На правах рукописи - Красноярский государственный аграрный

На правах рукописи
Ланкина Елена Петровна
Бактериальные сообщества пещер как источник штаммов
для биологической защиты растений от болезней
03.02.08 – экология (биология)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Красноярск – 2010
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный
университет»
Научный руководитель
доктор биологических наук, профессор
Хижняк Сергей Витальевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Машанов Александр Иннокентьевич
кандидат биологических наук, доцент
Абдуллин Шамиль Раисович
Ведущая организация
ГНУ «Красноярский
научно-исследовательский
институт сельского хозяйства»
Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится «20» января 2011 г. в 14 30 часов на заседании
диссертационного совета Д 220.037.04 при ФГОУ ВПО «Красноярский
государственный аграрный университет» по адресу: 660049, г. Красноярск,
проспект Мира, 90. Факс: (391)227-36-09
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
«Красноярский государственный аграрный университет»
Автореферат разослан «
»
ФГОУ
2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
Г.А. Демиденко
ВПО
3
Актуальность проблемы. В качестве экологически безопасных методов
защиты растений от болезней хорошей альтернативой химическим препаратам
являются биологические средства, разработанные на основе микроорганизмов
– антагонистов возбудителей заболеваний растений (Штерншис, 2004;
Copping, 2004; Pal, 2006; Perelló, 2007). В настоящее время развитые
государства, включая Россию, вводят ограничения на применение химических
препаратов, и переориентируют сельхозпроизводителей на использование
биологических средств защиты растений (Федеральная целевая программа
«Основные направления агропродовольственной политики правительства
Российской Федерации на 2001-2010 годы»). Однако внедрение
микробиологических препаратов в практику сельского хозяйства тормозится в
том числе тем, что микроорганизмы, входящие в их состав,
часто
оказываются малоэффективными в условиях низких температур начала
вегетации. Другим препятствием для широкого применения микроорганизмов
в защите растений является потенциальная опасность для человека и
животных даже непатогенных видов бактерий и грибов при промышленном
использовании биопрепаратов (Strasser, 2006).
Предполагается,
что
использование
психрофильных
и
психротолерантных штаммов позволит решить проблему эффективности
биопрепаратов в условиях низких температур начала вегетационного периода,
а также устранит опасность заболевания человека и теплокровных животных
даже при массированной инокуляции организма (Нестеренко, 2007). Хорошим
природным источником подобных штаммов являются карстовые пещеры
умеренного климатического пояса (Хижняк и др., 2003).
Целью настоящего исследования было изучение перспектив
использования пещерных микробных сообществ в качестве источника
бактериальных штаммов для биологической защиты растений от болезней в
условиях континентального климата.
Основные задачи:
1.
Сравнительное изучение относительной встречаемости антагонистов к
фитопатогенным грибам в пещерных грунтах, почвах и почвоподобном
субстрате.
2.
Выделение из пещерных сообществ бактериальных изолятов,
представляющих интерес с точки зрения биологической борьбы с
фитопатогенными грибами.
3.
Идентификация выделенных изолятов и изучение их биологических
особенностей.
4.
Лабораторная оценка эффективности выделенных изолятов в защите
зерновых от обыкновенной корневой гнили.
5.
Полевые испытания пещерных изолятов в качестве биологического
агента для защиты зерновых от корневой гнили и листовой пятнистости в
почвенно-климатических условиях Сибири.
Научная новизна. Впервые показана возможность использования
психрофильных и психротолерантных бактерий, выделенных из пещерных
микробных сообществ, в качестве
эффективного и безопасного для
4
теплокровных средства для биологической защиты сельскохозяйственных
растений от болезней. Показана целесообразность использования в защите
растений комбинированных биопрепаратов, составленных из штаммов с
разными температурными оптимумами роста.
Создана коллекция штаммов, представляющих практический интерес
для биологической борьбы с корневой гнилью и листовой пятнистостью
зерновых культур в условиях Сибири. Ряд выделенных из пещер изолятов по
комплексу биологических характеристик и результатам секвенирования гена
16S рРНК отличаются от известных бактерий на уровне вида.
Установлено, что относительная встречаемость и антибиотическая
активность штаммов, проявляющих антагонизм к фитопатогенным грибам, в
пещерных сообществах статистически значимо превышает аналогичные
показатели для почв и почвоподобного субстрата. Установлено, что
максимальная встречаемость антагонистов наблюдается в участках пещер с
мало интенсивным, но исторически длительным притоком органического
вещества, минимальная – в антропогенно загрязнённых участках.
Впервые показано, что в микробных сообществах пещер Средней
Сибири присутствуют бактерии, проявляющие антибиотическую активность в
отношении возбудителей заболеваний человека и животных. Создана
коллекция
изолятов,
проявляющих
антибиотическую
активность
одновременно в отношении метициллин-резистентного Staphylococcus aureus
(MRSA), Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis и Aspergilus fumigatus.
