010734 - 1 - Группа изобретений относится к лекарственному

010734
Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из кровеносных сосудов и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как
средство, нормализующее функции кровеносных сосудов.
Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (патент РФ № 944191, 1994; а.с. SU № 1112606, 1996; а.с. SU № 1218521, 1994; патент
РФ 1298879, 1993; патент РФ № 1448443, 1994; патент РФ № 2075944, 1997; патент РФ № 2104702, 1998;
патент РФ № 2161501, 2001; патент US 4341765, патент GB 1161896, 1969; патент FR 2583982, 1987).
Известен комплекс полипептидов, выделенных из кровеносных сосудов животных, снижающих содержание холестерина в крови (а.с. SU № 1227198, 1986, А61K 35/44), являющийся наиболее близким
аналогом - прототипом для предлагаемого средства и способа его получения.
Способ получения полипептидов, описанный в а.с. SU № 1227198, включает
экстрагирование измельченных кровеносных сосудов животных 3%-ным водным раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка в течение 48-72 ч;
центрифугирование;
обработку надосадочной жидкости ацетоном при температуре от минус 3 до минус 5°С;
растворение осадка в 1%-ном водном растворе уксусной кислоты;
фильтрование и лиофилизацию фильтрата.
К недостаткам известного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани сосудов большого количества (более 70%) веществ не пептидной природы, которые, являясь примесями, не
определяют биологическую активность выделенного активного вещества, а также его низкий выход.
Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства,
нормализующего функции кровеносных сосудов, в виде лекарственной формы для парентерального введения из кровеносных сосудов телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да и получение водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов
2,5-2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить его
выход.
Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую
стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, нормализующего функции кровеносных сосудов, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.
Другим аспектом изобретения является средство, нормализующее функции кровеносных сосудов в
виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный комплекс с
содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, технический результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных веществ,
полученных ранее из животного сырья, по молекулярной массе (от 500 до 1500 Да) входящих в него пептидных компонентов (патенты РФ № 1298879, 2104702, 2163129), а также по его нетоксичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.
В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор
средства с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что
позволяет считать показанным использование средства при различных видах патологии сосудистой системы. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.
В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, нормализующего функции кровеносных сосудов, выполненного в виде лекарственной
формы для парентерального введения (далее - препарат):
повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее двух раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до
получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких
как липидные, белковые, фосфолипидные и другие;
получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да и добавлении в
ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10-20 мг/мл при pH 5,6-6,6;
стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 мин при температуре
120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2, что обеспечивает стабильность препарата при сохранении
терапевтической эффективности.
-1-
010734
Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально. Указанный технический
результат достигается тем, что средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, выполнено в
виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с
содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл и получено из кровеносных сосудов телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.
Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения
средства, нормализующего функции кровеносных сосудов, характеризуется тем, что кровеносные сосуды телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус
40°С, выдерживают при температуре минус (20-22)°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-16°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч,
экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном
соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3-5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее 2-х раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°С ацетона
до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации
полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной
очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10-20 мг/мл
при рН 5,6-6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см2, разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2.
Сущность изобретения поясняется таблицами и фигурой.
В табл. 1 показано влияние препарата на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.
На фигуре показано влияние препарата на развитие эксплантатов сосудистой стенки.
В табл. 2 представлено влияние препарата на показатели липидного и углеводного обмена у больных атеросклерозом артерий.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
пример 1 - способ получения препарата;
пример 2 - изучение токсичности препарата;
пример 3, подтверждающий биологическую активность препарата;
пример 4, подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.
Пример 1. Способ получения препарата.
В качестве сырья используются кровеносные сосуды телят (не старше 12-месячного возраста) или
свиней, которые замораживают при температуре не менее минус 40°С и выдерживают при температуре
минус (20-22)°С в течение не менее двух месяцев.
В реактор для экстракции перекачивают 500 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры 20±5°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 100 кг измельченного до
получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1,
охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-16°С, затем перемешивают по 1 ч через
каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.
Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при 5000±500 об/мин в течение 1 ч. К
экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре 3-5°С в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее двух раз. Затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета. Промытый осадок
протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают
двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном
шкафу до полного удаления запаха ацетона.
Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного
из кровеносных сосудов) составляет 30 г на 1 кг исходного сырья.
Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при
комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5-2,9 мг/мл. Полученный раствор
-2-
010734
центрифугируют при 3000±200 об/мин в течение 20±5 мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа
АР-15 или аналогичный.
Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да.
В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола до его конечной концентрации
10-20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении pH 5,6-6,6.
Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0 кгс/см2.
Полученный раствор разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом
подвергают стерилизации в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении не более
1,1 кгс/см2.
Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с
концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.
Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.
Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях.
С целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной
хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.
Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм, максимум поглощения отмечается при длине волны 270±5 нм.
Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют следующими методами:
методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки
колонки 1,6×60 см используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия);
методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Voyager
DE Biospectrometry с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (MALDI-TOF) при относительной интенсивности азотного лазера 2300-2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки
90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6×106 тор;
методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором
маркерных белков.
Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 72 до 678 Да.
С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C18», колонка 2×62 мм), установлено, что в состав препарата входят
преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в
препарате отсутствуют.
Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып. 2, с. 183)
при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия
хлорида для инъекций. Показано, что препарат является апирогенным.
Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной
фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от
72 до 678 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.
Пример 2. Изучение токсичности препарата.
Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой
токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при
длительном введении препарата.
Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах
с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 35, 50, 100, 150, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9%
раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.
Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 65 белых беспородных крысахсамцах с массой тела 150-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат
внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата на 30-, 60- и 90-е сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.
