таблицы, наиболее часто определялись высоко онкогенные типы вируса папилломы человека. Важно отметить, что у 10 пациенток отмечалась ассоциация ВПЧ 16/18 и 6/11, 31/33-го типов. При обзорной микроскопии наблюдались признаки папилломавирусного поражения многослойного плоского эпителия, такие как койлоцитоз, акантоз, папилломатоз. В ряде случаев наблюдалось формирование кондилом с различными типами роста (выявлялись плоские кондиломы, кондиломы с инвертирующим ростом, а также кондиломы с экзофитным ростом), отмечались явления ЦИН различной степени выраженности (рисунки 40–43), явления лейкоплакии (рисунок 44). Сосуды МЦР представлены артериолами, венулами и капиллярами. При просмотре гистологических срезов, окрашенных по методу ван Гизона и ГабуДыбану для выявления эластических и коллагеновых волокон регистрировались структурные изменения в соединительнотканном каркасе сосудов. Базальная мембрана сохранялась, но границы ее не везде четкие. Коллагеновые и эластические волокна окрашены не всегда равномерно, отмечались их разволокнение и фрагментация (рисунки 40, 41). 113 Следует отметить, что гистотопографически ближе к эпителиальным структурам располагались капилляры и венулы (рисунки 40, 41). Наиболее отдаленно определялись артериолы (рисунок 45). По мере нарастания степени тяжести ЦИН отмечались изменения в строении сосудов. При ЦИН 2-й и 3-й степени наблюдалось выраженное разволокнение и набухание коллагенового и эластического каркаса в венулах и капиллярах, а также в артериолах (рисунки 40, 41). При ЦИН 2 в строме имелись капилляры, которые подрастают к многослойному плоскому эпителию. Однако широкой анастомозирующей сети не формируется (рисунки 46, 47). При ЦИН 3-й степени ближе к эпителиальному компоненту отмечалось увеличение количества сосудов МЦР (особенно капилляров и венул), которые образовывали обширные анастомазирующие сети (рисунки 48, 49) с формированием крупных фокусов между эпителиальными пластами (рисунки 50, 51). Рисунок 40 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 23). Под эпителием (ЦИН 2-й степени) видны множественные капилляры, подрастающие вплотную к эпителию (венулы и артериолы лежат в глубоких отделах). Коллагеновые и эластические волокна не изменены. Окраска по Габу-Дыбану, ×100 114 Рисунок 41 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 23). Видны артериолы и венулы с дезорганизацией эластических и коллагеновых волокон стенки. Окраска по Габу-Дыбану, ×200 Рисунок 42 — Ткань ШМ в зоне пора- Рисунок 43 — Ткань ШМ в зоне пора- жения ВПЧ (наблюдение № 42). ЦИН жения ВПЧ (наблюдение № 42). ЦИН 1-й степени. Видны сосуды различного 1-й степени. Видны капилляры, венустроения (капилляры, венулы, артериолы). Окраска гематоксилином и эозином, ×100 лы. Окраска по ван Гизону, ×100 115 Рисунок 44 — Ткань ШМ в зоне пора- Рисунок 45 — Ткань ШМ в зоне пора- жения ВПЧ (наблюдение № 23). ЦИН жения ВПЧ (наблюдение № 23). 1-й степени, лейкоплакия. Видны ка- В строме видны капилляры, венулы, пилляры, венулы, артериолы. Окраска артериолы, ×100 по ван Гизону, ×100 Рисунок 46 — Ткань ШМ в зоне пора- Рисунок 47 — Ткань ШМ в зоне пора- жения ВПЧ (наблюдение № 132). ЦИН жения ВПЧ (наблюдение № 141). ЦИН 1-й степени. Капилляры, венулы, арте- 2-й степени. В строме видны капилля- риолы, ×100 ры, венулы, ×400 116 Рисунок 48 — Ткань ШМ в зоне пора- Рисунок 49 — Ткань ШМ в зоне пора- жения ВПЧ (наблюдение № 555). жения ВПЧ (наблюдение № 634). ЦИН 2-й степени. Капилляры, ЦИН 3-й степени / carcinoma in situ. подрастающие к эпителию, ×400 Видна густая сеть сосудов (капилляры, венулы), ×400 Рисунок 50 — Ткань ШМ в зоне пора- Рисунок 51 — Ткань ШМ в зоне пора- жения ВПЧ (наблюдение № 364). Экто- жения ВПЧ (наблюдение № 364). ЦИН пия и ЦИН 3-й степени. Обилие ана- 3-й степени. Видна густая сеть сосудов стомозирующих сосудов, ×400 (капилляры, венулы), ×400 Рисунки 45–51: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод (СD34), докраска гематоксилином. 117 Морфометрический анализ клеточного инфильтрата стромы в зоне поражения и вне зоны поражения ВПЧ вокруг сосудов МЦР показал, что клетки стромы были представлены фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами и гранулоцитарными лейкоцитами. Вокруг сосудов МЦР количественный состав клеточного инфильтрата стромы вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ представлен в таблицах 12–14. Задача статистического анализа результатов морфометрических исследований заключалась в проверке статистической гипотезы, которая выражается в том, что статистические распределения изучаемых клеточных элементов в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ не имеют значимых различий. Альтернативная статистическая гипотеза состояла в том, что имеют место значимые различия между статистическими распределениями изучаемых клеточных элементов в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ. Статистические распределения изучаемых клеточных элементов в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ значимо отличаются от нормального распределения ( p 0, 05 ). Проверка гипотезы о нормальности распределения осуществлялась по критерию 2 (Пирсона) на уровне значимости 0, 05. Проверка статистической гипотезы об отсутствии статистически значимых различий между статистическими распределениями изучаемых клеточных элементов в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ сводилась к проверке статистической гипотезы H0 об отсутствии значимых различий между типичными уровнями (значениями) анализируемых статистических распределений (типичным является тот факт, что в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ наблюдаемое число клеточных элементов одинаково). Альтернативная статистическая гипотеза H1 — типичные уровни анализируемых статистических распределений значимо различаются (типичным является тот факт, что в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ наблюдаемое число клеточных элементов больше (меньше), чем в тканях в зоне поражения ВПЧ). 118 Для проверки статистической гипотезы об отсутствии значимых различий между типичными уровнями анализируемых распределений использовался непараметрический критерий Манна—Уитни (таблицы 12–14). Таблица 12 — Распределение клеточных популяций вокруг артериол в различных зонах ткани ШМ при ВПЧ поражении Средний ранг выборки Статистика критерия Критерий Зона ВПЧ Вне зоны ВПЧ V1 V2 W ФЦ 295,44 303,56 1212,50 0,283 >0,05 ФБ 299,56 299,44 17,50 0,479 >0,05 ЛФ 385,79 212,50 25864,00 0,000 <0,05 ПЛ 384,00 215,00 25226,00 0,00 <0,05 МФ 368,79 230,21 20718,00 0,00 <0,05 ГРЛ 352,26 246,74 15775,00 0,00 <0,05 ПАР 323,20 275,80 7086,00 7,69E-08 <0,05 Манна—Уитни p — значимо различные показатели Для анализа введем понятие среднего ранга выборки: V1 — зона ВПЧ, V2 — вне зоны ВПЧ. Морфометрическое исследование клеточных популяций показало, что вокруг артериол в тканях, пораженных ВПЧ, достоверно возрастает (p 0,05) число лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов, гранулоцитарных лейкоцитов и клеток паренхимы по сравнению с зоной вне поражения ВПЧ. Таким образом, есть основание отклонить гипотезу Н0 и принять Н1. Типичным является тот факт, что вне зоны ВПЧ наблюдаемое число клеточных элементов меньше, чем в зоне ВПЧ. 119 Однако средние ранги выборок по фиброцитам и фибробластам показал, что в зоне ВПЧ и вне зоны поражения типичное наблюдаемое число клеточных элементов одинаково (p > 0,05) (таблица 12), следовательно, нет оснований отклонить гипотезу Н0. При статистической обработке морфометрических показателей клеточных популяций вокруг венул и капилляров в тканях ВПЧ достоверно возрастает (p 0,05) число лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов и гранулоцитарных лейкоцитов по сравнению с тканями вне зоны ВПЧ. При этом средниие ранги выборок по фиброцитам, фибробластам и клеткам паренхимы в зоне ВПЧ и вне зоны поражения достоверно не отличались (p > 0,05), следовательно нет оснований отклонить гипотезу Н0. Поэтому в зоне ВПЧ и вне зоны ВПЧ типичное наблюдаемое число клеточных элементов одинаково (таблица 13, 14). Таблица 13 — Распределение клеточных популяций вокруг венул в различных зонах ткани ШМ при ВПЧ-поражении Средний ранг выборки Статистика критерия Критерий Зона ВПЧ Вне зоны ВПЧ V1 V2 W ФЦ 292,37 306,63 2133,00 0,0156 >0,05 ФБ 294,46 304,54 1506,50 0,238 >0,05 ЛФ 431,50 167,50 39468,00 0,0000 <0,05 ПЛ 428,00 171,00 38422,00 0,00000 <0,05 МФ 410,42 188,58 33165,00 0,0000 <0,05 ГРЛ 410,00 189,00 33040,00 0,0000 <0,05 ПАР 295,73 303,27 1126,00 0,28 >0,05 — значимо различные показатели Манна—Уитни p 120 Возможно, при прогрессии патологических изменений в ШМ на фоне вирусного поражения сосудистое русло, как один из структурных элементов, входящих в коммуникационные системы, обеспечивает двухстороннюю связь «макроорганизм — опухолевая ткань» и совместно с окружающими его клеточными популяциями может выступать самостоятельным звеном или посредником в развитии самых различных процессов, в том числе и опухолевых. Синхронное увеличение в клеточном инфильтрате ткани ШМ при ВПЧпоражении по сравнению с зоной вне поражения ВПЧ лимфоцитов, плазмоцитов, макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов, возможно, объясняется тем, что контроль за миграцией клеточных популяций из сосудов в ткани осуществляется сульфатированными формами гликозаминогликанов, фибронектина, ламинина, L-cелектина, которые синтезируются фибробластами. Нарушение баланса между этими системами отражают изменения паренхиматозно-стромальных взаимоотношений. Следовательно, каждому этапу морфогенеза новообразований должны соответствовать определенные изменения в системе эпителий — строма, кульминацией которых является злокачественная опухоль. Таблица 14 — Распределение клеточных популяций вокруг капилляров в различных зонах ткани ШМ при ВПЧ-поражении Средний ранг выборки Статистика критерия Критерий Зона ВПЧ Вне зоны ВПЧ V1 V2 W ФЦ 284,03 295,36 1636,00 0,207 >0,05 ФБ 284,66 294,68 1446,50 0,235 >0,05 ЛФ 433,87 165,13 40178,00 0,000 <0,05 ПЛ 433,00 166,00 39917,00 0,000 <0,05 Манна—Уитни p 121 Окончание табл. 14 Средний ранг выборки Статистика критерия Критерий Зона ВПЧ Вне зоны ВПЧ V1 V2 W МФ 368,68 170,93 30551,00 0,000 <0,05 ГРЛ 414,00 185,00 34236,00 0,000 <0,05 ПАР 283,82 295,58 1697,50 0,186 >0,05 Манна—Уитни p — значимо различные показатели. 4.2. Иммуногистохимическая характеристика экспрессии р53, Ki-67, bcl-2, NKl, СD4, СD8, СD79α, CD138, CD68, СD34, NGFR в стромальном и/или эпителиальном компоненте тканей шейки матки при папилломавирусных поражениях Иммуногистохимическое исследование проведено в 30 случаях в каждой зоне (зона поражения ВПЧ и зона вне поражения ВПЧ). Экспрессия вышеуказанных маркеров в различных зонах ШМ имела принципиальные отличия, поэтому приводим последовательное описание иммуногистохимической картины в тканях ШМ при поражении ВПЧ. Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ. При анализе экспрессии маркера апоптоза р53 выявлена умеренная или сильная ядерная экспрессия (рисунок 53) данного моноклонального антитела в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия (экспрессия обнаружена во всех наблюдениях). В десяти случаях отмечалась детекция р53 в клетках стромы (лимфоцитах и фибробластах). 122 Маркер супрессора апоптоза bcl-2 экспрессировался в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия. Окрашивание было умеренным (реже выраженным) цитоплазматическим и отмечалось во всех случаях, при этом в 14 случаях данный маркер определялся как в эпителии, так и в клетках стромы: в лимфоцитах и фибробластах (рисунок 55). Крайне редко наблюдались случаи со слабой экспрессией данного маркера (рисунок 54). Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 определялась в клетках шиповатого и базального слоев многослойного плоского эпителия во всех 30 случаях. При этом экспрессия данного антитела определялась во всех полях зрения. Окрашивание было ядерное, от слабо до умеренно выраженного (рисунок 52). В 10 случаях экспрессия Ki-67 была обнаружена в клетках стромы (лимфоцитах и фибробластах). Пролиферативный индекс по Ki-67 в эпителии был менее 10% (в клетках стромы менее 5%). Рисунок 52 — Ткань ШМ вне зоны Рисунок 53 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 6). поражения ВПЧ (наблюдение № 131). Экспрессия маркера клеточной проли- Умеренная ядерная экспрессия р53 ферации Ki-67 в единичных клетках в клетках базального слоя многослой- базального и шиповатого слоев много- ного плоского эпителия и единичных слойного плоского эпителия, ×400 клетках стромы (фибробластах), ×400 123 Рисунок 54 — Ткань ШМ вне зоны Рисунок 55 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 6). поражения ВПЧ (наблюдение № 142). Экспрессия bcl-2 в единичных клетках Выраженная цитоплазматическая экс- базального слоя многослойного плос- прессия bcl-2 в клетках базального кого эпителия, ×400 слоя многослойного плоского эпителия и клетках стромы (лимфоцитах и фибробластах), ×400 Рисунки 52–55: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Количественное распределение экспрессии р53, bcl-2, Кi-67 в строме и эпителии в данной зоне представлено на рисунке 85. Как видно, наибольшая экспрессия в эпителии приходится на маркер пролиферативной активности Ki-67 (70%). За ним, по частоте экспрессии, стоит р53, на его долю приходится около 40%. Последнее место занимает маркер супрессии апоптоза bcl-2, на его долю приходится менее 5%. В строме количественное распределение экспрессии р53, bcl-2, Кi-67 меняется. Обращает на себя внимание, что в строме наибольшая доля позитивных клеток принадлежит супрессору апоптоза bcl-2 (26%). Вторым по частоте экспрессии в строме был Ki-67, который выявлялся в 18,5%. Наименьшая доля приходится на экспрессию p53, который выявлялся в 10%. Как видно из рисунка 86, 124 их количество практически одинаковое в обеих зонах (достоверных различий не выявлено — р > 0,05). Как было отмечено выше, клеточный инфильтрат в зоне вне поражения ВПЧ был представлен следующими клеточными популяциями: фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами и гранулоцитарными лейкоцитами. Уточнение принадлежности клеток в инфильтрате к различным клеточным популяциям проводилось с помощью следующих моноклональных антител: NK1, CD4, CD8, CD79α, СD138, CD68. Как видно из рисунка 86, в данной зоне в клеточном инфильтрате преобладала экспрессия СD68. На его долю приходилось 38% всех клеточных популяций. Экспрессия от умеренной до ярко выраженной. Данный маркер определялся в макрофагах и клетках Лангерганса стромы. Также отмечена его экспрессия в клетках, лежащих в просвете сосудов (моноцитах). Экспрессия CD68 выявлялась во всех исследуемых случаях без исключения и во всех полях зрения. Как видно из рисунка 86, их количество практически одинаковое в обеих зонах (достоверных различий не выявлено — р > 0,05). В изучаемой зоне иммунодетекция Т-клеточных маркеров (рисунки 56–59, 86) была вариабельна. Рисунок 56 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 6). Умеренная цитоплазматическая экспрессия CD68 в клетках стромы, ×400 125 Рисунок 57 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 142). Экспрессия Т-клеточного маркера NK1 в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия и лимфоцитах стромы, ×400 Рисунок 58 — Ткань ШМ вне зоны Рисунок 59 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 364). поражения ВПЧ (наблюдение № 364). Мембранная экспрессия Т-клеточного Мембранная экспрессия Т-клеточного маркера CD4 в единичных лимфоцитах маркера CD8 в единичных лимфоцитах стромы, ×400 стромы и в базальных клетках многослойного плоского эпителия, ×400 Рисунки 56–59: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 126 NK1-позитивные клетки в ткани ШМ вне зоны поражения ВПЧ определялись во всех тридцати случаях. Как видно из рисунка 85, на их долю приходилось около 3% клеток в клеточном инфильтрате. Экспрессия была умеренной, мембранной (рисунок 57). Как правило, NК1-позитивные клетки располагались дискретно, субэпителиально. Следует отметить, что NK1-позитивные лимфоциты располагались рядом с сосудами венулярного и капиллярного типа, вокруг артериол позитивных клеток выявлено не было. Экспрессия CD4 была выявлена во всех случаях. На долю этой популяции Т-клеток пришлось 3% от всего клеточного инфильтрата (рисунок 86). Иммунодетекция CD4 была от слабой до умеренной, мембранная (рисунок 58). CD4-позитивные клетки располагались дискретно, субэпителиально, рядом с сосудами венулярного и капиллярного типов. Вокруг артериол данные клетки не выявлены. Иммунодетекция CD8 была выявлена во всех исследуемых случаях, экспрессия имела мембранный характер, умеренная (рисунок 59). На долю данной популяции Т-лимфоцитов пришлось около 5% всего клеточного инфильтрата (рисунок 86). CD8-позитивные лимфоциты располагались одиночно, как субэпителиально, так и в более глубоких отделах стромы, но преимущественно рядом с венулами и капиллярами. Вокруг артериол данные клетки выявлены не были. При анализе экспрессии CD79α маркера В-лимфоцитов положительные клетки обнаруживались во всех случаях. Экспрессия была умеренная, мембранная (рисунок 61). На долю данной популяции пришлось около 6% всего клеточного инфильтрата. В-лимфоциты располагались преимущественно субэпителиально. Данная клеточная популяция обнаруживалась и в более глубоких отделах стромы, причем исключительно вокруг венулярного и капиллярного отделов МЦР. Экспрессия СD138 (маркера плазматических клеток) выявлена в 24 случаях из тридцати. 127 Рисунок 60 — Ткань ШМ вне зоны Рисунок 61 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 364). поражения ВПЧ (наблюдение № 364). Слабая цитоплазматическая экспрес- Участок эктопии. Цитоплазматическая сия CD138 в единичных клетках стро- экспрессия В-клеточного маркера мы и выраженная экспрессия в клетках CD79α в единичных лимфоцитах базального и шиповатого слоев много- стромы, ×400 слойного плоского эпителия, ×100 Рисунок 62 — Ткань ШМ вне зоны Рисунок 63 — Ткань ШМ вне зоны поражения ВПЧ (наблюдение № 142). поражения ВПЧ (наблюдение № 131). Экспрессия NGFR в клетках базального Выраженная экспрессия NGFR в нервслоя многослойного плоского эпителия ных структурах стромы, ×400 и единичных клетках стромы, ×400 128 Рисунки 60–63: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Иммунодетекция была умеренной, цитоплазматической. На долю данных клеток пришлось 3% всего клеточного инфильтрата. Плазматические клетки располагались преимущественно субэпителиально и дискретно, исключительно вокруг венул и капилляров. Рядом с артериолами данные клетки не выявлены. Следует отметить, что выраженная цитоплазматическая экспрессия CD138 также была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия (рисунок 60). При анализе экспрессии эндотелиального маркера (CD34) положительной она была во всех исследуемых случаях и во всех исследуемых зонах. Была выявлена выраженная мембранная иммунодетекция в эндотелиальных клетках всех типов сосудов (рисунки 38, 39). Экспрессия NGFR (рецептор фактора роста нервов) в нервных структурах в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ была выявлена во всех исследуемых случаях. Отмечалась выраженная иммунодетекция в нервных волокнах в данной зоне (рисунок 63). При этом большинство нервных волокон располагалось в глубоких отделах стромы (на отдалении от покровного эпителия ШМ). Следует отметить, что данное антитело накапливалось в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия (рисунок 62). При этом экспрессия была слабой, а в редких случаях умеренной. В ряде наблюдений отмечалась неравномерность экспрессии NGFR в клетках эпителия. На протяженности всего среза встречались участки с негативной реакцией. Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ. Анализируя экспрессию маркера апоптоза р53, следует отметить, что иммунодетекция данного маркера была очень вариабельна, что зависело от морфологических изменений при ВПЧ поражении в ШМ и степени ЦИН многослойного плоского эпителия. 129 Так, при ЦИН 1-й степени (10 случаев), как правило, отмечалась слабая или умеренная ядерная экспрессия р53 в клетках базального слоя МПЭ. В строме имели место единичные позитивные клетки. Рисунок 64 — Ткань ШМ в зоне Рисунок 65 — Ткань ШМ в зоне пора- поражения ВПЧ (наблюдение № 2). жения ВПЧ (наблюдение № 555), ЦИН Экспрессия Т-клеточного маркера NK1 2-й степени. Экспрессия NK1 на лимна лимфоцитах в глубоких отделах фоцитах в строме под многослойным стромы, ×200 плоским эпителием, ×400 Рисунок 66 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 2). Мембранная экспрессия Т-клеточного маркера CD8 в лимфоцитах стромы вокруг сосудов МЦР, ×400 130 Рисунок 67 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 555). ЦИН 2-й степени. Мембранная экспрессия CD8 в лимфоцитах клеточного инфильтрата стромы, ×400 Рисунки 64–67: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. В процентном соотношении это составило 4% и 0,7% соответственно. При эктопиях и ЦИН 2-й степени (10 случаев) отмечалась умеренная или сильная ядерная экспрессия данного моноклонального антитела в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия и единичных клетках стромы (фибробласты, лимфоциты). В процентном соотношении клетки эпителия — 10%, стромы — 3%. При ЦИН 3-й степени и кондиломах с инвертирующим ростом экспрессия р53 была обнаружена во всех 10 случаях и во всех полях зрения, как в клетках МПЭ, так и в клетках субэпителиального инфильтрата (рисунок 83). Экспрессия была выраженной. В процентном соотношении 16% и 10% соответственно. Экспрессия маркера супрессора апоптоза bcl-2 также отличалась вариабельностью и зависела от морфологических изменений в ШМ при ВПЧ инфекции. Так, в тканях ШМ, пораженных ВПЧ с признаками ЦИН 1-й степени (10 случаев), отмечалась выраженная экспрессия bcl-2 в клетках базального слоя МПЭ (рисунок 82) и в единичных клетках инфильтрата (лимфоциты). В про- 131 центном соотношении — 2% и 3% соответственно. В тканях ШМ с ЦИН 2-й степени при ВПЧ поражении экспрессия данного маркера была в клетках базального слоя, но не во всех полях зрения, и наблюдалась в 7 случаях из десяти в процентном соотношении 5% и 6% соответственно. В тканях ШМ с ЦИН 3-й степени экспрессия bcl-2 наблюдалась в 8 случаях из 10. Окрашивание было слабым в единичных клетках МПЭ, в процентном соотношении — 7% и 11% соответственно. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 также зависела от степени выраженности ЦИН в ткани ШМ при ВПЧ-поражении. Ki-67 определялся в клетках шиповатого и базального слоев МПЭ во всех 30 случаях. Окрашивание было ядерное от слабого до выраженного (рисунок 80, 81). В тканях шейки матки пролиферативный индекс по Ki-67 при ЦИН 1-й степени составил в эпителии 10–20% (в клеточном инфильтрате стромы не превышал 2%). При ЦИН 2-й степени пролиферативный индекс равнялся 25–45% в эпителии (в клеточном инфильтрате стромы 8–14%). При ЦИН 3-й степени в эпителии 50–80% (в клеточном инфильтрате стромы 25–30%). Основными клетками стромы, которые экспрессировали Ki-67, были лимфоциты и фибробласты. Количественное распределение экспрессии р53, bcl-2, Кi-67 в строме и эпителии в данной зоне представлено на рисунке 85. Как видно, наибольшая экспрессия в эпителии приходится на маркер пролиферативной активности Ki-67 (87%). За ним по частоте экспрессии стоит р53. На его долю приходится около 51%. Последнее место занимает маркер супрессии апоптоза bcl-2, на его долю приходится менее 12,5%. В строме количественное распределение данных маркеров меняется, но лидирующая роль остается за Ki-67 — 9%. Вторым по частоте экспрессии в строме был супрессор апоптоза bcl-2 — 7%. Наименьшая доля приходится на экспрессию p53 — 3%. Как видно на рисунке 85, доля р53 позитивных клеток в эпителии в 1,45 раза, а в строме в 4 раза больше в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ, чем в зоне поражения ВПЧ. Что касается Ki-67, то количество этих позитивных клеток в эпителии в 1,3 раза, а в строме в 2 раза больше в зоне поражения ВПЧ, чем в тканях ШМ вне зоны поражения. При ана- 132 лизе экспрессии bcl-2-позитивных клеток вывлено, что в эпителии этих клеток в 2,85 раза больше в зоне поражения ВПЧ, чем вне зоны поражения, а вот в строме картина противоположная — в зоне поражения количество bcl-2позитивных клеток в 5 раз меньше, чем вне зоны поражения. При этом имелись достоверные различия (p < 0,05) в количественном распределении выше указанных маркеров между зоной вне поражения ВПЧ и зоной поражения ВПЧ шейки матки. Как было отмечено выше, клеточный инфильтрат в зоне поражения ВПЧ был представлен следующими клеточными популяциями: фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами и гранулоцитарными лейкоцитами. Уточнение принадлежности клеток в инфильтрате к различным клеточным популяциям проводилось с помощью панели моноклональных антител: NK1, CD4, CD8, CD79α, СD138, CD68. Рисунок 68 — Ткань ШМ в зоне Рисунок 69 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 23). поражения ВПЧ (наблюдение № 555). ЦИН 1-й степени. Мембранная экс- Выраженный воспалительный прессия Т-клеточного маркера CD4 инфильтрат в строме, мембранная в лимфоцитах в субэпителиальных экспрессия CD4 в лимфоцитах отделах стромы, ×200 стромы, ×200 133 Рисунок 70 — Ткань ШМ в зоне Рисунок 71 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 365). поражения ВПЧ (наблюдение № 555). Участок эктопии, ЦИН 3-й степени. Цитоплазматическая экспрессия CD79α Цитоплазматическая экспрессия в лимфоидном фолликуле стромы, ×200 В-клеточного маркера CD79α в лимфоцитах стромы, ×400 Рисунки 68–71: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. В данной зоне поражения в клеточном инфильтрате преобладала экспрессия СD68 (рисунок 86). На его долю приходилось 85% всех клеточных популяций. Экспрессия от умеренной до ярко выраженной (рисунки 74, 75). Данный маркер определялся в макрофагах и клетках Лангерганса стромы, а также отмечена экспрессия в клетках, лежащих в просвете сосудов (моноцитах). Экспрессия CD68 выявлялась во всех случаях без исключения и во всех полях зрения. При сравнении этих двух зон (вне поражения и зоны поражения ВПЧ) видно, что количество CD68 позитивных клеток в 2,2 раза больше в зоне поражения, чем вне зоны поражения ВПЧ, при этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. В изучаемой зоне иммунодетекция Т-клеточных маркеров (рисунки 64–68) была вариабельна. NK1-позитивные клетки в данной зоне определялись во всех 134 случаях. Как видно из рисунка 86, на их долю приходилось около 10% клеток в клеточном инфильтрате. Экспрессия была умеренной, мембранной (рисунки 64, 65), как правило, позитивные клетки располагались в лимфоидном инфильтрате в глубоких слоях стромы (рисунок 64) или субэпителиально (рисунок 65). Следует отметить, что NK1-позитивные лимфоциты располагались рядом с сосудами венулярного и капиллярного типов. При сравнении этих двух зон видно, что количество NК1-позитивных клеток в 3,3 раза больше в зоне поражения, чем вне зоны поражения ВПЧ, при этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. Экспрессия CD4 была выявлена во всех исследуемых случаях, на долю этой популяции Т-клеток пришлось 7% от всего клеточного инфильтрата (рисунок 86). Иммунодетекция CD4 была умеренной, мембранной (рисунки 68, 69). CD4-позитивные клетки располагались дискретно, субэпителиально, рядом с сосудами венулярного и капиллярного типов. При сравнении зоны вне поражения и зоны поражения ВПЧ прослеживается, что количество CD4 позитивных клеток в 2,3 раза больше в зоне поражения, чем вне зоны поражения ВПЧ, при этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. Рисунок 72 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 555). Выраженная цитоплазматическая экспрессия CD138 маркера плазматических клеток в клеточном инфильтрате стромы, ×400 135 Рисунок 73 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 365). ЦИН 2-й степени. Умеренная цитоплазматическая экспрессия CD138 в клетках стромы и выраженная экспрессия в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия, ×400 Рисунок 74 — Ткань ШМ в зоне пора- Рисунок 75 — Ткань ШМ в зоне пора- жения ВПЧ (наблюдение № 23). Уме- жения ВПЧ (наблюдение № 365). Экто- ренная цитоплазматическая экспрессия пия, глубокие отделы стромы. ВыраCD68 в клетках стромы, ×400 женная цитоплазматическая экспрессия CD68 в клетках стромы, ×400 136 Рисунки 72–75: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Иммунодетекция CD8 была выявлена во всех случаях, экспрессия имела мембранный характер, умеренная (рисунки 66, 67). На долю данной популяции Т-лимфоцитов пришлось около 37% всего клеточного инфильтрата (рисунок 85). CD8-позитивные лимфоциты располагались одиночно или образовывали скопления. Данная популяция лимфоцитов располагалась как субэпителиально, так и в более глубоких отделах стромы, но преимущественно рядом с венулами и капиллярами. При сравнении зоны вне поражения и зоны поражения ВПЧ видно, что количество CD8-позитивных клеток в 7,4 раза больше в зоне поражения, чем вне зоны поражения ВПЧ. При этом имелись достоверные различия (p < 0,05) по данным показателям. При анализе экспрессии CD79α, маркера В-лимфоцитов положительные клетки обнаруживались во всех наблюдениях. Экспрессия была выраженная, мембранная (рисунки 70, 71). На долю данной популяции пришлось около 25% всего клеточного инфильтрата. В-лимфоциты располагались как субэпителиально в виде скоплений (рисунок 70) или одиночно лежащих клеток, так и образовывали крупные лимфоидные фолликулы со светлыми центрами (рисунок 71). Данная клеточная популяция обнаруживалась и в более глубоких отделах стромы, причем исключительно вокруг венулярного и капиллярного отделов МЦР. При сравнении зоны вне поражения и зоны поражения ВПЧ прослеживается, что количество CD79α позитивных клеток в 4,1 раза больше в зоне поражения, чем вне зоны поражения ВПЧ. При этом имелись достоверные различия (p < 0,05) по данным показателям. Экспрессия СD138 (маркера плазматических клеток) выявлена во всех тридцати случаях. Иммунодетекция была выраженной, мембранной или цитоплазматической, на долю данных клеток пришлось 10% всего клеточного инфильтрата (рисунок 86). 