Защищаемые положения:
1. В микробных сообществах карстовых пещер Средней Сибири наблюдается
повышенная по сравнению с почвой встречаемость бактерий, обладающих
антибиотической активностью в отношении фитопатогенных грибов.
2. Выделенные из карстовых пещер психрофильные и психротолерантные
бактерии могут быть использованы в качестве эффективного и безопасного
для теплокровных биологического агента для защиты зерновых культур от
корневых гнилей в условиях континентального климата.
3. Микробные сообщества карстовых пещер Средней Сибири представляют
интерес в качестве потенциального источника продуцентов антибиотиков для
борьбы с болезнями человека и сельскохозяйственных животных.
Практическое значение работы. Коллекция выделенных в пещерах
Сибири психрофильных и психротолерантных микроорганизмов используется
в преподавании дисциплин "Микология" и "Защита растений" для
специальностей 110102, 110203 и 110201М на кафедре экологической
генетики и биотехнологии ФГОУ ВПО КрасГАУ (Акты внедрения от
15.10.2009 и от 15.12.2009). Выделенные в пещерах психрофильные и
психротолерантные штаммы
антагонистов возбудителя обыкновенной
корневой гнили зерновых в 2008 и 2009 годах успешно прошли полевые
испытания в ОПХ «Минино» (КрасНИИСХ) в качестве биологических агентов
в борьбе с гельминтоспориозной корневой гнилью и альтернариозом (Справки
о производственных испытаниях от 03.04.2009, 19.04.2010 и 24.09.2010).
Перспективные для практического использования бактериальные изоляты
5
прошли испытания на безопасность в Научно-исследовательском институте
медицинских проблем Севера СО РАМН (Отчет от 20.05.2010). Ряд изолятов
проходят процедуру патентного депонирования в ВКПМ.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 22
работы, в том числе 3 – в журнале, рекомендованном ВАК РФ. Материалы
исследований были представлены на: Всероссийской научно-практической
конференции «Аграрная наука на рубеже веков» (Красноярск, 2005);
Всероссийской студенческой научной конференции «Студенческая наука взгляд в будущее» (Красноярск 2007); V Международной научнопрактической конференции молодых ученых СФО «Современные тенденции
развития АПК в России» (Красноярск, 2007); II (Новосибирск, 2008, 1-е место)
и III этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди
молодых ученых Минсельхоза РФ (Москва, 2008, 2-е место); Международной
научно-практической конференции "Агроэкологическая роль плодородия почв
и современные агротехнологии" (Уфа, 2008); Научно-практической
конференции "Пещеры: охрана, история исследований, культура, туризм,
современное состояние и перспективы научных исследований в пещерах на
территории бывшего СССР" (Красноярск, 2008); Всероссийской научнопрактической и научно-методической конференции с международным
участием "Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы
развития" (Красноярск, 2008); IV международной конференции молодых
ученых «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых
ученых (Новосибирск 2010); III международной научно-практической
конференции молодых ученых «Инновационные тенденции развития
российской науки» (Красноярск 2010).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139
страницах текста, содержит 67 рисунков и 5 таблиц. Работа состоит из
введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования,
результатов и их обсуждения, практических рекомендаций, выводов и списка
литературы, содержащего ссылки на 239 источников, из которых 71 – на
иностранных языках.
Личный вклад автора. Отбор и анализ образцов, эксперименты,
обработка и интерпретация полученных результатов выполнены лично
автором. Секвенирование гена 16S рРНК бактериальных изолятов выполнено
в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Глава 1. Обзор литературы
Несмотря на большое количество уже существующих биопрепаратов,
поиск новых штаммов антагонистов, адаптированных к конкретным почвенноклиматическим условиям, остаётся актуальным (McSpadden Gardener, 2009).
Для защиты растений от целого ряда заболеваний, включая корневые гнили,
биопрепараты должны быть эффективны при низких температурах начала
вегетационного периода, когда происходит заражение проростков (Чулкина,
1985; Цугленок и др., 2003). Ряд авторов отмечают потенциальную опасность
применяемых в сельском хозяйстве биопрепаратов для здоровья человека и
сельскохозяйственных животных (Strasser, 2006). Использование в защите
6
растений психрофильных и психротолерантных микроорганизмов позволит
обеспечить высокую эффективность биопрепаратов в начале вегетации и
одновременно устранить риск здоровью человека и теплокровных животных
(Нестеренко, 2007). Природным источником таких микроорганизмов могут
служить микробные сообщества карстовых пещер (Хижняк и др., 2003).
Глава 2. Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили микробные сообщества карстовых
известняковых пещер Водораздельная, Маячная и Женевская. Протяжённость
ходов соответственно 2500 м, 1100 м и 6020 м, глубина – 177 м, 60 м и 90 м,
геологический возраст около 20 млн. лет. Объектами для сравнения служили
микробные сообщества почв (почва сельскохозяйственного назначения,
садово-огородная почва, дерново-луговая почва, почва из-под комнатных
растений) и почвоподобный субстрат, предоставленный к.б.н. Мануковским
Н.С. (ИБФ СО РАН). Тест-объектами служили фитопатогенные грибы р.р.