-3-
010734
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из
длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 84 морских свинках-самцах с массой тела 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 месяцев в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У
животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови
общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга,
спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников,
гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.
При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата
животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения,
более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической
широте препарата.
Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 3003000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели
периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено (табл. 1).
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и
дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.
Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве
лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.
Пример 3. Влияние препарата на развитие эксплантатов сосудистой стенки.
Эксперименты проведены на 39 фрагментах сосудистой стенки периферической артерии крыс линии «Wistar» с массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из
35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты сосудистой стенки помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой
подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С, в течение 2 суток. В экспериментальную
среду добавляли препарат в концентрациях 1, 10, 50, 100, 200 и 400 нг/мл. Критерием биологической
активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента сосудистой стенки. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.
На фигуре показано влияние препарата на развитие эксплантатов сосудистой стенки.
Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на
коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации препарата 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 25% по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов сосудистой стенки на более длительных сроках культивирования (7 дней) было
выявлено аналогичное стимулирующее действие препарата в той же концентрации.
Таким образом, в отношении ткани сосудистой стенки препарат оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.
Пример 4. Эффективность применения препарата у больных с атеросклерозом сосудов головного
мозга.
Изучение клинической эффективности применения препарата проводили с участием 27 пациентов,
страдающих атеросклерозом сосудов головного мозга в возрасте от 67 до 83 лет. У больных отмечались
различные клинические проявления цереброваскулярных расстройств в виде нарушения памяти, концентрации внимания, аффективной лабильности.
Все больные методом простой рандомизации были разделены на 2 группы. В основную группу вошли 15 больных, которые дополнительно к общепринятому лечению получали препарат в дозе 5 мг в
2,0 мл физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.
Контрольная группа включала 12 пациентов, получавших только общепринятое лечение.
В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое исследование крови и мочи,
биохимическое изучение крови.
Установлено, что применение препарата у больных с атеросклерозом сосудов головного мозга способствовало улучшению общего самочувствия, уменьшению эмоциональной лабильности, стабилизации
-4-
010734
настроения, уменьшению тревожности. Больные отмечали улучшение памяти, концентрации внимания.
Среди лабораторных показателей наиболее информативными были данные биохимического исследования крови (табл. 2). Применение препарата способствовало достоверному снижению уровня общего
холестерина в крови по сравнению с показателем как до лечения, как и после лечения с применением
общепринятых средств. Отмечалась также отчетливая тенденция к снижению содержания холестерина
липопротеидов очень низкой плотности, являющихся наиболее атерогенными. Это свидетельствует о
нормализующем влиянии препарата на метаболизм в клетках сосудистой стенки.
Эффективность влияния препарата на интегративную функцию мозга изучали с использованием
психофизиологических тестов, характеризующих особенности памяти и мышления у больных с цереброваскулярными расстройствами:
«Кратковременная зрительная память на числа» (КПЗ),
«Долговременная память на числа» (ДП) и
«Установление закономерностей».
У больных контрольной группы, получавших общепринятую терапию, достоверных изменений показателей психофизиологических тестов выявлено не было.
У пациентов основной группы, получавших лечение с применением препарата, были выявлены достоверные изменения показателей тестов по сравнению с показателями до лечения и с показателями у
больных контрольной группы (табл. 3). Это проявлялось в положительной динамике изменения когнитивных функций, характеризующих объем и точность зрительной информации (КЗП на числа), точность
запоминания, хранения и оперативного воспроизведения информации (оперативная память, ОП) и логическое мышление (способность к умозаключению). Кроме того, у пациентов основной группы было выявлено достоверное повышение устойчивости и концентрации внимания, скорости переработки информации, нормализация основных корковых процессов, достоверное улучшение кратковременной и даже
тенденция к улучшению долговременной памяти, достоверное улучшение показателей, характеризующих логическое мышление, снижение времени сенсомоторной реакции (табл. 3). Изменения психофизиологических показателей характеризуют усиление процесса возбуждения в коре головного мозга у
больных с цереброваскулярными расстройствами, что свидетельствует об улучшении кровоснабжения
подверженных ишемии участков головного мозга и о благоприятном действии препарата на функцию
кровеносных сосудов. При изучении клинической эффективности применения препарата побочного действия и осложнений не выявлено.
Таким образом, результаты проведенного клинического исследования свидетельствуют о лечебной
эффективности применения препарата в терапевтически эффективной дозе 5 мг (2,5 мг/мл) внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней и целесообразности его применения в комплексном лечении атеросклероза артерий.
-5-
010734
Таблица 1
Таблица 2
*P<0,05 по сравнению с показателем до лечения;
#P<0,05 по сравнению с показателем после лечения с применением общепринятых средств.
-6-
010734
Таблица 3
*Р<0,05 по сравнению с показателем до лечения;
#P<0,05 по сравнению с показателем после лечения с применением общепринятых средств.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, представляющее собой лекарственную
форму для парентерального введения в виде раствора пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл и полученное из кровеносных сосудов телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.
2. Способ получения средства по п.1, характеризующийся тем, что кровеносные сосуды телят не
старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус (20-22)°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°С, экстракцию
проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50 объемов однородной взвеси к 1 объему 1% раствора
хлористого цинка, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-16°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении сырье:ацетон, равном 1:5, выдерживают при температуре 3-5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно
осаждают ацетоном не менее 2-х раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутчфильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°С ацетона до получения осадка
светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной
воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов
2,5-2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000
Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10-20 мг/мл при pH 5,6-6,6,
раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см2, разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2.
-7-
010734
*P<0,05 по сравнению с показателем в контроле, принятым за 100%
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-8-