137 Рисунок 76 — Ткань ШМ в зоне Рисунок 77 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 552). поражения ВПЧ (наблюдение № 23). Умеренная цитоплазматическая экс- ЦИН 2-й степени. Экспрессия NGFR прессия CD68 в клетках стромы, ×400 в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия и единичных клетках стромы, ×400 Рисунок 78 — Ткань ШМ в зоне пора- Рисунок 79 — Ткань ШМ в зоне пора- жения ВПЧ (наблюдение № 365). Глу- жения ВПЧ (наблюдение № 365). Суб- бокие отделы стромы. Выраженная эпителиальная зона, ЦИН 3-й степени. экспрессия NGFR в нервных структу- Выраженная экспрессия NGFR в клет- рах стромы, ×200 ках многослойного плоского эпителия и в нервных структурах и клетках инфильтрата стромы, ×400 138 Рисунки 76–79: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Рисунок 80 — Ткань ШМ в зоне Рисунок 81 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ, ЦИН 1-й степени поражения ВПЧ, плоская кондилома (наблюдение № 23). Экспрессия Ki-67 (наблюдение № 131). Экспрессия Ki-67 в единичных клетках базального в клетках базального и шиповатого и шиповатого слоев многослойного слоев многослойного плоского плоского эпителия, ×400 эпителия и клетках стромы, ×400 Рисунок 82 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 365). Выраженная цитоплазматическая экспрессия bcl-2 в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия и клетках стромы (лимфоцитах и фибробластах), ×400 139 Рисунок 83 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ, эктопия, ЦИН 2–3-й степени (наблюдение № 555). Умеренная ядерная экспрессия р53 в клетках многослойного плоского эпителия и единичных клетках стромы, ×400 Рисунки 80–83: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Рисунок 84 — Ткань ШМ в зоне поражения ВПЧ (наблюдение № 364). Участок эктопии. Видна густая сеть сосудов ×400. Стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод (СD34), докраска гематоксилином 140 Плазматические клетки располагались как субэпителиально, так и в глубоких слоях стромы, образовывая скопления (рисунок 72). Часто данные клетки лежали вокруг венул и капилляров. Следует отметить, что выраженная цитоплазматическая экспрессия CD138 также была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия (рисунок 73), экспрессия зависела от степени ЦИН в МПЭ шейки матки. Иммунодетекция CD138 в МПЭ усиливалась от ЦИН 1 к ЦИН 2 и ЦИН 3-й степени, и наиболее ярко была выражена в ЦИН 3, где экспрессия наблюдалась во всех слоях МПЭ (рисунок 73). При сравнении зоны вне поражения и зоны поражения ВПЧ прослеживается, что количество CD138 позитивных клеток в 3,3 раза больше в зоне поражения, чем вне зоны поражения ВПЧ, при этом имелись достоверные различия (p < 0,05) по данным показателям. При анализе экспрессии эндотелиального маркера (CD34) положительная экспрессия была обнаружена во всех исследуемых случаях и во всех исследуемых зонах. Была выявлена выраженная мембранная иммунодетекция в эндотелиальных клетках всех типов сосудов (рисунки 45–51, 84). 141 800 700 600 500 400 p53 300 Ki-67 200 bcl-2 100 0 зона поражения эпителий вне зоны поражения эпителий зона поражения строма вне зоны поражения строма Рисунок 85 — Распределение экспрессии р53, bcl-2, Ki-67 в ткани ШМ при поражении ВПЧ Также было проведено определение площади сосудистого русла на срезах, окрашенных данным антителом, с помощью программы «ВидеоТест 4.0». При сравнении площади сосудистого русла в зоне вне поражения ВПЧ с зоной поражения ВПЧ видно (рисунок 87), что площадь сосудистого русла в зоне поражения ВПЧ на 21,92% больше, чем вне зоны поражения, при этом различия были значимы (p < 0,05). Экспрессия NGFR в нервных структурах в тканях ШМ в зоне поражения ВПЧ была выявлена во всех исследуемых случаях. Отмечалась выраженная мембранная иммунодетекция в нервных волокнах в данной зоне ШМ. При этом нервные волокна располагались как в глубоких отделах стромы (рисунок 78), так и субэпителиально, также обнаруживались рядом с клеточным воспалительным инфильтратом. В ряде случаев клетки воспалительного инфильтрата окружали NGFR-позитивные нервные волокна. Следует отметить, что данные антитела накапливались в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия (рисунки 77, 79). 142 8000 7000 6000 5000 вне зоны поражения ВПЧ 4000 зона поражения ВПЧ 3000 2000 1000 0 СD4 СD79α СD138 СD8 NK1 СD68 Рисунок 86 — Распределение иммунодетекции клеточных маркеров (CD4, CD79α, CD138, СD8, NK1, C 68) в ткани ШМ при поражении ВПЧ При этом экспрессия была умеренной или ярко выраженной. Обращает на себя внимание, что экспрессия данного маркера в клетках МПЭ зависела от степени ЦИН. Так, при ЦИН 1-й степени отмечалась выраженная, но неравномерная экспрессия NGFR в клетках эпителия на протяженности всего среза, иногда встречались участки с негативной реакцией. При ЦИН 2-й степени экспрессия NGFR была равномерной и хорошо выраженной в базальном и парабазальном слоях МПЭ. В нервных волокнах сохранялась умеренная экспрессия данного антитела. При ЦИН 3-й степени отмечалась яркая экспрессия данного маркера во всех слоях МПЭ, в нервных волокнах экспрессия была слабо или умеренно выраженная. Экспрессия данного антитела была обнаружена даже в клетках воспалительного инфильтрата (лимфоциты, макрофаги). Как видно из рисунка 87, в ткани ШМ в зоне поражения ВПЧ количество NGFR-позитивных элементов на 21,10% больше, чем вне зоны поражения, при этом различия были достоверны (p < 0,05). 143 70 60 50 40 30 20 10 0 Площадь сосудистого русла (доля в %) Экспрессия NGFR (доля в %) вне зоны поражения ВПЧ 39,04 39,95 зона поражения ВПЧ 60,96 61,05 ВПЧ Рисунок 87 — Площадь сосудистого русла (по CD34) и экспрессия NGFR в ткани ШМ при поражении ВПЧ 4.3. Корреляционный анализ клеточных популяций вокруг разных сосудов микроциркуляторного русла в тканях шейки матки при папилломавирусных поражениях Корреляционный анализ проводился в два этапа. Вначале был выполнен парный корреляционный анализ клеточных популяций в ткани ШМ в зоне вне поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ вокруг различных сосудистых единиц (артериол, венул, капилляров). Парные корреляции не дают полного представления о происходящих межклеточных взаимоотношениях и не исключают влияния иных клеточных элементов на выявленные корреляционные связи, поэтому был проведен частный корреляционный анализ. Следует отметить, что система частных корреляций между клеточными популяциями вокруг различных звеньев сосудистого русла была представлена многочисленными и разнообразными по си- 144 ле и характеру взаимосвязями. Так, вне зоны поражения ВПЧ — вокруг венулярного отдела МЦР было выявлено 11 корреляционных связей, вокруг капиллярного отдела — 20, а вокруг артериол — 40. В зоне поражения ВПЧ количество корреляционных связей возрастает в десятки раз и выражается следующими показателями: вокруг венулярного отдела МЦР было обнаружено 376 корреляционных связей, вокруг капиллярного отдела — 449, а вокруг артериол — 405. Все представленные корреляционные взаимосвязи являлись статистически значимыми (коэффициент корреляции /r/ — от 0,3 до 0,5, p < 0,05), имели как положительные, так и отрицательные значения. Провести полноценный анализ полученных результатов (всего было выявлено 1230 корреляционных связей в зоне поражения ВПЧ и 71 вне зоны поражения ВПЧ) не представлялось возможным: во-первых, из-за огромного их количества, а во-вторых, они не дают полного представления о происходящих межклеточных взаимоотношениях и не исключают влияния иных клеточных элементов на выявленные корреляционные связи. Поэтому был проведен частный корреляционный анализ. Частный корреляционный анализ позволил получить корреляционную матрицу, в которой корреляции между двумя клеточными популяциями выявлены при исключении влияния иных клеточных элементов. Полученные матрицы явились исходным материалом для проведения факторного анализа. Он позволил провести редукцию имеющейся обширной информации путем перехода к новым обобщенным переменным (главные компоненты), которые независимы между собой. Исходными данными для компонентного анализа вне зоны поражения ВПЧ вокруг различных сосудов были коэффициенты парных частных корреляций (таблицы 15–17). 145 Таблица 15 — Значения коэффициентов парных частных корреляций в ткани ШМ вокруг артериол вне зоны поражения ВПЧ ФЦ ФБ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 –0,1172 –0,3798 0,1779 0,3089 ФБ –0,1172 1 –0,2142 0,0900 0,1128 МФ –0,3798 –0,2142 1 0,3843 0,5489 ГРЛ 0,1779 0,0900 0,3843 1 –0,2375 ПАР 0,3089 0,1128 0,5489 –0,2375 1 Таблица 16 — Значения коэффициентов парных частных корреляций в ткани ШМ вокруг венул вне зоны поражения ВПЧ ФЦ ФБ МФ ПАР ФЦ 1 0,1171 -0,0245 0,0534 ФБ 0,1171 1 -0,1535 –0,1287 МФ 0,1171 –0,1928 1 –0,1287 ПАР 0,0534 –0,1287 0,2326 1 Учитывая, что при парном корреляционном анализе вокруг артериол, венул и капилляров была обнаружена 71 достоверная связь (диапазон /r/ от –0,1172 до 0,5406, p < 0,05) между различными клеточными популяциями, в результате факторного анализа после редукции исходных данных количество достоверных частных корреляционных связей претерпело конкретные изменения, которые мы приводим ниже. 146 Таблица 17 — Значения коэффициентов парных частных корреляций в ткани ШМ вокруг капилляров вне зоны поражения ВПЧ ФЦ ФБ ЛФ МФ ПАР ФЦ 1 0,1463 –0,0362 –0,0616 –0,0230 ФБ 0,1463 1 –0,0472 –0,1624 –0,0471 ЛФ –0,0362 –0,0472 1 –0,0225 –0,0102 МФ –0,0616 –0,1624 –0,0225 1 0,3061 ПАР –0,0230 –0,0471 –0,0102 0,3061 1 В тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ вокруг различных звеньев МЦР с помощью факторного анализа (объем выборки для артериол и венул составил: n = 299 единиц наблюдения, а для капилляров n = 279) было установлено, что наиболее активным в плане формирования клеточных корреляционных связей является венулярный отдел МЦР. Так, вокруг венул в данной зоне были выявлены три главных компоненты с процентом дисперсии 81,153% (таблица 19). Вокруг артериол накопленная информативность трех главных компонент составила 79,287% (таблица 18). Вокруг капиллярного отдела МЦР в данной зоне накопленная информативность трех главных компонент составила 69,537% (таблица 20). Для анализа и интерпретации выявленной факторной структуры использовали факторные нагрузки, значение которых больше или равно 0,3 (в таблицах 21–23 они выделены значком*). 147 Таблица 18 — Собственные значения главных компонент в ткани ШМ вокруг артериол вне зоны поражения ВПЧ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,59051 31,089 31,089 2 1,29708 25,354 56,443 3 1,16869 22,844 79,287 4 1,05966 20,713 100 5 0 0 100 информативность (процент дисперсии) Таблица 19 — Собственные значения главных компонент в ткани ШМ вокруг венул вне зоны поражения ВПЧ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,35277 33,819 33,819 2 1,07331 26,833 60,652 3 0,820045 20,501 81,153 4 0,753872 18,847 100 информативность (процент дисперсии) Таблица 20 — Собственные значения главных компонент в ткани ШМ вокруг капилляров вне зоны поражения ВПЧ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,40174 28,035 28,035 2 1,10638 22,128 50,162 3 0,968742 19,375 69,537 4 0,853624 17,072 86,610 5 0,66952 13,390 100,000 информативность (процент дисперсии) 148 Таблица 21 — Факторные нагрузки в ткани ШМ вокруг артериол вне зоны поражения ВПЧ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,116596 0,0911754 0,996275* ФБ –0,0929567 –0,146565 0,00045472 ЛФ 0,670292* 0,590302* –0,488822* МФ –0,213713 0,958707* 0,112764 ПАР 0,978075* –0,0658272 0,191083 Вокруг артериол в ткани ШМ в данной зоне (таблица 21) с первым фактором (который мы обозначили в главе 3 как стромообразующий), имеющим наибольшее собственное значение 1,59051 и информативность 31,089%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и ПАР. Со вторым фактором, имеющим собственное значение 1,29708 и информативность 25,354%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и МФ. Данный фактор мы определили как дезинтегрирующий (глава 2). С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,16869 и информативность 22,844%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ и ЛФ. Вокруг венулярного звена МЦР (таблица 22) с первым (стромообразующим) фактором, имеющим наибольшее собственное значение 1,35277 и информативность 33,819%, наиболее тесно связаны клеточные элементы МФ и ПАР. 149 Таблица 22 — Факторные нагрузки в ткани ШМ вокруг венул вне зоны поражения ВПЧ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,0138 0,9698* 0,0718 ФБ –0,097 0,0705 0,9887* МФ 0,8154* –0,169 –0,013 ПАР 0,746551* 0,202705 –0,12789 Со вторым дезинтегрирующим фактором, который имел собственное значение 1,07331 и информативность 26,833%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ. Таблица 23 — Факторные нагрузки в ткани ШМ вокруг капилляров вне зоны поражения ВПЧ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,0728831 0,786946* 0,0334351 ФБ –0,169816 0,708319* –0,0776742 ЛФ –0,0191816 –0,0365239 0,995675* МФ 0,782765* –0,182474 –0,0428381 ПАР 0,817092* 0,0745367 0,0209556 С третьим (пролиферирующим) фактором, имеющим собственное значение 0,820045 и информативность 20,501%, наиболее статистически тесно связаны клеточные элементы ФБ. 150 Вокруг капиллярного звена МЦР в ткани ШМ вне зоны поражения ВПЧ с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,40174 и информативность 28,035%, наиболее тесно связаны клеточные элементы МФ и ПАР. Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,10638 и информативность 22,128%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ и ФБ. С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 0,968742 и информативность 19,375%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ. Таким образом, проведя факторный анализ в данной зоне, мы видим, что по сравнению с интактной ШМ в зоне вне ВПЧ-поражения имеются выраженные изменения в корреляционных взаимосвязях между клеточными популяциями вокруг всех звеньев сосудистого русла. При этом нарушения выявляются во всех трех факторах: стромообразующем, дезинтегрирующем и пролиферирующем, что позволяет предположить, что уже даже в данной зоне идут изменения в межклеточных взаимодействиях, которые впоследствии могут привести к прогрессии ВПЧ-поражений и формированию типичных морфологических изменений, характерных для данной патологии. Исходными данными для компонентного анализа в ткани ШМ в зоне поражения ВПЧ вокруг различных сосудов были коэффициенты парных корреляций (таблицы 24–26). При парном корреляционном анализе вокруг артериол, венул и капилляров было обнаружено 1230 достоверных связей между клеточными популяциями. Однако в результате факторного анализа произошла редукция исходных данных и частные корреляционные связи претерпели определенные изменения. 151 Таблица 24 — Значения коэффициентов парных корреляций в ткани ШМ вокруг артериол в зоне поражения ВПЧ ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,0318 0,1100 –0,0071 –0,2788 0,3581 0,0917 ФБ 0,0318 1 –0,0255 –0,0845 –0,1921 0,1199 0,0162 ЛФ 0,1100 –0,0255 1 0,2702 0,3178 0,1002 0,1733 ПЛ –0,0071 –0,0845 0,2702 1 0,4833 0,2610 –0,0016 МФ –0,2788 –0,1921 0,3178 0,4833 1 0,1905 0,0252 ГРЛ 0,3581 0,1199 0,1002 0,2610 0,1905 1 0,0687 ПАР 0,0917 0,0162 0,1733 –0,0016 0,0252 0,0687 1 Таблица 25 — Значения коэффициентов парных корреляций в ткани ШМ вокруг венул в зоне поражения ВПЧ ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,3173 0,2509 0,1945 –0,1105 0,1710 0,0068 ФБ 0,3173 1 –0,0817 –0,1242 –0,2147 –0,0869 –0,0566 ЛФ 0,2509 –0,0817 1 0,4492 0,1591 –0,1179 –0,0027 ПЛ 0,1945 –0,1242 0,4492 1 0,4357 0,0217 0,0435 МФ –0,1105 –0,2147 0,1591 0,4357 1 0,1472 0,0429 ГРЛ 0,1710 –0,0869 –0,1179 0,0217 0,1472 1 –0,1517 ПАР 0,0068 –0,0566 –0,0027 0,0435 0,0429 –0,1517 1 152 Таблица 26 — Значения коэффициентов парных корреляций в ткани ШМ вокруг капилляров в зоне поражения ВПЧ ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,3903 0,3175 0,0948 –0,0336 0,0280 0,1402 ФБ 0,3903 1 –0,1234 –0,1611 –0,1806 –0,2588 –0,1166 ЛФ 0,3175 –0,1234 1 0,2483 0,3353 0,1120 –0,0586 ПЛ 0,0948 –0,1611 0,2483 1 0,2733 0,2105 0,1683 МФ –0,0336 –0,1806 0,3353 0,2733 1 0,0727 0,0901 ГРЛ 0,0280 –0,2588 0,1120 0,2105 0,0727 1 –0,2299 ПАР 0,1402 –0,1166 –0,0586 0,1683 0,0901 –0,2299 1 В тканях ШМ в зоне поражения ВПЧ вокруг различных звеньев сосудистого русла с помощью факторного анализа (объем выборки для венул и капилляров составил n = 299 единиц наблюдения, а для артериол — n = 298) было установлено, что наиболее активным в плане формирования клеточных корреляционных связей является капиллярный отдел МЦР. Так, вокруг капилляров в зоне ВПЧпоражения были выявлены три главных компоненты с процентом дисперсии 64,376% (таблица 29). Вокруг венулярного звена накопленная информативность трех главных компонент составила 63,558% (таблица 28). Вокруг артериол в данной зоне накопленная информативность трех главных компонент составила 62,662% (таблица 27). Однако следует отметить, что разница по накопленной информативности между этими тремя звеньями МЦР незначительная (таблицы 27–29). Данный факт позволяет предположить, что все три звена активно влияют на формирование корреляционных взаимосвязей в зоне поражения ВПЧ, что было подтверждено при дальнейшем факторном анализе. Далее для анализа и интерпретации выявленной факторной структуры были использованы факторные нагрузки, значение которых больше или равно 0,3 (в таблицах 30–32 они выделены значком*). 153 Таблица 27 — Собственные значения главных компонент в ткани ШМ вокруг артериол в зоне поражения ВПЧ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,88301 26,9 26,9 2 1,4607 20,867 47,767 3 1,04263 14,895 62,662 4 0,957317 13,676 76,338 5 0,766826 10,955 87,293 6 0,549745 7,853 95,146 7 0,339773 4,854 100 информативность (процент дисперсии) Таблица 28 — Собственные значения главных компонент в ткани ШМ вокруг венул в зоне поражения ВПЧ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,80955 25,851 25,851 2 1,43644 20,521 46,371 3 1,20305 17,186 63,558 4 0,933866 13,341 76,899 5 0,759592 10,851 87,75 6 0,45486 6,498 94,248 7 0,402643 5,752 100 информативность (процент дисперсии) 154 Таблица 29 — Собственные значения главных компонент в ткани ШМ вокруг капилляров в зоне поражения ВПЧ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,8089 25,841 25,841 2 1,47679 21,097 46,938 3 1,22064 17,438 64,376 4 0,896588 12,808 77,185 5 0,70502 10,072 87,256 6 0,59026 8,432 95,689 7 0,301796 4,311 100,000 информативность (процент дисперсии) Таблица 30 — Факторные нагрузки в ткани ШМ вокруг артериол в зоне поражения ВПЧ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ –0,11641 0,785387* 0,221987 ФБ –0,20503 0,414824* –0,11619 ЛФ 0,462243* 0,033322 0,571834* ПЛ 0,811387* 0,082185 –0,00724 МФ 0,830808* –0,27069 0,066892 ГРЛ 0,429931* 0,739797* –0,01404 ПАР –0,0964 0,022632 0,872929* В ткани ШМ в зоне ВПЧ поражения вокруг артериол с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,88301 155 и информативность 26,9%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ, ПЛ, MФ, ГРЛ. Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,4607 и информативность 20,867%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ФБ и ГРЛ. С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,04263 и информативность 14,895%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и ПАР. В данной зоне вокруг венулярного отрезка МЦР с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,80955 и информативность 25,851%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ЛФ, ПЛ, МФ. Таблица 31 — Факторные нагрузки в ткани ШМ вокруг венул в зоне поражения ВПЧ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,385542* 0,748715* 0,213381 ФБ –0,14662 0,763555* –0,01952 ЛФ 0,751958* 0,160856 –0,19686 ПЛ 0,852568* –0,08785 0,007772 МФ 0,5625* –0,51238* 0,191847 ГРЛ 0,0501 –0,06233 0,860349* ПАР 0,098 –0,08851 –0,58733* Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,43644 и информативность 20,521%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ФБ и МФ. 156 С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,20305 и информативность 17,186%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ГРЛ и ПАР. В зоне поражения ВПЧ вокруг капиллярного звена МЦР с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,8089 и информативность 25,841%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФБ, ЛФ, ПЛ, МФ и ГРЛ. Таблица 32 — Факторные нагрузки в ткани ШМ вокруг капилляров в зоне поражения ВПЧ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,247531 0,854442* 0,0434186 ФБ –0,381052* 0,759879* 0,0719087 ЛФ 0,681214* 0,326543* –0,223424 ПЛ 0,701315* –0,0370181 0,0421888 МФ 0,671344* –0,135474 0,0620541 ГРЛ 0,313294* –0,161256 –0,704894* ПАР 0,27594 –0,0527646 0,834782* Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,47679 и информативность 21,09%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ФБ и ЛФ. С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,22064 и информативность 17,43%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ГРЛ и ПАР. Проведенный анализ показывает, что в тканях ШМ в зоне поражения ВПЧ по сравнению с зоной вне ВПЧ-поражения увеличивается количество клеточных 157 популяций, которые формируют корреляционные связи. При этом изменения наблюдаются вокруг всех трех звеньев МЦР и касаются всех трех выделенных факторов (стромообразующего, дезинтегрирующего и пролиферирующего). Так, вокруг артериол, венул и капилляров вне зоны ВПЧ наблюдались только по одной или две клеточные популяции, которые были связаны с первым, вторым и третьим фактором, а в зоне поражения — с ними связано три, четыре или пять клеточных популяций. Таким образом, наблюдается увеличение количества разных клеточных популяций, участвующих в корреляционных связях, тем самым нарушая тканевой гомеостаз. Эти нарушения в последующем ведут к изменению стромально-паренхиматозных взаимоотношений в ткани ШМ при ВПЧ-инфекции и, возможно, вызывают прогрессию процесса, способствуют опухолевой трансформации эпителия. 158 ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ СОСУДИСТОГО КОМПОНЕНТА КОММУНИКАЦИОННЫХ СИСТЕМ В ТКАНЯХ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ Проанализирован материал от 30 женщин, страдающих плоскоклеточным раком ШМ. В данной группе было выделено две зоны: зона опухоли и контрлатеральная зона (КЛЗ) от опухоли. 