Bipolaris, Fusarium, Alternaria, выделенные из поражённых органов ячменя и
пшеницы. Лабораторные исследования выполняли по стандартным
методикам. Полевые испытания проводили в ОПХ "Минино" Красноярского
НИИСХ СО РАСХН в соответствии с методикой проведения
мелкоделяночных опытов.
Глава 3. Сравнительный анализ встречаемости антагонистов к
фитопатогенным грибам в бактериальных сообществах почв, почвоподобных субстратов и пещер
Исследования показали, что между изученными почвами нет
статистически значимых различий по относительной встречаемости
антагонистов и спектру их активности в отношении тест-культур (рис. 1).
2,0
1,5
1,0
Root 2
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
-2,0
-2,5
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Почва из-под
пшеницы
Садовоогородная
почва
Дерноволуговая
почва
Почва из-под
комнатных
растений
Root 1
Рисунок 1 – Проекция изолятов, выделенных из разных почв, на оси
дискриминации по их способности подавлять рост тест-культур
Распределение выделенных в почвах и пещерах изолятов по
антибиотической активности статистически значимо (p<0,001) отличается от
7
нормального и носит двувершинный характер. Для почвоподобного субстрата
аналогичное распределение является асимметричным (рис. 2).
Доля изолятов, %
45
Почвы
Почвоподобный субстрат
Пещеры
30
15
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Степень подавления прорастания конидий тест-культуры, %
Рисунок 2 – Распределение бактериальных изолятов, выделенных из почв,
почвоподобного субстрата и пещер по антибиотической активности в
отношении тест-культур (на примере антагонистов к грибам р. Bipolaris)
Между пещерными грунтами, почвой и почвоподобным субстратом
отмечены статистически значимые (p=0,05) различия по относительной
встречаемости антагонистов. Максимальная встречаемость антагонистов
отмечена в пещерных грунтах, характеризующихся исторически длительным
(судя по костным останкам – с плейстоцена), но мало интенсивным
поступлением экзогенного органического вещества и низким уровнем
антропогенного загрязнения (рис. 3).
Рисунок 3 – Относительная встречаемость сильных (подавление тесткультуры на 75-100%) и слабых (подавление тест-культуры на 20-75%)
антагонистов в почве (1), почвоподобном субстрате (2), пещерах с высоким
уровнем антропогенного загрязнения (3), пещерах с низким уровнем
антропогенного загрязнения (4) на примере антагонистов к грибам р. Bipolaris.
8
Наблюдаемый феномен можно объяснить длительной эволюцией
сообщества в условиях жёсткого субстратного лимитирования, когда
способность продуцировать антибиотики становится важным конкурентным
преимуществом. Пещерные грунты с высоким уровнем антропогенного
загрязнения по встречаемости антагонистов не отличаются от почв, что
подтверждается многомерным анализом (рис. 4).
Complete Linkage
СО
КР
ПП
ВА
НА
Фактор2 (28,89%)
ДЛ
2
ПП
1
ВА
НА
0
СО ДЛ
КР
-1
-2
-1
0
1
2
Фактор1 (46,16%)
Рисунок 4 – Результаты кластеризации (слева) и проекции на главные факторы
(справа) микробных сообществ по относительной встречаемости антагонистов
и их антибиотической активности в отношении тест-культур: ДЛ-дерноволуговая почва, СО-садово-огородная почва; КР-почва из-под комнатных
растений; ПП-почва из-под пшеницы; ВА и НА - пещерные грунты с высоким
и низким уровнем антропогенного загрязнения.
Глава 4. Биологические особенности пещерных изолятов, проявивших
антибиотическую активность в отношении фитопатогенных грибов
Максимальную антибиотическую активность в отношении тест-культур
проявили изоляты из пещеры Водаздельная: ВДР5м (максимальная
температура роста (Tmax) 23ºС, по результатам секвенирования гена 16S
рРНК – 98.486% уровень сходства с Pseudochrobactrum kiredjianiae); ВДР5кр
(Tmax 29ºС, 99.3% уровень сходства с Paenibacillus amylolyticus); ВДР7(1)
(Tmax 25ºС, предварительная идентификация – р. Bacillus); ВДР7(2) (Tmax
34ºС, 95.8% уровень сходства с Bacillus odysseyi); ВДР10 (Tmax выше 37ºС,
100% уровень сходства с Bacillus tequilensis); изоляты из пещеры Женевская:
УОЗК2 (Tmax 26ºС, 99.1% уровень сходства с Sporosarcina globispora); УОЗК7
(Tmax 28ºС, предварительная идентификация – р. Bacillus); изоляты из
пещеры Маячная: БО4 (Tmax 34ºС, 96.9% уровень сходства с Bacillus
odysseyi); ТП3 (Tmax 30ºС, 96.7% уровень сходства с Bacillus odysseyi).