5.1. Морфологическая и морфометрическая характеристика сосудистого компонента (сосуды микроциркуляторного русла и клеточные популяции вокруг них) коммуникационных систем в тканях рака шейки матки В ткани шейки матки контрлатеральной зоны от РШМ наблюдались признаки папиломавирусного поражения и явления цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени выраженности (рисунки 88–97). Следует отметить, что изменения, наблюдаемые в сосудах и в строме данной зоны, были близки к изменениям, которые отмечались в ткани ШМ зоны поражения ВПЧ (глава 4). Сосуды МЦР на светооптическом уровне сохраняли типичное гистологическое строение: артериолы имели трехслойное строение, характерное для сосудов артериального типа. Строение венул и капилляров также соответствовало классическим описаниям данных структур. Коллагеновый и эластический каркас во всех типах сосудов был сохранен, однако отмечались истончение и разволокнение коллагеновых и эластиновых волокон, особенно в зонах выраженного клеточного инфильтрата и ЦИН 2–3-й степени (рисунки 88–90). Следует отметить, что по мере нарастания дисплазии многослойного плоского эпителия отмечалась перестройка сосудов МЦР. Так, при ЦИН 1-й степени в субэпите- 159 лиальной зоне в строме обнаруживались немногочисленные капилляры со слабо выраженными признаками пролиферации эндотелия (рисунки 92, 94). Как правило, диаметр данных сосудов небольшой, и располагались они горизонтально по отношению к многослойному плоскому эпителию (рисунки 94, 98, 99). В тканях шейки матки с ЦИН 2-й степени наблюдались изменения гистоархитектоники сосудов. Венулы и капилляры имели вертикальное расположение и нередко подрастали к многослойному плоскому эпителию (рисунки 95, 96, 99). При ЦИН 3-й степени в тканях ШМ наблюдалась перестройка сосудистого русла, увеличивалось количество капилляров и венул в субэпителиальной зоне, отмечалось увеличение венул и капилляров, подрастающих вплотную к базальной мембране (рисунки 88, 89). В отдельных случаях отмечалось врастание сосудов в многослойный плоский эпителий (рисунки 90, 100, 101). Также имел место обильный лимфоцитарный, плазмоцитарный и гистиоцитарный инфильтрат, который располагался периваскулярно в субэпителиальной зоне (рисунок 93, 97). Рисунок 88 — Ткань КЛЗ (признаки ЦИН 3-й ст./carcinoma in situ; наблюдение № 56). Видны сосуды различного строения (капилляры, венулы, артериолы), в субэпителиальных отделах располагается воспалительный инфильтрат. Окраска гематоксилином и эозином, ×100 160 Рисунок 89 — Ткань КЛЗ (признаки ЦИН 3-й ст./carcinoma in situ; наблюдение № 56). Субэпителиально обилие капилляров, подрастающих к базальной мембране. Окраска по Габу-Дыбану, ×100 Рисунок 90 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 91 — Ткань КЛЗ (признаки ЦИН 3-й ст./carcinoma in situ; наблю- ЦИН 2-й ст.; наблюдение № 47). Суб- дение № 56). Разрастание зрелой со- эпителиально лежит большое количе- единительной ткани вокруг венул и ар- ство вертикально расположенных териол. Окраска по ван Гизону, ×100 капилляров и венул. Окраска по ГабуДыбану, ×100 161 Рисунок 92 — Ткань КЛЗ (наблюдение Рисунок 93 — Ткань КЛЗ (признаки № 45). Видны сосуды типичного строе- ЦИН 3-й ст./carcinoma in situ) (набл. ния (капилляры, венулы, артериолы). № 56). Субэпителиально воспалитель- Окраска гематоксилином и эозином, ный инфильтрат вокруг сосудов. Окра- ×100 ска гематоксилином и эозином, ×200 Рисунок 94 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 95 — Ткань КЛЗ (признаки ЦИН 1-й ст.; наблюдение № 47). Суб- ЦИН 2-й ст.; наблюдение № 49). Суб- эпителиально видны множественные эпителиально видны множественные капилляры с пролиферацией эндотелия. капилляры с пролиферацией эндотелия Окраска гематоксилином и эозином, и подрастанием к эпителию. Окраска ×200 по Габу-Дыбану, ×400 162 Рисунок 96 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 97 — Ткань КЛЗ (глубокий ЦИН 2–3-й ст.; наблюдение № 56). Суб- отдел; наблюдение № 56), видны мноэпителиально видна венула с врастани- жественные венулы с пролиферацией ем в эпителий. Окраска по Габу- эндотелия и воспалительным инфиль- Дыбану, ×400 тратом вокруг. Окраска по ГабуДыбану, ×400 100 Рисунок 98 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 99 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ; наблюдение № 45). Капилляры, ВПЧ; наблюдение № 45). Видна густая подрастающие к эпителию, ×100 сеть сосудов (капилляры, венулы), ×400 163 Рисунок 100 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 101 — Ткань КЛЗ (признаки ЦИН 3-й ст./carcinoma in situ; наблюде- ЦИН 3-й степени; наблюдение № 56). ние № 56). Капилляры, подрастающие Видна густая сеть сосудов (капилляры, к эпителию, ×200 венулы), ×200 Рисунки 98–101: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод (СD34), докраска гематоксилином. Ткань плоскоклеточного РШМ (зона опухоли) была представлена различными гистологическими вариантами плоскоклеточных раков шейки матки. Следует отметить неоднородность строения опухолевой ткани. В одних участках она имела вид крупных округлых островков опухолевых клеток, разнообразных по величине и форме, с тонкими прослойками соединительной ткани, в других — опухолевые клетки разъединялись мощным слоем фиброзной ткани, в которой залегали кровеносные сосуды и определялись нервные структуры. Микрососуды были представлены артериолами, капиллярами и венулами и имели классическое строение. Однако присутствовали псевдососуды по типу примитивных тканевых каналов и щелей, ограниченных опухолевыми клетками. Следует отметить нарушение в гистотопографии сосудов микроциркуляторного русла. Рядом c раковыми комплексами находились преимущественно сосуды венозного и капиллярного типов (рисунки 102, 103). Они образовывали густую сосудистую сеть (рисунки 106, 109). Сосуды артериального типа чаще были окру- 164 жены мощными прослойками соединительной ткани. Эластический и коллагеновый каркас сосудов имел признаки выраженной дезорганизации (рисунки 104, 105), на отдельных участках полностью разрушен опухолевыми клетками (рисунок 108). Также отмечались опухолевая инвазия и опухолевые эмболы в сосудах. В сосудах капиллярного типа встречались явления пролиферации эндотелия. Вокруг сосудов венулярного и капиллярного типов наблюдалась выраженная лимфо-плазмоцитарная и гистиоцитарная инфильтрация (рисунок 107). Морфометрический анализ клеточного инфильтрата стромы в ткани шейки матки контрлатеральной зоны от РШМ и в зоне опухоли вокруг сосудов МЦР показал, что клетки стромы были представлены фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами и полиморфноядерными лейкоцитами. Вокруг сосудов МЦР количественный состав клеточного инфильтрата стромы вне зоны поражения ВПЧ и в зоне поражения ВПЧ представлен в таблицах 33–35. Рисунок 102 — Ткань РШМ в зоне опу- Рисунок 103 — Ткань РШМ в зоне холи (наблюдение № 39). Видны мелкие опухоли (наблюдение № 39). Опухо- опухолевые фокусы, рядом с ними лежат левые комплексы врастают в сосуды. капилляры и венулы. Артериолы находятся на отдалении, они окружены соединительнотканными прослойками. Окраска гематоксилином и эозином, ×100 Окраска по ван Гизону, ×200 165 Рисунок 104 — Ткань РШМ в зоне опу- Рисунок 105 — Ткань РШМ в зоне холи (наблюдение № 39). Видны мно- опухоли (наблюдение № 39). Видны жественные опухолевые комплексы, венулы с дезорганизацией эластиче- окруженные сосудами различного ских и коллагеновых волокон стенки строения с дезорганизацией сосудистой с врастанием опухолевых клеток стенки. Окраска по Габу-Дыбану, ×200 в сосудистую стенку. Окраска по Габу-Дыбану, ×400 Рисунок 106 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 29). Густая сосудистая сеть вокруг опухолевых комплексов, ×100 166 Рисунок 107 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 29). В строме гнезда опухолевых клеток, вокруг капилляры, венулы и лимфогистиоцитарный инфильтрат, ×400 Рисунок 108 — Ткань РШМ в зоне опу- Рисунок 109 — Ткань РШМ в зоне опу- холи (наблюдение № 34). Крупные фо- холи (наблюдение № 39). Слева МПЭ кусы опухолевых клеток, внутри кото- с признаками ЦИН 3-й ст. и хорошо рых расположены сосуды МЦР с дез- выраженной сетью сосудов, которая организацией стенок, ×100 частично окружает комплексы инвазивного плоскоклеточного рака, ×100 Рисунки 106–109: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод (СD34), докраска гематоксилином. 167 Задача статистического анализа результатов морфометрических исследований заключалась в проверке статистической гипотезы, которая выражается в том, что статистические распределения изучаемых клеточных элементов в зоне опухоли и вне зоны опухоли не имеют значимых различий. Альтернативная статистическая гипотеза состояла в том, что имеют место значимые различия между статистическими распределениями изучаемых клеточных элементов в зоне опухоли и вне зоны опухоли. В качестве показателя, характеризующего различия статистических распределений, обычно используют среднее арифметическое значение, которое количественно характеризует типичное (наиболее вероятное) значение изучаемого признака. Таблица 33 — Распределение клеточных популяций вокруг артериол в ткани РШМ и контрлатеральной зоне Средний ранг выборки Статистика критерия Зона Контрлатеральная Критерий опухоли зона от РМШ Манна—Уитни V1 V2 W ФЦ 305,5 314,49 1392 0,266 >0,05 ФБ 331,78 288,29 6730 0,0012 <0,05 ЛФ 346,05 270,95 11566 6,5E-08 <0,05 ПЛ 331,23 286,98 6826 0,00069 <0,05 МФ 307,88 312,12 656,5 0,383 >0,05 ГРЛ 322,97 298 3866 0,035 <0,05 ПАР 310,69 310,31 57,5 0,489 >0,05 p — значимо различные показатели. Среднее арифметическое значение можно использовать в качестве количественного показателя типичного числа клеток в поле зрения в том случае, когда анализируемое статистическое распределение является нормальным. 168 Статистические распределения изучаемых клеточных элементов в зоне опухоли и вне зоны опухоли значимо отличаются от нормального распределения ( p 0,05). Проверка гипотезы о нормальности распределения осуществлялась по критерию 2 (Пирсона) на уровне значимости 0,05. Проверка статистической гипотезы об отсутствии статистически значимых различий между статистическими распределениями изучаемых клеточных элементов в зоне опухоли и вне зоны опухоли сводилась к проверке статистической гипотезы H0 об отсутствии значимых различий между типичными уровнями (значениями) анализируемых статистических распределений (типичным является тот факт, что в зоне опухоли и вне зоны опухоли наблюдаемое число клеточных элементов одинаково). Альтернативная статистическая гипотеза H1 — типичные уровни анализируемых статистических распределений значимо различаются (типичным является тот факт, что в зоне опухоли наблюдаемое число клеточных элементов больше (меньше), чем вне зоны опухоли). Для проверки статистической гипотезы об отсутствии значимых различий между типичными уровнями анализируемых распределений использовался непараметрический критерий Манна—Уитни. Для анализа введем понятие среднего ранга выборки, V1 — выборка в зоне опухоли, V2 — выборка вне зоны опухоли. Морфометрическое исследование клеточных популяций показало, что вокруг артериол в тканях РШМ достоверно возрастает (p 0,05) число фибробластов, лимфоцитов, плазматических клеток и гранулоцитарных лейкоцитов по сравнению с контрлатеральной стороной от РШМ. Однако средний ранг выборки по фиброцитам, макрофагам и клеткам паренхимы показал, что в зоне опухоли и вне зоны опухоли типичное наблюдаемое число клеточных элементов одинаково (p > 0,05) (таблица 33). При статистической обработке морфометрических показателей клеточных популяций вокруг венул и капилляров в тканях РШМ достоверно возрастает (p 0,05) число ЛФ, ПЛ и ГРЛ по сравнению с контрлатеральной стороной от РШМ. 169 Таблица 34 — Распределение клеточных популяций вокруг венул в ткани РШМ и контрлатеральной зоне Средний ранг выборки Статистика критерия Зона Контрлатеральная Критерий опухоли зона от РМШ Манна—Уитни V1 V2 W ФЦ 303,24 317,76 2252 0,156 >0,05 ФБ 317,8 303,2 2262,5 0,155 >0,05 ЛФ 341,75 279,25 9688 0,0000054 <0,05 ПЛ 342,31 277,8 9982,5 0,0000013 <0,05 МФ 324,24 296,76 4259,5 0,027 <0,05 ГРЛ 325,88 295,12 4766,5 0,011 <0,05 ПАР 302,46 318,54 2491,5 0,126 >0,05 p — значимо различные показатели. Таблица 35 — Распределение клеточных популяций вокруг капилляров в ткани РШМ и контрлатеральной зоне Средний ранг выборки Статистика критерия Зона Контрлатеральная Критерий опухоли зона от РМШ Манна—Уитни V1 V2 W ФЦ 311,45 309,55 295 0,447 >0,05 ФБ 319,11 301,89 2668 0,1158 >0,05 ЛФ 356,11 262,05 14509 2,19E-11 <0,05 ПЛ 345,1 266,52 12003 7,9E-09 <0,05 МФ 330,2 289,73 6262 0,0024 <0,05 ГРЛ 330,37 290,63 6160 0,0021 <0,05 ПАР 314,38 306,62 1202,5 0,293 >0,05 — значимо различные показатели. p 170 При этом средние ранги выборки по ФЦ, ФБ, МФ и клеткам ПАР в зоне опухоли и вне зоны опухоли достоверно не отличались (p > 0,05), следовательно, типичное наблюдаемое число клеточных элементов одинаково (таблица 34, 35). Морфометрическое исследование клеточных популяций выявило достоверное увеличение лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов вокруг артериол, капилляров, венул в тканях РШМ по сравнению с контрлатеральной стороной от РШМ. Указанные морфометрические изменения в тканях контрлатеральной стороны от РШМ позволяют утверждать, что данная зона ШМ должна исследоваться в практике для исключения поражений предопухолевыми и опухолевыми процессами и может являться одним из критериев индивидуального прогноза. 5.2. Иммуногистохимическая характеристика экспрессии р53, Ki-67, bcl-2, NKl, СD4, СD8, СD79α, CD138, CD68, СD34, NGFR в стромальном и/или эпителиальном компоненте тканей рака шейки матки Иммуногистохимическое исследование проведено в 30 случаях в каждой зоне (контрлатеральная зона от РШМ и ткань РШМ в зоне опухоли). Экспрессия вышеуказанных маркеров в различных зонах ШМ имела принципиальные отличия, поэтому приводим последовательное описание иммуногистохимической картины в тканях различных зон при РШМ. В ткани шейки матки контрлатеральной зоны от РШМ. Анализируя экспрессию маркера апоптоза р53, следует отметить, что иммунодетекция данного маркера была очень вариабельна (рисунки 111–113), что зависело от морфологических изменений, наблюдаемых в данной зоне (наличие ВПЧ-поражений в шейке матки и степени ЦИН многослойного плоского эпителия). При ЦИН 171 1-й степени (10 случаев), как правило, отмечалась слабая ядерная экспрессия р53 в клетках базального слоя МПЭ или экспрессия отсутствовала полностью. При эктопиях и ЦИН 2-й степени (10 случаев) отмечалась слабая или умеренная ядерная экспрессия данного антитела в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия и единичных клетках стромы (фибробласты, лимфоциты). При ЦИН 3-й степени/саrcinoma in situ экспрессия р53 была обнаружена во всех 10 случаях и во всех полях зрения, как в клетках МПЭ, так и в клетках субэпителиального инфильтрата, экспрессия была выраженной. Рисунок 111 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 112 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ-поражения и ЦИН 1-й степени ЦИН 2–3-й степени, наблюдение (наблюдение № 35). Отсутствие экспрес- № 56). Слабая ядерная экспрессия р53 сии р53 в клетках многослойного плос- в клетках многослойного плоского кого эпителия и строме, ×200 эпителия, ×400 172 Рисунок 113 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 114 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ-поражения; наблюдение № 56). ВПЧ-поражения; наблюдение № 39). Отсутствие экспрессии р53 в клетках Умеренная экспрессия bcl-2 в клетках многослойного плоского эпителия базального слоя многослойного плос- и клетках стромы, ×400 кого эпителия, ×200 Рисунки 111–114: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Рисунок 115 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ-поражения; наблюдение № 57). Экспрессия маркера клеточной пролиферации Ki-67 в единичных клетках базального и шиповатого слоев МПЭ, ×400 173 Рисунок 116 — Ткань КЛЗ (признаки ЦИН 2–3-й степени; наблюдение № 56). Выраженная экспрессия маркера клеточной пролиферации Ki-67 в клетках многослойного плоского эпителия, ×400 Рисунок 117 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 118 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ-поражения; наблюдение № 56). ЦИН 3-й степени/carcinoma in situ; Экспрессия маркера клеточной проли- наблюдение № 56). Экспрессия марке- ферации Ki-67 в клетках базального ра клеточной пролиферации Ki-67 и шиповатого слоев многослойного в клетках многослойного плоского плоского эпителия, ×200 эпителия, ×200 Рисунки 115–118: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 174 Экспрессия маркера супрессора апоптоза bcl-2 отличалась вариабельностью и зависела от морфологических изменений в ШМ и от степени ЦИН (рисунок 14). Так, в тканях ШМ, пораженных ВПЧ с признаками ЦИН 1-й степени (10 случаев), отмечалась выраженная экспрессия bcl-2 в клетках базального слоя МПЭ и в единичных клетках инфильтрата (лимфоциты). В тканях ШМ с ЦИН 2-й степени при ВПЧ-поражении экспрессия данного маркера была выражена в клетках базального слоя, но не во всех полях зрения, и наблюдалась в 6 случаях из десяти. В тканях ШМ с ЦИН 3-й степени экспрессия bcl-2 наблюдалась в 4 случаях из 10, окрашивание было слабым в единичных клетках МПЭ. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 также зависела от степени выраженности ЦИН в ткани ШМ и наличия ВПЧ-поражения. Ki-67 определялся в клетках шиповатого и базального слоев МПЭ во всех 30 случаях. Окрашивание было ядерное, от слабого до выраженного (рисунки 115–118). В тканях шейки матки пролиферативный индекс по Ki-67 при ЦИН 1-й степени составил в эпителии 10–20% (в клеточном инфильтрате стромы не превышал 4–5%). При ЦИН 2-й степени пролиферативный индекс равнялся 20–40% в эпителии (в клеточном инфильтрате стромы 8–14%). При ЦИН 3-й степени в эпителии 50–80% (в клеточном инфильтрате стромы 25–30%), основными клетками стромы, которые экспрессировали Ki-67, были лимфоциты и фибробласты. Количественное распределение экспрессии р53, bcl-2, Кi-67 в строме и эпителии в данной зоне представлено на рисунке 156. Как видно, наибольшая экспрессия в эпителии приходится на маркер пролиферативной активности Ki-67 (84%), за ним по частоте экспрессии стоит р53: на его долю приходится около 30%. Последнее место занимает маркер супрессии апоптоза bcl-2, на его долю приходится около 20%. В строме количественное распределение данных маркеров меняется. Обращает на себя внимание, что в строме доля позитивных клеток по Ki-67 снижается до 36%. 175 Рисунок 119 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 120 — Ткань КЛЗ (наблюде- ЦИН 2-й степени; наблюдение № 56). ние № 57). Цитоплазматическая экс- Умеренная цитоплазматическая экс- прессия CD68 в единичных клетках прессия CD68 в клетках стромы и меж- стромы, ×100 эпителиальными клетками, ×100 Рисунок 121 — Ткань КЛЗ (наблюде- Рисунок 122 — Ткань КЛЗ (признаки ние № 56). В глубоких отделах стромы ВПЧ-поражения; наблюдение № 56). вокруг сосудов лимфогистиоцитарная В строме слабовыраженный лимфоги- инфильтрация, среди данных клеток стиоцитарный инфильтрат, среди дан- имеются CD68 позитивные клетки, ×100 ного инфильтрата имеются CD68 позитивные клетки, ×200 176 Рисунки 119–122: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Рисунок 123 — Ткань КЛЗ (наблюде- Рисунок 124 — Ткань КЛЗ (наблюде- ние № 56). В глубоких отделах стромы ние № 56). Выраженная цитоплазма- вокруг венул умеренная инфильтрация тическая экспрессия CD68 в клетках CD68 позитивными клетками, ×200 стромы, ×400 Рисунок 125 — Ткань КЛЗ (наблюде- Рисунок 126 — Ткань КЛЗ (признаки ние № 56). Экспрессия Т-клеточного ЦИН 3-й ст./carcinoma in situ; наблю- маркера NK1 в лимфоцитах стромы дение № 56). Отсутствие экспрессии рядом с венулами и капиллярами, ×100 Т-клеточного маркера (хелперы/индуцеры) CD4 в клетках стромы, ×400 177 Рисунки 123–126: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Вторым по частоте экспрессии в строме был супрессор апоптоза bcl-2, однако его доля резко снижается до 6%. Экспрессия р53 также резко снижается, и его доля составляет всего около 4%. Как было отмечено выше, клеточный инфильтрат в данной зоне был представлен следующими клеточными популяциями: фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами и полиморфноядерными лейкоцитами. Уточнение принадлежности клеток в инфильтрате к различным клеточным популяциям проводилось с помощью следующих маркеров: NK1, CD4, CD8, CD79α, СD138, CD68. Как видно из рисунка 161, в данной зоне в клеточном инфильтрате преобладала экспрессия СD68. На его долю приходилось 42% всех клеточных популяций. Экспрессия была от умеренной до ярко выраженной (рисунки 119–124). Данный маркер определялся в макрофагах и клетках Лангерганса стромы. Также была отмечена его экспрессия в клетках, лежащих в просвете сосудов (моноцитах). Экспрессия CD68 выявлялась во всех исследуемых случаях без исключения и во всех полях зрения. В изучаемой зоне иммунодетекция Т-клеточных маркеров (рисунки 125–130) была вариабельна. NK1-позитивные клетки в данной зоне определялись во всех случаях. Как видно из рисунка 161, на их долю приходилось около 9% клеток в клеточном инфильтрате. Экспрессия была умеренной, мембранной (рисунки 127, 128). Как правило, позитивные клетки располагались в лимфоидном инфильтрате в глубоких слоях стромы и образовывали мелкие лимфоидные фолликулы (рисунок 125) или субэпителиально. Следует отметить, что NK1-позитивные лимфоциты располагались рядом с сосудами венулярного и капиллярного типов. Вокруг артериол данные клетки практически не встречались. 178 Рисунок 127 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 128 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ-поражения; наблюдение № 56). ЦИН 3-й степени/carcinoma in situ; Экспрессия Т-клеточного маркера NK1 наблюдение № 56). Экспрессия Т-кле- в единичных лимфоцитах стромы, ×400 точного маркера NK1 в клетках многослойного плоского эпителия и лимфоцитах стромы вокруг сосудов, ×400 Рисунок 129 — Ткань КЛЗ (признаки ЦИН 3-й ст./carcinoma in situ; наблюдение № 56). Экспрессия Т-клеточного маркера CD8 в единичных лимфоцитах стромы, ×100 179 Рисунок 130 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ; наблюдение № 56). Мембранная экспрессия Т-клеточного маркера CD8 в лимфоцитах стромы и в базальных клетках многослойного плоского эпителия, ×400 Рисунки 127–130: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Рисунок 131 — Ткань КЛЗ (наблюдение Рисунок 132 — Ткань КЛЗ (признаки № 56). В глубоких отделах стромы пери- ВПЧ-поражения; наблюдение № 56). васкулярная инфильтрация с формиро- Перивенулярно видны CD79α-пози- ванием лимфоидных фолликулов, со- тивные лимфоциты с формированием стоящих из CD79α-позитивных лимфо- лимфоидных фолликулов, ×100 цитов, ×100 180 Рисунок 133 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 134 — Ткань КЛЗ (косвенные ЦИН 3-й степени/carcinoma in situ; на- признаки ВПЧ-поражения; наблюде- блюдение № 56). Цитоплазматическая ние № 56). В строме слабовыражен- экспрессия В-клеточного маркера ный инфильтрат, CD79α-позитивные CD79α в лимфоцитах стромы, ×200 клетки в строме отсутствуют, ×200 Рисунки 131–134: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Экспрессия CD4 была выявлена во всех исследуемых случаях. На долю этой популяции Т-клеток пришлось 9% от всего клеточного инфильтрата (рисунок 160). Иммунодетекция CD4 была слабая, мембранная (рисунок 126). CD4позитивные клетки располагались дискретно, субэпителиально, рядом с сосудами венулярного и капиллярного типов. Иммунодетекция CD8 была выявлена во всех случаях. Экспрессия имела мембранный характер, умеренная (рисунок 129, 130). На долю данной популяции Т-лимфоцитов пришлось около 9% всего клеточного инфильтрата (рисунок 160). CD8-позитивные лимфоциты располагались одиночно или образовывали скопления. Данная популяция лимфоцитов располагалась как субэпителиально, так и в более глубоких отделах стромы, но преимущественно рядом с венулами и капиллярами. 181 Анализ экспрессии CD79α, маркера В-лимфоцитов, показал, что положительные клетки обнаруживались во всех наблюдениях. Экспрессия была выраженная, мембранная (рисунок 135). На долю данной популяции пришлось около 9% всего клеточного инфильтрата. В отдельных случаях CD79α-позитивные клетки вообще не обнаруживались (рисунок 134). Это наблюдалось в тех случаях, когда поражения МПЭ были минимальными (имели место косвенные признаки ВПЧ-поражения ШМ, без явления ЦИН). В-лимфоциты располагались как субэпителиально в виде скопления (рисунки 131, 132) или одиночно лежащих клеток, так и образовывали крупные лимфоидные фолликулы со светлыми центрами. Данная клеточная популяция обнаруживалась и в более глубоких отделах стромы, причем исключительно вокруг венулярного и капиллярного отделов МЦР (рисунки 135, 136). Экспрессия СD138 (маркера плазматических клеток) выявлена во всех тридцати случаях. Иммунодетекция была слабой, цитоплазматической (рисунки 137, 138, 140). В отдельных полях зрения воспалительный инфильтрат не содержал СD138-позитивные клетки (рисунок 141). На долю данных клеток пришлось 5% от всего клеточного инфильтрата (рисунок 160). Рисунок 135 — Ткань КЛЗ (наблюдение № 56). В глубоких отделах видны множественные сосуды МЦР, вокруг лимфогистиоцитарный инфильтрат, среди которого присутствуют множественные CD79α-позитивные лимфоциты (экспрессия мембранная), ×400 182 Рисунок 136 — Ткань КЛЗ (наблюдение № 56). В строме видны артериолы и венулы, вокруг них скопления CD79α-позитивных лимфоцитов, ×400 Рисунок 137 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 138 — Ткань КЛЗ (признаки ВПЧ-поражения; наблюдение № 34). ЦИН 2-й ст.; наблюдение № 35). Сла- Слабая цитоплазматическая экспрес- бая цитоплазматическая экспрессия сия CD138 в единичных клетках CD138 в единичных клетках стромы стромы, ×400 и выраженная экспрессия в клетках многослойного плоского эпителия, ×400 Рисунки 135–138: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 183 Плазматические клетки располагались как субэпителиально, так и в глубоких слоях стромы, образуя скопления. Часто данные клетки лежали вокруг венул и капилляров. Следует отметить, что выраженная цитоплазматическая экспрессия CD138 также была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия. Экспрессия зависела от степени ЦИН в МПЭ шейки матки. Иммунодетекция CD138 в МПЭ усиливалась от ЦИН 1 к ЦИН 2 (рисунки 137, 138) и ЦИН 3-й степени и наиболее ярко была выражена в ЦИН 3, где экспрессия наблюдалась во всех слоях МПЭ. При анализе экспрессии эндотелиального маркера (CD34) положительная экспрессия была обнаружена во всех исследуемых случаях и во всех исследуемых зонах. Была выявлена выраженная мембранная иммунодетекция в эндотелиальных клетках всех типов сосудов (рисунки 98–101). Рисунок 139 — Ткань КЛЗ (наблюде- Рисунок 140 — Ткань КЛЗ (признаки ние № 56). В строме инфильтрация ЦИН 3-й степени/carcinoma in situ; на- лимфоцитами, гистиоцитами, экспрес- блюдение № 56). Вокруг эпителиаль- сии CD138-позитивных плазматиче- ного комплекса в строме воспалитель- ских клеток не выявлено, ×100 ный инфильтрат, в котором единичные CD138-позитивные клетки, ×200 Рисунки 139, 140: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 184 Экспрессия NGFR в нервных структурах в тканях контрлатеральной зоны от РШМ была выявлена во всех исследуемых случаях. Отмечалась выраженная иммунодетекция в нервных волокнах в данной зоне ШМ. При этом нервные волокна располагались как в глубоких отделах стромы (рисунки 141, 142), так и субэпителиально. Они также обнаруживались рядом с клеточным воспалительным инфильтратом. В ряде случаев клетки инфильтрата окружали NGFRпозитивные нервные волокна. Следует отметить, что данное антитело накапливалось в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия (рисунок 144). При этом экспрессия была умеренной или ярко выраженной. Экспрессия данного маркера в клетках МПЭ зависела от степени ЦИН. Так, при ЦИН 1-й степени отмечалась выраженная, но неравномерная экспрессия NGFR в клетках эпителия на протяженности всего среза. Иногда встречались участки с негативной реакцией. При ЦИН 2-й степени экспрессия NGFR была равномерной и хорошо выраженной в базальном и парабазальном слоях МПЭ. В нервных волокнах сохранялась умеренная экспрессия данного антитела. При ЦИН 3-й степени отмечалась яркая экспрессия данного маркера во всех слоях МПЭ. Однако встречались случаи, когда экспрессия NGFR полностью отсутствовала в МПЭ (рисунок 143), а в нервных волокнах экспрессия была слабо или умеренно выраженная. Экспрессия данного антитела была обнаружена даже в клетках воспалительного инфильтрата (лимфоциты, макрофаги). 185 Рисунок 141 — Ткань КЛЗ (наблюде- Рисунок 142 — Ткань КЛЗ (наблюде- ние № 44). Умеренная экспрессия ние № 56). Глубокие отделы стромы NGFR в нервных структурах стромы, с сосудами МЦР и яркой экспрессией ×200 NGFR в нервных структурах стромы, ×400 Рисунок 143 — Ткань КЛЗ (признаки Рисунок 144 — Ткань КЛЗ от РШМ ЦИН 3-й степени/carcinoma in situ; на- вне зоны поражения ВПЧ (наблюде- блюдение № 56). Экспрессия NGFR ние № 56). Выраженная экспрессия в нервных структурах стромы, отсутст- NGFR в базальном слое многослойно- вие экспрессии в клетках многослой- го плоского эпителия, ×400 ного плоского эпителия, ×100 Рисунки 141–144: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 186 Ткань плоскоклеточного РШМ (зона опухоли). При анализе экспрессии маркера апоптоза р53 выявлена умеренная или выраженная ядерная экспрессия (рисунки 145–148) данного моноклонального антитела в опухолевых клетках (экспрессия обнаружена в 28 случаях). В 8 случаях отмечалась слабая детекция р53 в клетках стромы (лимфоцитах и фибробластах). Маркер супрессора апоптоза bcl-2 экспрессировался в опухолевых клетках (рисунок 150). Окрашивание было умеренным (чаще выраженным), цитоплазматическим и отмечалось в 21 случае. При этом в 17 случаях данный маркер определялся как в эпителии, так и в клетках стромы в лимфоцитах (рисунок 149). В 3 случаях наблюдалась слабая экспрессия данного маркера в опухолевых клетках. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 определялась в опухолевых клетках во всех 30 случаях. При этом экспрессия данного антитела определялась во всех полях зрения. Окрашивание было ядерное, от умеренного до ярко выраженного (рисунки 151, 152). В 18 случаях экспрессия Ki-67 была обнаружена в клетках стромы (лимфоцитах и фибробластах). Пролиферативный индекс по Ki-67 в эпителии колебался от 40 до 65% (в клетках стромы около 20–35%). Количественное распределение экспрессии р53, bcl-2, Кi-67 в строме и эпителии в данной зоне представлено на рисунке 153. Как видно, наибольшая экспрессия в эпителии приходится на маркер пролиферативной активности Ki-67 (86%). За ним по частоте экспрессии стоит р53, на его долю приходится около 54%. Последнее место занимает маркер супрессии апоптоза bcl-2 — на его долю приходится около 40%. В строме количественное распределение данных маркеров меняется. Обращает на себя внимание, что в строме доля позитивных клеток по Ki-67 снижается до 18%. Вторым по частоте экспрессии в строме остается р53, однако его доля резко снижается и составляет всего около 10%. На последнем месте был супрессор апоптоза bcl-2, однако его доля резко снижается до 6%. 187 Рисунок 145 — Ткань РШМ в зоне опу- Рисунок 146 — Ткань РШМ в зоне холи (наблюдение № 18). Умеренная опухоли (наблюдение № 29). Умерен- ядерная экспрессия р53 (маркера апо- ная ядерная экспрессия р53 (маркера птоза) в опухолевых клетках и единич- апоптоза) в опухолевых клетках, ×200 ных клетках стромы, ×200 Рисунок 147 — РШМ в зоне опухоли Рисунок 148 — Ткань РШМ в зоне (наблюдение № 39). Выраженная ядер- опухоли (наблюдение № 56). Умерен- ная экспрессия р53 в клетках опухоле- ная ядерная экспрессия р53 в единич- вых комплексов, ×200 ных опухолевых клетках, ×200 Рисунки 145–148: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 188 Рисунок 149 — Ткань РШМ в зоне опу- Рисунок 150 — Ткань РШМ в зоне холи (наблюдение № 29). В строме лим- опухоли (наблюдение № 39). Цитофоидный инфильтрат, имеется цито- плазматическая экспрессия bcl-2 плазматическая экспрессия bcl-2 в лим- в опухолевых клетках и клетках фоцитах, ×400 стромы (лимфоцитах), ×400 Рисунок 151 — Ткань РШМ в зоне опу- Рисунок 152 — Ткань РШМ в зоне холи (наблюдение № 39). Выраженная опухоли (наблюдение № 56). Умерен- экспрессия Ki-67 в опухолевых клетках, ная ядерная экспрессия Ki-67 в опухо- ×200 левых клетках, ×200 Рисунки 149–152: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный ме- тод, докраска гематоксилином. 