Характерной особенностью изолятов является способность к росту при
4ºС, температурный оптимум в районе 15-25ºС, и (за исключением ВДР10)
неспособность к нормальному росту и развитию при температуре
человеческого тела. Ряд изолятов способны к ограниченному росту при
температуре на 2..3ºС выше Tmax, однако при этом образуются аномальные
клетки, которые при дальнейшем инкубировании погибают, а у
спорообразующих изолятов утрачивается способность к споруляции (рис. 5).
9
Рисунок 5 – Нарушения роста
и
развития
пещерных
изолятов
при
высокой
температуре (на примере
УОЗК7): слева – нормальные
клетки при температуре 23ºС,
справа – непроросшие споры
и аномальные клетки при
29ºС, 24-часовая культура
Глава 5. Возможность использования пещерных изолятов в защите
растений в виде смешанных культур
Исследования показали, что ряд пещерных изолятов способны к росту в
совместной культуре. При этом в случае, если оптимальная и максимальная
температуры роста изолятов различаются, их соотношение в культуре зависит
от температуры культивирования (рис. 6).
Рисунок 6 –
Влияние
температуры на
соотношение
психрофильного и
психротолерантного
изолятов в
смешанной
культуре
на примере ВДР-5м
(мелкие палочки) и
ВДР-5кр (крупные
палочки), 24часовая культура
Это открывает возможность создания комбинированных биопрепаратов,
эффективных в широком диапазоне температур. Динамика роста бактерий в
таком случае при условии постоянного притока субстрата (например, за счёт
корневых выделений растений) может быть описана системой уравнений:
dX m
S
  max m (T ) 
 Xm  m  Xm
dt
K Sm  S
dX p
dt
 max p (T ) 
S
K Sp  S
 X p  p  X p
10


dS
S
1
S
 1

 S0  
 max m (T ) 
 Xm 
 max p (T ) 
Xp
dt
K Sm  S
Yp
K Sp  S
 Ym



где S – количество субстрата, S0 – приток субстрата, Xm и Xp – численности,
μmaxm(T)
и
μmaxp(T)
– максимально возможные при данной температуре
Численность
скорости размножения, KSm и KSp – константы Михаэлиса, εp и εp – удельные
скорости гибели, Ym и Yp – экономические коэффициенты соответственно
психротолерантного и психрофильного изолятов.
Компьютерный анализ модели с использованием экспериментально
полученных зависимостей скоростей
роста пещерных изолятов от
температуры показал, что в условиях характерного для условий Сибири
постепенного роста температуры почвы в период вегетации с +5..+7ºС до
+25..+30ºС смешанный препарат будет иметь преимущество перед
препаратами, составленными из чистых культур. Это достигается за счёт
преимущественного роста сначала психрофильного, а затем
–
психротолерантного изолята (рис. 7).
Рисунок 7 –
Динамика численности
Xp
психрофильного (Xp),
Xm
психротолерантного
Summa
(Xm) изолятов и их
суммарной
численности
(Summa)
в
условиях постоянного
притока субстрата и
роста температуры от
+5 до +25..+30ºC
Время
Интенсивность
развития
заболевания, %
В этой связи в дальнейших экспериментах использовали как чистые, так
и смешанные культуры пещерных изолятов.
Глава 6. Лабораторные и полевые испытания эффективности
выделенных из пещер изолятов в защите зерновых от корневой гнили и
листовой пятнистости
100
80
60
40
20
0
Контроль
Заражение
ВДР5
ВДР7
ВДР10
Рисунок 8 – Влияние бактеризации пещерными изолятами на поражение
проростков пшеницы корневой гнилью при искусственном заражении семян
11
При лабораторных испытаниях наиболее эффективными в защите
растений пшеницы (Новосибирская-15) от обыкновенной корневой гнили
проявили себя изолят ВДР10, а также смеси ВДР5м + ВДР5кр и ВДР7(1) +
ВДР7(2), в дальнейшем именуемые соответственно ВДР5 и ВДР7 (рис. 8).
Полевые испытания изолятов ВДР5 и ВДР10 в 2008 г. показали их
высокую эффективность как в снижении поражения растений корневыми
гнилями, так и в обеспечении статистически значимой прибавки урожая
(p<0,05). Средняя прибавка урожая в пересчёте в т/га по сравнению с
контролем при бактеризации семян смесью ВДР5 (из расчёта 10 л/т семян)
составила для ячменя 0,13, для овса 0,19 и для пшеницы 0,15. При
бактеризации изолятом ВДР10 прибавка урожая составила 0,2, 0,05 и 0,07 т/га
соответственно. Гидротермический режим вегетационного периода 2009 года
существенно отличался от среднемноголетних характеристик. ГТК
Селянинова с мая до сентября составил 1,52. При понижении среднесуточных
температур на -0,2°С количество осадков превышено на 94,4 мм. Сумма
активных температур до созревания составила 1700°С, то есть формирование
зерна проходило при пониженной температуре (Проведение оценки…, 2009).