189 Как видно на рисунке 153, доля р53-позитивных клеток в эпителии в 1,8 раза, а в строме — в 3,5 раза больше в тканях зоны опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. Что касается Ki-67, то количество этих позитивных клеток в эпителии в 1,2 раза, а в строме в 1,8 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При анализе экспрессии bcl-2-позитивных клеток выявлено, что в эпителии этих клеток в 1,92 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ, а вот в строме картина противоположная: в зоне опухоли количество bcl-2-позитивных клеток — в 1,3 раза меньше, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При этом имелись достоверные различия (p < 0,05) в количественном распределении вышеуказанных маркеров между КЛЗ от РШМ и зоной опухоли. Клеточный инфильтрат в данной зоне был представлен фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами и полиморфноядерными лейкоцитами. Уточнение принадлежности клеток в инфильтрате к различным клеточным популяциям проводилось с помощью следующего набора антител: NK1, CD4, CD8, CD79α, СD138, CD68. Как видно из рисунка 158, в данной зоне в клеточном инфильтрате преобладала экспрессия СD68. На его долю приходилось 92% всех клеточных популяций. Экспрессия от умеренной до ярко выраженной (рисунки 154–156). Данный маркер определялся в макрофагах и клетках Лангерганса стромы. Была отмечена экспрессия в клетках, лежащих в просвете сосудов (моноцитах). Очень часто СD68-позитивные клетки располагались периваскулярно, преимущественно вокруг сосудов венулярного и капиллярного типов, иногда вокруг мелких артериол. Экспрессия CD68 выявлялась во всех исследуемых случаях без исключения и во всех полях зрения. При сравнении этих двух зон (контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли) видно, что количество CD68-позитивных клеток в 2,3 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ, при этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. 190 2500 2000 1500 P53 Ki-67 bcl-2 1000 500 0 зона опухоли эпителий вне зоны опухоли эпителий зона опухоли строма вне зоны опухоли строма Рисунок 153 — Распределение экспрессии р53, bcl-2, Ki-67 в ткани рака шейки матки В изучаемой зоне иммунодетекция Т-клеточных маркеров (рисунки 157, 159, 160–162) была вариабельна. NK1-позитивные клетки в данной зоне определялись во всех исследованных случаях. Как видно из рисунка 158, на их долю приходилось около 25% клеток в клеточном инфильтрате. Экспрессия была умеренной, мембранной (рисунки 158, 161). Как правило, NК1-позитивные клетки располагались дискретно или мелкими скоплениями, субэпителиально. Следует отметить, что NK1-позитивные лимфоциты располагались рядом с сосудами венулярного и капиллярного типов. Вокруг артериол позитивные клетки выявлялись крайне редко. Следует отметить, что при сравнении этих двух зон (контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли) видно, что количество NК1-позитивных клеток в 7,5 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ, при этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. 191 Рисунок 154 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 155 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 18). В строме опухоли (наблюдение № 44). Глубокие выраженный воспалительный ин- отделы стромы инфильтрированы фильтрат, в котором преобладают CD68-позитивными клетками, ×400 CD68-позитивные клетки, ×100 Рисунок 156 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 157 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 29). В строме опухоли (наблюдение № 34). Умерен- видны комплексы опухолевых клеток, ный воспалительный инфильтрат многочисленные сосуды МЦР, в строме, мембранная экспрессия CD4 периваскулярно множественные (хелперы/индуцеры) в лимфоцитах, CD68-позитивные клетки, ×400 ×200 192 Рисунки 154–157: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Экспрессия CD4 была выявлена во всех исследуемых случаях, на долю этой популяции Т-клеток пришлось 14% от всего клеточного инфильтрата (рисунок 158). Иммунодетекция CD4 была умеренной, мембранной (рисунок 157). 14000 12000 10000 8000 вне зоны опухоли зона опухоли 6000 4000 2000 0 СD 4 СD79а СD 138 СD 8 NK 1 СD 68 Рисунок 158 — Распределение иммунодетекции клеточных маркеров (CD4, CD79α, CD138, СD8, NK1, CD68) в ткани рака шейки матки CD4-позитивные клетки располагались дискретно или образовывали скопления в виде мелких лимфоидных фолликулов. Данная популяция клеток располагалась рядом с сосудами венулярного и капиллярного типов и вокруг мелких артериол. При сравнении контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли четко видно, что количество CD4-позитивных клеток в 2 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. 193 Иммунодетекция CD8 была выявлена во всех случаях, экспрессия имела мембранный характер, была умеренной (рисунки 161, 162). На долю данной популяции Т-лимфоцитов пришлось около 22% всего клеточного инфильтрата (рисунок 158). Рисунок 159 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 160 — Ткань РШМ в зоне опу- опухоли (наблюдение № 18). Экспрес- холи (наблюдение № 29). Экспрессия сия Т-клеточного маркера NK1 на NK1 на лимфоцитах в строме между лимфоцитах вокруг венул, ×400 комплексами опухолевых клеток, ×200 Рисунок 161 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 29). Мембранная экспрессия Т-клеточного маркера CD8 в лимфоцитах стромы вокруг сосудов МЦР, ×400 194 Рисунок 162 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 44). Выраженная мембранная экспрессия Т-клеточного маркера CD8 в лимфоцитах стромы вокруг сосудов МЦР, ×400 Рисунки 159–162: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Рисунок 163 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 164 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 29). В строме опухоли (наблюдение № 29). В строме выраженная лимфоидная инфильтра- диффузный воспалительный инфильт- ция с формированием лимфоидного рат, в состав которого входят CD79α- фолликула, в котором имеются позитивные лимфоциты, рядом лежит CD79α-позитивные лимфоциты, ×100 опухолевый комплекс, ×200 195 Рисунок 165 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 166 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 39). Диффуз- опухоли (наблюдение № 44). Цито- ный опухолевый инфильтрат, состоя- плазматическая экспрессия CD79α щий из В-лимфоцитов, которые марки- в В-лимфоцитах воспалительного руются CD79α, ×200 инфильтрата, ×400 Рисунки 163–166: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. Рисунок 167 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 18). Слабая цитоплазматическая экспрессия CD138 маркера плазматических клеток в опухолевых клетках, ×200 196 Рисунок 168 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 39). Слабая цитоплазматическая экспрессия CD138 маркера плазматических клеток в единичных опухолевых клетках ×400 Рисунок 169 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 170 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 29). Слабая опухоли (наблюдение № 34). Отсут- цитоплазматическая экспрессия ствие экспрессии CD138 в опухолевых CD138 маркера в опухолевых клетках клетках, в единичных клетках стромы и в единичных клетках стромы, ×200 имеется слабая экспрессия данного маркера, ×400 Рисунки 167–170: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. 197 CD8 позитивные лимфоциты располагались одиночно, как субэпителиально, так и в более глубоких отделах стромы, но преимущественно рядом с венулами и капиллярами, встречались вокруг мелких артериол. При сравнении контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли четко видно, что количество CD8позитивных клеток в 3,8 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ, при этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. Анализ экспрессии CD79α показал, что положительные клетки обнаруживались во всех исследуемых случаях. Экспрессия была умеренная, мембранная (рисунки 163–166). На долю данной популяции пришлось около 42% всего клеточного инфильтрата (рисунок 158). CD79α-позитивные клетки обнаруживались в более глубоких отделах стромы, формируя множественные лимфоидные фолликулы. Также отмечалась диффузная инфильтрация данными клетками, причем рядом с опухолевыми комплексами или вокруг венулярного и капиллярного отдела МЦР. При сравнении контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли видно, что количество CD79α-позитивных клеток в 6 раз больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. Экспрессия СD138 (маркера плазматических клеток) выявлена во всех случаях. Иммунодетекция была слабой, цитоплазматической. На долю данных клеток пришлось 14% всего клеточного инфильтрата (рисунок 158). Плазматические клетки располагались преимущественно субэпителиально и дискретно и исключительно вокруг венул и капилляров. Следует отметить, что цитоплазматическая экспрессия CD138 также была обнаружена в опухолевых клетках (рисунки 167–169), но она была слабой, а в отдельных случаях отсутствовала (рисунок 170). Следует обратить внимание, что при сравнении контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли видно, что количество CD138-позитивных клеток в 2 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При этом имелись значимые различия (p < 0,05) по данным показателям. 198 Рисунок 171 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 172 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 29). Умерен- опухоли (наблюдение № 44). Отсут- ная экспрессия NGFR в клетках сохра- ствует экспрессия NGFR в опухолевых ненного базального слоя многослойно- клетках, имеется нервная структура, го плоского эпителия и в нервных которая экспрессирует данный маркер, структурах, в опухолевых клетках экс- ×200 прессия отсутствует, ×100 Рисунок 173 — Ткань РШМ в зоне Рисунок 174 — Ткань РШМ в зоне опухоли (наблюдение № 34). Слабая опухоли (наблюдение № 35). Слабая экспрессия NGFR в нервных структу- экспрессия NGFR в клетках сохранен- рах стромы, ×400 ного базального слоя многослойного плоского эпителия, ×400 199 Рисунки 171–174: стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. При анализе экспрессии эндотелиального маркера (CD34) положительная экспрессия была обнаружена во всех исследуемых случаях и во всех исследуемых зонах. Была выявлена выраженная мембранная иммунодетекция в эндотелиальных клетках всех типов сосудов (рисунки 106–109). 80 60 40 20 0 Площадь сосудистого русла (доля в %) Экспрессия NGFR (доля в %) вне зоны опухоли 41,07 20,8 зона опухоли 58,93 69,1 Рисунок 175 — Площадь сосудистого русла (по CD34) и экспрессия NGFR в ткани РШМ Также было проведено определение площади сосудистого русла. При сравнении площади сосудистого русла контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли видно, что площадь сосудистого русла в зоне опухоли на 17,86% больше, чем контрлатеральной зоны от РШМ. При этом различия были значимы (p < 0,05). Экспрессия NGFR в нервных структурах в тканях контрлатеральной зоны от РШМ и в зоне опухоли была выявлена во всех исследуемых случаях. Отмечалась выраженная иммунодетекция в нервных волокнах в данной зоне (рисун- 200 ки 171–174). При этом большинство нервных волокон располагались в строме между опухолевыми клетками. На отдельных участках нервные структуры находились в непосредственной близости от раковых клеток. Следует отметить, что данное антитело накапливалась в клетках сохраненных участков базального слоя многослойного плоского эпителия (рисунок 171). При этом экспрессия была слабой или умеренной. В опухолевых клетках раковых комплексов данное тело не экспрессировалось (рисунки 171–173). Как видно из рисунка 174, в ткани РШМ в зоне опухоли количество NGFR позитивных элементов на 48,3% больше, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При этом различия были значимы (p < 0,05). 5.3. Корреляционный анализ клеточных популяций вокруг разных сосудов микроциркуляторного русла в тканях рака шейки матки Корреляционный анализ проводился в два этапа. Вначале был выполнен парный корреляционный анализ клеточных популяций в ткани ШМ в контрлатеральной зоне от РШМ и в зоне опухоли вокруг различных звеньев МЦР (артериол, венул, капилляров). Парные корреляции не дают полного представления о происходящих межклеточных взаимоотношениях и не исключают влияния иных клеточных элементов на выявленные корреляционные связи, поэтому был проведен частный корреляционный анализ. Следует отметить, что система частных корреляций между клеточными популяциями вокруг различных звеньев сосудистого русла была представлена многочисленными и разнообразными по силе и характеру взаимосвязями. Так, в контрлатеральной зоне от РШМ вокруг венулярного отдела МЦР было выявлено 382 корреляционные связи, вокруг капиллярного отдела — 276, а вокруг артериол — 350. В зоне опухоли количество 201 корреляционных связей резко возрастает и выражается следующими показателями: вокруг венулярного отдела МЦР было обнаружено 540 корреляционных связей, вокруг капиллярного отдела — 590, а вокруг артериол — 420. Все представленные корреляционные взаимосвязи являлись средними или сильными, высоко значимыми (коэффициент корреляции /r/ — от 0,3 до 1,0, p < 0,05). Они были как с положительными, так и с отрицательными значениями. Таким образом, провести полноценный анализ полученных результатов (всего было выявлено 1008 корреляционных связей в контрлатеральной зоне от РМШ и 2700 в зоне опухоли) не представлялось возможным. Во-первых, их было очень большое количество, а во-вторых, не было полного представления о происходящих межклеточных взаимоотношениях. При этом нельзя исключить влияния иных клеточных элементов на выявленные корреляционные связи. Поэтому был проведен частный корреляционный анализ, который позволил получить корреляционную матрицу, в которой корреляции между двумя клеточными популяциями выявлены при исключении влияния иных клеточных элементов. Данные матрицы стали исходным материалом для проведения факторного анализа. Он позволил провести редукцию имеющейся обширной информации путем перехода к новым обобщенным переменным (главные компоненты), которые независимы между собой. Исходными данными для компонентного анализа в контрлатеральной зоне от РМШ вокруг артериол, венул и капилляров сосудов были коэффициенты парных корреляций (таблицы 36–38). 202 Таблица 36 — Значения коэффициентов парных частных корреляций вокруг артериол в ткани контрлатеральной зоны от РШМ ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,5971 0,0513 –0,1294 0,1598 0,0817 0,0646 ФБ 0,5971 1 0,1025 0,0587 0,2592 0,0725 –0,033 ЛФ 0,0513 0,1025 1 0,5558 0,1427 0,0145 0,03 ПЛ –0,1294 0,0587 0,5558 1 0,0864 0,0984 –0,1121 МФ 0,1598 0,2592 0,1427 0,0864 1 0,0609 0,123 ГРЛ 0,0817 0,0725 0,0145 0,0984 0,0609 1 0,1068 ПАР 0,0646 –0,033 0,03 –0,1121 0,123 0,1068 1 Таблица 37 — Значения коэффициентов парных частных корреляций вокруг венул в ткани контрлатеральной зоны от РШМ ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,6226 –0,0148 –0,0673 0,0443 0,1646 –0,0221 ФБ 0,6226 1 –0,0264 0,0373 0,1829 –0,1463 0,0493 ЛФ –0,0148 –0,0264 1 0,3637 0,0747 0,0749 0,0569 ПЛ –0,0673 0,0373 0,3637 1 0,0737 0,1297 0,0604 МФ 0,0443 0,1829 0,0747 0,0737 1 0,0854 0,1633 ГРЛ 0,1646 –0,1463 0,0749 0,1297 0,0854 1 0,1214 ПАР –0,0221 0,0493 0,0569 0,0604 0,1633 0,1214 1 Таблица 38 — Значения коэффициентов парных частных корреляций вокруг капилляров в ткани контрлатеральной зоны от РШМ ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,6941 –0,0757 0,0349 0,1922 0,0801 0,1376 ФБ 0,6941 1 –0,0391 –0,0759 0,2377 0,0077 –0,0923 ЛФ –0,0757 –0,0391 1 0,4992 0,0686 0,0977 0,0387 ПЛ 0,0349 –0,0759 0,4992 1 0,0298 0,0588 –0,0877 МФ 0,1922 0,2377 0,0686 0,0298 1 0,1508 0,2116 ГРЛ 0,0801 0,0077 0,0977 0,0588 0,1508 1 0,0095 ПАР 0,1376 –0,0923 0,0387 –0,0877 0,2116 0,0095 1 203 Таблица 39 — Собственные значения главных компонент вокруг артериол в ткани контрлатеральной зоны от РШМ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,813 25,90 25,9 2 1,554 22,20 48,1 3 1,114 15,92 64,02 4 0,944 13,49 77,51 5 0,799 11,41 88,92 6 0,444 6,34 95,26 7 0,332 4,74 100 информативность (процент дисперсии) При парном корреляционном анализе в данной зоне вокруг артериол, венул и капилляров было обнаружено 1008 достоверных связей между клеточными популяциями. Однако в результате факторного анализа произошла редукция исходных данных и частные корреляционные связи претерпели определенные изменения. В тканях ШМ контрлатеральной зоны от РШМ вокруг различных звеньев МЦР с помощью факторного анализа (объем выборки для артериол и венул составил: n = 310, а для капилляров — n = 305 единиц наблюдения) было установлено, что наиболее активным в плане формирования клеточных корреляционных связей является капиллярный отдел МЦР. 204 Таблица 40 — Собственные значения главных компонент вокруг венул в ткани контрлатеральной зоны от РШМ Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,67102 23,872 23,872 2 1,49938 21,420 45,291 3 1,0949 15,641 60,933 4 0,9944 14,349 75,281 5 0,816802 11,669 86,950 6 0,647447 9,249 96,199 7 0,266054 3,801 100,000 информативность (процент дисперсии) Таблица 41 — Собственные значения главных компонент вокруг капилляров в ткани контрлатеральной зоны от РШМ Накопленная Главные ком- Собственное Информативность поненты значение (процент дисперсии) 1 1,84183 26,312 26,312 2 1,54397 22,057 48,369 3 1,16637 16,662 65,031 4 0,965053 13,786 78,818 5 0,741183 10,588 89,406 6 0,518571 7,408 96,814 7 0,223016 3,186 100,000 информативность (процент дисперсии) Подобные изменения наблюдались в тканях ШМ в зоне поражения ВПЧ. Так, вокруг капилляров в контрлатеральной зоне от РШМ были выявлены три главных компоненты с процентом дисперсии 65,031% (таблица 41). 205 Вокруг венулярного звена накопленная информативность трех главных компонент составила 60,933% (таблица 40). Вокруг артериол в данной зоне накопленная информативность трех главных компонент составила 64,02% (таблица 39). Следует отметить, что разница по накопленной информативности между этими тремя звеньями МЦР была значительной (таблицы 39–41). Исходя из данного факта, можно предположить, что все три звена сосудистого русла участвуют в формировании корреляционных взаимосвязей в контрлатеральной зоне от РШМ. Далее для анализа и интерпретации выявленной факторной структуры были использованы факторные нагрузки, значение которых больше или равно 0,3 (в таблицах 42–44 они выделены значком*). В тканях ШМ в контрлатеральной зоне от РШМ вокруг артериол с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,813 и информативность 25,9%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ФБ и MФ. Таблица 42 — Факторные нагрузки вокруг артериол в ткани контрлатеральной зоны от РШМ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,86* –0,12 0,05 ФБ 0,89* 0,09 –0,03 ЛФ 0,09 0,85* 0,07 ПЛ –0,06 0,89* –0,03 МФ 0,40* 0,22 0,38* ГРЛ 0,05 0,1 0,58* ПАР –0,05 –0,14 0,82* 206 Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,554 и информативность 22,20%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и ПЛ. С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,114 и информативность 15,92%, наиболее тесно связаны клеточные элементы МФ, ГРЛ и ПАР. В тканях ШМ в контрлатеральной зоне от РШМ вокруг венул с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,67102 и информативность 23,872%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ и ФБ. Таблица 43 — Факторные нагрузки вокруг венул в ткани контрлатеральной зоны от РШМ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,873663* –0,0397784 0,0584764 ФБ 0,912878* 0,012858 0,00207742 ЛФ –0,0129177 0,819022* 0,0438434 ПЛ –0,009287 0,820225* 0,0927618 МФ 0,20317 0,0587592 0,595788* ГРЛ –0,0571667 0,13161 0,57931* ПАР –0,0455422 –0,0458669 0,741003* Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,49938 и информативность 21,420%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и ПЛ. 207 С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,0949 и информативность 15,641%, наиболее тесно связаны клеточные элементы МФ, ГРЛ и ПАР. В тканях ШМ в контрлатеральной зоне от РШМ вокруг капилляров с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,84183 и информативность 26,312%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ и ФБ. Таблица 44 — Факторные нагрузки вокруг капилляров в ткани контрлатеральной зоны от РМШ Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,877492* –0,021468 0,166438 ФБ 0,930697* –0,0409872 –0,017682 ЛФ –0,0789828 0,835983* 0,13472 ПЛ 0,00944361 0,861854* –0,0503239 МФ 0,287801 0,0733364 0,677123* ГРЛ 0,0533291 0,222702 0,37694* ПАР –0,132518 –0,165567 0,794331* Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,54397 и информативность 22,057%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и ПЛ. С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,16637 и информативность 16,662%, наиболее тесно связаны клеточные элементы МФ, ГРЛ и ПАР. Как видно из таблиц 42, 43 и 44, прослеживается однотипность корреляционных взаимосвязей вокруг различных звеньев сосудистого русла в контрла- 208 теральной зоне от РШМ. Так, вокруг артериол, венул и капилляров в данной зоне с первым фактором (изначально мы его определили как стромообразующий) тесно коррелировали фибробласты и фиброциты (исключение составил артериолярный отрезок, вокруг которого отмечалась зависимость и от макрофагов). Второй фактор, который был обозначен как дезинтегрирующий, наиболее тесно связан с популяциями лимфоцитов и плазмоцитов. Третий фактор — пролиферирующий — наиболее тесно коррелировал с макрофагами, полиморфноядерными лейкоцитами и паренхимой. Такое распределение корреляционных взаимосвязей можно объяснить тем, что в данной зоне морфологически были выявлены признаки ВПЧ-поражения ШМ. Имеющиеся признаки ЦИН различной степени выраженности укладываются в картину прогрессии и нарастания пролиферативных процессов в многослойном плоском эпителии. Таблица 45 — Значения коэффициентов парных корреляций вокруг артериол в зоне опухоли (РШМ) ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,5467 –0,1657 –0,1808 0,1929 0,0702 0,1874 ФБ 0,5467 1 –0,0515 0,1674 0,1734 –0,0411 –0,1638 ЛФ –0,1657 –0,0515 1 0,3912 –0,0535 0,0879 0,1583 ПЛ –0,1808 0,1674 0,3912 1 0,1504 0,207 –0,0143 МФ 0,1929 0,1734 –0,0535 0,1504 1 0,1109 0,052 ГРЛ 0,0702 –0,0411 0,0879 0,207 0,1109 1 –0,0514 ПАР 0,1874 –0,1638 0,1583 –0,0143 0,052 –0,0514 1 209 Таблица 46 — Значения коэффициентов парных корреляций вокруг венул в зоне опухоли (РШМ) ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,5478 –0,1243 –0,1066 0,1012 0,0327 –0,0413 ФБ 0,5478 1 0,1124 0,0515 0,3360 0,1713 –0,0486 ЛФ –0,1243 0,1124 1 0,5840 0,3830 0,2897 0,1455 ПЛ –0,1066 0,0515 0,5840 1 0,3333 0,3095 0,2376 МФ 0,1012 0,3360 0,3830 0,3333 1 0,1246 0,1767 ГРЛ 0,0327 0,1713 0,2897 0,3095 0,1246 1 0,0451 ПАР –0,0413 –0,0486 0,1455 0,2376 0,1767 0,0451 1 Таблица 47 — Значения коэффициентов парных корреляций вокруг капилляров в зоне опухоли (РШМ) ФЦ ФБ ЛФ ПЛ МФ ПЯЛ ПАР ФЦ 1 0,6476 –0,0623 –0,1462 0,1437 –0,0494 0,1074 ФБ 0,6476 1 –0,2270 0,0650 0,0805 –0,0126 –0,0413 ЛФ –0,0623 –0,2270 1 0,5525 0,0400 –0,0336 0,0466 ПЛ –0,1462 0,0650 0,5525 1 0,0356 0,1756 –0,0827 МФ 0,1437 0,0805 0,0400 0,0356 1 0,1428 –0,0202 ГРЛ –0,0494 –0,0126 –0,0336 0,1756 0,1428 1 –0,0203 ПАР 0,1074 –0,0413 0,0466 –0,0827 –0,0202 –0,0203 1 Исходными данными для компонентного анализа в зоне опухоли (РШМ) вокруг артериол, венул и капилляров сосудов были коэффициенты парных корреляций (таблицы 45–47). При парном корреляционном анализе в данной зоне вокруг артериол, венул и капилляров было обнаружено 2700 достоверных связей между клеточны- 210 ми популяциями, после проведения факторного анализа произошла редукция исходных данных и упрощение частных корреляционных связей. Таблица 48 — Собственные значения главных компонент вокруг артериол в зоне опухоли (РШМ) Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,69517 24,217 24,217 2 1,5364 21,949 46,165 3 1,14882 16,412 62,577 4 0,985493 14,078 76,655 5 0,851936 12,171 88,826 6 0,529476 7,564 96,390 7 0,25271 3,610 100,000 информативность (процент дисперсии) Таблица 49 — Собственные значения главных компонент вокруг венул в зоне опухоли (РШМ) Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 2,21288 31,613 31,613 2 1,62275 23,182 54,795 3 1,080492 14,007 68,802 4 0,721361 11,734 80,535 5 0,57929 8,276 88,811 6 0,414646 5,924 94,735 7 0,36858 5,265 100,000 информативность (процент дисперсии) В тканях ШМ в зоне РШМ вокруг различных звеньев МЦР с помощью факторного анализа (объем выборки для артериол и капилляров составил n = 310, а для венул — n = 309 единиц наблюдения) было установлено, что наи- 211 более активным в плане формирования клеточных корреляционных связей является венулярный отдел МЦР. Подобные изменения наблюдались в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ. Так, вокруг венул в данной зоне были выявлены три главных компоненты, при этом накопленная информативность составила 68,802% (таблица 49). Следующим звеном по активности формирования корреляционных связей был капиллярный отдел МЦР, где накопленная информативность трех главных компонент составила 63,072% (таблица 50). Наименьшую активность по формированию корреляционных связей в данной зоне имели артериолы, где накопленная информативность трех главных компонент составила 62,577% (таблица 48). Таблица 50 — Собственные значения главных компонент вокруг капилляров в зоне опухоли (РШМ) Накопленная Главные Собственное Информативность компоненты значение (процент дисперсии) 1 1,81664 25,952 25,952 2 1,47918 21,131 47,083 3 1,11921 15,989 63,072 4 1,01921 14,560 77,632 5 0,872849 12,469 90,101 6 0,497823 7,112 97,213 7 0,195079 2,787 100,000 информативность (процент дисперсии) Следует отметить, что разница по накопленной информативности между этими тремя звеньями МЦР была значительная (таблицs 48–50). Исходя из данного факта, можно предположить, что все три звена сосудистого русла участвуют в формировании корреляционных взаимосвязей в зоне РШМ. Далее для анализа и интерпретации выявленной факторной структуры были использованы факторные нагрузки, значение которых больше или равно 0,3 (в таблицах 51–53 они выделены значком*). 212 В тканях ШМ в зоне РМШ вокруг артериол с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,69517 и информативность 24,217%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ФБ и МФ. Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,5364 и информативность 21,949%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ, ПЛ и ПЯЛ. Таблица 51 — Факторные нагрузки вокруг артериол в зоне опухоли (РШМ) Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,842374* –0,242402 0,211161 ФБ 0,807536* 0,0793851 –0,243799 ЛФ –0,189841 0,684923* 0,351601* ПЛ 0,0622993 0,854995* м0,0602145 МФ 0,511399* 0,232419 0,0569773 ГРЛ 0,13272 0,470432* –0,117053 ПАР 0,0537656 –0,0315022 0,952356* Таблица 52 — Факторные нагрузки вокруг венул в зоне опухоли (РШМ) Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ –0,166877 0,84822* –0,0323304 ФБ 0,160977 0,87665* –0,0220328 ЛФ 0,808889* –0,0260418 0,188856 ПЛ 0,783715* –0,0728181 0,27049 МФ 0,451897* 0,395376* 0,458443* ГРЛ 0,680325* 0,117777 –0,339012* ПАР 0,0790659 –0,0697293 0,846202* 213 С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,14882 и информативность 16,412%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и ПАР. В тканях ШМ в зоне РМШ вокруг венул с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 2,21288 и информативность 31,613%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ, ПЛ, MФ и ГРЛ. Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,62275 и информативность 23,182%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ФБ и MФ. С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,080492 и информативность 14,007%, наиболее тесно связаны клеточные элементы МФ, ГРЛ и ПАР. Таблица 53 — Факторные нагрузки вокруг капилляров в зоне опухоли (РШМ) Факторные нагрузки Фактор Фактор Фактор 1 2 3 ФЦ 0,902122* –0,0605467 –0,0923589 ФБ 0,885853* –0,0561334 0,0590251 ЛФ –0,110232 0,886857* –0,140257 ПЛ 0,00195038 0,866231* 0,191862 МФ 0,257932 0,0778757 0,559502* ГРЛ –0,0504097 0,0706611 0,763739* ПАР 0,114331 0,0606031 –0,446013* В тканях ШМ в зоне РМШ вокруг капилляров с первым фактором (стромообразующим), имеющим наибольшее собственное значение 1,81664 и информативность 25,952%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ФЦ, ФБ и MФ. 214 Со вторым фактором (дезинтегрирующим), имеющим собственное значение 1,47918 и информативность 21,131%, наиболее тесно связаны клеточные элементы ЛФ и ПЛ. С третьим фактором (пролиферирующим), имеющим собственное значение 1,11921 и информативность 15,989%, наиболее тесно связаны клеточные элементы МФ, ГРЛ и ПАР. При сравнении этих двух зон (контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли) обращает на себя внимание, что вокруг различных звеньев МЦР идет смена клеточных популяций, которые коррелировали со стромообразующим, дезинтегрирующим и пролиферирующим факторами. Наиболее стабильными вокруг артериол были корреляции между первым фактором (стромообразующим) и ФЦ, ФБ и MФ, данная зависимость сохранялась в обеих зонах. Вторым по стабильности был второй фактор (дезинтегрирующий), который сохранил зависимость от ЛФ и ПЛ, однако в зоне РШМ данный фактор стал зависим от ГРЛ. Самым нестабильным оказался третий фактор (пролиферирующий), который кардинально поменял корреляционную зависимость от клеточных популяций. Если в контралатеральной зоне от РШМ третий фактор зависел от МФ, ГРЛ и ПАР, то в зоне опухоли данный фактор зависел от популяции ЛФ и ПАР. Стабильность ПАР легко объяснима, если была бы утеряна данная корреляция, то ни о каком опухолевом росте, возможно, не могла бы идти речь, т. к. пролиферация и следующая за ней клеточная атипия МПЭ является основным признаком прогрессии злокачественного процесса. 215 ГЛАВА 6. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СОСУДИСТОГО КОМПОНЕНТА КОММУНИКАЦИОННЫХ СИСТЕМ — ОДНО ИЗ ОСНОВОПОЛАГАЮЩИХ ЗВЕНЬЕВ МОРФОГЕНЕЗА И ПРОГРЕССИИ ОПУХОЛИ (ЗАКЛЮЧЕНИЕ) Обобщение и творческое осмысление известных положений, касающихся морфометрических и иммуногистохимических маркеров прогрессии РШМ, сегодня невозможно без учета изменений стромального компонента опухоли и, прежде всего, коммуникационных систем. В осуществлении межклеточных взаимодействий значительная роль принадлежит так называемым внутриклеточным регуляторам (Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995). Комплексное исследование взаимоотношений эпителиальных и стромальных элементов различного происхождения невозможно без синхронного изучения различных клеточных регуляторов, таких как р53 (он контролирует активность генов, продукты которых вызывают как остановку клеточного цикла в различных его фазах — G1, G2, так и апоптоз); р16INK4a (продукт гена INK4a), который обладает супрессорной функцией на р53 (следует отметить, что уровень экспрессии р16INK4a при дисплазиях шейки матки и РШМ очень вариабелен); Ki-67, отражающий пролиферативную активность клеток как эпителиального, так мезенхимального происхождения. Уточнение механизмов их взаимодействия со специфическими рецепторами на клетках-мишенях в периваскулярных зонах рака шейки матки поможет раскрыть вероятную значительную роль таких взаимоотношений в стартовых процессах инвазии РШМ. В последние годы в литературе широко обсуждаются вопросы молекулярной диагностики предопухолевых и опухолевых процессов в шейке матки с использованием различных моноклональных антител. Чтобы иметь адекватное представление о молекулярных маркерах при опухолевом росте, необходимо 216 знать характер распределения данных маркеров в нормальном эпителии шейки матки. Проведенное исследование показало, что в исследуемой группе (интактная шейка матки) сосуды МЦР представлены артериолами, капиллярами и венулами, в которых базальная мембрана была сохранена, границы ее везде четкие. Коллагеновые и эластические волокна были без признаков дезорганизации. Гистотопографически к многослойному плоскому эпителию ближе располагались капилляры, венулы залегали на отдалении от эпителия, наиболее отдаленно располагались артериолы. Все сосуды имели типичное гистологическое строение, согласно существующим гистологическим описаниям в литературе (Хэм А., Кормак Д., 1983; Мягкова М.А., 1988). Вторая группа наблюдения — ткань шейки матки, пораженная ВПЧ, что по своей сути является предраковым состоянием для РШМ. В ней было выделено две зоны (зона поражения ВПЧ и зона вне поражения ВПЧ). В тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ особенностей в строении и гистотопографии сосудов МЦР выявлено не было. Под многослойным плоским неороговевающим эпителием на различной глубине располагались сосуды МЦР. Микрососуды в данной зоне были представлены артериолами, капиллярами и венулами, которые сохраняли типичное гистологическое строение. Эластический и коллагеновый каркас во всех типах сосудов был сохранен, имел непрерывное строение. Таким образом, строение сосудов МЦР вне зоны поражения ВПЧ практически полностью соответствует строению сосудов в интактной шейке матки. В ткани ШМ в зоне поражения ВПЧ наблюдались признаки ВПЧпоражения МПЭ, кондиломы с различными типами роста, явления ЦИН различной степени выраженности и явления лейкоплакии. Сосуды МЦР представлены артериолами, венулами и капиллярами. При этом наблюдали структурные изменения в соединительнотканном каркасе сосудов. Базальная мембрана сосудов сохранялась, но границы ее не везде четкие, отмечались дезорганизация коллагеновых и эластических волокон, их разволокнение и фрагментация. Гистотопо- 217 графически к эпителиальным структурам ближе располагались капилляры и венулы. Наиболее отдаленно располагались артериолы. По мере нарастания степени тяжести ЦИН наблюдалась прогрессирующая дезорганизция коллагенового и эластического каркаса в венулах, капиллярах и артериолах. При ЦИН 2-й степени имелась перестройка капилляров и венул, которые подрастали к МПЭ и формировали так называемые ангиоматозные гнезда (Мягкова М.А., 1988). Однако широкой анастомозирующей сосудистой сети не формируется. При ЦИН 3-й степени ближе к эпителиальному компоненту отмечалось увеличение количества сосудов МЦР, особенно капилляров и венул, имеющих вертикальный рост и образующих обширные анастомозирующие сети. Сочетание пролиферации многослойного плоского эпителия и сосудов лежит в основе патогномоничного для ПВИ признака — формирования различных типов кондилом (Дерижанова И.С., Гамалеева Т.О., 1999; Пименова В.В., Холодная Т.О., 2005; Холодная Т.О., Дерижанова И.С., 2007). Известно, что пролиферативная активность опухолевых клеток зависит от их близости к кровеносному руслу, при этом пролиферация эндотелия происходит значительно быстрее, чем в нормальных тканях (Ушморов А.Г, Александров В.А., 1989). Помимо эпителия, значительные альтеративные и пролиферативные изменения развиваются в эндотелиоцитах, преимущественно капилляров (Холодная Т.О., Дерижанова И.С., Пименова В.В., 2007). В третьей группе исследований были ткани ШМ, пораженные плоскоклеточным раком. В данной группе было выделено две зоны: зона опухоли и контрлатеральная зона от опухоли. В ткани шейки матки контрлатеральной зоны от РШМ наблюдались признаки папиломавирусного поражения и явления цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени выраженности. Изменения, наблюдаемые в сосудах и в строме данной зоны, были близки к изменениям, которые отмечались в ткани ШМ в зоне поражения ВПЧ, хотя вышеописанные нарушения были более выраженными. Следует отметить, что по мере нарастания дисплазии многослойного плоского эпителия отмечалась пере- 218 стройка сосудов МЦР. Так, при ЦИН 1-й степени в субэпителиальной зоне в строме обнаруживались немногочисленные капилляры со слабо выраженными признаками пролиферации эндотелия. Как правило, диаметр данных сосудов небольшой и располагались они горизонтально по отношению к многослойному плоскому эпителию. В тканях шейки матки с ЦИН 2-й степени наблюдались изменения гистоархитектоники сосудов. Венулы и капилляры имели вертикальное расположение и подрастали к многослойному плоскому эпителию. При ЦИН 3-й степени в тканях ШМ наблюдалась перестройка сосудистого русла, увеличивалось количество капилляров и венул в субэпителиальной зоне, отмечалось увеличение венул и капилляров, подрастающих вплотную к базальной мембране. Часть сосудов врастали в МПЭ и образовывали сосудисто-эпителиальные ассоциации. В ткани плоскоклеточного РШМ (зона опухоли) микрососуды были представлены артериолами, капиллярами и венулами и имели классическое строение. Однако присутствовали псевдососуды по типу примитивных тканевых каналов и щелей, ограниченных опухолевыми клетками. Следует отметить нарушение в гистотопографии сосудов микроциркуляторного русла. Рядом c раковыми комплексами находились сосуды преимущественно венозного и капиллярного типов, образуя густую сосудистую сеть. Сосуды артериального типа чаще всего были окружены мощными прослойками соединительной ткани. Эластический и коллагеновый каркас сосудов имел признаки выраженной дезорганизации, на отдельных участках был полностью разрушен опухолевыми клетками. Отмечались опухолевая инвазия и опухолевые эмболы в сосудах. В сосудах капиллярного типа встречались явления пролиферации сосудистого эндотелия. Вокруг сосудов венулярного и капиллярного типов наблюдалась выраженная лимфо-плазмоцитарная и гистиоцитарная инфильтрация. Злокачественный процесс невозможен без формирования предракового окружения. При этом остается открытым вопрос, являются ли предраковые состояния общим связующим механизмом поддержания злокачественного роста для разных типов опухолей (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; 219 Шварцбурд П.М., 2006). Важную роль в стромообразовании опухолей и в разрушении ЭЦМ играют соединительнотканные клетки гистогенного и гематогенного происхождения, формирующие клеточные инфильтраты (Аничков Н.М., Горделадзе А.С., Новицкая Т.А., Чупров И.Н., 1995). Клетки инфильтратов (макрофаги, лимфоциты, плазмоциты, полиморфноядерные лейкоциты) (Краевский Н.А., Смольянников А.В., Франк Г.А., 1986) способны продуцировать как факторы, стимулирующие образование стромы (ростовые факторы, ИЛ-1, ФНОά, ТФР, фибронектин, различные типы коллагена и др.), так и различные протеолитические ферменты (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003). Ряд авторов в своих работах отмечает, что злокачественные новообразования обладают способностью индуцировать и сохранять вокруг себя in vivo раковое микроокружение. Данный процесс сопровождается увеличением популяции незрелых эпителиальных клеток, активацией внеклеточного протеолиза, ростом сосудов (Дикштейн Е.А., Василенко И.В., 1987; Liotta L.A., Kohn E., 2001; Bissel M.J., LaBarge M.A., 2005). Морфометрическое исследование клеточного инфильтрата в строме интактной ШМ показало, что он был малочисленным и представлен фиброцитами, фибробластами, макрофагами, единичными лимфоцитами, плазмоцитами и единичными полиморфноядерными лейкоцитами. В отдельных работах указывается, что клеточные факторы напоминают лимфоидные элементы бронхов, пейеровых бляшек в кишечнике. В подслизистом слое влагалища, матки, маточных труб имеются скопления плазматических клеток, лимфоцитов, тканевых макрофагов, нейтрофилов (Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Однако в слизистой оболочке интактной ШМ подобных изменений мы не выявили. Крупных скоплений данных клеточных популяций в слизистой оболочке нормальной ШМ обнаружено не было. Как правило, наблюдались единичные рассеянно лежащие вышеописанные клеточные элементы. Статистический анализ результатов морфометрических исследований клеточных популяций вокруг артериол, венул и капилляров подтвердил, что в передней и в задней губе типичное 220 наблюдаемое число клеточных элементов одинаково (достоверных различий выявлено не было, p > 0,05). Во второй группе исследований в зоне и вне зоны поражения ВПЧ вокруг сосудов МЦР морфометрический анализ клеточного инфильтрата стромы показал, что клетки стромы были представлены фиброцитами, фибробластами, макрофагами, лимфоцитами, плазмоцитами и полиморфноядерными лейкоцитами. Морфометрическое исследование клеточных популяций показало, что вокруг артериол, венул и капилляров в тканях, пораженных ВПЧ, значимо возрастает (p 0,05) число лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов и клеток паренхимы по сравнению с зоной вне поражения ВПЧ. Таким образом, типичным является факт, что вне зоны ВПЧ наблюдаемое число клеточных элементов меньше, чем в зоне ВПЧ. При этом количество фиброцитов и фибробластов остается одинаковым (p > 0,05). Обращает на себя внимание факт, что при сравнении данной зоны с тканями интактной ШМ вокруг артериол, венул и капилляров в тканях вне зоны поражения ВПЧ значимо возрастает (p 0,05) число лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов — по сравнению с интактной ШМ. Таким образом, в интактной ШМ наблюдаемое число клеточных элементов меньше, чем в ткани ШМ вне зоны поражения ВПЧ во второй группе наблюдений. Синхронное увеличение в клеточном инфильтрате ткани ШМ в зоне поражения ВПЧ по сравнению с зоной вне поражения ВПЧ и интактной ШМ лимфоцитов, плазмоцитов, макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов, возможно, объясняется тем, что в процессе эволюции между эпителием и соединительной тканью возникла функциональная и морфологическая взаимосвязь, проявляющаяся как в физиологических условиях, так и при патологии. В литературе имеются указания о сохранении этой корреляции при опухолевом росте (Габуния У.А., Цагортин З.Г., 1974; Журавлева Т.Б., Антипова Л.М., 1975; Николаев А.А., Ягубов А.С., 1975). Таким образом, мы наблюдаем, что в ткани ШМ вне зоны поражения ВПЧ возникает новый уровень межклеточных взаимодействий, которых мы не видели 221 в интактной ШМ, хотя явных морфологических признаков ПВИ в данной зоне не обнаружено. При этом реакция стромы в виде увеличения клеточных популяций в инфильтрате имела место. В литературе описано, что наиболее глубокие изменения эпителия репродуктивного тракта развиваются при насыщении организма эстрогенами. В многослойном плоском эпителии влагалища и шейки матки выявляются пролиферация клеток базального слоя и гиперкератоз. При этом синхронные изменения наблюдаются в строме (инфильтрация ее эозинофильными лейкоцитами, плазмоцитами). Согласно литературным данным, накопление лимфоцитов и плазматических клеток в тканях гормонозависимых органов может означать участие иммунных механизмов в наблюдающихся тканевых перестройках (Журавлева Т.Б., Антипова Л.М., 1975). В третьей группе качественный состав клеточного инфильтрата стромы в ткани шейки матки контрлатеральной зоны от РШМ и в зоне опухоли оставался однотипным и включал: фиброциты, фибробласты, макрофаги, лимфоциты, плазмоциты и полиморфноядерные лейкоциты. Морфометрическое исследование клеточных популяций показало, что вокруг артериол в тканях РШМ значимо возрастает (p 0,05) число фибробластов, лимфоцитов, плазматических клеток и полиморфноядерных лейкоцитов по сравнению с КЛЗ от РШМ. При этом средний ранг выборки по фиброцитам, макрофагам и клеткам паренхимы оставался не измененным (p > 0,05). Вокруг венул и капилляров в зоне опухоли значимо возрастает (p 0,05) число лимфоцитов, плазматических клеток и полиморфноядерных лейкоцитов по сравнению с КЛЗ от РШМ, но средние ранги выборки по фиброцитам, фибробластам, макрофагам и клеткам паренхимы в зоне опухоли и КЛЗ от РШМ достоверно не отличались (p > 0,05). Опухоль обладает системным и местным действием на организм. Местные изменения возникают в результате прямого влияния опухолевых клеток на неопухолевые клетки и клетки экстрацеллюлярного матрикса стромы путем воздействия на них секретированных новообразованием онкобелков, факторов роста, цитокинов (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Капланская И.Б., 222 Гласко Е.Н., Франк Г.А., 2005). Кроме того, местные изменения могут быть связаны с воздействием на ткань клеток стромального воспалительного инфильтрата, состоящего из Т-лимфоцитов, NK-клеток, макрофагов, плазмоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов. Стромообразование в опухоли является результатом взаимодействия опухолевых клеток с неопухолевыми клетками соединительной ткани гистиогенного и гематогенного происхождения (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Шварцбурд П.М., 2006). Для конкретизации состава клеточного инфильтрата проведена иммунногистохимическая идентификация клеточных элементов во всех трех группах с помощью следующих антител: NK1, CD4, CD8, CD79α, СD138, CD68. В результате проведенного исследования выяснилось, что клеточный инфильтрат был представлен различными субпопуляциями Т-лимфоцитов, которые экспрессировали маркеры — NK1, CD4 и CD8, причем иммунодетекция Т-клеточных маркеров была вариабельна. Количество NK1-, CD4- и CD8позитивных клеток в строме тканей ШМ увеличивалось от группы к группе. Так, количество NK1-позитивных клеток в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ было в 2,7 раза больше, чем в тканях интактной ШМ; в тканях КЛЗ от РШМ (третья группа наблюдений) их количество было больше в 4 раза по сравнению с зоной поражения ВПЧ (вторая группа наблюдений); в тканях КЛЗ от РШМ — в 11,1 раза больше по сравнению с интактной ШМ. В 2 раза этот показатель был больше в зоне опухоли (РШМ), чем в зоне поражения ВПЧ (при этом имелись достоверные различия, p < 0,05). Количество CD-4позитивных клеток в разных группах исследований было не одинаково и увеличивалось по мере прогрессирования дисплазии в МПЭ и ангиогенеза. Так, количество CD4 в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ было 10 раз больше, чем в тканях интактной ШМ. В тканях КЛЗ от РШМ (третья группа наблюдений) их количество было больше в 1,4 раза по сравнению с зоной поражения ВПЧ (вторая группа наблюдений), а в тканях КЛЗ от РШМ — в 40 раз больше по сравнению с интактной ШМ, в 4,2 раза этот показатель был 223 выше в зоне опухоли (РШМ), чем в зоне поражения ВПЧ (причем различия были значимы, p < 0,05). Тенденция к увеличению в клеточном инфильтрате стромы CD8позитивных клеток имела место во всех исследуемых группах, причем количество CD8-позитивных Т-лимфоцитов в разных группах исследований было не одинаково. Количество CD8-позитивных клеток в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ было в 10 раз больше, чем в тканях интактной ШМ, в тканях КЛЗ от РШМ (третья группа наблюдений) их количество было больше в 2 раза по сравнению с зоной поражения ВПЧ (вторая группа наблюдений), а в тканях КЛЗ от РШМ — в 20 раз больше по сравнению с интактной ШМ, в 1,4 раза этот показатель был больше в зоне опухоли (РШМ), чем в зоне поражения ВПЧ (различия были значимыми, p < 0,05). Отмечалось увеличение и количества В-лимфоцитов (CD79α-позитивных клеток) в клеточном инфильтрате стромы в разных группах исследования. При этом количество CD79α-позитивных лимфоцитов в разных группах исследований было неодинаково. Так, количество CD79α-позитивных клеток в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ было в 7,14 раза больше, чем в тканях интактной ШМ, в тканях КЛЗ от РШМ (третья группа наблюдений) их количество было больше в 2 раза по сравнению с зоной поражения ВПЧ (вторая группа наблюдений); а в тканях КЛЗ от РШМ — в 20 раз больше по сравнению с интактной ШМ. В 3 раза этот показатель был больше в зоне опухоли (РШМ), чем в зоне поражения ВПЧ (причем различия были значимыми, p < 0,05). Анализ экспрессии маркера макрофагов и гистиоцитов CD68 показал, что эта популяция была самой многочисленной во всех группах исследования, и отмечалось четкое увеличение количества CD68-позитивных клеток в клеточном инфильтрате стромы при различных поражениях ШМ. Количество CD68позитивных клеток в разных группах исследований было неодинаково. Так, количество CD68-позитивных клеток в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ было в 3,67 раза больше, чем в тканях интактной ШМ, а в тканях КЛЗ от РШМ — 224 в 6,6 раза больше по сравнению с интактной ШМ, в 1,85 раза этот показатель был больше в зоне опухоли (РШМ), чем в зоне поражения ВПЧ. Однако в тканях КЛЗ от РШМ (третья группа наблюдений) их количество было меньше в 1,16 раза по сравнению с зоной поражения ВПЧ (вторая группа наблюдений). Причем различия были значимыми (p < 0,05). Тенденция к увеличению в клеточном инфильтрате стромы CD138-позитивных клеток (маркера плазматических клеток) имела место во всех исследуемых группах. При этом количество CD138-позитивных клеток в разных группах исследований было не одинаково. Так, количество CD138-позитивных клеток в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ было в 10 раз больше, чем в тканях интактной ШМ, а в тканях КЛЗ от РШМ — в 20 раз больше по сравнению с интактной ШМ, в 2,2 раза этот показатель был больше в зоне опухоли (РШМ), чем в зоне поражения ВПЧ. Однако в тканях КЛЗ от РШМ (третья группа наблюдений) их количество было меньше в 1,8 раза по сравнению с зоной поражения ВПЧ (вторая группа наблюдений). Различия были значимыми (p < 0,05). Следует отметить, что выраженная цитоплазматическая экспрессия CD138 была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоев МПЭ в тканях интактной ШМ. Это не противоречит существующим данным. Отмечено, что выраженная цитоплазматическая экспрессия CD138 также была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоев многослойного плоского эпителия. Экспрессия зависела от степени ЦИН в шейке матки. Иммунодетекция CD138 в МПЭ усиливалась от ЦИН 1 к ЦИН 2 и ЦИН 3-й степени и наиболее ярко была выражена в ЦИН 3, где экспрессия наблюдалась во всех слоях МПЭ. Следует отметить, что цитоплазматическая экспрессия CD138 также была обнаружена в опухолевых клетках в тканях зоны опухоли (третья группа наблюдений). Она была слабой, а в части случаев полностью отсутствовала. Как известно, наиболее выраженные изменения эпителия репродуктивного тракта развиваются при гиперэстрогенэмии. В многослойном плоском эпителии влагалища и шейки матки выявляются пролиферация клеток базального слоя 225 и гиперкератоз. При этом синхронные изменения наблюдаются и в строме с инфильтрацией ее эозинофильными лейкоцитами, плазмоцитами. Накопление лимфоцитов и плазматических клеток в тканях гормонозависимых органов означает участие иммунных механизмов в наблюдающихся тканевых перестройках (Журавлева Т.Б., Антипова Л.М., 1975). При тяжелых дисплазиях ШМ выявляется массивная инфильтрация стромы гранулоцитами, лимфоцитами и плазмоцитами. За нарастающей клеточной инфильтрацией увеличивается роль иммунокомпетентных клеток в защитной реакции организма в ответ на усиление пролиферативных процессов в тканях (Железнова Б.И., Ежова Л.С., Беляева Л.А., 1989). Модифицирующее влияние стромы на опухолевые клетки развивается через адгезивные молекулы и интегриновые рецепторы, передающие сигнал элементам цитоскелета и далее в геном клетки (Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995). В настоящее время в качестве основного механизма неоплазии предполагаются дефицит адгезивных взаимодействий (Бочарова О.А., 2002) и постоянно меняющиеся адгезивные свойства опухолевых клеток за счет изменений в экспрессии ими рецепторов для кадгеринов из суперсемейства ICAM, что обеспечивает инвазивный рост и метастазирование опухолей (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Hart I.R., Goode N.T., Wilson R.E., 1989). Суперсемейство иммуноглобулинов ICAM, состоящее из ICAM-1, ICAM-2 и VCAM-1, вовлекается в Т-клеточно-эндотелиальное взаимодействие, что ведет к недостаточности взаимодействия молекул из суперсемейства ICAM c их лигандами, обеспечивающими в норме прикрепление иммунных эффекторов к клеткам-мишеням, сводя к минимуму элиминацию опухолевых клеток макрофагами, нейтрофилами, NK-клетками, цитотоксическими лимфоцитами (Бочарова О.А., 2002; Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003). Это вызывает эффект экранирования опухолевых клеток от противоопухолевого иммунитета. Усиление мембранной экспрессии адгезивных молекул на опухолевых клетках сопровождается формированием собственной сосудистой сети опухоли через индукцию экспрессии VCAM-1 (Бочарова О.А., 2002). Ослабление межклеточной адгезии в тканях 226 является специфичным свойством опухолевого роста и характеризуется увеличением клеточной адгезии и, соответственно, повышением экспрессии молекул LFA-1, ICAM-1, ICAM-2 в ответ на медиаторы воспаления (противовоспалительные цитокины, гормоны, инфекции). Это ведет к увеличению хелперносупрессорного (СD4/СD8) соотношения, активации NK-клеток, макрофагов, нейтрофилов. Подавление повышенной экспрессии этих молекул за счет моноклональных антител, глюкокортикоидов и кортикостероидов приводит к терапевтическому эффекту и снижает выраженность воспалительной реакции. Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркера апоптоза p53, супрессора апоптоза bcl-2 и маркера пролиферации Ki-67 вывило, что данные маркеры определяются в МПЭ интактной ШМ, в тканях шейки матки при поражениях ВПЧ и в тканях рака шейки матки. В интактной ШМ р53, bcl-2, Ki-67 присутствовали во всех трех исследованных группах. Их количество сильно отличалось в эпителиальном и стромальном компонентах исследуемых зон. Оно зависело от степени выраженности патологических процессов в шейке матки. В первой группе (интактная ШМ) на долю маркера супрессии апоптоза bcl-2 в эпителии приходится 98% в тканях передней губы, а задней — 96%. В строме позитивных клеток не выявлено. Второй по частоте экспрессии в эпителии был Ki-67, который выявлялся с одинаковой частотой в задней (54%) и передней (55%) губе в строме (13% и 6% соответственно). Наименьшая доля встречаемости приходится на экспрессию p53, который выявлялся в эпителии передней (17%) и задней (14%) губы. В клетках стромы данного маркера не выявлено. Однако достоверных различий в обеих зонах по данным маркерам не было выявлено (р > 0,05). Таким образом, наши наблюдения не противоречат существующему мнению, что в интактной ШМ нет статистически значимых различий в экспрессии вышеперечисленных маркеров (Isacson С., Kessis T.D., Hedric L., Cho K.R., 1996; Shoji Y., Saegusa M., Takano Y., Ohbu M., Okayasu I., 2002). Во второй исследуемой группе выявлено, что наибольшая экспрессия в эпителии приходится на маркер пролиферативной активности Ki-67 (87%). 227 За ним по частоте экспрессии стоит р53, на его долю приходится около 51%. Последнее место занимает маркер супрессии апоптоза bcl-2. На его долю приходится менее 12,5%. В строме количественное распределение данных маркеров меняется, но лидирующая роль остается за Ki-67 (9%). Вторым по частоте экспрессии в строме был супрессор апоптоза bcl-2 (7%). Наименьшая доля приходится на экспрессию p53 (3%). Доля р53-позитивных клеток в эпителии в 1,45 раза, а в строме в 4 раза больше в тканях ШМ вне зоны поражения ВПЧ, чем в зоне поражения ВПЧ. Что касается Ki-67, то количество этих позитивных клеток в эпителии в 1,3 раза, а в строме — в 2 раза больше в зоне поражения ВПЧ, чем в тканях ШМ вне зоны поражения. При анализе экспрессии bcl-2позитивных клеток выявлено, что в эпителии этих клеток в 2,85 раза больше в зоне поражения ВПЧ, чем вне зоны поражения. В строме картина противоположная: в зоне поражения количество bcl-2-позитивных клеток в 5 раз меньше, чем вне зоны поражения. При этом имелись достоверные различия (p < 0,05) в количественном распределении вышеуказанных маркеров между зоной вне поражения ВПЧ и зоной поражения ВПЧ шейки матки. Третья группа наблюдений характеризовалась тем, что наибольшая экспрессия в эпителии приходилась на маркер пролиферативной активности Ki-67 (86%). За ним по частоте экспрессии стоит р53. На его долю приходится около 54%. Последнее место занимает маркер супрессии апоптоза bcl-2. На его долю приходится около 40%. В строме количественное распределение данных маркеров меняется. В строме доля позитивных клеток по Ki-67 снижается до 18%. Второй по частоте экспрессии в строме остается р53, однако его доля резко снижается и составляет всего около 10%. На последнем месте был супрессор апоптоза bcl-2. Однако его доля резко снижается до 6%. Доля р53-позитивных клеток в эпителии в 1,8 раза, а в строме в 3,5 раза больше в тканях зоны опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. Что касается Ki-67, то количество этих позитивных клеток в эпителии в 1,2 раза, а в строме в 1,8 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При анализе экспрессии 228 bcl-2-позитивных клеток выявлено, что в эпителии этих клеток в 1,92 раза больше в зоне опухоли, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. В строме картина противоположная — в зоне опухоли количество bcl-2-позитивных клеток в 1,3 раз меньше, чем в КЛЗ от РШМ. При этом имелись значимые различия (p < 0,05) в количественном распределении вышеуказанных маркеров между КЛЗ от РШМ и зоной опухоли. Таким образом, проведенное исследование подтверждает мнение, что увеличение содержания клеток с положительной реакцией на Ki-67 в базальных отделах ведет к появлению клеток, содержащих мутантный ген р53 в ядрах. Повидимому, размножающиеся клетки при регенерации являются местом наименьшего сопротивления для трансформирующего воздействия вируса. Именно здесь создаются условия для развития рака (Дерижанова И.С., Гамалеева Т.О., 1999; Пименова В.В., Холодная Т.О., 2005; Холодная Т.О., Дерижанова И.С., 2007). Известно, что пролиферативная активность опухолевых клеток зависит от их близости к кровеносному руслу. При этом пролиферация эндотелия происходит значительно быстрее, чем в нормальных тканях (Ушморов А.Г., Александров В.А.,1989). Ангиогенез в условиях опухолевого роста идет непрерывно. Новообразованные сосуды анастомозируют только с функционирующими микрососудами (Ярыгин Н.Е., Николаева Т.Н., Кораблев А.В., 1993). VEGF отводится ключевая роль в ангиогенезе опухолей. Он вызывает миграцию клеток эндотелия, их инвазию в коллагеновый гель и образование трубчатых структур, также он повышает проницаемость сосудов (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Карамышева А.Ф., 2004; Folkman J., 1990). Действие указанных факторов вызывает врастание капилляров в опухоль из окружающих «нормальных» тканей. Нарушение межклеточных и стромально-паренхиматозных взаимоотношений в опухолевой ткани на фоне измененного ЭЦМ приводит к развитию неполноценных сосудов капиллярного типа с прерывистой базаль- 229 ной мембраной и нарушенной эндотелиальной выстилкой (Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995). Проведенное исследование показало, что площадь сосудистого русла в верхней и нижней губе интактной ШМ практически одинаковая и отличается всего на 0,24% (различия были не достоверны, p < 0,05). Во второй группе исследований при сравнении площади сосудистого русла в зоне вне поражения ВПЧ с зоной поражения ВПЧ видно, что площадь сосудистого русла в зоне поражения ВПЧ на 21,92% больше. При анализе экспрессии эндотелиального маркера (CD34) в третьей исследуемой группе (ткани РШМ) положительная экспрессия была обнаружена во всех исследуемых случаях и во всех исследуемых зонах. При сравнении площади сосудистого русла контрлатеральной зоны от РШМ и зоны опухоли видно, что площадь сосудистого русла в зоне опухоли на 17,86% больше, чем контрлатеральной зоны от РШМ. При этом различия были достоверны (p < 0,05) во всех трех группах. Экспрессия NGFR (рецептор фактора роста нервов) наблюдалась в нервных структурах в тканях передней и задней губы интактной ШМ. Отмечалась выраженная мембранная иммунодетекция в нервных волокнах шейки матки. При этом большинство нервных волокон располагалось в глубоких отделах стромы (на отдалении от покровного эпителия ШМ). Такое распределение нервных структур в ШМ наблюдали и другие авторы (Доросевич А.Е., Бехтерева И.А., Судиловская В.В., 2009). Данное антитело накапливалось в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия. При этом экспрессия была слабой, в редких случаях умеренной. Количество NGFR-позитивных структур в обеих зонах отличалось на 10,11%. В ткани передней губы шейки матки количество NGFR-позитивных структур значимо выше (р 0,05) по сравнению с задней губой ШМ. Экспрессия NGFR в нервных структурах в тканях ШМ в зоне поражения ВПЧ была выявлена во всех исследуемых случаях. Отмечалась выраженная мембранная иммунодетекция в нервных волокнах в данной зоне ШМ. Нервные волокна располагались как в глубоких отделах стромы, так и субэпите- 230 лиально. В ряде случаев клетки воспалительного инфильтрата окружали NGFR-позитивные нервные волокна. Следует отметить, что данное антитело накапливалось в клетках базального слоя многослойного плоского эпителия. При этом экспрессия была умеренной или ярко выраженной. Следует отметить, что экспрессия данного маркера в клетках МПЭ зависела от степени ЦИН. Так, при ЦИН 1-й степени отмечалась выраженная, но неравномерная экспрессия NGFR в клетках эпителия на протяженности всего среза, иногда встречались участки с негативной реакцией. При ЦИН 2-й степени экспрессия NGFR была равномерной и хорошо выраженнной в базальном и шиповатом слоях МПЭ, а в нервных волокнах сохранялась умеренная экспрессия данного антитела. При ЦИН 3-й степени отмечалась яркая экспрессия данного маркера во всех слоях МПЭ. В нервных волокнах экспрессия была слабо или умеренно выраженная, экспрессия данного антитела была обнаружена даже в клетках воспалительного инфильтрата (лимфоциты, макрофаги). В ткани ШМ в зоне поражения ВПЧ количество NGFR-позитивных структур на 21,10% больше, чем вне зоны поражения. В третьей группе (ткани рака шейки матки) экспрессия NGFR в нервных структурах в тканях контрлатеральной зоны от РШМ и в зоне опухоли была выявлена во всех исследуемых случаях. Отмечалась выраженная иммунодетекция в нервных волокнах в данной зоне. При этом большинство нервных волокон располагалось в строме между опухолевыми клетками, на отдельных участках нервные структуры находились в непосредственной близости от раковых клеток. Следует отметить, что данное антитело накапливалось в клетках сохраненных участков базального слоя многослойного плоского эпителия. При этом экспрессия была слабой или умеренной, в опухолевых клетках раковых комплексов данное тело не экспрессировалось. В ткани РШМ в зоне опухоли количество NGFR-позитивных структур на 48,3% больше, чем в контрлатеральной зоне от РШМ. При этом различия были значимы (p < 0,05) во всех исследуемых группах. 231 Анализ изученной литературы показал, что в неизмененной ШМ в различные возрастные периоды обнаруживается вариабельность соотношения паренхимы и стромы, проявляющаяся изменениями эпителия, клеточных и волокнистых элементов стромы, сосудов, качественными и количественными особенностями клеточного инфильтрата и распределения веществ, выявляющихся гистохимически неоднородными (Деражне А.Б., 1969; Мягкова М.А., 1988; Черный А.П., Яковлева Н.И., 1990; Царева Н.В., 1998; Гуркин Ю.А., Иванова О.И., Павлович В.Г., 1983; Хмельницкий О.К., 2004). По мере нарастания катаплазии происходит увеличение ангиогенеза (Сулава Т.А., 1981; Козлов Д.В., Зорин Н.А., Голубев О.А., 1996; Востропятова Е.М., 1991; Lenczewski A., Terlikowski S., Famulski W. et al., 2001; Tjalma W.A., Weyler J.J., Bogers J.J. et al., 2001). Во все трех группах исследования был выполнен парный корреляционный анализ клеточных популяций вокруг различных сосудистых единиц (артериол, венул, капилляров). Далее, с помощью факторного анализа, было установлено, что наиболее активным в плане формирования клеточных корреляционных связей в интактной ШМ является венулярный отдел МЦР. Вокруг артериол никаких корреляционных связей выявлено не было. Было выяснено, что вокруг венулярного и капиллярного звена КС в ткани передней и задней губы ШМ были выявлены три главных компоненты, накопленная информативность которых имела высокие значения. Таким образом, выделено три основных фактора, которые обеспечивают постоянство паренхиматозно-стромальных взаимоотношений в интактной ШМ. Напомним, что условно мы назвали первый фактор стромообразующим, т. к. основными клетками в системе корреляционных связей были установлены фибробласт и фиброцит, которые являются основными элементами в процессе стромообразования. Второй основной фактор дает корреляционные связи с полиморфноядерными лейкоцитами, которые одними из первых реагируют на клеточные повреждения и запускают механизм клеточной дезинтеграции. Следовательно, данный фактор условно назвали дезинтегрирующим. 232 Третий основной фактор в данной ситуации имеет устойчивые корреляции с паренхимой органа; как известно, паренхиматозные клетки (в нашей ситуации это многослойный плоский эпителий) начинают активно реагировать на любое повреждение путем пролиферации и созревания резервных клеток, запуская механизмы регенерации. Учитывая данный факт, третий фактор был назван пролиферирующим. Выделение трех данных факторов подтверждает, что интактный МПЭ изменяется циклично на протяжении менструального цикла и в разные возрастные периоды женщины. Общеизвестно, что клеточный рост и дифференцировка МПЭ являются гормонозависимыми. Эстрогены могут вызывать эпителиальную пролиферацию и созревание клеток. Прогестерон угнетает созревание клеток верхней части среднего слоя эпителия и способствует их слущиванию. В результате под влиянием эстрогенов (эстрадиол, эстриол) МПЭ становится зрелым, а под влиянием прогестерона — полузрелым (Яковлева И.А., 1969; Никулин Н.К., Кунцевич Л.Д., Борщевская Р.П., 1999; Царева Н.В., 1998; Гуркин Ю.А., 2000; Русакевич П.С., Литвинова Т.М., 2006). Эти три основных фактора, выделенные в интактной ШМ, позволили нам с позиций паренхиматозно-стромальных взаимоотношений рассмотреть роль сосудистого компонента коммуникационных систем в процессах становления и прогрессии рака шейки матки и уточнить возможное значение взаимоотношений сосудистого русла и его клеточного микроокружения в прогнозе карцином шейки матки. Установлено, что сосудистый компонент в процессе опухолевого роста находится в тесном взаимодействии с паренхимой и с компонентами стромы, такими как клеточный и внеклеточный матрикс (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е., 2003; Капланская И.Б., Гласко Е.Н., Франк Г.А., 2005). Во второй группе проведенный корреляционный факторный анализ в данной зоне показал, что по сравнению с интактной ШМ в зоне вне ВПЧпоражения имеются выраженные изменения в корреляционных взаимосвязях между клеточными популяциями вокруг всех звеньев сосудистого русла. При этом нарушения выявляются во всех трех факторах: стромообразующем, дезин- 233 тегрирующем и пролиферирующем, что позволяет предположить, что уже даже в данной зоне имеются изменения в межклеточных взаимодействиях, которые впоследствии ведут к прогрессии ВПЧ-поражений и формированию типичных морфологических изменений, характерных для данной патологии. Данный факторный анализ показал, что в тканях ШМ в зоне поражения ВПЧ по сравнению с зоной вне ВПЧ-поражения увеличивается количество клеточных популяций, которые формируют корреляционные связи. При этом изменения наблюдаются вокруг всех трех звеньев МЦР и касаются всех трех выделенных факторов (стромообразующего, дезинтегрирующего и пролиферирующего). Так, вокруг артериол, венул и капилляров вне зоны ВПЧ наблюдались только по одной или две клеточные популяции, которые были связаны с первым, вторым и третьим факторами, а в зоне поражения с ними связано три, четыре или пять клеточных популяций. Таким образом, наблюдается расширение клеточных популяций, участвующих в корреляционных связях, тем самым нарушая тканевой гомеостаз, что в последующем ведет к нарушению стромально-паренхиматозных взаимоотношений в ткани ШМ при ВПЧ-инфекции, вызывая прогрессию процесса, и способствует опухолевой трансформации эпителия. В третьей группе четко прослеживается однотипность корреляционных взаимосвязей вокруг различных звеньев сосудистого русла в контрлатеральной зоне от РМШ. Так, вокруг артериол, венул и капилляров в данной зоне с первым фактором (изначально мы его определили как стромообразующий) тесно коррелировали фибробласты и фиброциты (исключение составил артериолярный отрезок, вокруг которого отмечалась зависимость и от макрофагов). Второй фактор, который был обозначен как дезинтегрирующий, наиболее тесно связан с популяциями лимфоцитов и плазмоцитов. Третий фактор — пролиферирующий — наиболее тесно коррелировал с макрофагами, полиморфноядерными лейкоцитами и паренхимой. Такое распределение корреляционных взаимосвязей можно объяснить тем, что в данной зоне морфологически были выявлены признаки ВПЧ-поражения ШМ. Имеющиеся признаки ЦИН различной степени вы- 234 раженности укладываются в картину прогрессии и нарастания пролиферативных процессов в многослойном плоском эпителии. При сравнении этих двух зон (контрлатеральной зоны от РШМ и зоны РШМ) обращает на себя внимание, что вокруг различных звеньев МЦР идет смена клеточных популяций, которые коррелировали со стромообразующим, дезинтегрирующим и пролиферирующим факторами. Наиболее стабильными вокруг артериол были корреляции между первым фактором (стромообразующим) и фиброцитами, фибробластами, макрофагами. Данная зависимость сохранялась в обеих зонах. Вторым по стабильности был второй фактор (дезинтегрирующий), который сохранил зависимость от лимфоцитов и плазмоцитов. Однако в зоне РШМ данный фактор стал зависим от полиморфноядерных лейкоцитов. Самым нестабильным оказался третий фактор (пролиферирующий), который кардинально поменял корреляционную зависимость от клеточных популяций. Если в контрлатеральной зоне от РШМ третий фактор зависел от макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов и паренхиматозных клеток (опухолевых клеток), то в зоне РШМ данный фактор зависел от популяции лимфоцитов и паренхиматозных клеток (опухолевых клеток). Стабильность паренхиматозых клеток (опухолевых клеток) легко объяснима. Если бы была утеряна данная корреляция, то ни о каком опухолевом росте, возможно, не могла бы идти речь, т. к. пролиферация и следующая за ней клеточная атипия многослойного плоского эпителия являются основным признаком злокачественности процесса. 235 ВЫВОДЫ 1. В тканях интактной шейки матки и в зоне вне поражения ВПЧ име- ются типичные по гистологическому строению сосуды МЦР, но при этом выявлены гистотопографические особенности расположения сосудов микроциркуляторного русла по отношению к многослойному плоскому эпителию (ближе всего к эпителию расположены капилляры и венулы, а артериолы залегают в более глубоких отделах стромы). 2. В тканях ШМ в зоне поражения ВПЧ и в тканях контрлатеральной зоны от РШМ по мере нарастания ЦИН в ткани шейки матки идет перестройка сосудов МЦР, которая сопровождается изменением гистоархитектоники и гистотопографии сосудов МЦР и характеризуется формированием сосудистоэпителиальных ассоциаций. 3. В тканях зоны опухоли (рак шейки матки) имеется нарушение в гис- тотопографии сосудов МЦР, которое характеризуется хаотичным расположением капилляров, венул и артериол и формированием густой сосудистой сети рядом с эпителиальными опухолевыми структурами. 4. В тканях интактной шейки матки, в тканях шейки матки при пора- жении ВПЧ и тканях рака шейки матки по мере нарастания ЦИН и трансформации в раковый процесс значимо увеличивается площадь сосудистого русла и количество NGFR позитивных структур (рецептор фактора роста нервов). 5. В тканях интактной шейки матки и в зоне вне поражения ВПЧ при морфометрическом исследовании обнаружена слабовыраженная клеточная инфильтрация, которая была представлена различными клеточными популяциями (фиброцитами, фибробластами, макрофагами, единичными лимфоцитами, плазмоцитами и полиморфноядерными лейкоцитами). При этом в зоне вне поражения ВПЧ количественный состав данных клеток был значимо выше, чем в интактной шейке матки. 236 6. Проведенное морфометрическое исследование показало гетероген- ность в распределении клеточных популяций вокруг артериол, венул и капилляров в тканях шейки матки в зоне поражения ВПЧ. Имелось значимое возрастание числа лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов и клеток паренхимы по сравнению с зоной вне поражения ВПЧ. Наиболее стабильными были популяции фиброцитов и фибробластов. 7. Клеточные популяции вокруг артериол в тканях РШМ достоверно возрастали: число фибробластов, лимфоцитов, плазматических клеток и полиморфноядерных лейкоцитов по сравнению с КЛЗ от РШМ. Вокруг венул и капилляров в зоне опухоли достоверно возрастало число лимфоцитов, плазматических клеток и гранулоцитарных лейкоцитов по сравнению с КЛЗ от РШМ. Наиболее стабильными были популяции фиброцитов, макрофагов и клетки паренхимы. 8. Иммуногистохимическая идентификация клеточных элементов по- казала, что в тканях интактной шейки матки, в тканях ШМ при поражении ВПЧ и тканях рака шейки матки имеются NK1, CD4, CD8, CD79α, СD138, CD68позитивные клеточные популяции, распределение которых было крайне вариабельно вокруг сосудов МЦР, но имелось значимое увеличение данных клеток в строме по мере нарастания ЦИН в эпителии шейки матки и трансформации в РШМ. 9. Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркера апоптоза p53, супрессора апоптоза bcl-2 и маркера пролиферации Ki-67 вывило, что данные маркеры определяются в многослойном плоском эпителии интактной ШМ, в тканях шейки матки при поражениях ВПЧ и в тканях рака шейки матки. Однако в интактной ШМ нет статистически значимых различий в экспрессии вышеперечисленных маркеров. Статистически значимые различия в экспрессии p53, bcl-2 и Ki-67 выявлены в тканях ШМ при поражении ВПЧ и ткани рака шейки матки. 237 10. Проведенный факторный анализ показал, что наиболее активным в плане формирования клеточных корреляционных связей в интактной шейке матки является венулярный отдел МЦР. Вокруг венулярного и капиллярного звеньев КС в ткани интактной шейки матки были выявлены три главных компоненты, накопленная информативность которых была значимой. Это позволило выделить три основных фактора, которые обеспечивают постоянство паренхиматозно-стромальных взаимоотношений в интактной шейке матки: стромообразующий, дезинтегрирующий, пролиферирующий. 11. Проведенный корреляционный факторный анализ показал, что по сравнению с интактной шейкой матки в зоне вне ВПЧ-поражения имеются выраженные изменения в корреляционных взаимосвязях между клеточными популяциями вокруг всех звеньев сосудистого русла. При этом нарушения выявляются во всех трех факторах: стромообразующем, дезинтегрирующем и пролиферирующем, что позволяет предположить, что даже в данной зоне идут изменения в межклеточных взаимодействиях, которые могут привести к прогрессии ВПЧ-поражений и формированию типичных морфологических изменений, характерных для данной патологии. 12. Проведенный корреляционный факторный анализ в контрлатераль- ной зоне от РШМ и в зоне РШМ показал, что вокруг различных звеньев МЦР идет смена клеточных популяций, которые коррелировали с стромообразующим, дезинтегрирующим и пролиферирующим факторами. Наиболее стабильным вокруг артериол был стромообразующий фактор. Вторым по стабильности был дезинтегрирующий фактор. Самым нестабильным оказался пролиферирующий фактор, который кардинально поменял корреляционную зависимость от клеточных популяций. 238 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Учет особенностей гистоархитектоники и гистотопографии сосудов МЦР и эпителия позволит конкретизировать диагностику предрака и рака шейки матки. 2. Комплексная морфологическая оценка взаимоотношений сосудистого компонента коммуникационных систем с внутриклеточными регуляторами при предраковых и раковых процессах шейки матки позволяет значительно увеличить информативность морфометрического исследования и, в дальнейшем, предположить течение патологического процесса в шейке матки, что позволит создать индивидуальный прогноз течения заболевания. 3. Сочетание морфометрических и иммуногистохимических методов исследования с последующей оценкой состояния сосудистого компонента коммуникационных систем при предраковых и раковых процессах шейки матки необходимо использовать в клинической практике, как один из возможных критериев индивидуального прогноза и тактики лечения. 4. Учитывая морфологические, морфометрические и иммуногистохимические изменения в тканях вне зоны поражения ВПЧ и контрлатеральной зоне от РШМ, можно утверждать, что данные зоны ШМ должны исследоваться в клинической практике для исключения поражений предопухолевыми и опухолевыми процессами, что позволит дать рекомендации по тактике лечения и разработать критерии индивидуального прогноза. 5. При патологоанатомической диагностике предраковых и раковых процессов шейки матки необходимо учитывать особенности состояния стромообразующего, дезинтегрирующего и пролиферирующего факторов шейки матки, стабильность которых зависит от состава клеточных популяций, их количества и внутриклеточных регуляторов. 239 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВПЧ — ВИРУС ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА В-ПИП — ВЫСОКАЯ СТЕПЕНЬ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ИЛ — ИНТЕРЛЕЙКИН ИППП — ИНФЕКЦИИ, ПЕРЕДАВАЕМЫЕ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ ИФ — ИНТЕРФЕРОН КЛЗ — КОНТРЛАТЕРАЛЬНАЯ ЗОНА КС — КОММУНИКАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ ЛФ — ЛИМФОЦИТЫ МПЭ — МНОГОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ ЭПИТЕЛИЙ МЦР — МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОЕ РУСЛО МФ — МАКРОФАГИ Н-ПИП — НИЗКАЯ СТЕПЕНЬ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ПАР — ПАРЕНХИМА ПВИ — ПАПИЛЛОМАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ПИП — ПЛОСКОКЛЕТОЧНОЕ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЕ ПОРАЖЕНИЕ ПЛ — ПЛАЗМОЦИТЫ ПЦР — ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ГРЛ — ГРАНУЛОЦИТАРНЫЕ ЛЕЙКОЦИТЫ РШМ — РАК ШЕЙКИ МАТКИ ФБ — ФИБРОБЛАСТЫ ФНОα — ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ-Α ФЦ — ФИБРОЦИТЫ 240 ЦИН — ЦЕРВИКАЛЬНАЯ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ НЕОПЛАЗИЯ ЦКР — ЦИТОКЕРАТИНЫ ЦЭ — ЦИЛИНДРИЧЕСКИЙ ЭПИТЕЛИЙ ШМ — ШЕЙКА МАТКИ ЭНД — ЭНДОТЕЛИОЦИТЫ ЭЦМ — ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНЫЙ МАТРИКС ICAM — МОЛЕКУЛЫ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ПРИЛИПАНИЯ HSIL — HIGHT-GRADE SQUAMOUS INTRAEPITELIAL LESSION (ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫЕ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ) LSIL — LOW-GRADE SQUAMOUS INTRAEPITELIAL LESSION (ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫЕ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ НИЗКОЙ СТЕПЕНИ ) VCAM — МОЛЕКУЛЫ АДГЕЗИИ КЛЕТОК СОСУДОВ 241 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абросимов, С.Ю. Морфогенетические потенции коммуникационных систем при дисплазиях и фиброаденомах молочной железы / С.Ю. Абросимов, А.Е. Доросевич, О.А. Голубев // Архив патологии. — 1996. — Т. 58. — № 3. — С. 33–37. 2. Абросимов, С.Ю. Морфометрическая идентификация стромы дисплазии и рака молочной железы с позиций коммуникационных систем: автореф. дис. ... д-ра мед. наук / С.Ю. Абросимов. — Санкт-Петербург, 2004. — 38 с. 3. Аничков, Н.М. О некоторых важнейших морфологических маркерах опухолей ткани / Н.М. Аничков // Общие и частные вопросы морфологии: Сборник научных трудов. — Л. : ЛСГМИ, 1990. — С. 4–17. 4. Аничков, Н.М. Фибропластика и реакция свободных клеток стромы в меланоцитарных опухолях / Н.М. Аничков, А.С. Горделадзе, Т.А. Новицкая, И.Н. Чупров // Съезд Международного союза ассоциаций патологоанатомов. — 1-й : тезисы докладов. — Москва, 1995. — С. 7–8. 5. Анкирская, А.С. Вагинальные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами (бактерии, грибы, микоплазмы): критерии диагностики / А.С. Анкирская // Материалы рабочего совещания дерматологов и акушеров-генекологов «Современные методы диагностики, терапии и профилактики ИППП и других урогенитальных инфекций». — 1999. — С. 6–7. 6. Атлас TNM : Иллюстрированное руководство по TNM/рTNM классификации злокачественных опухолей / Пер. с англ. 4-го издания / Под ред. В.Е. Кратенка, Е.А. Короткевича. — Минск : Белорусск. Центр науч.-мед. информации, 1998. — 381 с. 242 7. Афанасьев, М.С. Вирусно-бактериальная природа дисплазии и рака шейки матки / М.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев // Вестник РАМН. — 2004. — № 6. — С. 35–40. 8. Баггиш, М. Кольпоскопия. Атлас-справочник / М. Баггиш // Пер. с англ. — М. : Практика, 2008. — 340 с. 9. Баженов, С.М. Особенности паренхиматозно-стромальных и иммунологических взаимоотношений при раке молочной железы I–II стадии : Дис. ... канд. мед. наук / С.М. Баженов. — Смоленск, 1989. — 161 с. 10. Бакшеев, Н.С. Злокачественные новообразования женских половых органов / Н.С. Бакшеев, А.И. Миляновский, Н.А. Ильяшенко // М.: Медицина, 1977. — 328 с. 11. Балонина, Н.В. К вопросу об изменении стенок кровеносных сосудов при раке / Н.В. Балонина, В.П. Шехонин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 1946. — Т. 3. — № 22. — С. 9–12. 12. Басаргин, С.Т. Клеточная реакция стромы и иммунокомпетентность онкологических больных / С.Т. Басаргин // Иммунологический контроль у онкологических больных / Под ред. В.В. Городиловой. — Томск, 1978. — С. 29–59. 13. Бауэр, Г. Цветной атлас по кольпоскопии / Г. Бауэр / Пер. с нем. под ред. С.И. Роговской. — М. : ГЭОТАР-МЕД, 2002. — 86 с. 14. Бахидзе, Е.В. Патогенетическая неоднородность рака шейки матки / Е.В. Бахидзе, А.Г. Косников, С.Я. Максимов // Вопросы онкологии. — 1996. — Т. 42. — № 5. — С. 45–51. 15. Белокриницкая, Е.У. Роль цитокинов в патогенезе нарушений иммунитета и гомеостаза у больных с тяжелыми дисплазиями и раком шейки матки / Е.У. Белокриницкая, Ю.А. Витковский, Ю.Н. Пономарева // Вопросы онкологии. — 2003. — Т. 49. — № 1. — С. 51–54. 243 16. Белушкина, Н.Н. Молекулярные основы патологии апоптоза / Н.Н. Белушкина, С.Е. Северин // Архив патологии. — 2001. — Т. 63. — № 1. — С. 51–60. 17. Берштейн, Л.М. Гормональный канцерогенез / Л.М. Берштейн — СПб. : Наука, 2000. — 199 с. 18. Бехтерева, И.А. Особенности гистоархитектоники вегетативных нервных терминалей и их клеточного окружения в тканях рака влагалищной порции шейки матки / И.А. Бехтерева, А.Е. Доросевич, В.В. Судиловская // Современные проблемы клинической патоморфологии : Тез. Всероссийская конференция, посвященная памяти профессора О.К. Хмельницкого. — СПб., 2005. — С. 25–27 (1). 19. Бехтерева, И.А. Нервный компонент коммуникационных систем в тканях плоскоклеточного рака шейки матки / И.А. Бехтерева, А.Е. Доросевич, В.В.Судиловская // Новые методы и разработки в онкоморфологии : IV конференция российских патологоанатомов. СD-версия : МеdMcorp. — 2005. — С. 13–14 (2). 20. Билынский, Б.Т. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности / Б.Т. Билынский, Н.А. Володько, Я.В. Шпарык. — Киев : Наукова думка, 1991. — 245 с. 21. Бобрик, И.И. Ультраструктурные закономерности новообразования вторичных кровеносных микрососудов в пренатальном периоде морфогенеза человека / И.И. Бобрик, В.Г. Черкасов, Е.А. Шевченко // Архив анатомии. — 1989. — № 2. — С. 23–26. 22. Бобро, Л.И. Фибробласты и их значение в тканевых реакциях / Л.И. Бобро // Архив патологии. — 1990. — Т. 52. — № 12. — С. 65–68. 23. Болч, Б. Многомерные статистические методы для экономики / Б. Болч, К. Дж. Хуань // Пер. с англ. — М. : Статистика, 1979. — 317 с. 24. Бохман, Я.В. Руководство по онкогинекологии / Я.В. Бохман. — СПб. : Фолиант, 2002. — 463 с. 244 25. Бочарова, О.А. Адгезивные взаимодействия в биологии рака / О.А. Бочарова // Вестник РАМН. — 2002. — № 1. — С. 22–25. 26. Брондз, Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании / Б.Д. Брондз. — М. : Наука, 1987. — 353 с. 27. Быков, В.Л. Дендритные антигенпредставляющие клетки дистального отдела женского репродуктивного тракта в норме, эксперименте и при патологических состояниях / В.Л. Быков // Архив патологии. — 1997. — Т. 59. — № 6. — С. 69–73. 28. Быковская, С.Н. Т-лимфоциты в протифоопухолевом иммунитете / С.Н. Быковская, Е.В. Грунтенко. — Новосибирск : Наука, 1982. — С. 272. 29. Ващенко, С.Н. Иммуногистохимическая характеристика регенераторного потенциала слизистой оболочки шейки матки / С.Н. Ващенко, О.В. Семухина, А.Н. Грибань // Успехи современного естествознания. — 2009. — № 1. — С. 21–26. 30. Волгарева, Г.М. Экспрессия белкового маркера р16INK4а в раке шейки матки / Г.М. Волгарева, Л.Э. Завалишина, Г.