Тем не менее, полевые испытания 2009 г. также показали высокую
эффективность изолятов пещерных бактерий (смеси ВДР5 и ВДР7) в защите
зерновых от корневых гнилей. Эффект бактеризации проявился в
статистически значимом (p<0,001) снижении поражения растений корневой
гнилью и листовой пятнистостью (рис. 9, 10), так и в статистически значимой
(p<0,05) прибавке урожая в сравнении с контролем (рис. 11).
1,6
Контроль
ВДР5
ВДР7
1,2
0,8
0,4
0
кущение
колошение
пшеница
кущение
колошение
ячмень
Рисунок 9 – Влияние бактеризации на поражение зерновых листовой
пятнистостью (баллы) в полевых испытаниях 2009 г.
Эффект бактеризации (из расчёта 10 л/т семян) в целом не уступал
эффекту протравливания семян такими химическими фунгицидами, как
Раксил Ультра, Ламадор, Виал Траст, Витацид, Скарлет, Дивидент стар, Экос,
Табу+Бункер. Так, средняя прибавка урожая по сравнению с контролем при
бактеризации смесью ВДР5 составила в пересчёте в т/га для ячменя 0,17, для
пшеницы 0,22 т/га. При бактеризации смесью ВДР7 прибавка урожая ячменя и
пшеницы составила 0,16 и 0,26 т/га соответственно. В то же время прибавка
урожая, которую обеспечили перечисленные химические фунгициды,
12
составила от 0,12 т/га до 0,25 т/га для ячменя и от 0,24 т/га до 0,48 т/га для
пшеницы.
3,5
3
2,5
2
1,5
Пшеница (кущение)
Контроль
ВДР5
ВДР7
1
0,5
0
первич
вторич
эпикотиль
Пшеница
(колошение)
корень
корень
Контроль ВДР5 ВДР7
основ
стебля
Сумма
баллов
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
первич
вторич
эпикотиль
Ячмень
(кущение)
корень
корень
Контроль ВДР5 ВДР7
основ
стебля
Сумма
баллов
55
4,5
4,5
44
3,5
3,5
33
2,5
2,5
22
1,5
1,5
11
0,5
0,5
00
первич
вторич
эпикотиль
Ячмень
(колошение)
Ячмень
корень (колошение)
корень
Контроль
Контроль ВДР5
ВДР5 ВДР7
ВДР7
основ
стебля
Сумма
баллов
Основание
основ
стебля
Сумма
баллов
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Первичный
первич
корень
корень
Вторичный
вторич
корень
корень
Эпикотиль
эпикотиль
Рисунок 10 – Влияние бактеризации на поражение зерновых корневой гнилью
(баллы) в полевых испытаниях 2009 г.
13
Дисперсионный анализ показал, что и у ячменя, и у пшеницы
бактеризация в наибольшей степени снизила поражаемость основания стебля,
первичного корня и вторичного корня.
3,6
4,2
2,4
3,4
3,4
4
2,2
3,2
3,2
3,8
2
3
Пшеница
Контроль
ВДР5
2008
Ячмень
Пшеница
ВДР10
Контроль
Ячмень
ВДР5
ВДР7
2009
Рисунок 11 – Влияние бактеризации пещерными изолятами на урожай ячменя
и пшеницы (т/га) в полевых испытаниях 2008 и 2009 г.г.
Глава 7. Перспективы поиска в пещерных сообществах продуцентов
антибиотиков, эффективных в отношении возбудителей заболеваний
человека и животных
В связи с выявленной в ходе исследований высокой антагонистической
активностью бактерий из пещерных сообществ, было изучено их воздействие
на возбудителей человека и животных (табл. 1).
Таблица 1 – Влияние культурального фильтрата пещерных изолятов на рост
возбудителей заболеваний человека и животных (метод колодцев на
агаризованной среде): 0 баллов – зоны отсутствия роста нет, 1 балл – зона
отсутствия роста 1-2 мм, 2 балла – зона отсутствия роста 3-4 мм, 3 балла –
зона отсутствия роста 5 мм и выше
Изолят
Степень подавления тест-культуры, баллы
MRSA
P.aeruginosa
P.mirabilis
A. fumigatus
ВДР5к
2
0
1
3
ВДР5м
2
2
2
3
ВДР10
3
2
1
3
ВДР7(1)
1
0
0
3
ВДР7(2)
3
1
0
3
УозК2
2
3
2
3
УозК7
1
1
0
3
БО4
3
2
3
3
ТП3
2
3
3
3
Обнаружена статистически значимая (p=0,05) корреляционная связь
(коэффициент корреляции r=0,752, коэффициент ранговой корреляции
14
Спирмена rs=0,765) между способностью изолятов подавлять рост P.
aeruginosa и P. mirabilis, что может быть связано с одинаковым
(грамотрицательным) типом клеточной стенки у данных возбудителей. В
настоящее время изоляты, проявившие высокую антибиотическую активность
в отношении указанных патогенов, успешно прошли первый этап
доклинических испытаний под руководством д.м.н. Новицкого И.А. (НИИ
медицинских проблем Севера СО РАМН).