А. Франк, Ю.Ю. Андреева, А.Н. Петров, Ф.Л. Киселев, Д.Д. Спитковский // Архив патологии. — 2002. — Т. 64. — № 1. — С. 22–24. 31. Волкова, О.В., Пекарский М.И. Эмбриогенез и возрастная гистология внутренних органов человека / О.В. Волкова, М.И. Пекарский. — М. : Медицина, 1976. — 416 с. 32. Габуния, У.А. Васкуляризация раковой опухоли в процессе ее становления / У.А. Габуния, З.Г. Цагортин // Тез. VIII съезда АГЭ. — Ташкент, 1974. — С. 34–35. 33. Ганусевич, И.И. Роль матриксных металлопротеиназ (ММП) при злокачественных новообразованиях. II. Участие ММП в ангиогенезе, инвазии и метастазировании опухолей / И.И. Ганусевич // Онкология. — 2010. — Т. 12. — № 2. — С. 108–117. 245 34. Гаршин, В.Г. Воспалительные разрастания эпителия, их биологическое значение и отношение к проблеме рака / В.Г. Гаршин. — М. : Л. : Медгиз, 1939. — 130 с. 35. Герасимов, А.Н. Медицинская статистика / А.Н. Герасимов. — М. : Медицинское информационное агентство, 2007. — 480 с. 36. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. — М. : Практика, 1998. — 459 с. 37. Голубев, О.А. Взаимоотношения сосудистого компонента коммуникационных систем и внутритканевых регуляторов при раке молочной железы : Автореф. дис. ... д-ра мед. наук / О.А. Голубев. — СПб., 2002. — 36 с. 38. Гуркало, В.К. Роль вегетативной нервной системы в химическом канцерогенезе : Автореф. дис. ... д-ра мед. наук / В.К. Гуркало. — Л., 1989. — 49 с. 39. Гуркин, Ю.А. Гинекология подростков. Руководство для врачей / Ю.А. Гуркин. — СПб. : Фолиант, 2000. — 574 с. 40. Двужильная, Е.Д. Изменения в нервах при раке и доброкачественных опухолях молочной железы / Е.Д. Двужильная // Врачебное дело. — 1953. — № 9. — С. 820–821. 41. Деражне, А.Б. Преклинический рак шейки матки / А.Б. Деражне. — Л. : Медицина, 1972. — 222 с. 42. Дерижанова, И.С. Гистологическая и цитологическая характеристика предраковых состояний и рака шейки матки при папилломавирусной инфекции / И.С. Дерижанова, Т.О. Гамалеева // Новые методы и разработки в онкологии. Тез. VII научной конференции. — М., 1999. — С. 17–20. 43. Дикштейн, Е.А. Общие закономерности местных иммунных реакций при предраке и раке различных органов / Е.А. Дикштейн, И.В. Василенко, Н.М. Ровенская и др. // Архив патологии. — 1985. — № 11. — С. 51–57. 44. Дикштейн, Е.А. Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения в опухолях и методы их изучения / Е.А. Дикштейн, И.В. Василенко // Архив патологии. — 1987. — № 6. — С. 87– 94. 246 45. Дикштейн, Е.Н. Ультраструктура сосудов рака молочной железы / Е.Н. Дикштейн, И.В. Василенко, С.А. Данильченко и др. // Архив патологии. — 1990. — Вып. 11. — С. 41–46. 46. Дмитриев, Г.А. Папилломавирусная инфекция / Г.А. Дмитриев, О.А. Биткина. — М. : Медицинская книга, 2006. — 80 с. 47. Доросевич, А.Е. Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения при раке молочной железы до и после лучевой терапии (гистологическое и иммуноморфологическое исследование) : дис ... д-ра мед. наук / А.Е. Доросевич. — Смоленск, 1987. — 384 с. 48. Доросевич, А.Е. Коммуникационные системы и опухолевый рост / А.Е. Доросевич // Актовая речь. — С. : Универсум, 2007. — 44 с. 49. Доросевич, А.Е. Особенности гистоархитектоники вегетативных нервных терминалей и их клеточное микроокружение в тканях плоскоклеточного рака шейки матки / А.Е. Доросевич, И.А. Бехтерева, В.В. Судиловская // Архив патологии. — 2009. — Т. 71. — № 5. — С. 43–46. 50. Доросевич, А.Е.. Роль коммуникационных систем в морфогенезе рака молочной железы / А.Е. Доросевич, О.А. Голубев, С.Ю. Абросимов и др. // Вопросы онкологии. — 1998. — № 4. — С. 398–402. 51. Евстигнеева, Е.Л. Генитальная папилломавирусная инфекция и онкобелок Е7 / Е.Л. Евстигнеева, Н.К. Левчик, Н.М. Герасимова, Н.П. Малишевская // Тез. научных работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов. — М., 2005. — С. 89–90. 52. Ежова, Л.С. Папилломавирусная инфекция генеталий. Морфологические особенности и диагностика / Л.С. Ежова // Заболевания шейки матки. — М., 1999. — С. 254–258. 53. Жданов, Д.А. Анатомия сосудов опухолей / Д.А. Жданов, Л.Е. Этинген, Б.П. Ахмедов. — Душанбе : Ирфон, 1974. — 190 с. 247 54. Железнов, Б.И. Ультраструктура эпителия шейки матки при дисплазии / Б.И. Железнов, Л.С. Ежова, Л.А. Беляева // Архив патологии. — 1989. — Т. 51. — № 6. — С. 56–62. 55. Журавлева, Т.Б. Свободные клетки соединительной ткани при патологической пролиферации эпителия и при опухолевом росте / Т.Б. Журавлева, Л.М. Антипова // Архив патологии. — 1975. — Т. 37. — № 3. — С. 3–11. 56. Журавлева, Т.Б. Межструктурная кооперация при различных видах патологической пролиферации эпителия / Журавлева Т.Б., Рыбакова М.Г. // Актуальные вопросы онкоморфологии / Под ред. Н.М. Аничкова, А.Е. Колосова. — СПб. : Киров, 1996. — С. 37–42. 57. Зайратьянц, О.В. Пролиферативная активность и апоптоз в эутопическом и эктопическом эндометрии при генитальном эндометриозе / О.В. Зайратьянц, Х.Р. Мовтаева, Л.В. Адамян и др. // Тез. докладов Всерос. конференции с международным участием, научные чтения, посвященные памяти члена-корр. РАМН О.К. Хмельницкого и 25-летию курса цитологии каф. пат. анат. СПб МАПО. — СПб., 2007. — С. 36–38. 58. Зарудин, В.В. Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения при опухолях центрального генеза (тимус) и периферических органов иммуногенеза в эксперименте / В.В. Зарудин // Современные представления о паренхиматозно-стромальных взаимоотношениях при предраках и раках различной локализации и их клиническое значение / Под ред. В.В. Зарудина, А.Е. Доросевича. — Смоленск : СГМИ, 1983. — С. 4–12. 59. Зербино, Д.Д. Внутриопухолевая пролиферация сосудов / Д.Д. Зербино, И.М. Дмитрук // Архив патологии. — 1983. — Вып. 4. — С. 80–83. 60. Злокачественные новообразования в России в 2003 (заболеваемость и смертность) / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой.— М : МНИОИ им. П.А. Герцена, 2005. — 256 с. 61. Иванова, О.И. Предраковые заболевания шейки матки / О.И. Иванова, В.Г. Павлович. — Л., 1983. — 327 с. 248 62. Иванова, И.М. Изучение связи генитальной инфекции ВПГ и ВПЧ с предопухолевыми и опухолевыми процессами шейки матки : дис. … канд. мед. наук / И.М. Иванова. — М., 1992. — 168 с. 63. Иванян, А.Н. Иммунологические маркеры в диагностике предрака шейки матки / А.Н. Иванян, Н.Ю. Мелехова, И.Г. Сухарева и др. // Материалы 8-го Всероссийского форума «Мать и дитя». — М., 2006. — С. 455–456. 64. Кавецкий, Р.Е. Опухоль и организм / Р.Е. Кавецкий. — Киев : Госкомиздат, 1962. — 302 с. 65. Канцерогенез / Под ред. Д.Г. Заридзе. — М. : Медицина, 2004. — 576 с. 66. Капланская, И.Б. Ангиогенез, межклеточные контакты и стромальнопаренхиматозные взаимоотношения в норме и патологии / И.Б. Капланская, Е.Н. Гласко, Г.А. Франк // Российский онкологический журнал. — 2005. — № 4. — С. 53–57. 67. Карамышева, А.Ф. Ангиогенез опухоли : Механизмы, новые подходы к терапии / А.Ф. Карамышева // Канцерогенез / Под. ред. Д.Г. Заридзе. — М. : Медицина, 2004. — С. 429–447. 68. Карселадзе, А.И. Опухоли женских половых органов // Атлас патологии опухолей человека / А.И. Карселадзе, И.Н. Волощук // Под ред. М.А. Пальцева, Н.М. Аничкова. — М. : Медицина, 2005. — С. 282–326. 69. Киселев, В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки / В.И. Киселев. — М., 2004. — 179 с. 70. Киселев, В.И. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки / В.И. Киселев, О.И. Киселев // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2. — № 4. — С. 31–38. 71. Киселев, Ф.Л. Вирусы папиллом человека как этиологический фактор рака шейки матки : значение для практики здравоохранения / Ф.Л. Киселев // Вопросы вирусологии. — 1997. — Т. 42. — № 6. — С. 248–251. 249 72. Киселев, Ф.Л. Клонирование трансформированных генов вирусов папилломы человека типа 18 / Ф.Л. Киселев // Вопросы онкологии. — 1997. — Т. 43. — № 6. — С. 248–251. 73. Киселев, Ф.Л. Онкогенный потенциал вирусов и механизмы его проявления // Канцерогенез / Под ред. Д.Г. Заридзе. — М. : Научный мир, 2000. — С. 172–188. 74. Киселев, Ф.Л. Вирус-ассоциированные опухоли человека : рак шейки матки и вирусы папиллом / Ф.Л. Киселев // Биохимия. — 2000. — № 65. — С. 79–81. 75. Киселев, Ф.Л. Вирусы папиллом и их роль в канцерогенезе шейки матки / Канцерогенез // Под. ред. Заридзе Д.Г. — М. : Медицина. — 2004. — С. 287–297. 76. Киселев, Ф.Л. Молекулярные маркеры рака шейки матки / Ф.Л. Киселев, Н.Н. Мазуренко, Н.П. Киселева, В.К. Кобзаева и др. // Вестник РАМН. — 2002. — № 1. — С. 8–14. 77. Кисина, В.И. Роль бактерий и вирусов в патогенезе фоновых и диспластических процессов слизистой оболочки шейки матки и влагалища / В.И. Кисина, О.Е. Михалко, М.А. Мерзабекова, Н.А. Полищук // Вестник дерматологии и венерологии. — 2001. — № 2. — С. 40–45. 78. Коблова, Н.Г. Нервно-сосудистые отношения в коже молочной железы при раке ее / Н.Г. Коблова // Макро-микроморфология : межвуз. науч. темат. сб. — Саратов, 1983. — С. 108–110. 79. Кобзарь, А.И. Прикладная математическая статистика. Для инженеров и научных работников / А.И. Кобзарь. — М. : ФИЗМАТЛИТ, 2006. — 816 с. 80. Коган, Е.А. Соотношение процессов пролиферации, апоптоза, ангиогенеза и метастазирования в различных гистогенетических типах рака легкого (иммуногистохимическое исследование) / Е.А. Коган, С.И. Швец, В.Л. Коваленко, Ю.А. Соболева // Архив патологии. — 2004. — Т. 66. — № 6. — С. 33–38. 250 81. Козаченко, А.В. Новые направления в диагностике и лечении микрокарциномы шейки матки / А.В. Козаченко // Акушерство и гинекология. — 2006, приложение. — C. 56–59. 82. Козаченко, В.П. Рак шейки матки / В.П. Козаченко // Современная онкология. — 2000. — Т. 2. — № 2. — С. 40–44. 83. Козлов, Д.В. Вторичный неоангиогенез — одно из звеньев становления и прогресси рака молочной железы / Д.В. Козлов, Н.А. Зорин, О.А. Голубев // Архив патологии. — 1996. — Вып. 4. — С. 72–75. 84. Козлова, В.И. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий : руководство для врачей / В.И. Козлова, А.Ф. Пухнер. — М.: Предтеча, 2003. — 792 с. 85. Коломиец, Л.А. Клинико-морфологические аспекты цервикальной папилломавирусной инфекции / Л.А. Коломиец, Л.Н. Уразова, Н.В. Севостьянова, О.Н. Чуруксаева // Вопросы онкологии. — 2002. — Т. 48. — № 1. — С. 43–46. 86. Кондратенко, Н.Н. Папилломавирусные поражения шейки матки как фактор женского бесплодия : дисс … канд. мед. наук / Н.Н. Кондратенко. — Смоленск, 2002. — 139 с. 87. Кондриков, Н.И. Заболевания женской половой системы / Н.И. Кондриков, И.А. Казанцева // Патология : руководство / Под ред. М.А. Пальцева, В.С. Паукова, Э.Г. Улумбекова. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2002. — С. 483– 534. 88. Копнин, Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров : ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза / Б.П. Копнин // Биохимия. — 2000. — Т. 65. — С. 5–53. 89. Косников, А.Г. Морфологические критерии, влияющие на прогноз плоскоклеточного рака шейки матки / А.Г. Косников, О.Ф. Чепик, С.Я. Максимов // Вопросы онкологии. — 1998. — Т. 44. — № 2. — С. 167–169. 251 90. Коханевич, Е.В. Кольпоцервикоскопия. Атлас / Е.В. Коханевич, К.П. Ганина, В.В. Суменко. — Киев : Вища школа, 1997. — С. 49. 91. Краевский, Н.А. Дисплазия и рак / Н.А. Краевский, А.В. Смольянников, Г.А. Франк // Архив паталогии. — 1986. — Т. 48. — Вып. 4. — С. 3–9. 92. Краснопольский, В.И. Патология влагалища и шейки матки / В.И. Краснопольский (и др.). — М. : Медицина, 1997. — 205 с. 93. Криволапов, Ю.А. Морфологическая диагностика лимфом / Ю.А. Криволапов, Е.Е. Леенман. — СПб. : Коста, 2006. — 208 с. 94. Куевда, Д.А. Молекулярные маркеры диспластических изменений шейки матки / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина, Г.Н. Минкина (и др.) // Тез. науч. работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов. — Москва, 2005. — С. 53. 95. Кузнецова, Ю.Н. Латентная папилломавирусная инфекция шейки матки, обусловленная вирусами папилломы человека высокого онкогенного риска / Ю.Н. Кузнецова // Тез. науч. работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов. — Москва, 2005. — С. 92. 96. Кулаков, В.И. Проблемы злокачественных новообразований репродуктивной системы в практике гинеколога / В.И. Кулаков, А.А. Тохиян // Журнал акушерства и женских болезней. — 2001. — Т. L. — Вып. 1. — С. 9–12. 97. Кунцевич, Л.Д. Циклоферон в комплексном лечении остроконечных кондилом / Л.Д. Кунцевич, Е.В. Щибаева, В.Р. Мишанов // Тез. науч. работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов. — Москва, 2005. — С. 93. 98. Куперт, А.Ф. Псевдоэрозии шейки матки (терминология, классификация) / А.Ф. Куперт // Журнал акушерства и женских болезней. — 2000. — Т. XLIX. — Вып. 2. — С. 54–58. 99. Куприянов, В.В. Микроциркуляторное русло / В.В. Куприянов, Я.Л. Караганов, В.И. Козлов. — М. : Медицина, 1975. — 214 с. 252 100. Курашвили, Л.Р. Морфологическая характеристика субклинических форм папилломавирусной инфекции шейки матки / Л.Р. Курашвили, С.А. Галустян, О.В. Почтаренко, Ю.А. Новикова // Научно-практическая конференция и школа по инфекционной патологии 20–24 ноября // Сборник науч. трудов. — М. : МДВ, 2007. — С. 64. 101. Лушников, Е.Ф. Гибель клетки (апоптоз) / Е.Ф. Лушников, А.Ю. Абросимов. — М. : Медицина, 2001. — 192 с. 102. Мазуренко, Н.Н. Роль вирусов папиллом в канцерогенезе шейки матки / Н.Н. Мазуренко // Современная онкология. — 2003. — Т. 5. — № 1. — С. 7–10. 103. Максимов, С.Я. Роль опухоль-ассоциированных типов папилломавирусной инфекции гениталий в генезе фоновых заболеваний эктоцервикса, дисплазии и преинвазивного рака шейки матки / С.Я. Максимов, А.М. Савичева, М.А. Башмакова (и др.) // Вопросы онкологии. — 1999. — Т. 45. — № 6. — С. 627–629. 104. Малевич, К.И. Методы лазеротерапии в акушерстве и гинекологии / К.И. Малевич, Г.И. Герасимович, П.С. Русакевич. — Минск, 1992. — 202 с. 105. Манухин, И.Б. Определение пролиферативной активности эпителия шейки матки при папилломавирусной инфекции / И.Б. Манухин, Г.Н. Минкина, Г.А. Франк (и др.) // Вестник РАМН. — 1997. — № 2. — С. 20–24. 106. Манухин, И.Б. Иммунотерапия папилломавирусной инфекции шейки матки / И.Б. Манухин, Г.М. Минкина, Б.В. Пинегин (и др.) // Иммунология. — 1998. — № 3. — С. 24–26. 107. Марьина, Л.А. Рак шейки матки : лучевая терапия с использованием калифорния-252, кобальта-60, цезия-137 / Л.А. Марьина, В. Н. Чехонадский, М.И. Нечушкин, М.В. Киселева — М. : Вентана-Граф, 2004. — 432 с. 253 108. Медик, В.А. Статистика в биологии и медицине. Том 1. Теоретическая статистика / В.А. Медик, М.С. Токмачев, Б.Б. Фишман. — М. : Медицина, 2000. — 412 с. 109. Медико-социальные аспекты рака шейки матки / О.В. Благодыр, A.M. Иванян, М.Ю. Мелехова и др. // Материалы международного конгресса «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии». — М., 2006. — С. 25. 110. Маянский, Д.Н. Хроническое воспаление / Д.Н. Маянский. — М. : Медицина, 1991. — 272 с. 111. Мелехова, Н.Ю. Папилломавирусные поражения шейки матки у пациенток различного возраста : дис. … д-ра. мед. наук / Н. Ю. Мелехова. — Смоленск, 2005. — 297 с. 112. Мелехова, Н.Ю. Клинико-морфологические особенности лейкоплакии шейки матки / Н.Ю. Мелехова, Л.И. Харитонова, А.Н. Иванян и др. // Материалы международного конгресса «Практическая гинекология : от новых возможностей к новой стратегии». — М., 2006. — С. 118. 113. Мелехова, Н.Ю. Онкологический потенциал различных патологических состояний шейки матки / Н.Ю. Мелехова, А.П. Иванян. Л.И. Харитонова и др. // Журнал акушерства и женских болезней. — 2006. — Вып. 3. — T. LV. — С. 17–19. 114. Меркулов, Г.А. Курс патологической техники / Г.А. Меркулов. — М. : Медицина, 1969. — 424 с. 115. Минкина, Г.Н. Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения шейки матки : дис. … д-ра мед. наук / Г.Н. Минкина. — М., 1999. — С. 219. 116. Минкина, Г.Н. Состояние иммунитета у больных с папилломавирусной инфекцией / Г.Н. Минкина, И.Б. Манухин и др. // Акушерство и гинекология-информ. — 1998. — № 34. — С. 8–9. 117. Минкина, Г.Н. Предрак шейки матки / Г.Н. Минкина, И.Б. Манухин, Г.А. Франк. — М. : Аэрограф-медиа, 2001. — 112 с. 254 118. Мягкова, М.А. Изменения кровеносных сосудов шейки матки при ее деформациях и гипертрофиях / М.А. Мягкова // Архив патологии. — 1988. — Т. 50. — № 2. — С. 43–49. 119. Николаев, А.А. О стромообразовании в эпителиальных злокачественных опухолях / А.А. Николаев, А.С. Ягубов // Архив патологии. — 1975. — Т. 37. — № 2. — С. 21–28. 120. Никулин, Н.К. Клинико-иммунологические особенности остроконечных кондилом у девушек-подростков / Н.К. Никулин, Л.Д. Кунцевич, Р.П. Борщевская // Российский журнал кожных и венерических болезней. — 1999. — № 6. — С. 33–36. 121. Пальцев, М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов. — М. : Медицина, 1995. — 224 с. 122. Пальцев, М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов, С.Е. Северин. — М. : Медицина, 2003. — 288 с. 123. Пальцев, М.А. Атлас патологии опухолей человека / М.А. Пальцев, Н.М. Аничков. — М. : Медицина, 2005. — 424 с. 124. Петров, С.В. Экспрессия цитокератина № 17 в плоскоклеточных раках шейки матки : иммуногистохимическое исследование 19 случаев / С.В. Петров, Н.Т. Райхлин // Вопросы онкологии. — 1992. — Т. 38. — № 7. — С. 797–805. 125. Петров, С.В. Экспрессия клеточных онкогенов в нормальном, метапластическом, диспластическом эпителии и плоскоклеточном раке шейки матки / С.В. Петров, Н.Н. Мазуренко, Н.М. Сухова // Архив патологии. — 1994. — Т. 56. — № 4. — С. 22–31. 126. Петров, С.В. Иммуногистохимическая характеристика и ультраструктурные особенности плоскоклеточного рака шейки матки эктоцервикального и эндоцервикального (резервноклеточного или метапластического) генеза / С.В. Петров, Н.Т. Райхлин, Г. Сере, Ф. Смедтс // Архив патологии. — 1996. — № 2. — С. 13–21. 255 127. Петровичев, Н.Н. Прогностическое значение гистологических признаков при плоскоклеточном раке туловища и конечностей / Н.Н. Петровичев, В.В. Яворский, В.Н. Аризи, Н.А. Пирогова // Архив патологии. — 1987. — Вып. 1. — С. 37–41. 128. Пименова, В.В. Ранняя диагностика плоскоэпителиальных поражений шейки матки при помощи кольпоскопического и цитологического методов / В.В. Пименова, Т.О. Холодная // Современные диагностические и лечебные технологии. Сборник статей научно-практической конференции. — Ростов-на-Дону, 2005. — С. 292–294. 129. Писарев, А.А. Влияние физиологических активных веществ и фармакологических препаратов на микроциркуляторное русло / А.А. Писарев // Фармакология и токсикология. — 1981. — Т. 44. — № 2. — С. 247–252. 130. Плотникова, Н.А. Роль папилломавирусной инфекции в развитии рака шейки матки / Н.А. Плотникова, С.П. Кемайкин, Т.В. Харитонова // Труды II Съезда Российского общества патологоанатомов, 11–14 апреля. — М., 2006. — Т. 1. — С. 334–336. 131. Подистов Ю.И. Роль вируса папилломы в развитии предрака и рака шейки матки / Ю.И. Подистов // Клиническая лабораторная диагностика. — 2003. — № 5. — С. 44–49. 132. Пожарисский, К.М. Современные методы определения пролиферативной активности опухолей (на примере рака молочной железы) / К.М. Пожарисский, В.Ф. Семиглазов, А.В. Упоров // Съезд Международного союза ассоциаций патологоанатомов, 2-й : тезисы. — М., 1999. — С. 238–239. 133. Пожарисский, К.М. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний / К.М. Пожарисский, Е.Е. Леенман // Архив патологии. — 2000. — Т. 62. — № 5. — С. 3–11. 134. Познанин, П.Л. Проблема развития и роста рака с морфологической стороны / П.Л. Познанин // Труды смоленского общества естествоиспытате- 256 лей и врачей при Смоленском государственном университете. — Смоленск, 1930. — Т. 4. — С. 9–15. 135. Пономарева, Ю.Н. Сравнительная оценка продукции провоспалительных цитокинов при различных заболеваниях шейки матки / Ю.Н. Пономарева // Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике. — Чита, 2002. — С. 104–105. 136. Пономарева, Ю.Н. Молекулярно-биологические факторы в диагностике цервикальной интраэпителиальной неоплазии / Ю.Н. Пономарева, И.Б. Манухин, Л.А. Ашрафян // Опухоли женской репродуктивной системы. — 2010. — № 1. — С. 72–76. 137. Попов, Л.Н. Изменения кровеносных сосудов в опухолях : автореф. дисс. ... д-ра мед. наук / Л.Н. Попов. — Чкалов, 1951. — 36 с. 138. Прилепская, В.Н. Фоновые заболевания шейки матки : патогенез, диагностика, лечение / В.Н. Прилепская, Т.А. Фокина // Акушерство и гинекология. — 1990. — № 6. — С. 12–15. 139. Прилепская, В.Н. Вагинальный кандидоз / В.Н. Прилепская, А.С. Анкирская, Г.Р. Байрамова и др. — М., 1997. — С. 4–9. 140. Прилепская, В.Н. Значение вируса папилломы человека в развитии диспластических процессов шейки матки / В.Н. Прилепская, Н.И. Кондриков // Гинекология для практических врачей. — 2000. — № 3. — С. 80–82. 141. Прилепская, В.Н. Генитальные инфекции и патология шейки матки. Клинические лекции / В.Н. Прилепская, Е.Б. Рудакова. — Омск : ИПЦ ОмГМА, 2004. — 212 с. 142. Раковская, И.В. Микоплазменные инфекции урогенитального тракта / И.В. Раковская, Ю.В. Вульфович. — М., 1995. — С. 66. 143. Робинсон, М.В. Апоптоз клеток иммунной системы / М.В. Робинсон, В.А. Труфанов // Успехи современной биологии. — 1991. — Т. 111. — № 2. — С. 246–259. 257 144. Роговская, С.И. Папилломавирусная инфекция у женщин и патология шейки матки. В помощь практикующему врачу / С.И. Роговская. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. — С. 224. 145. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. — Казань, 2012. — 624 с. 146. Рыбакова, М.Г. Функциональная морфология паренхиматозно-стромальных взаимоотношений при регенерации длительно незаживающих язв желудка / М.Г. Рыбакова, Г.М. Нутфуллина // Съезд Международного союза ассоциаций патологоанатомов, 1-й : тезисы. — М., 1995. — С. 139. 147. Русакевич, П.С. Заболевания шейки матки у беременных : диагностика, лечение, мониторинг, профилактика / П.С. Русакевич, Т.М. Литвинова. — М. : ООО «Медицинское информационное агентство», 2006. — 144 с. 148. Савицкий, Г.А. Миома матки (проблемы патогенеза и патогенетической терапии) / Г.А. Савицкий, А.Г. Савицкий. — СПб. : ЭЛБИ-СПб., 2000. — 236 с. 149. Сафронникова, Н.Р. Факторы онкологического риска при папилломавирусной инфекции / Н.Р. Сафронникова, М.И. Зарайский, А.Б. Чухловин // Вопросы онкологии. — 2003. — Т. 49. — № 4. — С. 450–454. 150. Силагадзе, Д.Г. Иммуноморфологическая (свето- и электронномикроскопическая) диагностика плоскоклеточного рака человека с помощью моноклональных антител / Д.Г. Силагадзе, Л.В. Белецкая, П.В. Челедзе и др. // Архив патологии. — 1987. — Т. XLIX. — Вып. 8. — С. 23–29. 151. Смоляр, Е.М. Морфофункциональные параллели строения микроциркуляторного русла некоторых периферических нервов и параневрия / Е.М. Смоляр и др. // Труды Крымского мед. института. — Симферополь, 1989. — С. 33–36. 152. Cтруков, Е.Л. Гиперпролактинемия как маркер прогрессии рака шейки матки / Е.Л. Cтруков, Н.Р. Сафронникова, Ю.Ф. Бобров и др. // Вопросы онкологии. — 1990. — № 7. — С. 831–834. 258 153. Сулава, Т.А. Васкуляризация опухолей молочных желез : автореф. дис. ... канд. мед. наук / Т.А. Сулава. — Тбилиси, 1981. — 29 с. 154. Суслов, А.П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет / А.П. Суслов // Итоги науки и техники. Серия. Онкология. — ВИНИТИ, 1990. — Т. 19. — С. 1–162. 155. Сухих, Г.Т. Показатели иммунитета у больных с папилломавирусной инфекцией гениталий / Г.Т. Сухих, Н.К. Матвеева // Акушерство и гинекология. — 2000. — № 2. — С. 43–46. 156. Трушина, О.И. Роль папилломавирусной инфекции в генезе рака шейки матки / О.И. Трушина, Е.Г. Новикова // Российский онкологический журнал. — 2005. — № 1. — С. 45–51. 157. Уманский, Ю.А. Лимфоциты и опухолевый рост / Ю.А. Уманский, В.Г. Пинчук. — Киев : Наук. думка, 1982. — 255 с. 158. Ушморов, А.Г. Ангиогенез как мишень для противоопухолевых воздействий / А.Г. Ушморов, В.А. Александров // Вопросы онкологии. — 1989. — № 3. — С. 263–270. 159. Фролова, И.И. Иммуногистохимические исследования дискератоза и неопластических изменений экзоцервикса при гинекологической патологии / И.И. Фролова, Г.М. Местергази, В.Е. Радзинский и др. // Архив патологии. — 2002. — Т. 64. — № 6. — С. 23–26. 160. Фролова, И.И. Аспекты этиологии и патогенеза цервикальных интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки / И.И. Фролова // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. — 2003. — Т. 2. — № 1. — С. 78–86. 161. Хансон, К.П. Современные представления о канцерогенезе рака шейки матки / К.П. Хансон, Е.Н. Имянитов // Практическая онкология. — 2002. — Т. 3. — № 3. — С. 145–155. 162. Харитонова, Л.И. Маркеры пролиферативной активности в диагностике атипической лейкоплакии шейки матки / Л.И. Харитонова. И.А. Бехтерева, Н.Ю. Мелехова // Материалы VIII Российского форума «Мать и дитя». — 2006. — С. 552–553. 259 163. Харитонова, Л.И. Лейкоплакия шейки матки как ВПЧ-ассоциированное заболевание / Л.И. Харитонова, Н.Ю. Мелехова, А.Н. Иванян и др. // Материалы 7-го Всероссийского форума «Мать и дитя». — М., 2005. — С. 533. 164. Харлова, О.Г. Сравнительная оценка состояния клеточного и гуморального иммунитета при лечении больных с папилломавирусной инфекцией шейки матки / О.Г. Харлова, Л.А. Агикова // Тезисы докладов научнопрактической конференции молодых ученых ММСИ. — М., 1996. — С. 62. 165. Химический канцерогенез / В.С. Турусов, Г.А. Белицкий, Л.Н. Пылев, В.А. Кобляков // Канцерогенез / Под. ред. Д.Г. Заридзе. — М. : Медицина, 2004. — С. 215–225. 166. Хмельницкий, О.К. Цитологическая и гистологическая диагностика заболеваний шейки матки и тела матки / О.К. Хмельницкий. — СПб. : СОТИС, 2004. — 334 с. 167. Холодная, Т.О. Папилломавирусная инфекция (ПВИ) и патология шейки матки / Т.О. Холодная, И.С. Дерижанова, В.В. Пименова // Труды II Съезда Российского общества патологоанатомов, 11–14 апреля. — М. : ГУ НИИ МЧ РАМН, 2006. — Т. 1. — С. 400–402. 168. Хэм, А. Гистология. Том 5 / А. Хэм, Д. Кормак. — М. : Мир, 1983. — 296 с. 169. Царева, Н.В. Состояние шейки матки у женщин в постменопаузе до и в процессе заместительной гормонотерапии : автореф. дис. … канд. мед. наук / Н.В. Царева // Науч. центр акушерства, гинекологии и перинатологии Рос. АМН. — М., 1998. — 26 с. 170. Чазова, Н.Л. Молекулярно-биологические маркеры опухолевой прогрессии как факторы прогноза эффективности лучевой, химио- и сочетанной терапии рака шейки матки / Н.Л. Чазова, А.М. Берщанская, Н.В. Мельникова и др. // Тезисы докл. Всерос. конференции с международным участием, научные чтения, посвященные памяти члена-корр. РАМН О.К. Хмельницкого 260 и 25-летию курса цитологии каф. пат. анат. СПб МАПО. — СПб., 2007. — С. 121–122. 171. Черкасов, В.Г. Ультраструктурные закономерности новообразования вторичных кровеносных микрососудов в пренатальном периоде морфогенеза человека / В.Г. Черкасов, Е.А. Шевченко // Архив анатомии. — 1989. — № 2. — С. 23–26. 172. Чернух, А.М. Микроциркуляция в норме и патологии / А.М. Чернух, И.Л. Есипова // Архив патологии. — 1975. — Вып. 4. — С. 21–27. 173. Черный, А.П. Изменения структур клеточной поверхности и организации эпителиальной ткани в процессе развития рака шейки матки : автореф. дис. … д-ра мед. наук / А.П. Черный. — М., 1986. — 39 с. 174. Черный, А.П. Эпителиальные стыковые зоны анального канала и шейки матки : ультраструктура некоторых опухолей этих зон / А.П. Черный, Н.И. Яковлева // Архив патологии. — 1990. — Т. 52. — № 9. — С. 34–39. 175. Чернявская, Г.Я. Клеточный и гуморальный иммунитет и его регуляция у больных раком шейки матки / Г.Я. Чернявская, В.П. Вагнер, А.М. Тютюнова и др. // Патология органов мочеполовой системы : сб. науч. тр. — Кабардино-Балкарский университет, 1981. — С. 158–160. 176. Чумаков, П.М. Функции гена р53 : выбор между жизнью и смертью / П.М. Чумаков // Биохимия. — 2000. — Т. 65. — С. 34–47. 177. Чумаченко, П.А. Молочная железа и эндокринный гомеостаз / П.А. Чумаченко, О.К. Хмельницкий, И.П. Шлыков. — Воронеж : Изд-во Воронежского университета, 1987. — 128 с. 178. Шахламов, В.А. Капилляры / В.А. Шахламов. — М. : Медицина, 1971. — 210 с. 179. Шварцбурд, П.М. Хроническое воспаление повышает риск развития эпителиальных новообразований, индуцируя предраковое микроокружение : анализ механизмов дисрегуляции / П.М. Шварцбурд // Вопросы онкологии. — 2006. — Т. 52. — № 2. — С. 137–144. 261 180. Швец, Н.А. Иммуноморфология лучевого патоморфоза и прогноз лучевой терапии рака шейки матки / Н.А. Швец, О.