Практические рекомендации
1. Смеси выделенных в пещере Водораздельная бактериальных изолятов
ВДР5м и ВДР5кр, ВДР7(1) и ВДР7(2) рекомендуются в качестве основы
эффективных в условиях континентального климата и безопасных для
человека и теплокровных животных биопрепаратов для защиты зерновых
культур от корневой гнили и листовой пятнистости.
2. Руководству МУ "Центр путешественников" и Красноярского
краевого клуба спелеологов необходимо ограничить посещение пещеры
Водораздельная спелеотуристами в целях сохранения уникального
микробного сообщества, представляющего научную и практическую
ценность.
3. Руководству Центра космической биологии и технологии
жизнеобеспечения Пекинского аэрокосмического университета (BUAA)
рекомендуется
при
разработке
системы
защиты
растений
в
биорегенеративных системах жизнеобеспечения в рамках соглашения о
научно-исследовательском
сотрудничестве
между
Красноярским
государственным аграрным университетом (Россия) и Пекинским
аэрокосмическим университетом (КНР) от 25.06.09 использовать безопасные
для человека и теплокровных животных бактериальные изоляты, выделенные
из пещер Средней Сибири.
4. НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН рекомендуется
провести исследования возможности использования выделенных из пещер
Средней Сибири бактерий в качестве продуцентов новых антибиотиков.
Выводы
1.
Встречаемость
бактерий,
проявляющих
антагонизм
к
фитопатогенным грибам р.р. Bipolaris, Fusarium, Alternaria, в пещерных
сообществах Средней Сибири статистически значимо (p<0,05) выше, чем в
почвах и почвоподобных субстратах. Ключевым фактором, определяющим
встречаемость антагонистов, является интенсивность притока органики и
уровень антропогенного загрязнения; максимальное число антагонистов
наблюдается в пещерах с небольшим, но исторически длительным притоком
органического вещества и малым уровнем антропогенного загрязнения.
2.
По способности к подавлению роста и развития фитопатогенных
грибов и температурным диапазонам роста наибольший интерес с
практической точки зрения представляют изоляты ВДР5м, ВДР5кр, ВДР7(1),
ВДР7(2), ВДР10 (место выделения – пещера Водораздельная), УОЗК2, УОЗК7
(место выделения – пещера Женевская), БО4, ТП3 (место выделения – пещера
Маячная).
15
3.
По совокупности генетических и культуральных характеристик
изоляты ВДР5м, ВДР7(2), БО4, ТП3 отличаются от известных бактерий на
уровне новых видов. Изоляты ВДР5кр, ВДР10 и УОЗК2 по результатам
секвенирования гена 16S рРНК близки к известным видам бактерий
(соответственно Paenibacillus amylolyticus, Bacillus tequilensis, Sporosarcina
globispora). Изоляты ВДР7(1) и УОЗК7 предварительно идентифицированы
как представители р. Bacillus.
4.
Максимальная температура роста изолята ВДР5м составляет
+23ºС, УОЗК2 +26ºС, ВДР5кр +29ºС, УОЗК7 +29ºС, ВДР10, ВДР7(1),
ВДР7(2), БО4, ТП3 +30ºС.
5.
Все перечисленные изоляты безопасны для теплокровных, что
подтверждено испытаниями, проведёнными в НИИ медицинских проблем
Севера СО РАМН под руководством д.м.н. Новицкого И.А.
6.
Наибольший эффект в защите пшеницы от обыкновенной
корневой гнили в лабораторных испытаниях показал изолят ВДР10, а также
смеси изолятов ВДР5м и ВДР5кр, ВДР7(1) и ВДР7(2). Эффект бактеризации
проявляется в статистически значимом (p<0,05) снижении интенсивности
заболевания, и в статистически значимом (p<0,05) улучшении биометрических
показателей инфицированных проростков. Кроме этого, бактеризация
статистически значимо (p<0,01) снижает количество образующихся на
проростках конидий возбудителя.
7.
Полевые испытания 2008 и 2009 гг. показали, что изолят ВДР10, а
также смеси изолятов ВДР5м и ВДР5кр, ВДР7(1) и ВДР7(2) статистически
значимо (p<0,001) подавляют развитие корневой гнили и листовой
пятнистости зерновых, статистически значимо (p<0,05) повышают
урожайность, и могут быть рекомендованы в качестве основы эффективных в
условиях континентального климата и безопасных для человека и
теплокровных животных биопрепаратов для защиты зерновых культур от
корневой гнили и листовой пятнистости.
8.
Компьютерное моделирование, а также лабораторные и полевые
испытания продемонстрировали целесообразность использования в защите
растений комбинированных биопрепаратов, составленных из смеси штаммов с
разными температурными оптимумами роста.
9.
Кроме способности к подавлению фитопатогенных грибов, 9
выделенных из пещер изолятов проявили антибиотическую активность в
отношении метициллин-резистентного Staphylococcus aureus, 7 – в отношении
Pseudomonas aeruginosa, 6 – в отношении Proteus mirabilis, и 9 – в отношении
Aspergilus fumigatus. Пять изолятов проявили антибиотическую активность в
отношении всех перечисленных патогенов. Обнаружена статистически
значимая (p<0,05) корреляционная связь (коэффициент корреляции r=0,752,
коэффициент ранговой корреляции Спирмена rs=0,765) между способностью
изолятов подавлять рост P. aeruginosa и P. mirabilis.
16
Основные положения диссертации опубликованы в работах:
I.
Журналы, рекомендованные ВАК РФ
1.
Хижняк, С.В. Оценка эффективности психрофильных пещерных
микроорганизмов в биологической борьбе с обыкновенной корневой гнилью
зерновых / С.В. Хижняк, Е.П. Ланкина, И.Р. Илиенц // Вестник Красноярского
государственного аграрного университета. – 2009 - № 6. – С. 49-52.
2.
Хижняк, С.В. Связь между уровнем антропогенной нагрузки и
антибиотической активностью пещерной микробиоты / С.В. Хижняк, И.Р.
Илиенц, Е.П. Ланкина // Вестник Красноярского государственного аграрного
университета. – 2009 - № 7. – С. 52-55.
3.
Ланкина, Е.П. Перспективы использования пещеры Маячная в
качестве источника психрофильных и психротолерантных бактерий / Е.П.
Ланкина, С.В. Хижняк, А.А. Кимм // Вестник Красноярского государственного
аграрного университета. – 2009 - № 8. – С. 69-71.
II.
Другие научные издания
4. Ланкина, Е.П. Выделение почвенных грибов-антагонистов и анализ их
антибиотической активности в отношении фитопатогенных грибов р.
Fusarium и р. Bipolaris / Е.П. Ланкина // Современные тенденции развития
АПК в России : мат-лы V Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых
Сибирского федерального округа / Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск,
2007. – С. 166-170.
5. Ланкина, Е.П. Выделение почвенных грибов-антагонистов и анализ их
антибиотической активности в отношении фитопатогенных грибов р.
Fusarium и р. Bipolaris / Е.П. Ланкина // Студенческая наука – взгляд в
будущее: мат-лы Всероссийской студенческой научной конф. посвященной
55-летию ФГОУ ВПО «КрасГАУ»: состоялась 28.03.07. / Краснояр. гос. аграр.
ун-т. – Красноярск, 2007. – С. 76-78.
6. Ланкина, Е.П. Скрининг почвенных бактерий-антагонистов к
возбудителям гельминтоспориозной и фузариозной корневых гнилей / Е.П.
Ланкина, С.В. Драчева // Студенческая наука – взгляд в будущее: мат-лы
Всероссийской студенческой научной конф. посвященной 55-летию ФГОУ
ВПО «КрасГАУ»: состоялась 28.03.07. / Краснояр. гос. аграр. ун-т. –
Красноярск, 2007. – С. 78-79.
7. Ланкина, Е.П. Встречаемость бактерий-антагонистов возбудителей
корневых гнилей зерновых в различных почвах / E.П. Ланкина, С.В. Хижняк //
Агроэкологические функции плодородия почв и современные агротехнологии
: мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. / Башкирский. гос. аграр. ун-т. – Уфа,
2008. – С. 196-198.
8. Ланкина, Е.П. Скрининг мезофильных и психрофильных
микроорганизмов, перспективных для использования в биологической защите
зерновых от корневых гнилей / E.П. Ланкина // Всероссийский конкурс на
лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученных /
Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2008. – 33 с.
9. Березикова, А.А. Психротрофные микроорганизмы дерновокарбонатных выщелоченных почв / А.А. Березикова, Е.П. Ланкина, С.В.
17
Хижняк // Аграрная наука на рубеже веков: мат-лы Всероссийской научнопрактической конференции / Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2005. –
С. 55-57.
10. Хижняк, С.В. Микробиологический состав и фитосанитарные
свойства почво-подобных субстратов / С.В. Хижняк, В.А. Козлов, Е.П.
Ланкина // Агроэкологические функции плодородия почв и современные
агротехнологии: мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. / Башкирский. гос.
аграр. ун-т. – Уфа, 2008. – С. 86-88.
11. Lankina, E.P. Possible reason of soil-like substance antifungal activity in
the BIOS closed ecosystem / E.P. Lankina, B.A. Koslov B.A. // Сборник молодых
ученых КрасГАУ «Молодые ученые – науке Сибири» / Краснояр. гос. аграр.
ун-т. – Красноярск, 2008. – С. 97-98.