В. Зайратьянц // Труды II Съезда Российского общества патологоанатомов, 11–14 апреля. — М., 2006. — Т. II. — С. 374–376. 181. Шистерова, О.А. Морфофункциональные особенности клеточного окружения микрососудов в тканях рака молочной железы до и после лучевой терапии : дис. … канд. мед наук / О.А. Шистерова. — Смоленск, 2003. — 144 с. 182. Шубич М.Г., Авдеева М.Г. Медиаторные аспекты воспалительного процесса // Архив патологии. — 1997. — Т. 59. — № 2. — С. 3–8. 183. Эффективность различных методов скрининга рака шейки матки / О.В. Благодыр, A.Н. Иванян, Н.Ю. Мелехова и др. // Материалы 8-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — М., 2006. — С. 333. 184. Якимова, Т.П. Лучевой патоморфоз рака молочной железы и его значение для оценки эффективности комбинированного лечения / Т.П. Якимова // Экспериментальная и клиническая радиология. — Киев, 1982. — № 16. — С. 81–86. 185. Яковлева, И.А. Морфологическая диагностика предопухолевых процессов и опухолей матки по биопсиям и соскобам / И.А. Яковлева, Б.Г. Кукутэ. — Кишенев : ШТИИНЦА, 1979. — 148 с. 186. Яковлева, И.А. Эпителий шейки матки в процессе малигнизации / И.А. Яковлева, А.П. Черный, Э.Р. Ботнарь. — Кишенев : ШТИИНЦА, 1981. — 128 с. 187. Ярыгин, Н.Е. Морфологическая классификация сосудистых изменений системы микрогемоциркуляции / Н.Е. Ярыгин, Т.Н. Николаева, А.В. Кораблев // Архив патологии. — 1993. — Т. 55. — № 4. — С. 43–47. 188. Adam, E. A prospective study of association of herpes simplex virus and human papillomavirus infection with cervical neoplasia in women exposed to diethyl- 262 stilbestrol in uterus / E. Adam, R.H. Kaufman, K. Adler-Storthz / Int. J. Cancer. — 1985. — Vol. 1. — P. 19–26. 189. Amano, H. Host prostaglandin E2-EP3 signaling regulates tumor-associated angiogenesis and tumor growth / H. Amano, I. Hayashi, H. Endo et al. // J. Exp. Med. — 2003. — Vol. 197. — P. 221–232. 190. Arany, I. Status of local cellular immunity in interferon-responsive and nonresponsiv human Papillomavirus associated lesions / I. Arany, S.K. Tyring // Sex. Trans. Dis. — 1996. — Vol. 23. — P. 475–480. 191. Aroesty, J. Convection and diffusion in the microcirculation / J. Aroesty, J. Gross // Microvasc. Res. — 1970. — V. 2. — N 3. — P. 247–267. 192. Barasso, R. Colposcopic diagnosis of HPV cervical lesions / R. Barasso // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / Еd. N. Munoz, F.X. Bosch, K.V. Shah, A. Meheus. — Lyon, France : IARC, 1992. — P. 43– 74. 193. Barskay, S.H. Loss of basement membrane component by invasive tumors but not their benign counterparts / S.H. Barskay, G.P. Siegal, F. Jannotta, L.A. Liotta // Laboratory Investigetion. — 1983. — Vol. 49. — P. 140–147. 194. Beer-Romero, P. Antisense targeting of Е6АР elevates p53 in HPV-infected cells but not in normal cells / P. Beer-Romero, S. Glass, M. Rolfe // Oncogene. — 1997. — Vol. 14. — N 5. — P. 595–602. 195. Berberat, P.O. Inhibition of heme oxygenase-1 increases responsiveness of pancreatic cancer cells to anticancer treatment / P.O. Berberat, Z. Dambrauskas, A. Gulbinas et al. // Clin. Cancer Res. — 2005. — Vol. 11. — P. 3790–3798. 196. Bergeron, C. Human papillomaviruses associated with cervical intraepithelial neoplasia : great diversity and distinct distribution in low- and hig-grade lisions / C. Bergeron, R. Barrasso, S. Beaudenon et al. // Am. J. Surg. Pathol. — 1992. — Vol. 16. — P. 731–735. 263 197. Bissel, M.J. Context, tissue plasticity, and cancer : Are tumor stem cells also regulated by the microenvironment? / M.J. Bissel, M.A. LaBarge // Cancer Cell. — 2005. — Vol. 7. — P. 17–23. 198. Boon, T. Tumor antigens recognized by T-lymphocytes / T. Boon, J.-C. Cerottini, B. Van den Eynde et al. // Ann. Rev. Immonol. — 1994. — Vol. 12. — P. 337–365. 199. Bosch, F.X. Prevalence of Human papillomavirus in cervical cancer — a worldwide perspective / F.X. Bosch, M.M. Manos, N. Munoz et al. // J. Nat. Cancer Inst. — 1995. — Vol. 87. — P. 796–802. 200. Bosch, F.X. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer / F.X. Bosch, A. Lorincz, N. Munoz et al. // J. Clin. Pathol. — 2002. — Vol. 55. — P. 244–265. 201. Bowen, J. Mitosis and apoptosis. Matters of life and death / J. Bowen, S. Bowen, A. Jones. — London : Chapman & Hall, 1998. — 240 p. 202. Brinton, L.A. Risk Factors for Cervical Cancer by Hystology / L.A. Brinton, S. Herrero, W.S. Reeves et al. // Gynec. Oncol. — 1993. — Vol. 51. — N 3. — P. 301–306. 203. Broker, T.R. Molecular Diagnostics of Human Cancer / T.R. Broker, L.T. Chow, M.T. Chin et al. / Ed. M. Furth. — New York, 1989. — P. 197–208. 204. Bulbrook, R.D. Endocrinological aspects of benign breast disease / R.D. Bulbrook // Cancer. Detect. Prev. — 1992. — V. 16. — N 1. — P. 21–23. 205. Burk, R.D. Sexual behavior and partner characteristics are the predominant risk factors for genital human papillomavirus infectin in young women / R.D. Burk // J. Infect. Dis. — 1996. — Vol. 174. — P. 679. 206. Chao, D.T. BCL-2 family : regulator of cell death / D.T. Chao, S.J. Korsmeyer // Ann. Rev. Immunol. — 1998. — Vol. 160. — P. 395–419. 207. Cho, Y.S. Down modulation of IL-18 expression by hyman papillomavirus type 16 E6 oncogene via binding to IL-18 / Y.S. Cho, J.W. Kang, C.W. Cho et al. // FEBS Lett. — 2001. — Vol. 501. — N 2–3. — P. 139–145. 264 208. Coussens, L.M. Inflammation and cancer / L.M. Coussens, Z. Werb // Nature. — 2002. — Vol. 420. — P. 860–867. 209. Dabbs, D.J. Diagnostic immunohistochemistry / D.J. Dabbs. — New York : Churchill Livingstone, 2002. — 673 c. 210. D’Arcangelo, G.A Protein related to extracellular matrix proteins deleted in the mouse mutant reeler G. / D’Arcangelo, G.G. Miao, S.C. Chen et al. // Nature. — 2000. — Vol. 376. — P. 719–723. 211. De Sarmishtha. VEGF-integrin interplay controls tumor growth and vascularization / De Sarmishtha, O. Razorenova, N. McCabe et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 2005. — Vol. 102. — P. 7589–7594. 212. Dell, G. Human papillomaviruses and their role in cervical cancer / G. Dell, K. Gaston // Cell. Mol. Life Sci. — 2001. — Vol. 58. — N 12–13. — P. 1923– 1942. 213. Delvenne, P. Epithelial metaplasia : an inadequate environment for antitumor immunity? / P. Delvenne, P. Hubert, N. Jacobs // Trends in immunology. — 2004. — Vol. 25. — P. 169–172. 214. Dewhirst, M.W. Effects of bradykinin on the hemodynamics of tumor and granulating normal tissue microvasculature / M.W. Dewhirst, R.Z. Vinuya, E.T. Ong et al. // Radiat-Res. — 1992. — V. 130. — N 3. — P. 345–354. 215. Engels, K. Distinct angiogenic patterns are associated with high-grade in situ ductal carcinomas of the breast / K. Engels, S.B. Fox, R.M. Whitehouse et al. // J. Pathol. — 1997. — Vol. 181. — N 2. — P. 207–212. 216. Ervasti, J.M. A role for the dystrophin-glycoprotein complex as a transmembrane linker between laminin and actin / J.M. Ervasti, K.P. Compbell // Journal of Cell Biology. — 1993. — Vol. 122. — P. 809–823. 217. Evan, G.I. Proliferation cell cycle and apoptosis in cancer / G.I. Evan, K.H. Vousden // Nature. — 2001. — Vol. 411. — P. 342–348. 265 218. Ferrara, N. The role of vascular endothelial growth fagtor in pathological angiogenesis / N. Ferrara // Brest Cancer Res. Treat. — 1995. — Vol. 36. — P.127– 137. 219. Field, S.B. Are transplanted tumours suitable as models for studies on vasculature? / S.B. Field, I.A. Burney, S. Needham et al. // Int. J. Radiat. Biol. — 1991. — Vol. 60. — N 1–2. — P. 255–60. 220. Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? / J. Folkman // J. Natl. Cancer Inst. — 1990. — Vol. 82. — P. 4–6. 221. Frankowski, A. Lymfocyte subpopulations in the blood of women with HPV 16 positive and negative cervical cancer / A. Frankowski, K. Wictorowicz, W. Kedria et al. // Eur. J. Gynecol. Oncol. — 1997. — Vol. 18. — N 5. — P. 394–396. 222. Frega, A. Cervical intraepithelial neoplasia and bacterial vaginosis : correlation or risk factor? / A. Frega, P. Stentella, G. Sperga et al. // Eur. J. Gynecol. Oncol. — 1997. — Vol. 18. — N 1. — P. 76–77. 223. Furuya, H. Apoptosis and cell growth fraction in normal, dysplastic and neoplastic squamous epithelium of uterine cervix / H. Furuya, H. Yabushita, M. Noguchi, M. Nakanishi // Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. — 1995. — Vol. 47. — N 2. — P. 141–148. 224. Gisela, D.H. Tradional and new molecular methods for early detection of cervical cancer / D.H. Gisela, M.J. Trank, M. Knebel Doeberitz // Архив патологии. — 2004. — N 1. — Т. 66. — С. 35–39. 225. Gubie, H.A. Alongitudinal study of HPV detection and cervical pathology in HIV infected woman / H.A. Gubie, A.L. Seagar, G.J. Beattie et al. // Sex. Transm. Infect. — 2000. — N 76. — P. 257–261. 226. Graflund, M. The prognostic value of histopathologic grading parameters and microvessel density in patients with early squamous cell carcinoma of the uterine cervix / M. Graflund, B. Sorbe, A. Hussein et al. // Int. J. Gynecol. Cancer. — 2002. — N 12. — Р. 32–41. 266 227. Gullino, P.M. Angiogenesis factors / P.M. Gullino // Tissue Growth Factors / Ed. R. Basserga. — Berlin etc. : Springer. Verlag, 1981. — P. 427–449. 228. Gullino, P.M. Prostaglandins and gangliosides of tumor microenvironment : their role in angiogenesis / P.M. Gullino // Acta Oncol. — 1995. — V. 34. — N 3. — P. 439–41. 229. Gonzales, S.JL.Value of estrogen and progesterone receptors in the management of intraepithelial squamous lesions of grade / S.JL. Gonzales, D.J. Chavez, R.A. Maricela et al. // Ginecol. Obstet. Mex. — 2001. — Vol. 69. — N 1. — P. 156–164. 230. Grace, V.M. Co-overexpression of p53 and bcl-2 proteins in HPV-induced squamous cell carcinoma of uterine cervix / J.V. Shalini, T.T. Lekha et al. // Gynecol. Oncol. — 2003. — Vol. 91. — N 1. — P. 51–58. 231. Graflund, M. MIB-1, p53, and bcl-2, and WAF-1 expression in pelvic lymph nodes and primary tumors in early stage cervical carcinomas : correlation with clinical outcome / M. Graflund, B. Sorbe, M. Karlsson // Int. J. Oncol. — 2002. — Vol. 20. — N 95. — P. 1041–1047. 232. Hart, I.R. Molecular aspects of the metastatic cascade / I.R. Hart, N.T. Goode, R.E. Wilson // Biochem. Biophys. Acta. — 1989. — Vol. 989. — P. 65–84. 233. Herrington, M.R. Human papillomavirus and cervical neoplasia. Classification, virology, pathology, and epidemiology / M.R. Herrington // J. Clin. Pathol. — 1994. — Vol. 47. — P. 1066–10. 234. Hildenbrand, R. Urokinase plasminogen activator induces angiogenesis and tumor vessel invasion in breast cancer / R. Hildenbrand, I. Dilger, A. Horlin, H.J. Stutte // Pathol. Res. Pract. — 1995. — Vol. 191. — N 5. — P. 403–09 (1). 235. Hildenbrand, R. Urokinase and macrophages in tumour angiogenesis / R. Hildenbrand, I. Dilger, A. Horlin, H.J. Stutte // Br. J. Cancer. — 1995. — Vol. 72. — N 4. — P. 818–23 (2). 267 236. Ho, G.Y.F. HPV 16 and cigarette smoking as risk factor for high-grade cervical intraepithelial displasia / G.Y.F. Ho, A.S. Kadish, R.D. Burk et al. // Int. J. Cancer. — 1998. — Vol. 78. — P. 281–285. 237. Hunter, R. Regulation of oviduct function in pigs by local transfer of ovarian steroid and prostaglandins : a mechanism to influence sperm transport / R. Hunter, B. Cook, K. Peyser // Eur. J. Obstet. Gynecol. — 1993. — Vol. 14. — N 4. — P. 225–232. 238. Isacson, C. Both cell proliferation and apoptosis increase with grade in cervical neoplasia but do not correlate with human papillomavirus type / C. Isacson, T.D. Kessis, L. Hedric, K.R. Cho // Cancer Res. — 1996. — Vol. 56. — N 4. — P. 669–674. 239. Israels, L. Apoptosis / L. Israels, S. Israels // The oncologist. — 1999. — Vol. 4. — N 4. — P. 332–339. 240. Jeng, M.H. Estrogen receptor expression and function in long-term estrogendeprived human Brest cancer cells / M.H. Jeng, M.A. Shupnic, T.P. Bender, R.J. Santen // Endocrinol. — 1998. — Oct. — 139 (10). — P. 4164–4174. 241. Kadish, A.S. Biologic characteristics of specific human papillomavirus types predicted from morphology of cervical lesions / A.S. Kadish, R.J. Hagan, D.B. Ritter et. al. // Hum. Pathol. — 1992. — Vol. 23. — P. 1262–1269. 242. Kamura, T. Multivariate analysis of the histopathologic factors of cervical cancer in patients undergoing radical hysterectomy / T. Kamura, N. Tsukamoto, N. Tsuruchi et al. // Cancer (Philad.). — 1992. — Vol. 69. — P. 181–186. 243. Kasa, P. Endothelial cells from human fetal brain microvessels may be cholinoceptive, but do not synthesize acetylcholine / P. Kasa, M. Pakaski, F. Joo, A. Lajtha // J. Neurochem. — 1991. — Vol. 56. — N 6. — P. 2143–2146. 244. Kiess, W. Hormonal control of programmed cell death/apoptosis / W. Kiess, B. Gallaher // Eur. J. Endocrinol. — 1998. — Vol. 138. — P. 482–491. 268 245. Kim, C.Y. Selection of human cervical epithelial cells that possess reduced apoptotic potential to low-oxygen conditions / C.Y. Kim, M.H. Tsai, C. Osmanian et al. // Cancer Res. — 1997. — Vol. 57. — N 19. — P. 4200–4204. 246. Kinishi, P. Immunohistochemical analysis of estrogen resoptors, progesterone receptors, Ki-67 antigen, and human papillomavirus DNA in normal and neoplastic epithelium of the uterine cervix / P. Kinishi, S. Fujii, H. Nonogaki et al. // Cancer (Philad.). — 1991. — Vol. 68. — P. 1340–1350. 247. King, M.M. The detection of adducts in human cervix tissue DNA using 32P-postlabelling : a study of the relationship with smoking history and oral contraceptive use / M.M. King, A. Holligswrth, J. Cuzick, R.C. Garner // Carcinogenesis. — 1994. — Vol. 15. — P. 1097–1100. 248. Kokowa, K. Apoptosis and expression of Bax and bcl-2 in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the uterine cervix / K. Kokowa, T. Shikone, T. Otani, R. Nakano // Cancer. — 1999. — Vol. 85. — N 8. — P. 1799–1809. 249. Kubota, Y. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures / Y. Kubota, H.K. Kleinman, G.R. Martin, T.J. Lawley // Journal of Cell Biology. — 1988. — Vol. 107. — P. 1589–1598. 250. Kyo, S. Regulation of early gene expression of human paplllomavirus type 16 by Inflammatory cytokines / S. Kyo, M. Inoue, N. Hayasaka et al. // Virology. — 1994. — 2000. — Vol. 1. — P. 130–139. 251. Liang, X.H. Bcl-2 protooncogene expression in cervical carcinoma cell lines containing inactive p53 / X.H. Liang, S. Mungal, A. Ayscue et al. // J. Cell Biohem. — 1995. — Vol. 57. — N 3. — P. 509–521. 252. Liehr, J.G. Mechanism of metabolic activation of catechol estrogens : a basis of genotoxicity / J.G. Liehr // Polycycl. Arom. Compounds. — 1994. — Vol. 6. — P. 229–239. 269 253. Liehr, J.G. Dual role of oestrogens as hormones and pro-carcinogens : tumour initiation by metabolic activation of oestrogens / J.G. Liehr // Eur. J. Cancer Prev. — 1997. — Vol. 6. — P. 3–10. 254. Lenczewski, A. Angiogenesis as a prognostic factor in infasive carcinoma of the uterine cervix / S. Terlikowski, W. Famulski et al. // Folia Histochem Cytobiol. — 2001. — Vol. 39. — N 2. — P. 165–166. 255. Liotta, L.A. The microenvironment of the tumor-host interface / L.A. Liotta, E. Kohn // Nature. — 2001. — Vol. 411. — P. 375–379. 256. Lobb, R.R. Integrin-immunoglobulin superfamily interactions in endothelialleukocyte adhesion / R.R. Lobb / Adhesion; Its role in Inflammatory Disease / J.M. Harlan, D.Y. Liu, eds., W.H. Freeman. — New York, 1992. — 224 p. 257. Maeda, M.Y. Relevance of the rates of PCNA, Ki-67 and p53 expression according to the epithelial compartment in cervical lesion / M. Simoes, A. Wakamatsu et al. // Pathologica. — 2001. — Vol. 93. — N 3. — P. 189–95. 258. Majima, M. Prostanoid receptor signaling relevant to tumor growth and angiogenesis / M. Majima, H. Amano, I. Hayashi // Trends in Pharmacol. Sci. — 2003. — Vol. 24. — P. 524–529. 259. Manos, M.M. Use of polymerase chain reaction for detection of genital / M.M. Manos, Y. Ting, D.K. Wright et al. // Int. J. Exp. Pathol. — 2001. — Vol. 82. — P. 15–33. 260. Martiny-Baron, G. VEGF-mediated tumour angiogenesis : a new target for cancer therapy / G. Martiny-Baron, D. Marme // Current option in Biotechnology. — 1995. — Vol. 6. — P. 675–680. 261. McMurray, H.R. Biology of human papillomaviruses / H.R. McMurray, D. Nguyen, T.F. Westbrook, D.J. McAnce // Int. J. Exp. Pathol. — 2001. — Vol. 82. — P. 15–33. 262. Meredith, J.E. The extracellular matrix as a cell survival factor / J.E. Meredith, B. Fazeli, M.A. Schwartz // Molecular Biology of Cell. — 1993. — Vol. 4. — N 9. — P. 953–961. 270 263. Moll, R. The catalog of human cytokeratins : patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells / R. Moll, W. Franke, D. Schiller et al. // Cell. — 1982. — Vol. 31. — P. 11–24. 264. Moll, R. Cytokeratins of normal epithelia and some neoplasms of the female genital tract / R. Moll, R. Levy, B. Czernobilsky et al. // Lab. Inverst. — 1983. — Vol. 49. — P. 599–610. 265. Morelli, A.E. Relationship between types of human papillomavirus and Langerhan’s cells in cervical condyloma and intraepithelial neoplasia / A.E. Morelli, C. Senanes, P.G. Di et al. // Am. J. Clin. Pathol. — 1993. — Vol. 99. — P. 220– 226. 266. Morris, H.B. Langerhan’s cells in human cervical epithelium : effects of wart virus infection and intraepithelial neoplasia / H.B. Morris, K.S. Gatter, G. Sykes et al. // Br. J. Obstet. Gynaecol. — 1983. — Vol. 90. — P. 412–420. 267. Moscicki, A.B. Human papillomavirus infectiob in sexually active adolescent females : prevalence and risk factors / A.B. Moscicki, J. Palefsky, J. Gonzales, G.K. Schoolnik // Pediatric Res. — 1990. — Vol. 28. — P. 507–515. 268. Munger, K. The role of human papillomaviruses in human cancer / K. Munger // Front. Biosci. 2002. — Vol. 1. — N 7. — P. 641–649. 269. Nair, P. Decreased programmed cell death in the uterine cervix associated with high risk human papillomavirus infection / P. Nair, K.M. Nair, P.G. Jayaprakash, M.R. Pillai // Pathol. Oncol. Res. — 1999. — Vol. 5. — N 2. — P. 95– 103. 270. Padovan, P. Prognostic vale of bcl-2, p53, and Ki-67 in invasive squamous carcinoma of the uterine / P. Padovan, R. Salmaso, M. Marchetti, R. Padovan // Eur. J. Gynecol. Oncol. — 2000. — Vol. 21. — N 3. — P. 267–272. 271. Park, T.W. The assessment of PCNA in cervical carcinoma patients infected with HPV types 16 and 18 / T.W. Park, S.N. Kim / In abstract book : 9th World Congress Cervical Pathology and Colposcopy. — Sydney, Ausralia, 1996. — 126 p. 271 272. Peoples, G.E. T-lymphocytes that infiltrate tumors and atherosclerotic plaques produce heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor and basic fibroblast growth factor : a potential pathologic role / G.E. Peoples, S. Blotnick, K. Takahashi et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1995. — V. 92. — N 14. — P. 6547–6551. 273. Petry, K.U. HPV in gynecology : associating with CIN and cervical cancer / K.U. Petry // Int. J. STD&AIDS. — 2001. — 12 suppl 2 : 18. 274. Ponvert, C. Les cytokines / C. Ponvert // Sem. hop. Paris. — 1995. — Vol. 71. — 307. — P. 355–363. 275. Pim D. HPV-18 E6*1 protein modulates the E6–directed degradation of p53 by binding to full-length HPV-18 E6 / D. Pim, L. Banks // Oncogene. — 1999. — Vol. 18. — N 52. — P. 7403–7408. 276. Rapp, L. The papillomavirus E6 proteins / L. Rapp, J.J. Chen // Biochim Biophys Acta. — 1998. — Vol. 1378. — N 1. — P. 1–19. 277. Rissau, W. Mechanisms of angiogenesis / W. Rissau // Nature. — 1997. — Vol. 386. — P. 671–674. 278. Ruas, M. The p16INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives / M. Ruas, G. Peters // Biochem. Biophys. Acta. — 1998. — Vol. 1378. — P. F115–F177. 279. Sakakura, T. New aspects of stroma-parenchyma relations in mammary gland differentiation / T. Sakakura // Int. Rev. Cytol. — 1991. — Vol. 125. — P. 165– 202. 280. Sanchez-Perez, A.M. Disruption of the papillomavirus type 16 E2 gene protect cervical carcinoma cells from E2 F-inducted apoptosis / A.M. Sanchez-Perez, S. Soriano, A.R. Clarc, K. Gaston // J. Gen. Virol. — 1997. — Vol. 78. — N 11. — P. 3000–3018. 281. Scheffner, M. Function of human papillomavirus proteins / M. Scheffner, H. Romanczuk, K. Munger et al. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 1994. — Vol. 186. — P. 83–96. 272 282. Schnerder, A. Natural history and epidemiology features of genital HPV infection / A. Schnerder, L. Koutsky // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / N. Munoz, F.X. Bosch, K.V. Shah, A. Meheus (eds). — Lyon, France : IARC, 1992. — P. 25–52. 283. Schoppmann, S.F. Inflammatory stromal reaction correlates with lymphatic microvessel density in early-stage cervical cancer / S.F. Schoppmann, M. Schind, S. Breiteneder-Geleff et al. // Anticancer Res. — 2001. — Vol. 21. — N 5. — P. 3419–23. 284. Schreiber, H. Tumor immunology / H. Schreiber // Fundamental Immunology. Third Edition / Ed. W.E. Paul. — New York : Raven Press, Ltd., 1993. — P. 1143–1178. 285. Seavey, S.E. The E7 oncoprotein of human papillomavirus type 16 stabilizes p53 through a mechanism independent of p19 (ARF) / S.E. Seavey, M. Holubar, L.J. Saucedo, M.E. Perry // J. Virol. — 1999. — Vol. 73. — N 9. — P. 7590– 7598. 286. Senger, D.R. Vascular permeability factor (VPF, VEGF) in tumor biology / D.R. Senge, L. Van De Water, L.F. Brown et al. // Cancer and Metastasis Rev. — 1993. — Vol. 12. — P. 303–324. 287. Sheets, E.E. Association between cervical neoplasia and apoptosis as detected by in situ nuclear labeling / E.E. Sheets, C.P. Crum, J. Yeh // Gynecol. Oncol. 1996. — Vol. 63. — N 1. — P. 94–100. 288. Sheets, E.E. The role of apoptosis in gynaecological malignancies / E.E. Sheets, J. Yeh // Ann. Med. — 1997. — Vol. 29. — N 2. — P. 121–126. 289. Shepherd, R. Intervenstions for encouraging sexual lifestyles and behaviours intended to prevent cervical cancer / R. Shepherd, J. Weston, G. Peersman, I.Z. Napuli // Cochrane Library, Issue. — Oxford : Update Software, 2000. — 150 p. 290. Sherr, C.J. Parsing Ink4a/Arf : ―pure‖ p16-null mice. / C.J. Sherr // Cell. — 2001. — Vol. 106. — P. 531–534. 273 291. Shirley, A.S. Evidence for Keratinocyte Immortalization in High-Grade Squamous Intraepithelial Lesions of the Cervix Infected with High-Risk Human Papillomaviruses / A.S. Shirley, I.W. McDicken, Ch.S. Herrington // Laboratory Investigation. — 2000. — Vol. 80. — P. 539–544. 292. Shoji, Y. Correlation of apoptosis with tumor cell differentiation, progression, and HPV infection in cervical carcinoma / Y. Shoji, M. Saegusa, Y. Takano et al. // J. Cllin. Pathol. — 1996. — Vol. 49. — N 2. — P. 134–138. 293. Sisk, E.A. Clinicsl implicatins of human papillomavirus infection / E.A. Sisk, E.S. Robertson // Front Biosci. — 2002. — Vol. 1. — N 7. — P. 77–84. 294. Smedts, F. Keratin expression in cervical cancer / F. Smedts, F. Ramaekers, S.M. Trojanovsky et al. // Amer. J. Pathol. — 1992. — Vol. 141. — P. 497– 511. 295. Smith, H. Cigarette Smoking and Cervical Cancer / H. Smith, G. Golderberg, C. Runowicz // The Female Patient. — 1992. — Vol. 17. — P. 59. 296. Smith, E.M. The frequency of human papillomavirus detection in postmenopausal women replacement therapy / E.M. Smith, S.R. Jonson, E.J. Figuerres et al. // Gynec. Oncol. — 1997. — Vol. 65. — N 3. — P. 441–446. 297. Smith-McCune, K.K. Demonstration and characterization of the angiogenic properties of cervical dysplasia / K.K. Smith-McCune, N. Weidner // Cancer Res. — 1994. — Vol. 54. — P. 800–804. 298. Southern, S.A. Molecular events in uterine cervical cancer / S.A. Southern, C.S. Herrington // Sex. Transm. Infect. — 1998. — Vol. 74. — P. 101–109. 299. Southern, S.A. Evidence for keratinocyte immortalization in high-grade squamous intraepithelial lesions of the cervix infected with high-risk human papillomaviruses / S.A. Southern, I.W. McDicken, C.S. Herrington // Lab. Invest. 2000. — Vol. 80. — N 4. — P. 539–44. 300. Strreuli, C.H. Expression of extracellular matrix components in regulated by substratum / C.H. Strreuli, M.J. Bissell // Journal of Cell Biology. — 1990. — Vol. 110. — P. 1405–1414. 274 301. Tavassoli, F.A. World Health Organization Classification of Tumours Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs / P. Devilee. — Lyon : IARC Press., 2003. 302. Terlikowski, S. Nissue expression of VEGF as a prognostic in early cervical squamous cell carcinoma / S. Terlikowski, A. Lenczewski, M. Sulkowska et al. // Folia Histochem Cytobiol. — 2001. — Vol. 39. — N 2. — P. 112–113. 303. The Cancer Handbook / Ed. M.R. Alison. Huangzhiman, 2003. — 1526 p. 304. Thiry, L. Cancer of cervix, papillomavirus, contraception and tobacco / L. Thiry, R. Vokaer, O. Detremmerie et al. // Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. (Paris). — 1993. — Vol. 22. — N 35. — P. 477–486. 305. Thomas, M. The role of the E6-p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV / M. Thomas, D. Pim, L. Banks // Oncogene. — 1999. — Vol. 18. — N 53. — P. 7690–7700. 306. Tjalama, W.A. The importance of biological factors (bcl-2, bax, p53, PCNA, MI, HPV and angiogenesis) in invasive cervical cancer / W.A. Tjalama, J.J. Weyler, J.J. Bogers et al. // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. — 2001. — Vol. 97. — N 2. — P. 223–230. 307. Tyring, S.K. Human papillomavirus infectins : epidemiology, pathogenesis, and host immune response / S.K. Tyring // J. Amer. Acad. Dermatol. — 2000. — Vol. 43. — P. S18–S26. 308. Ueda, M. Growth inhibition and apoptotic cell death in uterine cervical carcinoma cells induced by 5–fluorouracil / M. Ueda, K. Kumagai, K. Ueki et al. // Int. J. Cancer. — 1997. — Vol. 71. — N 4. — P. 668–674. 309. Venuti, A. Endothelin receptor blockade inhibits the growth of human papillomavirus-associated cervical carcinoma / D. Salani, A. Cirilli // Clin. Sci. (Lond). 2002. — Vol. 103. — N 48. — P. 310S–313S. 310. Villa, L.L. Human papillomaviruses and cervical cancer / L.L. Villa // Adv. Cancer Res. — 1997. — Vol. 71. — P. 321–341. 275 311. Vooijs, G.P. Benign Proliferate Reactions, Intraepithelial Neoplasia and Invasive Cancer of the Uterine Cervix / G.P. Vooijs / Ed. M. Bibbo. — Philadelphia, 1991. — P. 153–230. 312. Waggoner, S.E. Bcl-2 protein expression associated with resistance to apoptosis in clear cell adenocarcinomas of the vagina and cervix expressing wild-type p53 / S.E. Waggoner, D. A. Baunoch, S.A. Anderson et al. // Ann. Surg. Oncol. — 1998. — Vol. 5. — N 6. — P. 544–547. 313. Wang, W. Chronic inflammation in benign prostate hyperplasia is associated with focal up-regulation of cyclooxygenase-2, Bcl-2, and cell proliferation in the glandular epithelium / W. Wang, A.V. Fraser, J.E. Damber // Prostate. — 2004. — Vol. 61. — P. 60–72. 314. Wilkinson, E.J. Vulvar vestibulitis is rarely associated with Human papillomavirus infection types 6, 11, 16 or 18 / E.J. Wilkinson, E. Guerrero, R. Daniel et al. // Int. J. Gynecol. Pathol. — 1993. — Vol. 12. — P. 344. 315. Winkelstein, W. Smoking and cervical cancer — Current Status : A Review / W. Winkelstein // Am. J. Epidemiol. — 1990. — Vol. 131. — P. 945–957. 316. Wick, M.J. Diagnosis of human papillomavirus gynecologic infections / M.J. Wick // Clin. Lab. Med. — 2000. — Vol. 20. — P. 271–287. 317. Woodley, D.T. Interactions of basement membrane components / D.T. Woodley, C.N. Rao, J.R. Hassell, L.A. Liotta, G.R. Martin // Biocimica Biophysica Acta. — 1983. — Vol. 761. — P. 278–283. 318. Yager, J.D. Molecular mechanisms of oestrogen carcinogenesis / J.D. Yager, J.G. Liehr // Ann. Rev. Pharmacol. Tosicol. — 1996. — Vol. 36. — P. 203–232. 319. Yang, J. Preventation of apoptosis by bcl-2 : Release of cytochromal from mitochondria blocked / J. Yang, X.S. Liu, K. Bhalla et al. // Science. — 1997. — Vol. 275. — P. 1129–1132. 320. Zur hausen, H. Disrupted dichotomous intracellular control of Human papillomavirus infection in cancer of the cervix / H. Zur hausen // Cancer. — 1994. — Vol. 343. — P. 955–957. 276 321. Zur Hausen, H. Papillomavirus gynecologic infections / H. Zur Hausen // Biohim. Biophys. Acta. — 1996. — Vol. 1288. — P. F55–F78 (1). 322. Zur Hausen, H. Viruses in human tumors — reminiscences and perspectives / H. Zur hausen // Adv. Cancer. Res. — 1996. — Vol. 68. — P. 1–22 (2). 323. Zur Hausen, H. Papilloma virus causing cancer : evasion from control in early events of carcinogenesis / H. Zur Hausen // J. Nat. Cancer Inst. — 2000. — Vol. 92. — P. 690–698.