12. Хижняк С.В. Перспективы использования психрофильных и
психротолерантных микроорганизмов в защите зерновых от обыкновенной
корневой гнили / С.В. Хижняк, И.Р. Илиенц, Е.П. Ланкина // Инновации в
науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития: мат-лы
Всероссийской очно-заочной научно-практической и научно-методической
конференции с международным участием / Краснояр. гос. аграр. ун-т. –
Красноярск, 2009. – С. 222-225.
13. Хижняк С.В. Микробиологическая характеристика пещеры Маячная
/ С.В. Хижняк, Е.П. Ланкина // Пещеры: охрана, история исследований,
культура, туризм, современное состояние и перспективы научных
исследований в пещерах на территории бывшего СССР // Материалы научнопрактической конференции. Сб. науч. тр. – Красноярск: Поликом, 2009. – С.
221-225
14. Хижняк С.В. Перспективы использования микроорганизмов
карстовых пещер в сельскохозяйственной биотехнологии / С. В. Хижняк, Е. П.
Ланкина, И. Р. Илиенц, Е.В. Нестеренко // Пещеры: охрана, история
исследований, культура, туризм, современное состояние и перспективы
научных исследований в пещерах на территории бывшего СССР // Материалы
научно-практической конференции. Сб. науч. тр. – Красноярск: Поликом,
2009. – С. 228-229
15. Ланкина, Е.П. Перспективы использования психрофильных и
психротолерантных микроорганизмов в защите зерновых от корневых гнилей /
Е.П. Ланкина, И.Р. Илиенц, С.В. Хижняк // Материалы II международной
(заочной)
научно-практической
конференции
молодых
ученых
«Инновационные тенденции развития агропромышленного комплекса России»
/ Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2009. – С. 48-52.
16. Шевелев Д.И. Антитоксические свойства наночастиц гидроксида
железа в отношении тиабендазол-тебуканазоловых фунгицидов / Д.И.
Шевелев, Е.П. Ланкина, С.В. Хижняк // Экология Южной Сибири и
сопредельных территорий. Выпуск 13: в 2 т. Т.II. / Хакасский гос. Ун-т им.
Н.Ф. Катанова, 2009. – С. 206.
17. Ланкина Е.П. Эффективность пещерных бактерий-антагонистов в
биологической защите зерновых культур от корневых гнилей / E.П. Ланкина,
18
С.В. Хижняк // III международная (заочная) научно-практическая конференция
молодых ученных «Инновационные тенденции развития российской науки» /
Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2010. – С. 20-24.
18. Воробьева С.В. Микробные сообщества олиготрофных
местообитаний как потенциальный источник продуцентов антибиотиков /
С.В. Воробьева, И.Р. Илиенц, E.П. Ланкина // III международная (заочная)
научно-практическая конференция молодых ученных «Инновационные
тенденции развития российской науки» / Краснояр. гос. аграр. ун-т. –
Красноярск, 2010. – С. 36-37.
19. Ланкина Е.П., Хижняк С.В. Результаты полевых испытаний
выделенных в пещерах Сибири бактерий-антагонистов в биологической
защите зерновых от корневых гнилей / E.П. Ланкина, С.В. Хижняк // IV
международная конференция молодых ученных, посвященной 40-летию СО
Россельхозакадемии «Новейшие направления развития аграрной науки в
работах молодых ученых» / Рос. акад. с.-х. наук. Сиб. регион. отд. –
Новосибирск, 2010. Ч. 1. – С. 113-117.
20. Ланкина Е.П. Карстовые пещеры как источник бактерийантагонистов для биологической защиты растений от болезней / E.П. Ланкина
// IV международная конференция молодых ученных, посвященной 40-летию
СО Россельхозакадемии «Новейшие направления развития аграрной науки в
работах молодых ученых» / Рос. акад. с.-х. наук. Сиб. регион. отд. –
Новосибирск, 2010. Ч. 1. – С. 325-328.
21. Ланкина Е.П. Микробные сообщества экстремальных местообитаний
как источник продуцентов антибиотиков для борьбы с болезнями животных и
человека / Е.П. Ланкина, С.В. Воробьёва, И.Р. Илиенц // IV международная
конференция
молодых
ученных,
посвященной
40-летию
СО
Россельхозакадемии «Новейшие направления развития аграрной науки в
работах молодых ученых» / Рос. акад. с.-х. наук. Сиб. регион. отд. –
Новосибирск, 2010. Ч. 2. – С. 85-88.
22. Ланкина Е.П. Результаты полевых испытаний психрофильных и
психротолерантных бактерий-антагонистов в биологической защите зерновых
от корневых гнилей / Е.П. Ланкина, С.В. Хижняк, В.К. Пурлаур // Внедрение
экологически безопасных технологий комплексной защиты растений: мат-лы
Междунар. науч.-практ. конф. / Саратовкий гос. аграр. ун-т им. Вавилова. –
Саратов, 2010.